-6-附件5免疫毒性試驗方法Immunotoxicitytest1范圍本方法規(guī)定了動物免疫毒性試驗的基本原則、要求和方法。本方法適用于化妝品原料的免疫毒性檢測。 2試驗?zāi)康谋痉椒ㄓ糜谠u價化妝品原料免疫毒性反應(yīng)的潛在可能性。3定義3.1免疫毒性immunotoxicity受試物對機(jī)體免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能造成損害作用的能力，包括機(jī)體免疫系統(tǒng)的組織或器官損傷、免疫功能的抑制或增強(qiáng)。3.2體液免疫h(yuǎn)umoralimmunity抗原進(jìn)入機(jī)體后，刺激B細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)B細(xì)胞和記憶細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生抗體，與相應(yīng)的抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)。3.3細(xì)胞免疫cell-mediatedimmunity又稱細(xì)胞介導(dǎo)免疫。狹義的細(xì)胞免疫僅指T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，即T細(xì)胞受到抗原刺激后，分化、增殖、轉(zhuǎn)化為致敏T細(xì)胞，對抗原的直接殺傷作用及致敏T細(xì)胞所釋放的細(xì)胞因子的協(xié)同殺傷作用。T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的特征是出現(xiàn)以單核細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)和/或特異性的細(xì)胞毒性。廣義的細(xì)胞免疫還包括原始的吞噬作用以及NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。4試驗的基本原則本方法用于評價受試物是否改變或損傷免疫系統(tǒng)的機(jī)能狀態(tài)。免疫毒性試驗應(yīng)分層級開展，初始篩選免疫毒性試驗是在重復(fù)劑量毒性試驗免疫毒性相關(guān)檢查基礎(chǔ)上增加淋巴細(xì)胞亞群分布、免疫球蛋白含量測定等項目。初始篩選試驗提示存在免疫毒性風(fēng)險時，則需開展附加免疫毒性試驗。附加免疫毒性試驗時，給予不同劑量組受試物至少28d，每天對動物進(jìn)行觀察，記錄所出現(xiàn)的任何臨床毒性表現(xiàn)。給予受試物結(jié)束后處死動物，對相應(yīng)的評價指標(biāo)進(jìn)行檢測或分析。5初始篩選免疫毒性試驗5.1初始篩選試驗方法采用初始篩選免疫毒性試驗，對受試物潛在免疫毒性進(jìn)行初步評估。初始篩選試驗可整合至重復(fù)劑量毒性試驗中。為發(fā)現(xiàn)免疫毒性指征，需評價以下指標(biāo)：（1）血液學(xué)檢查：白細(xì)胞總數(shù)及分類計數(shù)等。（2）血液生化檢查：球蛋白、白蛋白/球蛋白比值。（3）大體病理學(xué)檢查：淋巴器官/組織。（4）臟器重量/臟器系數(shù)：胸腺、脾臟的濕重，必要時可選代表性淋巴結(jié)進(jìn)行稱重，并計算臟器系數(shù)。（5）組織病理學(xué)檢查：胸腺、脾臟、骨髓（股骨、胸骨或肋軟骨部位的骨髓）、有代表性的淋巴結(jié)（黏膜附近或周圍淋巴結(jié)）、所有肉眼可見的損傷。此外，免疫毒性初始篩選試驗還應(yīng)增加以下指標(biāo)的檢測：（1）免疫球蛋白分類（IgG、IgM、IgA和IgE）水平測定。（2）淋巴細(xì)胞亞群測定：該試驗屬于免疫表型分析，目的是對淋巴細(xì)胞亞型進(jìn)行鑒定和計數(shù)，通常采用流式細(xì)胞儀測試。對全血、外周血或從淋巴組織分離的免疫細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等進(jìn)行計數(shù)；檢測免疫細(xì)胞表面標(biāo)志物的改變，評估CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞或其它亞群的數(shù)量及比值。5.2試驗結(jié)果的評價初始篩選試驗結(jié)果，應(yīng)基于淋巴細(xì)胞亞群分布、免疫球蛋白分類的結(jié)果，并考慮重復(fù)劑量毒性試驗中的免疫毒性相關(guān)檢查，如血液學(xué)、血清免疫球蛋白含量、免疫器官重量、組織病理學(xué)（胸腺、脾、淋巴結(jié)）等結(jié)果進(jìn)行綜合評價。上述檢查項目出現(xiàn)異常時，即受試物各劑量組與溶劑對照組比較存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異（但應(yīng)考慮動物正常的參考范圍和變化，存在毒理學(xué)意義的改變），提示受試物存在潛在免疫毒性風(fēng)險，應(yīng)開展附加免疫毒性試驗研究，以驗證受試物潛在的免疫毒性，并明確免疫細(xì)胞和免疫功能受影響的程度。6附加免疫毒性試驗附加免疫毒性試驗包括：體液免疫、特異性細(xì)胞免疫、巨噬細(xì)胞檢測、NK細(xì)胞活性四個方面，每個方面應(yīng)至少選擇一種試驗方法進(jìn)行。6.1體液免疫試驗給予受試物后用抗原免疫動物，采用抗體形成細(xì)胞試驗（也稱溶血空斑試驗）方法或酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測抗體滴度的方法評價受試物對體液免疫的影響。6.1.1抗體形成細(xì)胞試驗（AntibodyPlagueFormingCell，PFC）受試物固體受試物應(yīng)溶解或懸浮于合適的溶劑中，臨用前稀釋至適當(dāng)濃度；液體受試物可以直接加入試驗系統(tǒng)和/或臨用前稀釋至適當(dāng)濃度。受試物應(yīng)在臨用前新鮮配制，否則須確認(rèn)貯存不影響其穩(wěn)定性。實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境.1動物種系的選擇選用健康嚙齒類動物，推薦使用小鼠（近交系）或大鼠。如果已知受試物對其中一種性別的動物更敏感，則應(yīng)使用這種性別的動物。雌性動物應(yīng)未孕、未產(chǎn)。試驗開始時每一性別的動物體重差異應(yīng)控制在±20%內(nèi)。.2動物的性別和數(shù)量 每一個劑量組和對照組至少應(yīng)該有20只動物（雌雄各半）。若計劃在試驗過程中處死動物，則應(yīng)增加計劃處死的動物數(shù)。.3飼養(yǎng)環(huán)境實驗動物和實驗動物設(shè)施應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。選用標(biāo)準(zhǔn)配合飼料，不限制飲水量。劑量分組至少要設(shè)三個劑量組、一個溶劑對照組和一個陽性對照組，如果受試物采用未知免疫毒性的溶劑時，還應(yīng)設(shè)立一個不作任何處理的空白對照組。高劑量應(yīng)不使動物產(chǎn)生明顯的應(yīng)激、營養(yǎng)不良或死亡，但最好可使動物產(chǎn)生一些可測量的一般中毒表現(xiàn)。低劑量最好不使動物產(chǎn)生任何免疫毒性作用。陽性對照組可選用已知的免疫抑制劑（如環(huán)磷酰胺等）作為陽性對照物。受試物給予開始給予受試物前至少要有3~5d時間使實驗動物適應(yīng)實驗室飼養(yǎng)環(huán)境。實驗動物隨機(jī)分組。受試物或溶劑經(jīng)口和/或經(jīng)皮和/或經(jīng)吸入給予，給予受試物途徑一般與90d重復(fù)劑量毒性試驗的途徑一致。每周給予受試物7d，至少28d。臨床觀察試驗期間，每天對動物至少進(jìn)行1次臨床觀察，記錄毒性癥狀的出現(xiàn)時間、嚴(yán)重程度及其持續(xù)時間。觀察應(yīng)包括但不限于以下方面：皮膚、被毛；眼、黏膜；呼吸系統(tǒng)；自主性和中樞神經(jīng)系統(tǒng)；循環(huán)系統(tǒng)；肢體運動功能；行為特征；抗感染能力等。每周測量1次動物的攝食量。動物給予受試物前稱體重，之后每周1次，處死前再次稱體重。任何瀕死動物一被發(fā)現(xiàn)應(yīng)與其他動物分開并被安樂死。對試驗過程中任何瀕死的或死亡的動物都應(yīng)進(jìn)行大體解剖。試驗方法給予受試物結(jié)束前4d，經(jīng)靜脈注射T細(xì)胞依賴性抗原綿羊紅細(xì)胞（SRBCs），通過計數(shù)動物脾臟中特異性抗體生成細(xì)胞的數(shù)量來反映抗體的產(chǎn)量，可用于檢測受試物對脾臟內(nèi)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的毒性作用。試驗時，應(yīng)考慮如下因素：（1）注射T細(xì)胞依賴性抗原SRBCs，應(yīng)對動物注射抗原后測定PFC的最佳時間作出評價。（2）測定每批補體的活性。（3）使用雙盲法進(jìn)行PFC計數(shù)。（4）測定脾細(xì)胞的活性。6.1.2免疫球蛋白定量測定受試物、實驗動物、劑量分組、受試物給予方式及臨床觀察同~。試驗方法在給予受試物結(jié)束前4d，用牛血清白蛋白免疫動物，2周后再次用抗原免疫動物，然后測定每只動物血清中IgG和IgM的滴度。測定抗體滴度的時間點應(yīng)足夠多（通常選擇3~5個），以便對受試物組和對照組動物的初級抗體反應(yīng)和次級抗體反應(yīng)進(jìn)行比較。測定抗體時受試物的給予時間至少為28d。試驗時，應(yīng)考慮測定血清中IgG和IgM滴度的方法應(yīng)足夠敏感以便測得每只動物的IgG和IgM滴度。該試驗評價受試物是否影響抗體對抗原的反應(yīng)性。6.2特異性細(xì)胞免疫試驗采用下列3種試驗方法中的任一種進(jìn)行試驗，評價給予受試物至少28d對特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響。如選擇淋巴細(xì)胞增殖試驗或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞檢測，可與NK細(xì)胞活性共用一組動物。6.2.1淋巴細(xì)胞增殖試驗受試物、實驗動物、劑量分組、受試物給予方式及臨床觀察同~。試驗方法可通過測量放射性標(biāo)記物（一般為3H-胸腺嘧啶，簡稱3H-TdR）摻入DNA的量來說明淋巴細(xì)胞的增殖，也可采用MTT、BrdU-ELISA/FCM法等方法。該方法可以證明給予受試物至少28d對同種異品系淋巴細(xì)胞刺激引起的淋巴細(xì)胞增殖能力的影響。采用3H-TdR摻入試驗時，應(yīng)對如下因素進(jìn)行考慮：（1）應(yīng)答細(xì)胞來自對照組和受試物組動物的脾細(xì)胞，在無菌條件下制備脾細(xì)胞。應(yīng)答細(xì)胞的DNA合成沒有采取阻斷處理。（2）刺激細(xì)胞來自未給予受試物的同種異品系動物的脾細(xì)胞，在無菌條件下制備脾細(xì)胞。刺激細(xì)胞的DNA合成用絲裂霉素或X線處理進(jìn)行阻斷。（3）測定應(yīng)答細(xì)胞和刺激細(xì)胞的活力。（4）應(yīng)設(shè)3份或4份對照，保證刺激細(xì)胞的非反應(yīng)性、測定DNA合成的基礎(chǔ)水平。（5）對空白對照和溶劑對照同時進(jìn)行測定。（6）用每個培養(yǎng)皿中摻入應(yīng)答細(xì)胞的放射性標(biāo)記物的量來表示脾細(xì)胞的增殖程度，表示為每分鐘居里數(shù)（curieperminute，CPM）。要計算凈CPM（nCPM），即應(yīng)答細(xì)胞被刺激細(xì)胞刺激后摻入的CPM均值減去未經(jīng)刺激的脾細(xì)胞摻入CPM的均值。受試物組與對照組差異的百分比表示為：[1-（受試物組nCPM/對照組nCPM）]。（7）不同的淋巴細(xì)胞增殖試驗存在許多不同，應(yīng)說明所引用的試驗方法及詳細(xì)的試驗步驟，說明主要試劑的來源，最好也說明這些試劑的純度。（8）為了證明方法的靈敏性，應(yīng)設(shè)立陽性對照組，給予已知的免疫抑制劑。6.2.2遲發(fā)型過敏（Delayed-typeHypersensitivity，DTH）反應(yīng)受試物同。實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境選用近交系小鼠，如果已知受試物對其中一種性別的動物更敏感，則應(yīng)使用這種性別的動物。雌性動物應(yīng)未孕、未產(chǎn)。動物6~8周齡時開始試驗，試驗開始時每一性別的動物體重差異應(yīng)控制在±20%內(nèi)。動物的性別和數(shù)量、飼養(yǎng)環(huán)境同。劑量分組、受試物給予方式及臨床觀察同~。試驗方法在給予受試物結(jié)束前4d，用牛血清白蛋白致敏動物，1~2周后用相同的抗原進(jìn)行激發(fā)，激發(fā)后24~48h，比較受試物組和對照組DTH反應(yīng)的差異，以激發(fā)前后反應(yīng)的差值來表示DTH的程度。該方法是一種檢測受試物對實驗動物誘導(dǎo)性DTH影響的體內(nèi)方法。開展該試驗時，應(yīng)對如下因素進(jìn)行考慮：（1）DTH檢測方法有數(shù)種，如耳腫脹法、足跖增厚法等，應(yīng)選用靈敏度高、可重復(fù)性好、并適用于所選用實驗動物品系的方法；不同的方法中下列參數(shù)也可能不同，如致敏及激發(fā)動物所用抗原的性質(zhì)，免疫注射的次數(shù)及途徑，免疫激發(fā)的時間，同位素的使用等。試驗時選用的這些參數(shù)及其他相關(guān)的參數(shù)應(yīng)可以使所選用的實驗動物產(chǎn)生足夠的DTH反應(yīng)。（2）測定DTH反應(yīng)前，應(yīng)對動物給予受試物至少28d。6.2.3細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CytotoxicT-lymphocyte，CTL）檢測受試物、實驗動物、劑量分組、受試物給予方式及臨床觀察同~。試驗方法該方法用于證明給予受試物至少28d對CTL生成的影響。常取動物脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞試驗，檢測采用放射免疫法或流式細(xì)胞術(shù)。放射法使用同種異品系腫瘤抗原對CTL進(jìn)行誘導(dǎo)（體內(nèi)或體外誘導(dǎo)），然后，來自受試物組和對照組動物的脾細(xì)胞與51Cr標(biāo)記的同種異品系腫瘤細(xì)胞共孵育4h后，腫瘤細(xì)胞所釋放的放射性標(biāo)記物的量可以說明T淋巴細(xì)胞溶解腫瘤細(xì)胞的能力。試驗時，考慮如下因素：（1）應(yīng)設(shè)立對照組來測定效應(yīng)細(xì)胞不存在時靶細(xì)胞釋放的放射性標(biāo)記物的本底量和放射性標(biāo)記物的總釋放量。（2）應(yīng)可以證明試驗中所選用的動物可產(chǎn)生CTLs，所選用的試驗方法應(yīng)適合于誘導(dǎo)動物CTL的生成。（3）CTL檢測有數(shù)種不同的方法，引用某一種方法時應(yīng)做到完全引用，對方法進(jìn)行修改時應(yīng)予以說明，合適的情況下應(yīng)說明主要試劑的來源、活性和/或純度。6.3NK細(xì)胞的活性6.3.1受試物、實驗動物、劑量分組、受試物給予方式及臨床觀察同~。6.3.2試驗方法建議采用Reynolds和Herberman的微量培養(yǎng)法來檢測給予受試物至少28d對NK細(xì)胞活性的影響，也可采用LDH釋放法等其他適合的方法。微量培養(yǎng)法是將受試物組和對照組動物的脾細(xì)胞與51Cr標(biāo)記的YAC淋巴瘤細(xì)胞共培養(yǎng)。靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞共培養(yǎng)4h后，靶細(xì)胞中釋放的放射性標(biāo)記物的量可用于表示NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。LDH釋放法是將受試物組和對照組動物的脾細(xì)胞與靶細(xì)胞（YAC細(xì)胞）共培養(yǎng)。靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞共培養(yǎng)4h后，靶細(xì)胞中釋放的乳酸脫氫酶含量可用于表示NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。開展該試驗時，應(yīng)對如下因素進(jìn)行考慮：（1）應(yīng)設(shè)立幾個對照以說明在沒有效應(yīng)細(xì)胞存在時，靶細(xì)胞釋放放射性標(biāo)記物或乳酸脫氫酶的本底量以及放射性標(biāo)記物或乳酸脫氫酶總的釋放量。（2）試驗可使用除YAC細(xì)胞之外的靶細(xì)胞，任何情況下都應(yīng)測定靶細(xì)胞的存活力。（3）引用某一種方法時應(yīng)做到完全引用，對方法進(jìn)行修改時應(yīng)予以說明，合適的情況下應(yīng)說明主要試劑的來源、活性和/或純度；如果對所選用的方法作了一些修改，則應(yīng)說明修改的科學(xué)性和合理性。6.4巨噬細(xì)胞檢測6.4.1受試物、實驗動物、劑量分組、受試物給予方式及臨床觀察同~。6.4.2試驗方法評價給予受試物至少28d對巨噬細(xì)胞數(shù)及其吞噬功能的影響。應(yīng)對如下方面進(jìn)行檢測：（1）試驗中應(yīng)計數(shù)腹腔細(xì)胞的總數(shù)及分類計數(shù)。（2）評價在有或沒有促進(jìn)因子（如γ-干擾素或細(xì)菌脂多糖）存在的情況下腹腔細(xì)胞對外源性物質(zhì)（如雞紅細(xì)胞、熒光微球等）的吞噬作用。（3）有數(shù)種不同的巨噬細(xì)胞檢測方法，推薦雞紅細(xì)胞吞噬法和流式細(xì)胞法，也可采用巨噬細(xì)胞溶酶體酶測定、巨噬細(xì)胞表面受體檢測法等，因此，應(yīng)對所選用的方法進(jìn)行描述并說明方法引證的來源；如果對所選用的方法作了一些修改，則應(yīng)說明修改的科學(xué)性和合理性。6.5結(jié)果處理（1）對于計數(shù)資料，表格應(yīng)顯示試驗開始時各組動物數(shù)、出現(xiàn)免疫毒性反應(yīng)的動物數(shù)、免疫毒性損傷的類型和每種損傷的動物百分比。（2）對于計量資料，一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多個試驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計。（3）NK細(xì)胞活性需進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，X＝Sin-1P，式中P為NK細(xì)胞活性，用小數(shù)表示，然后再進(jìn)行方差分析。（4）以吞噬百分率或吞噬指數(shù)表示巨噬細(xì)胞的吞噬能力。吞噬百分率需進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，X＝Sin-1P，式中P為吞噬百分率，用小數(shù)表示，然后再進(jìn)行方差分析。6.6結(jié)果評價附加免疫毒性試驗研究的結(jié)果應(yīng)與初始篩選試驗結(jié)果一起評估。在評價時應(yīng)綜合考慮生物學(xué)意義和統(tǒng)計學(xué)意義。評估包括：（1）對異常指標(biāo)進(jìn)行綜合分析：與溶劑對照組比較是否存在統(tǒng)計學(xué)的顯著差異，是否在背景數(shù)據(jù)范圍內(nèi)波動，受試物的劑量與異常指標(biāo)的發(fā)生與否、發(fā)生率和嚴(yán)重性之間的關(guān)系，以及指標(biāo)的相互關(guān)聯(lián)性等，判斷受試物是否引起了某一方面免疫功能異常。（2）受試物組體液免疫試驗、特異性細(xì)胞免疫試驗、巨噬細(xì)胞檢測、NK細(xì)胞活性四個方面中任一試驗結(jié)果出現(xiàn)異常，均認(rèn)為該受試物具有潛在的免疫毒性。7結(jié)果解釋免疫毒性試驗?zāi)軌蛱峁┦茉囄镌诜磸?fù)接觸機(jī)體后的毒性作用資料。其試驗結(jié)果僅可在很有限的程度上外推到人，但它可為確定人群的允許接觸水平提供有用的信息。附件6口腔黏膜刺激試驗方法Oralmucousirritationtest1范圍本方法適用于評價牙膏對口腔黏膜組織潛在的刺激作用。2試驗?zāi)康拇_定和評價牙膏對動物口腔黏膜組織是否有刺激作用及其程度。3定義口腔黏膜刺激oralmucosairritation口腔黏膜組織接觸受試物后所產(chǎn)生的水腫、炎性變化及組織損傷等反應(yīng)。4試驗的基本原則將受試物置于受試動物的一側(cè)頰囊內(nèi)，對照物置于另一側(cè)頰囊內(nèi)，在規(guī)定的時間間隔內(nèi)多次接觸，肉眼觀察并記錄動物頰囊接觸部位的刺激程度，并于末次接觸后24小時取材進(jìn)行組織學(xué)評價。5試驗方法5.1試樣5.1.1受試物：受試物直接使用，單次放置量為0.4g或0.4mL。5.1.2對照物：0.9%氯化鈉注射液（生理鹽水），用量同受試物，直接使用。5.2實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境5.2.1健康的SPF級金黃地鼠（拉丁學(xué)名：Mesocricetusauratus），6~8周齡。同一品系，雌雄不限，雌性動物應(yīng)未孕。5.2.2至少使用3只動物。5.2.3試驗前動物應(yīng)在實驗動物房環(huán)境內(nèi)至少適應(yīng)3天。實驗動物及實驗動物房應(yīng)符合國家相關(guān)規(guī)定。選用標(biāo)準(zhǔn)配合飼料，飲水不限制。5.3試驗步驟5.3.1動物準(zhǔn)備與麻醉用適當(dāng)?shù)穆樽韯┞樽韯游?，檢查動物雙側(cè)頰囊有無異常（剔除頰囊黏膜異常的動物）。翻轉(zhuǎn)動物頰囊用生理鹽水或蒸餾水清洗干凈后進(jìn)行試驗。5.3.2試樣接觸將受試物置于動物一側(cè)頰囊底部，對照物置于另一側(cè)頰囊底部。試樣與黏膜接觸5min，接觸時間結(jié)束后將頰囊翻出，去除試樣，用生理鹽水或蒸餾水清洗接觸部位，清洗時間一般為1min~2min，直至將試樣完全清除。重復(fù)上述操作4次，每次操作間隔1h（含接觸與清洗時間）。每次重復(fù)放置試樣前肉眼檢查頰囊，并記錄異常情況。末次接觸后的24h肉眼觀察頰囊并取與試樣接觸的頰囊組織進(jìn)行組織學(xué)評價。在試驗過程中，根據(jù)表1判定肉眼觀察結(jié)果。在試驗周期內(nèi)的任意時間點，3只動物中如有1只及以上出現(xiàn)重度水腫、紅斑、糜爛或潰瘍現(xiàn)象，可直接判定為重度口腔黏膜刺激反應(yīng)，無需再進(jìn)行組織學(xué)評價。5.4結(jié)果觀察5.4.1臨床觀察試驗期間觀察動物，記錄異常表現(xiàn)，包括局部、全身及異常行為等。肉眼觀察試驗部位，根據(jù)表1判定有無紅斑、水腫、糜爛及潰瘍等情況，并比較同一動物的試驗側(cè)頰囊和對照側(cè)頰囊，記錄每側(cè)頰囊的狀況，注意試驗側(cè)與對照側(cè)的差異。表1口腔黏膜臨床觀察評價表臨床表現(xiàn)反應(yīng)程度紅斑無紅斑無極輕微紅斑（勉強(qiáng)可見）極輕清晰紅斑輕度中度紅斑中度重度紅斑（紫紅色）至焦痂形成、糜爛、潰瘍重度水腫無水腫無極輕微水腫（勉強(qiáng)可見）極輕清晰水腫（腫起邊緣清晰）輕度中度水腫（腫起約1mm）中度重度水腫（腫起超過1mm，并超出接觸區(qū)）重度5.4.2組織學(xué)觀察組織切片制作末次接