傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒在腫瘤基因治療中的應(yīng)用：機(jī)制、進(jìn)展與挑戰(zhàn)一、引言1.1研究背景與意義腫瘤，作為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，一直是全球醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，全球新增癌癥病例1929萬(wàn)例，癌癥死亡病例996萬(wàn)例。其中，中國(guó)新增癌癥病例457萬(wàn)例，死亡病例300萬(wàn)例，發(fā)病率與死亡率均居于全球前列。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，涉及原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及細(xì)胞信號(hào)通路的異常調(diào)控等。盡管當(dāng)前針對(duì)腫瘤的治療手段，如手術(shù)切除、化療、放療和免疫治療等在一定程度上改善了患者的生存狀況，但這些傳統(tǒng)治療方法仍然存在諸多局限性。手術(shù)切除對(duì)于一些晚期腫瘤患者或腫瘤位置特殊難以切除的情況往往無(wú)能為力；化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致患者出現(xiàn)脫發(fā)、惡心、嘔吐、免疫力下降等一系列不良反應(yīng)；放療則會(huì)對(duì)周圍正常組織產(chǎn)生輻射損傷，限制了其應(yīng)用范圍；免疫治療雖然在部分腫瘤患者中取得了顯著療效，但存在響應(yīng)率低、耐藥性和免疫相關(guān)不良反應(yīng)等問(wèn)題。隨著分子生物學(xué)、生物化學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科的飛速發(fā)展，基因治療作為一種新興的腫瘤治療策略應(yīng)運(yùn)而生，為腫瘤治療帶來(lái)了新的希望。基因治療是指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，從而達(dá)到治療目的。在腫瘤基因治療中，通過(guò)導(dǎo)入特定的治療基因，如抑癌基因、免疫調(diào)節(jié)基因、自殺基因等，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷、抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡以及增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)等。與傳統(tǒng)治療方法相比，基因治療具有靶向性強(qiáng)、副作用小、能夠從根本上治療腫瘤等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是最具潛力的腫瘤治療方法之一。然而，基因治療在臨床應(yīng)用中也面臨著諸多挑戰(zhàn)，其中最關(guān)鍵的問(wèn)題之一就是如何將治療基因高效、安全地遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)。小環(huán)DNA（minicircleDNA，mcDNA）作為一種新型的基因載體，因其具有無(wú)細(xì)菌骨架序列、免疫原性低、基因表達(dá)效率高且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等顯著優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤基因治療領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。小環(huán)DNA是通過(guò)位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)將質(zhì)粒DNA中的細(xì)菌骨架序列去除后得到的一種超螺旋環(huán)狀DNA分子，其僅保留了目的基因表達(dá)盒和最小的復(fù)制起始位點(diǎn)。這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使得小環(huán)DNA在進(jìn)入細(xì)胞后，能夠避免細(xì)菌骨架序列引起的免疫反應(yīng)，從而提高基因治療的安全性和有效性。然而，小環(huán)DNA自身存在一些局限性，如分子質(zhì)量小、穩(wěn)定性差、難以穿透細(xì)胞膜等，限制了其在體內(nèi)的傳遞效率和靶向性。因此，開(kāi)發(fā)一種高效的小環(huán)DNA遞送系統(tǒng)，將其精準(zhǔn)地輸送到腫瘤細(xì)胞內(nèi)，成為了腫瘤基因治療領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。納米技術(shù)的迅速發(fā)展為解決小環(huán)DNA的遞送難題提供了新的途徑。納米顆粒（nanoparticles，NPs）作為一種新型的藥物載體，具有粒徑小（1-1000nm）、比表面積大、表面易于修飾、可實(shí)現(xiàn)多種功能集成等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。通過(guò)將小環(huán)DNA包裹或連接在納米顆粒表面，構(gòu)建傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒（targetednanoparticlesfordeliveringminicircleDNA，TNPs），可以有效地改善小環(huán)DNA的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)，提高其在腫瘤組織中的富集程度和細(xì)胞攝取效率，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向基因治療。靶向納米顆粒能夠通過(guò)表面修飾的靶向配體與腫瘤細(xì)胞表面特異性受體或抗原進(jìn)行特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)靶向運(yùn)輸。此外，納米顆粒還可以通過(guò)增強(qiáng)滲透和滯留（enhancedpermeabilityandretention，EPR）效應(yīng)，被動(dòng)地在腫瘤組織中富集，進(jìn)一步提高小環(huán)DNA的遞送效率。因此，傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒在腫瘤基因治療中具有廣闊的應(yīng)用前景，有望成為一種新型的腫瘤治療手段，為腫瘤患者帶來(lái)新的治療選擇和希望。本研究旨在深入探討傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒在腫瘤基因治療中的應(yīng)用，通過(guò)對(duì)小環(huán)DNA的特性、靶向納米顆粒的設(shè)計(jì)與制備、腫瘤靶向機(jī)制以及體內(nèi)外抗腫瘤療效等方面進(jìn)行系統(tǒng)研究，揭示傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒在腫瘤基因治療中的作用機(jī)制和潛在價(jià)值，為其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。具體而言，本研究將圍繞以下幾個(gè)方面展開(kāi)：首先，對(duì)小環(huán)DNA的制備方法進(jìn)行優(yōu)化，提高其制備效率和質(zhì)量；其次，設(shè)計(jì)并制備具有良好生物相容性、穩(wěn)定性和靶向性的納米顆粒，并將小環(huán)DNA高效負(fù)載到納米顆粒上；然后，深入研究靶向納米顆粒的腫瘤靶向機(jī)制，包括主動(dòng)靶向和被動(dòng)靶向機(jī)制，以及納米顆粒與腫瘤細(xì)胞的相互作用過(guò)程；最后，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒的抗腫瘤療效和安全性，為其進(jìn)一步的臨床研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本研究的開(kāi)展不僅有助于推動(dòng)腫瘤基因治療技術(shù)的發(fā)展，還將為腫瘤的精準(zhǔn)治療提供新的策略和方法，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1小環(huán)DNA的研究現(xiàn)狀小環(huán)DNA的概念最早于1998年由美國(guó)科學(xué)家Heinemann和同事提出，他們通過(guò)位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了小環(huán)DNA，并證明其能夠在體外高效表達(dá)目的基因。此后，小環(huán)DNA作為一種新型的基因載體，受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。在小環(huán)DNA的制備方法研究方面，目前主要有兩種策略：一種是基于細(xì)菌體內(nèi)重組系統(tǒng)的制備方法，另一種是基于體外重組技術(shù)的制備方法。在基于細(xì)菌體內(nèi)重組系統(tǒng)的制備方法中，研究人員利用噬菌體P1的Cre/loxP重組系統(tǒng)或噬菌體F1的Flp/FRT重組系統(tǒng)，在細(xì)菌體內(nèi)將質(zhì)粒DNA中的細(xì)菌骨架序列去除，從而得到小環(huán)DNA。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是制備過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，能夠利用細(xì)菌的高效繁殖能力大量生產(chǎn)小環(huán)DNA；缺點(diǎn)是制備周期較長(zhǎng)，且可能存在細(xì)菌內(nèi)毒素等雜質(zhì)污染。為了提高小環(huán)DNA的制備效率和質(zhì)量，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)該方法進(jìn)行了一系列優(yōu)化。例如，美國(guó)的Chen等通過(guò)優(yōu)化重組酶的表達(dá)水平和作用時(shí)間，將小環(huán)DNA的產(chǎn)量提高了2-3倍；中國(guó)的Wang等利用溫度敏感型質(zhì)粒構(gòu)建了一種新型的小環(huán)DNA制備系統(tǒng)，通過(guò)控制培養(yǎng)溫度實(shí)現(xiàn)了重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)，有效減少了細(xì)菌骨架序列的殘留?；隗w外重組技術(shù)的制備方法則是在體外利用限制性內(nèi)切酶和連接酶等工具酶，將質(zhì)粒DNA中的細(xì)菌骨架序列切割并去除，然后通過(guò)連接反應(yīng)將目的基因表達(dá)盒環(huán)化形成小環(huán)DNA。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是制備周期短，能夠精確控制小環(huán)DNA的結(jié)構(gòu)和組成；缺點(diǎn)是操作過(guò)程較為復(fù)雜，需要使用大量的工具酶，成本較高。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，一些新型的體外重組技術(shù)逐漸被開(kāi)發(fā)出來(lái)。例如，美國(guó)的Liu等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)合體外連接反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了小環(huán)DNA的快速制備，且制備得到的小環(huán)DNA純度較高；中國(guó)的Zhang等開(kāi)發(fā)了一種基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的小環(huán)DNA制備方法，該方法無(wú)需使用限制性內(nèi)切酶和連接酶，操作簡(jiǎn)單，成本低廉，具有良好的應(yīng)用前景。在小環(huán)DNA的應(yīng)用研究方面，目前主要集中在基因治療、疫苗研發(fā)和基因編輯等領(lǐng)域。在基因治療領(lǐng)域，小環(huán)DNA已被廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療研究，包括腫瘤、遺傳性疾病、心血管疾病等。例如，美國(guó)的Miao等將編碼凝血因子IX的小環(huán)DNA通過(guò)尾靜脈注射的方式導(dǎo)入血友病B小鼠體內(nèi)，成功實(shí)現(xiàn)了凝血因子IX的長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，有效改善了小鼠的凝血功能；中國(guó)的Li等構(gòu)建了攜帶抑癌基因p53的小環(huán)DNA，并將其包裹在脂質(zhì)納米顆粒中，用于治療肝癌小鼠模型，結(jié)果顯示該納米復(fù)合物能夠顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)小鼠的生存期。在疫苗研發(fā)領(lǐng)域，小環(huán)DNA作為一種新型的核酸疫苗載體，具有免疫原性低、基因表達(dá)效率高且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，有望成為傳統(tǒng)疫苗的替代品。例如，英國(guó)的Bagnall等利用小環(huán)DNA編碼流感病毒的血凝素蛋白，制備了一種新型的流感疫苗，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示出良好的免疫效果；中國(guó)的Sun等構(gòu)建了表達(dá)新冠病毒刺突蛋白的小環(huán)DNA疫苗，通過(guò)肌肉注射的方式免疫小鼠，結(jié)果表明該疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。在基因編輯領(lǐng)域，小環(huán)DNA可以作為供體DNA用于CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯，提高基因編輯的效率和準(zhǔn)確性。例如，美國(guó)的Anzalone等利用小環(huán)DNA作為供體，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)人類細(xì)胞中特定基因的精確編輯，為基因治療和遺傳疾病的研究提供了新的工具；中國(guó)的Wang等將小環(huán)DNA與CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)合，用于治療β-地中海貧血小鼠模型，通過(guò)基因編輯修復(fù)了突變的β-珠蛋白基因，有效改善了小鼠的貧血癥狀。1.2.2納米顆粒作為基因載體的研究現(xiàn)狀納米顆粒作為一種新型的基因載體，在基因治療領(lǐng)域的研究始于20世紀(jì)90年代。隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，越來(lái)越多的納米材料被開(kāi)發(fā)出來(lái)并應(yīng)用于基因遞送，包括脂質(zhì)納米顆粒、聚合物納米顆粒、無(wú)機(jī)納米顆粒等。脂質(zhì)納米顆粒（lipidnanoparticles，LNPs）是目前研究最為廣泛的一類納米基因載體。它主要由磷脂、膽固醇、陽(yáng)離子脂質(zhì)和聚乙二醇化脂質(zhì)等成分組成，通過(guò)自組裝形成納米級(jí)別的顆粒結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)納米顆粒具有良好的生物相容性、可生物降解性和低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效地包裹和保護(hù)核酸藥物，促進(jìn)其細(xì)胞攝取和內(nèi)體逃逸。在腫瘤基因治療中，脂質(zhì)納米顆粒已被成功應(yīng)用于多種治療基因的遞送。例如，美國(guó)的Dormitzer等開(kāi)發(fā)了一種基于脂質(zhì)納米顆粒的mRNA疫苗，用于治療黑色素瘤，在臨床試驗(yàn)中顯示出良好的安全性和有效性；中國(guó)的Zhang等利用脂質(zhì)納米顆粒遞送小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA），靶向抑制肝癌細(xì)胞中的關(guān)鍵致癌基因，顯著抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。聚合物納米顆粒（polymericnanoparticles，PNPs）是另一類重要的納米基因載體。它通常由合成聚合物或天然聚合物通過(guò)化學(xué)交聯(lián)、乳化、自組裝等方法制備而成。聚合物納米顆粒具有結(jié)構(gòu)可設(shè)計(jì)性強(qiáng)、載藥量高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠通過(guò)表面修飾實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向遞送。常見(jiàn)的用于制備聚合物納米顆粒的材料包括聚乳酸-羥基乙酸共聚物（polylactic-co-glycolicacid，PLGA）、聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）、殼聚糖（chitosan）等。例如，美國(guó)的Kim等利用PLGA納米顆粒包裹質(zhì)粒DNA，通過(guò)表面修飾靶向配體，實(shí)現(xiàn)了對(duì)乳腺癌細(xì)胞的特異性基因遞送和治療；中國(guó)的Liu等制備了一種基于殼聚糖的納米顆粒，將其與小環(huán)DNA結(jié)合，用于治療肺癌小鼠模型，結(jié)果顯示該納米復(fù)合物能夠有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，提高小鼠的生存率。無(wú)機(jī)納米顆粒（inorganicnanoparticles，INPs）由于其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，如磁性、熒光性、導(dǎo)電性等，在基因遞送領(lǐng)域也展現(xiàn)出了巨大的潛力。常見(jiàn)的無(wú)機(jī)納米顆粒包括磁性納米顆粒、量子點(diǎn)、二氧化硅納米顆粒等。無(wú)機(jī)納米顆粒能夠通過(guò)外部磁場(chǎng)、光熱效應(yīng)、熒光成像等手段實(shí)現(xiàn)對(duì)基因遞送過(guò)程的監(jiān)測(cè)和調(diào)控，提高基因治療的精準(zhǔn)性。例如，美國(guó)的Wang等利用磁性納米顆粒負(fù)載質(zhì)粒DNA，在外部磁場(chǎng)的引導(dǎo)下將基因遞送至腫瘤部位，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向治療；中國(guó)的Li等制備了一種基于二氧化硅納米顆粒的基因載體，通過(guò)表面修飾熒光分子，實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因遞送過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。1.2.3傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒在腫瘤基因治療中的研究現(xiàn)狀傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒作為一種新型的腫瘤基因治療策略，近年來(lái)受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。目前，該領(lǐng)域的研究主要集中在靶向納米顆粒的設(shè)計(jì)與制備、腫瘤靶向機(jī)制以及體內(nèi)外抗腫瘤療效等方面。在靶向納米顆粒的設(shè)計(jì)與制備方面，研究人員通常根據(jù)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性和納米顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)，選擇合適的納米材料和靶向配體，通過(guò)物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)等方法將小環(huán)DNA負(fù)載到納米顆粒表面，并對(duì)納米顆粒進(jìn)行表面修飾，以提高其穩(wěn)定性、生物相容性和靶向性。例如，美國(guó)的Duan等利用脂質(zhì)納米顆粒包裹小環(huán)DNA，通過(guò)表面修飾葉酸分子，制備了一種具有葉酸靶向性的納米復(fù)合物，該復(fù)合物能夠特異性地結(jié)合到高表達(dá)葉酸受體的腫瘤細(xì)胞表面，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向基因遞送；中國(guó)的Zhao等制備了一種基于聚多巴胺納米顆粒的基因載體，將小環(huán)DNA通過(guò)π-π堆積作用負(fù)載到納米顆粒表面，并通過(guò)表面修飾透明質(zhì)酸分子，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)靶向和被動(dòng)靶向雙重遞送。在腫瘤靶向機(jī)制方面，傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒主要通過(guò)主動(dòng)靶向和被動(dòng)靶向兩種機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性遞送。主動(dòng)靶向機(jī)制是指通過(guò)在納米顆粒表面修飾靶向配體，如抗體、肽段、核酸適配體、小分子等，使其能夠與腫瘤細(xì)胞表面特異性受體或抗原進(jìn)行特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)識(shí)別和靶向運(yùn)輸。例如，美國(guó)的Shao等利用抗體修飾的納米顆粒遞送小環(huán)DNA，該抗體能夠特異性地識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR），從而實(shí)現(xiàn)對(duì)EGFR高表達(dá)腫瘤細(xì)胞的靶向基因治療；中國(guó)的Chen等制備了一種基于核酸適配體修飾的納米顆粒，該核酸適配體能夠特異性地結(jié)合到前列腺癌細(xì)胞表面的前列腺特異性膜抗原（prostate-specificmembraneantigen，PSMA），實(shí)現(xiàn)了對(duì)前列腺癌細(xì)胞的靶向基因遞送。被動(dòng)靶向機(jī)制則是利用腫瘤組織的生理病理特點(diǎn)，如增強(qiáng)滲透和滯留（enhancedpermeabilityandretention，EPR）效應(yīng)，使納米顆粒能夠被動(dòng)地在腫瘤組織中富集。腫瘤組織由于新生血管豐富、血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙較大以及淋巴回流系統(tǒng)不完善等原因，使得納米顆粒能夠更容易地從血液循環(huán)中滲漏到腫瘤組織中，并在腫瘤組織中長(zhǎng)時(shí)間滯留。例如，美國(guó)的Fang等利用納米顆粒的EPR效應(yīng)，將小環(huán)DNA遞送至腫瘤組織，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的有效基因治療；中國(guó)的Wang等制備了一種具有良好EPR效應(yīng)的納米顆粒，將其與小環(huán)DNA結(jié)合，用于治療乳腺癌小鼠模型，結(jié)果顯示該納米復(fù)合物能夠在腫瘤組織中顯著富集，有效抑制腫瘤生長(zhǎng)。在體內(nèi)外抗腫瘤療效方面，眾多研究表明，傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒能夠顯著提高小環(huán)DNA的腫瘤遞送效率和細(xì)胞攝取效率，增強(qiáng)其抗腫瘤效果。例如，美國(guó)的Hu等在小鼠黑色素瘤模型中，將傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒與傳統(tǒng)化療藥物進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示靶向納米顆粒組的腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，小鼠的生存期顯著延長(zhǎng)，且毒副作用明顯降低；中國(guó)的Liu等在肝癌細(xì)胞系和裸鼠肝癌模型中，驗(yàn)證了傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒的抗腫瘤療效，結(jié)果表明該納米復(fù)合物能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的安全性。盡管傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒在腫瘤基因治療中取得了一定的研究進(jìn)展，但目前仍存在一些問(wèn)題和挑戰(zhàn)有待解決。例如，納米顆粒的制備工藝尚不成熟，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；納米顆粒在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)性質(zhì)仍不完全清楚，其長(zhǎng)期安全性和生物相容性有待進(jìn)一步評(píng)估；腫瘤靶向機(jī)制的研究還不夠深入，如何提高納米顆粒的靶向特異性和遞送效率仍是亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。此外，傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒從實(shí)驗(yàn)室研究到臨床應(yīng)用還需要克服諸多障礙，如臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)、監(jiān)管審批等。因此，未來(lái)需要進(jìn)一步加強(qiáng)相關(guān)基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究，不斷優(yōu)化靶向納米顆粒的設(shè)計(jì)與制備工藝，深入研究其腫瘤靶向機(jī)制和體內(nèi)外生物學(xué)效應(yīng)，為傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒在腫瘤基因治療中的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。1.3研究?jī)?nèi)容與方法1.3.1研究?jī)?nèi)容本研究圍繞傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒在腫瘤基因治療中的應(yīng)用展開(kāi)，具體研究?jī)?nèi)容如下：小環(huán)DNA的制備與優(yōu)化：采用細(xì)菌體內(nèi)重組系統(tǒng)或體外重組技術(shù)制備小環(huán)DNA，對(duì)制備過(guò)程中的關(guān)鍵參數(shù)，如重組酶的表達(dá)水平、作用時(shí)間、限制性內(nèi)切酶和連接酶的用量等進(jìn)行優(yōu)化，提高小環(huán)DNA的制備效率和質(zhì)量，降低雜質(zhì)污染。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、高效液相色譜（HPLC）、質(zhì)譜（MS）等技術(shù)對(duì)制備得到的小環(huán)DNA進(jìn)行純度、結(jié)構(gòu)和完整性鑒定。靶向納米顆粒的設(shè)計(jì)與制備：根據(jù)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性和納米顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)，選擇合適的納米材料，如脂質(zhì)、聚合物、無(wú)機(jī)材料等，設(shè)計(jì)并制備具有良好生物相容性、穩(wěn)定性和靶向性的納米顆粒。通過(guò)乳化、自組裝、化學(xué)交聯(lián)等方法將小環(huán)DNA負(fù)載到納米顆粒表面，并對(duì)納米顆粒進(jìn)行表面修飾，如連接靶向配體（抗體、肽段、核酸適配體、小分子等）、聚乙二醇（PEG）化等，以提高其穩(wěn)定性、生物相容性和靶向性。利用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）、透射電子顯微鏡（TEM）、掃描電子顯微鏡（SEM）等技術(shù)對(duì)納米顆粒的粒徑、形態(tài)、表面電位等物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征。靶向納米顆粒的腫瘤靶向機(jī)制研究：通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，深入研究靶向納米顆粒的腫瘤靶向機(jī)制，包括主動(dòng)靶向和被動(dòng)靶向機(jī)制。利用熒光顯微鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)觀察靶向納米顆粒與腫瘤細(xì)胞的相互作用過(guò)程，如納米顆粒的細(xì)胞攝取效率、攝取途徑、在細(xì)胞內(nèi)的分布情況等；通過(guò)體內(nèi)熒光成像、放射性核素標(biāo)記等技術(shù)研究納米顆粒在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布特性，分析其在腫瘤組織中的富集情況和滯留時(shí)間；采用蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）等技術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞表面受體或抗原的表達(dá)水平，以及納米顆粒與受體或抗原結(jié)合后對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路的影響，揭示靶向納米顆粒的主動(dòng)靶向機(jī)制；通過(guò)研究腫瘤組織的血管結(jié)構(gòu)和通透性、淋巴回流系統(tǒng)等生理病理特點(diǎn)，探討納米顆粒的被動(dòng)靶向機(jī)制，即增強(qiáng)滲透和滯留（EPR）效應(yīng)。傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒的體內(nèi)外抗腫瘤療效評(píng)價(jià)：在體外，采用多種腫瘤細(xì)胞系，如肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、肝癌細(xì)胞系HepG2等，進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（MTT法、CCK-8法）、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)（AnnexinV-FITC/PI雙染法）、細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)（Transwell實(shí)驗(yàn)）等，評(píng)價(jià)傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制、凋亡誘導(dǎo)和遷移侵襲抑制能力；在體內(nèi)，建立小鼠腫瘤模型，如皮下移植瘤模型、原位腫瘤模型等，通過(guò)尾靜脈注射、瘤內(nèi)注射等途徑給予傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況、體積變化、重量變化等，評(píng)價(jià)其體內(nèi)抗腫瘤療效。同時(shí)，對(duì)治療后的小鼠進(jìn)行血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)、組織病理學(xué)分析等，評(píng)估靶向納米顆粒的安全性和毒副作用。傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒的安全性評(píng)價(jià)：通過(guò)體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（MTT法、LDH釋放法）、溶血實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)急性毒性實(shí)驗(yàn)、長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)等，全面評(píng)價(jià)傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒的安全性。檢測(cè)納米顆粒對(duì)正常細(xì)胞系，如人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）、正常人肝細(xì)胞（L02）等的毒性作用；觀察納米顆粒在體內(nèi)的分布、代謝和排泄情況，以及對(duì)重要臟器，如心、肝、脾、肺、腎等的組織病理學(xué)影響；分析納米顆?？赡芤鸬拿庖叻磻?yīng)，如炎癥因子的釋放、免疫細(xì)胞的活化等，為其臨床應(yīng)用提供安全性依據(jù)。1.3.2研究方法本研究綜合運(yùn)用多種研究方法，以確保研究的科學(xué)性和可靠性，具體方法如下：文獻(xiàn)研究法：廣泛查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，包括學(xué)術(shù)期刊論文、學(xué)位論文、專利文獻(xiàn)、研究報(bào)告等，全面了解小環(huán)DNA、納米顆粒作為基因載體以及傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒在腫瘤基因治療中的研究現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢(shì)和存在的問(wèn)題，為研究提供理論基礎(chǔ)和研究思路。對(duì)收集到的文獻(xiàn)進(jìn)行系統(tǒng)梳理和分析，總結(jié)前人的研究成果和經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，明確本研究的切入點(diǎn)和創(chuàng)新點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)分析法：小環(huán)DNA的制備與鑒定實(shí)驗(yàn)：根據(jù)選定的制備方法，進(jìn)行小環(huán)DNA的制備實(shí)驗(yàn)。通過(guò)優(yōu)化制備工藝參數(shù)，提高小環(huán)DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量。利用瓊脂糖凝膠電泳分析小環(huán)DNA的純度和完整性，HPLC測(cè)定其含量，MS確定其結(jié)構(gòu)，確保制備得到的小環(huán)DNA符合實(shí)驗(yàn)要求。靶向納米顆粒的制備與表征實(shí)驗(yàn)：按照設(shè)計(jì)方案，進(jìn)行靶向納米顆粒的制備實(shí)驗(yàn)。通過(guò)調(diào)整納米材料的配方、制備工藝和表面修飾方法，制備出具有良好性能的靶向納米顆粒。運(yùn)用DLS測(cè)量納米顆粒的粒徑和粒徑分布，TEM和SEM觀察其形態(tài)和表面結(jié)構(gòu)，Zeta電位分析儀測(cè)定其表面電位，全面表征靶向納米顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)。腫瘤靶向機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)：進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究靶向納米顆粒的腫瘤靶向機(jī)制。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將靶向納米顆粒與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，利用熒光顯微鏡、CLSM和流式細(xì)胞術(shù)觀察納米顆粒的細(xì)胞攝取和分布情況，采用Westernblot和qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)變化；在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)體內(nèi)熒光成像和放射性核素標(biāo)記技術(shù)，追蹤納米顆粒在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布過(guò)程，分析其在腫瘤組織中的富集機(jī)制。體內(nèi)外抗腫瘤療效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)：在體外，以多種腫瘤細(xì)胞系為研究對(duì)象，進(jìn)行細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)；在體內(nèi)，建立小鼠腫瘤模型，給予靶向納米顆粒治療，定期測(cè)量腫瘤的生長(zhǎng)指標(biāo)，通過(guò)組織病理學(xué)分析觀察腫瘤組織的變化情況，綜合評(píng)價(jià)其體內(nèi)抗腫瘤療效。安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)：開(kāi)展體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)急性毒性、長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒對(duì)正常細(xì)胞和機(jī)體的毒性作用。通過(guò)檢測(cè)血液學(xué)指標(biāo)、肝腎功能指標(biāo)以及組織病理學(xué)檢查，評(píng)估納米顆粒對(duì)重要臟器的影響，全面評(píng)價(jià)其安全性。案例研究法：收集和分析國(guó)內(nèi)外已有的傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒在腫瘤基因治療中的相關(guān)案例，包括臨床前研究和臨床試驗(yàn)案例。對(duì)這些案例進(jìn)行深入剖析，總結(jié)成功經(jīng)驗(yàn)和失敗教訓(xùn)，為本研究提供實(shí)踐參考和借鑒。通過(guò)與本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，驗(yàn)證研究方法的可行性和有效性，進(jìn)一步完善研究方案。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1腫瘤基因治療概述2.1.1腫瘤基因治療的概念與原理腫瘤基因治療是一種新興的治療策略，旨在通過(guò)改變腫瘤細(xì)胞或機(jī)體細(xì)胞的基因物質(zhì)，以達(dá)到治療腫瘤的目的。其核心概念是利用分子生物學(xué)技術(shù)，將特定的基因?qū)氚屑?xì)胞，糾正或調(diào)節(jié)異常的基因表達(dá)，從而干預(yù)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，涉及原癌基因的激活、抑癌基因的失活、DNA修復(fù)基因的缺陷以及細(xì)胞信號(hào)通路的異常調(diào)控等。這些基因?qū)用娴母淖儗?dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖失控、凋亡受阻、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，從而威脅患者的生命健康。腫瘤基因治療正是基于對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制的深入理解，試圖從根源上糾正這些基因異常，為腫瘤治療開(kāi)辟了新的途徑。腫瘤基因治療的原理主要包括以下幾個(gè)方面：一是通過(guò)導(dǎo)入正常的基因來(lái)替代或修復(fù)突變的基因，恢復(fù)細(xì)胞的正常功能。例如，對(duì)于因抑癌基因p53突變而導(dǎo)致的腫瘤，將正常的p53基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，有望重新激活其對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。二是利用基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞中的致病基因進(jìn)行精確編輯，糾正突變位點(diǎn)，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。三是通過(guò)調(diào)控基因的表達(dá)水平，抑制腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，或增強(qiáng)抗腫瘤基因的表達(dá)。例如，采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，設(shè)計(jì)針對(duì)腫瘤相關(guān)基因的小干擾RNA（siRNA），使其特異性地結(jié)合并降解靶基因的mRNA，從而抑制該基因的表達(dá)，阻斷腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)信號(hào)通路。四是通過(guò)免疫基因治療，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。將細(xì)胞因子基因、共刺激分子基因等導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞，促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力。腫瘤基因治療的原理是基于對(duì)腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)，通過(guò)多種基因干預(yù)手段，從不同層面和角度對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向治療，以實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻止腫瘤轉(zhuǎn)移以及增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫能力的目標(biāo)。2.1.2腫瘤基因治療的主要策略基因修正與基因替代：基因修正旨在對(duì)突變的基因進(jìn)行精確修復(fù)，使其恢復(fù)正常的序列和功能。這種策略需要高度精確的基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠在特定的基因組位點(diǎn)進(jìn)行切割，然后利用細(xì)胞自身的修復(fù)機(jī)制，將正確的DNA序列引入并修復(fù)突變位點(diǎn)。然而，目前基因修正技術(shù)在應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)，如脫靶效應(yīng)、修復(fù)效率較低以及潛在的免疫原性等問(wèn)題?；蛱娲鷦t是將正常的基因?qū)爰?xì)胞，以替代缺失或功能異常的基因。例如，對(duì)于某些因抑癌基因缺失而導(dǎo)致的腫瘤，通過(guò)將正常的抑癌基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，有望恢復(fù)其對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。基因替代策略相對(duì)基因修正來(lái)說(shuō)，技術(shù)難度較低，但也存在基因表達(dá)調(diào)控不穩(wěn)定、載體安全性等問(wèn)題。免疫基因治療：免疫基因治療是通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)來(lái)增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。主要方式包括將細(xì)胞因子基因?qū)肽[瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些細(xì)胞因子能夠激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。此外，還可以通過(guò)導(dǎo)入共刺激分子基因，如B7等，增強(qiáng)免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用，提高免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和攻擊效率。免疫基因治療還可以利用腫瘤抗原基因，通過(guò)基因載體將腫瘤抗原導(dǎo)入機(jī)體，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)腫瘤抗原的特異性免疫反應(yīng)，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。免疫基因治療在多種腫瘤的治療中展現(xiàn)出了一定的潛力，但也存在免疫耐受、細(xì)胞因子風(fēng)暴等不良反應(yīng)，需要進(jìn)一步優(yōu)化治療方案。抑癌基因治療：抑癌基因在正常細(xì)胞中發(fā)揮著抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、維持基因組穩(wěn)定性等重要作用。在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，抑癌基因常常發(fā)生突變、缺失或失活，導(dǎo)致其功能喪失。抑癌基因治療的策略就是將正常的抑癌基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，恢復(fù)其抑癌功能。其中，p53基因是研究最為廣泛的抑癌基因之一，它參與調(diào)控細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡等多個(gè)重要的生物學(xué)過(guò)程。將野生型p53基因?qū)雙53突變或缺失的腫瘤細(xì)胞，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。此外，還有Rb基因、PTEN基因等多種抑癌基因也被應(yīng)用于腫瘤基因治療的研究中。然而，抑癌基因治療面臨著基因遞送效率低、腫瘤細(xì)胞對(duì)抑癌基因的抵抗等問(wèn)題，需要進(jìn)一步探索有效的解決方法。自殺基因治療：自殺基因治療是將某些病毒或細(xì)菌的基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，這些基因編碼的酶能夠?qū)o(wú)毒的前體藥物轉(zhuǎn)化為有毒的藥物，從而特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞。例如，單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因是常用的自殺基因之一，它編碼的胸苷激酶能夠?qū)o(wú)毒性的丙氧鳥(niǎo)苷（GCV）磷酸化為具有細(xì)胞毒性的三磷酸丙氧鳥(niǎo)苷，抑制腫瘤細(xì)胞DNA的合成，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。自殺基因治療不僅可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還可以通過(guò)“旁觀者效應(yīng)”，使周圍未轉(zhuǎn)染自殺基因的腫瘤細(xì)胞也受到殺傷。然而，自殺基因治療也存在一些局限性，如前體藥物的毒性、腫瘤細(xì)胞對(duì)前體藥物的攝取和轉(zhuǎn)化效率較低等問(wèn)題，需要進(jìn)一步優(yōu)化治療方案。RNA干擾技術(shù)：RNA干擾（RNAi）是一種由雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，能夠特異性地降解靶基因的mRNA，從而抑制基因的表達(dá)。在腫瘤基因治療中，RNAi技術(shù)可以用于抑制腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，如癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等。通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)這些基因的小干擾RNA（siRNA）或短發(fā)夾RNA（shRNA），并利用合適的載體將其遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)腫瘤相關(guān)基因的有效沉默，阻斷腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移信號(hào)通路。RNAi技術(shù)具有高度的特異性和高效性，但也面臨著siRNA的穩(wěn)定性差、遞送效率低、潛在的脫靶效應(yīng)等問(wèn)題，需要進(jìn)一步研究解決。2.1.3腫瘤基因治療的發(fā)展歷程與現(xiàn)狀腫瘤基因治療的發(fā)展歷程可以追溯到20世紀(jì)70年代，當(dāng)時(shí)科學(xué)家們開(kāi)始從理論上設(shè)想利用基因技術(shù)治療腫瘤。1972年，F(xiàn)riedmann和Roblin首次提出了基因治療的概念，并指出可以通過(guò)將正?；?qū)爰?xì)胞來(lái)糾正遺傳缺陷。然而，由于當(dāng)時(shí)基因技術(shù)的限制，這一設(shè)想在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)僅停留在理論階段。直到1989年，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）的Rosenberg等人首次進(jìn)行了人類基因治療臨床試驗(yàn)，他們將標(biāo)記基因?qū)肽[瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL），然后回輸?shù)桨┌Y患者體內(nèi)，盡管此次試驗(yàn)主要是為了驗(yàn)證基因治療的安全性，但它標(biāo)志著腫瘤基因治療從理論走向了臨床實(shí)踐。1990年，NIH批準(zhǔn)了首例真正意義上的基因治療臨床試驗(yàn)，對(duì)一名患有腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥的4歲女孩進(jìn)行了基因治療，通過(guò)將正常的ADA基因?qū)牖颊叩牧馨图?xì)胞，成功改善了患者的免疫功能。這一里程碑事件極大地推動(dòng)了腫瘤基因治療的發(fā)展，此后，越來(lái)越多的腫瘤基因治療臨床試驗(yàn)相繼開(kāi)展。20世紀(jì)90年代至21世紀(jì)初，腫瘤基因治療進(jìn)入了快速發(fā)展階段，各種新的治療策略和技術(shù)不斷涌現(xiàn)。然而，在這一過(guò)程中也遭遇了一些挫折。1999年，一名患有鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶（OTC）缺乏癥的18歲患者在接受基因治療臨床試驗(yàn)時(shí)，因?qū)d體產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫反應(yīng)而死亡，這一事件給腫瘤基因治療領(lǐng)域帶來(lái)了沉重的打擊，引發(fā)了人們對(duì)基因治療安全性的廣泛關(guān)注。此后，腫瘤基因治療的研究和臨床試驗(yàn)進(jìn)入了一個(gè)相對(duì)謹(jǐn)慎的階段，科學(xué)家們開(kāi)始更加注重基因治療的安全性和有效性研究，不斷優(yōu)化治療方案和載體系統(tǒng)。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)、生物化學(xué)、納米技術(shù)等基礎(chǔ)學(xué)科的飛速發(fā)展，腫瘤基因治療取得了一系列重要突破，重新成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在臨床應(yīng)用方面，目前已有一些腫瘤基因治療產(chǎn)品獲批上市。例如，2003年，中國(guó)批準(zhǔn)了世界上首個(gè)基因治療藥物——重組人p53腺病毒注射液（商品名“今又生”），用于治療頭頸部腫瘤。2017年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)了兩種嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）療法，Kymriah和Yescarta，用于治療某些類型的淋巴瘤和白血病。這標(biāo)志著腫瘤基因治療在血液系統(tǒng)腫瘤的治療中取得了重大突破，為癌癥患者帶來(lái)了新的治療選擇。然而，盡管腫瘤基因治療取得了一定的進(jìn)展，但目前仍面臨著諸多挑戰(zhàn)。首先，基因遞送系統(tǒng)仍然是腫瘤基因治療的關(guān)鍵瓶頸之一。如何將治療基因高效、安全地遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的基因治療，仍然是亟待解決的問(wèn)題?，F(xiàn)有的基因載體，包括病毒載體和非病毒載體，都存在各自的局限性，如病毒載體的免疫原性、潛在的致癌性，非病毒載體的遞送效率低、穩(wěn)定性差等。其次，腫瘤的異質(zhì)性也是影響腫瘤基因治療效果的重要因素。不同患者的腫瘤細(xì)胞以及同一腫瘤內(nèi)部的不同細(xì)胞之間，在基因表達(dá)、生物學(xué)行為等方面存在很大差異，這使得單一的基因治療方案難以對(duì)所有腫瘤細(xì)胞都產(chǎn)生有效的治療作用。此外，腫瘤基因治療的長(zhǎng)期安全性和有效性也需要進(jìn)一步評(píng)估，基因治療可能引發(fā)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，如基因插入突變、免疫反應(yīng)等，仍需要深入研究。未來(lái)，腫瘤基因治療的發(fā)展方向主要包括以下幾個(gè)方面：一是開(kāi)發(fā)更加高效、安全的基因遞送系統(tǒng)，如新型納米載體、智能靶向載體等，以提高基因治療的效果和安全性。二是深入研究腫瘤的異質(zhì)性，開(kāi)展個(gè)性化的腫瘤基因治療，根據(jù)患者的基因特征和腫瘤生物學(xué)特性，制定精準(zhǔn)的治療方案。三是加強(qiáng)聯(lián)合治療策略的研究，將腫瘤基因治療與傳統(tǒng)治療方法，如手術(shù)、化療、放療、免疫治療等相結(jié)合，發(fā)揮協(xié)同作用，提高腫瘤的綜合治療效果。四是進(jìn)一步探索新的腫瘤基因治療靶點(diǎn)和策略，如基于基因編輯技術(shù)的治療方法、腫瘤免疫微環(huán)境調(diào)控的基因治療等，為腫瘤治療提供更多的選擇。腫瘤基因治療作為一種極具潛力的腫瘤治療策略，雖然在發(fā)展過(guò)程中面臨諸多挑戰(zhàn)，但隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和研究的深入，有望為腫瘤患者帶來(lái)更多的希望和更好的治療效果。2.2小環(huán)DNA的特性與功能2.2.1小環(huán)DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)小環(huán)DNA是一種超螺旋環(huán)狀DNA分子，其結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特性。與傳統(tǒng)的質(zhì)粒DNA不同，小環(huán)DNA通過(guò)位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)去除了細(xì)菌骨架序列，僅保留了目的基因表達(dá)盒和最小的復(fù)制起始位點(diǎn)。這種結(jié)構(gòu)使得小環(huán)DNA的相對(duì)分子質(zhì)量顯著減小，通常比原始質(zhì)粒DNA小1-3kb。較小的相對(duì)分子質(zhì)量賦予了小環(huán)DNA一些優(yōu)勢(shì)，例如更容易穿透細(xì)胞膜，提高細(xì)胞攝取效率。同時(shí)，小環(huán)DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)使其在溶液中具有較高的穩(wěn)定性，能夠抵抗核酸酶的降解，有利于在體內(nèi)外環(huán)境中保持其完整性和功能。小環(huán)DNA的無(wú)細(xì)菌骨架序列結(jié)構(gòu)還帶來(lái)了低免疫原性的特點(diǎn)。細(xì)菌骨架序列中含有一些能夠激活機(jī)體免疫系統(tǒng)的元件，如CpG基序等，當(dāng)質(zhì)粒DNA進(jìn)入體內(nèi)時(shí)，這些元件會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)質(zhì)粒DNA產(chǎn)生排斥。而小環(huán)DNA去除了這些免疫刺激元件，大大降低了免疫原性，減少了免疫相關(guān)的不良反應(yīng)，提高了基因治療的安全性。此外，小環(huán)DNA的結(jié)構(gòu)緊湊，目的基因表達(dá)盒周圍的非編碼序列較少，這有助于提高目的基因的表達(dá)效率。研究表明，小環(huán)DNA在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程更為高效，能夠持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)目的基因，為腫瘤基因治療提供了更有力的保障。2.2.2小環(huán)DNA在腫瘤中的作用機(jī)制小環(huán)DNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其作用機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面：首先，小環(huán)DNA可以攜帶致癌基因，促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。一些研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中存在著含有致癌基因的小環(huán)DNA，如MYC、MDM2等基因，這些基因通過(guò)小環(huán)DNA的擴(kuò)增和高表達(dá)，能夠激活癌細(xì)胞內(nèi)的增殖信號(hào)通路，促進(jìn)癌細(xì)胞的無(wú)限增殖。同時(shí)，小環(huán)DNA攜帶的致癌基因還可以增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。例如，在乳腺癌細(xì)胞中，含有HER2基因的小環(huán)DNA的高表達(dá)與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后密切相關(guān)。其次，小環(huán)DNA在腫瘤細(xì)胞中的遺傳方式與傳統(tǒng)染色體不同，這可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的耐藥性和惡性程度增加。在細(xì)胞分裂過(guò)程中，小環(huán)DNA不遵循孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，它們可以隨機(jī)分配到子代細(xì)胞中，并且在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)也不穩(wěn)定。這種遺傳方式使得腫瘤細(xì)胞在接受治療時(shí)，部分細(xì)胞能夠通過(guò)獲得更多的小環(huán)DNA拷貝來(lái)逃避藥物的殺傷作用，從而產(chǎn)生耐藥性。此外，小環(huán)DNA的隨機(jī)分配還會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的異質(zhì)性增加，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的進(jìn)化和惡化。例如，在肺癌細(xì)胞中，小環(huán)DNA攜帶的EGFR基因的擴(kuò)增和隨機(jī)分配，使得部分癌細(xì)胞對(duì)EGFR靶向藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療失敗。最后，小環(huán)DNA還可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境來(lái)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等組成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移起著重要的調(diào)控作用。小環(huán)DNA可以通過(guò)表達(dá)一些細(xì)胞因子、趨化因子等，改變腫瘤微環(huán)境的組成和功能，促進(jìn)腫瘤血管生成、免疫逃逸等過(guò)程。例如，小環(huán)DNA表達(dá)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）可以促進(jìn)腫瘤血管的生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，支持腫瘤的生長(zhǎng)；小環(huán)DNA表達(dá)的免疫抑制因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）等，可以抑制免疫細(xì)胞的活性，幫助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。2.2.3小環(huán)DNA用于腫瘤基因治療的優(yōu)勢(shì)小環(huán)DNA在腫瘤基因治療中具有諸多優(yōu)勢(shì)，使其成為一種極具潛力的基因載體。首先，小環(huán)DNA的免疫原性低，這是其相較于傳統(tǒng)質(zhì)粒DNA的重要優(yōu)勢(shì)之一。如前所述，小環(huán)DNA去除了細(xì)菌骨架序列中的免疫刺激元件，在體內(nèi)不易引發(fā)免疫反應(yīng)。這使得小環(huán)DNA能夠更安全地遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，減少了因免疫排斥導(dǎo)致的治療失敗風(fēng)險(xiǎn)。低免疫原性還可以降低機(jī)體對(duì)基因治療載體的清除速度，延長(zhǎng)小環(huán)DNA在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，提高其到達(dá)腫瘤組織的機(jī)會(huì)。研究表明，將小環(huán)DNA和質(zhì)粒DNA分別導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，小環(huán)DNA引發(fā)的免疫反應(yīng)明顯較弱，且在體內(nèi)的持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。其次，小環(huán)DNA具有較高的轉(zhuǎn)染效率。由于其相對(duì)分子質(zhì)量小、結(jié)構(gòu)緊湊，小環(huán)DNA更容易穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。在細(xì)胞攝取過(guò)程中，小環(huán)DNA能夠更有效地逃避細(xì)胞內(nèi)的核酸酶降解，提高了其在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性和可用性。此外，小環(huán)DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)使其在與轉(zhuǎn)染試劑結(jié)合時(shí)具有更好的親和力，能夠更高效地被包裹和遞送。多項(xiàng)研究表明，在相同的轉(zhuǎn)染條件下，小環(huán)DNA的轉(zhuǎn)染效率明顯高于質(zhì)粒DNA。例如，在肝癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，小環(huán)DNA的轉(zhuǎn)染效率比質(zhì)粒DNA提高了2-3倍。再者，小環(huán)DNA能夠?qū)崿F(xiàn)基因的持久表達(dá)。其緊湊的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定的超螺旋狀態(tài)，使得目的基因表達(dá)盒在細(xì)胞內(nèi)不易受到外界因素的干擾，能夠持續(xù)穩(wěn)定地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。小環(huán)DNA在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和維持機(jī)制相對(duì)穩(wěn)定，保證了目的基因的長(zhǎng)期表達(dá)。這對(duì)于腫瘤基因治療尤為重要，因?yàn)樵S多腫瘤治療基因需要持續(xù)發(fā)揮作用，才能有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。例如，將攜帶抑癌基因p53的小環(huán)DNA導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞后，能夠在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持p53基因的高表達(dá)，持續(xù)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長(zhǎng)。小環(huán)DNA在腫瘤基因治療中能夠提高治療療效、降低治療風(fēng)險(xiǎn)。其低免疫原性、高轉(zhuǎn)染效率和持久的基因表達(dá)特性，使得小環(huán)DNA能夠更有效地將治療基因遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，并持續(xù)發(fā)揮治療作用。與傳統(tǒng)的基因治療載體相比，小環(huán)DNA可以減少治療過(guò)程中的不良反應(yīng)，提高患者的耐受性和依從性。小環(huán)DNA還可以與其他治療方法，如化療、放療、免疫治療等相結(jié)合，發(fā)揮協(xié)同作用，進(jìn)一步提高腫瘤的治療效果。例如，將小環(huán)DNA介導(dǎo)的基因治療與化療聯(lián)合應(yīng)用于乳腺癌小鼠模型，結(jié)果顯示聯(lián)合治療組的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果明顯優(yōu)于單一治療組，小鼠的生存期顯著延長(zhǎng)。2.3靶向納米顆粒的概述2.3.1靶向納米顆粒的定義與分類靶向納米顆粒是指通過(guò)特殊設(shè)計(jì)和制備，能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到靶組織或靶細(xì)胞表面的納米級(jí)微粒。其粒徑通常在1-1000nm之間，這一尺度賦予了它們獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)特性。由于粒徑小，靶向納米顆粒具有較大的比表面積，能夠攜帶更多的藥物或生物活性分子，并且能夠更容易地穿透生物膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。靶向納米顆?？梢酝ㄟ^(guò)表面修飾，連接各種靶向配體，如抗體、肽段、核酸適配體、小分子等，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定靶標(biāo)的精準(zhǔn)識(shí)別和結(jié)合。這種靶向性使得納米顆粒能夠在體內(nèi)準(zhǔn)確地富集到腫瘤組織或病變部位，提高藥物的療效，減少對(duì)正常組織的毒副作用。根據(jù)組成材料的不同，靶向納米顆?？梢苑譃榫酆衔锛{米顆粒、脂質(zhì)納米顆粒、無(wú)機(jī)納米顆粒等。聚合物納米顆粒是由合成聚合物或天然聚合物通過(guò)化學(xué)交聯(lián)、乳化、自組裝等方法制備而成。常見(jiàn)的合成聚合物材料包括聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）、聚乙二醇（PEG）、聚賴氨酸（PLL）等，天然聚合物材料有殼聚糖、明膠、海藻酸鈉等。聚合物納米顆粒具有結(jié)構(gòu)可設(shè)計(jì)性強(qiáng)、載藥量高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠通過(guò)表面修飾實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向遞送。脂質(zhì)納米顆粒主要由磷脂、膽固醇、陽(yáng)離子脂質(zhì)和聚乙二醇化脂質(zhì)等成分組成，通過(guò)自組裝形成納米級(jí)別的顆粒結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)納米顆粒具有良好的生物相容性、可生物降解性和低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效地包裹和保護(hù)核酸藥物，促進(jìn)其細(xì)胞攝取和內(nèi)體逃逸。無(wú)機(jī)納米顆粒則是由無(wú)機(jī)材料制備而成，常見(jiàn)的無(wú)機(jī)納米顆粒包括磁性納米顆粒、量子點(diǎn)、二氧化硅納米顆粒、金納米顆粒等。無(wú)機(jī)納米顆粒具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，如磁性、熒光性、導(dǎo)電性等，能夠通過(guò)外部磁場(chǎng)、光熱效應(yīng)、熒光成像等手段實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物遞送過(guò)程的監(jiān)測(cè)和調(diào)控，提高藥物治療的精準(zhǔn)性。按照靶向機(jī)制的不同，靶向納米顆粒又可分為被動(dòng)靶向納米顆粒、主動(dòng)靶向納米顆粒和物理化學(xué)靶向納米顆粒。被動(dòng)靶向納米顆粒主要利用腫瘤組織的生理病理特點(diǎn)，如增強(qiáng)滲透和滯留（EPR）效應(yīng)，使納米顆粒能夠被動(dòng)地在腫瘤組織中富集。腫瘤組織由于新生血管豐富、血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙較大以及淋巴回流系統(tǒng)不完善等原因，使得納米顆粒能夠更容易地從血液循環(huán)中滲漏到腫瘤組織中，并在腫瘤組織中長(zhǎng)時(shí)間滯留。主動(dòng)靶向納米顆粒則是通過(guò)在納米顆粒表面修飾靶向配體，使其能夠與腫瘤細(xì)胞表面特異性受體或抗原進(jìn)行特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)識(shí)別和靶向運(yùn)輸。物理化學(xué)靶向納米顆粒是利用物理或化學(xué)因素，如溫度、pH值、磁場(chǎng)、電場(chǎng)等，實(shí)現(xiàn)對(duì)納米顆粒的靶向遞送。例如，溫度敏感型納米顆粒在溫度升高時(shí)，其結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，從而釋放藥物；pH敏感型納米顆粒在酸性環(huán)境下，如腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)體的pH值較低，會(huì)發(fā)生降解或結(jié)構(gòu)改變，實(shí)現(xiàn)藥物的釋放。2.3.2靶向納米顆粒的制備方法靶向納米顆粒的制備方法多種多樣，主要包括物理方法、化學(xué)方法和生物方法，每種方法都有其獨(dú)特的原理、優(yōu)缺點(diǎn)以及對(duì)納米顆粒性質(zhì)的影響。物理方法制備靶向納米顆粒主要基于物理過(guò)程，如機(jī)械粉碎、超聲破碎、噴霧干燥、溶劑蒸發(fā)等。機(jī)械粉碎是通過(guò)機(jī)械力將較大的顆粒粉碎成納米級(jí)別的顆粒，常用的設(shè)備有球磨機(jī)、行星式球磨機(jī)等。這種方法操作簡(jiǎn)單，可大規(guī)模制備納米顆粒，但顆粒的粒徑分布較寬，形狀不規(guī)則，且在粉碎過(guò)程中可能會(huì)引入雜質(zhì)。超聲破碎則是利用超聲波的空化作用，使液體中的分子產(chǎn)生劇烈振動(dòng)和沖擊，從而將顆粒破碎成納米級(jí)。該方法制備的納米顆粒粒徑較小，分布相對(duì)較窄，但能耗較高，產(chǎn)量較低。噴霧干燥是將含有納米顆粒的溶液通過(guò)噴霧器噴入熱空氣流中，使溶劑迅速蒸發(fā)，從而得到干燥的納米顆粒。這種方法制備速度快，可連續(xù)生產(chǎn)，但顆粒的形態(tài)和粒徑受噴霧條件影響較大。溶劑蒸發(fā)法是將納米顆粒溶解在揮發(fā)性溶劑中，然后通過(guò)加熱或減壓等方式使溶劑蒸發(fā)，納米顆粒則逐漸聚集形成。該方法制備的納米顆粒純度較高，粒徑可控，但制備過(guò)程較為復(fù)雜，成本較高。物理方法制備的靶向納米顆粒通常具有較好的物理穩(wěn)定性，但表面活性較低，不利于進(jìn)一步的表面修飾和功能化?；瘜W(xué)方法是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)來(lái)制備靶向納米顆粒，常見(jiàn)的化學(xué)方法有乳化聚合法、沉淀法、溶膠-凝膠法、化學(xué)交聯(lián)法等。乳化聚合法是在乳化劑的作用下，將單體和引發(fā)劑分散在水相中形成乳液，然后通過(guò)引發(fā)劑引發(fā)單體聚合，形成納米級(jí)別的聚合物顆粒。這種方法可以精確控制納米顆粒的粒徑和結(jié)構(gòu)，表面活性較高，便于進(jìn)行表面修飾，但聚合過(guò)程中可能會(huì)殘留單體和引發(fā)劑，對(duì)納米顆粒的生物相容性產(chǎn)生影響。沉淀法是通過(guò)向溶液中加入沉淀劑，使目標(biāo)物質(zhì)從溶液中沉淀出來(lái)，形成納米顆粒。該方法操作簡(jiǎn)單，成本較低，但顆粒的粒徑分布較寬，且可能會(huì)引入雜質(zhì)。溶膠-凝膠法是將金屬醇鹽或無(wú)機(jī)鹽在有機(jī)溶劑中水解和縮聚，形成溶膠，然后通過(guò)干燥和熱處理等過(guò)程轉(zhuǎn)化為凝膠，最終得到納米顆粒。這種方法制備的納米顆粒純度高，粒徑均勻，可制備各種形狀的納米顆粒，但制備過(guò)程較為復(fù)雜，周期較長(zhǎng)?；瘜W(xué)交聯(lián)法是利用交聯(lián)劑將聚合物分子鏈之間進(jìn)行交聯(lián)，形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的納米顆粒。該方法可以提高納米顆粒的穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度，但交聯(lián)過(guò)程可能會(huì)影響納米顆粒的生物降解性和藥物釋放性能?；瘜W(xué)方法制備的靶向納米顆粒表面性質(zhì)豐富，可通過(guò)選擇不同的反應(yīng)條件和原料，實(shí)現(xiàn)對(duì)納米顆粒結(jié)構(gòu)和性能的精確調(diào)控。生物方法制備靶向納米顆粒是利用生物分子或生物體的自組裝能力來(lái)構(gòu)建納米結(jié)構(gòu)。例如，利用蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的自組裝特性，制備具有特定結(jié)構(gòu)和功能的納米顆粒。還可以利用微生物，如細(xì)菌、病毒等，作為模板或載體來(lái)制備納米顆粒。以病毒為例，某些病毒的外殼蛋白可以自組裝形成納米級(jí)別的顆粒，通過(guò)對(duì)病毒進(jìn)行基因工程改造，可以使其攜帶藥物或靶向配體，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向遞送。生物方法制備的靶向納米顆粒具有良好的生物相容性和生物可降解性，且能夠利用生物分子的特異性識(shí)別能力實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向。但生物方法制備過(guò)程較為復(fù)雜，產(chǎn)量較低，成本較高，且可能存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)。2.3.3靶向納米顆粒在藥物傳遞中的作用靶向納米顆粒作為一種新型的藥物載體，在藥物傳遞領(lǐng)域發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：首先，靶向納米顆粒能夠提高藥物的穩(wěn)定性。許多藥物在體內(nèi)環(huán)境中容易受到酶的降解、氧化、水解等因素的影響，導(dǎo)致藥物活性降低或失活。將藥物包裹在納米顆粒內(nèi)部或連接在納米顆粒表面，可以有效地保護(hù)藥物免受外界環(huán)境的干擾，提高藥物的穩(wěn)定性。例如，脂質(zhì)納米顆粒能夠?qū)⑹杷运幬锇谄鋬?nèi)部的脂質(zhì)核心中，避免藥物與水相接觸，從而防止藥物的水解和氧化；聚合物納米顆?？梢酝ㄟ^(guò)其高分子鏈的保護(hù)作用，減少藥物與酶的接觸，降低藥物的降解速度。其次，靶向納米顆粒能夠?qū)崿F(xiàn)藥物的靶向遞送。如前所述，靶向納米顆?？梢酝ㄟ^(guò)表面修飾的靶向配體與腫瘤細(xì)胞表面特異性受體或抗原進(jìn)行特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)靶向運(yùn)輸。還可以利用腫瘤組織的EPR效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向遞送。這種靶向遞送特性使得藥物能夠準(zhǔn)確地富集到腫瘤組織或病變部位，提高藥物在靶部位的濃度，增強(qiáng)藥物的治療效果。同時(shí)，減少了藥物在正常組織中的分布，降低了藥物對(duì)正常組織的毒副作用。例如，將攜帶化療藥物的納米顆粒表面修飾上針對(duì)腫瘤細(xì)胞表面特定受體的抗體，納米顆?？梢蕴禺愋缘刈R(shí)別并結(jié)合到腫瘤細(xì)胞上，將化療藥物高效地遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，從而提高化療的療效，減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷。再者，靶向納米顆粒能夠?qū)崿F(xiàn)藥物的控制釋放。通過(guò)合理設(shè)計(jì)納米顆粒的結(jié)構(gòu)和組成，可以實(shí)現(xiàn)藥物的緩慢、持續(xù)釋放，延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間。例如，采用可生物降解的聚合物制備納米顆粒，藥物被包裹在聚合物內(nèi)部，隨著聚合物的緩慢降解，藥物逐漸釋放出來(lái)。還可以利用環(huán)境響應(yīng)性材料制備納米顆粒，如pH敏感型、溫度敏感型材料等，使納米顆粒在特定的環(huán)境條件下，如腫瘤組織的酸性環(huán)境或局部加熱條件下，快速釋放藥物。這種控制釋放特性可以避免藥物的突釋，維持藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定濃度，提高藥物的治療效果和安全性。靶向納米顆粒還能夠增強(qiáng)藥物的療效。納米顆粒的小尺寸效應(yīng)和高比表面積特性，使其能夠增加藥物與細(xì)胞的接觸面積，促進(jìn)藥物的細(xì)胞攝取。一些納米顆粒還具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，如磁性、光熱效應(yīng)等，可以與藥物協(xié)同作用，增強(qiáng)藥物的治療效果。例如，磁性納米顆粒在外部磁場(chǎng)的作用下，可以將藥物定向引導(dǎo)至腫瘤部位，同時(shí)利用磁性納米顆粒的磁熱效應(yīng)，在局部產(chǎn)生熱量，增強(qiáng)化療藥物的細(xì)胞毒性，提高腫瘤的治療效果。此外，靶向納米顆粒還可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，進(jìn)一步提高藥物的療效。三、傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒作用機(jī)制3.1靶向納米顆粒與小環(huán)DNA的結(jié)合方式傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒在腫瘤基因治療中發(fā)揮作用的首要前提是實(shí)現(xiàn)靶向納米顆粒與小環(huán)DNA的有效結(jié)合。這種結(jié)合方式對(duì)于納米顆粒能否成功負(fù)載小環(huán)DNA，并將其準(zhǔn)確遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)起著關(guān)鍵作用。目前，靶向納米顆粒與小環(huán)DNA的結(jié)合方式主要包括靜電相互作用、化學(xué)鍵合以及其他相互作用，每種結(jié)合方式都具有獨(dú)特的特點(diǎn)和作用機(jī)制。3.1.1靜電相互作用靜電相互作用是靶向納米顆粒與小環(huán)DNA結(jié)合的一種常見(jiàn)方式。納米顆粒表面通常帶有電荷，這是由于其組成材料和制備過(guò)程所決定的。例如，陽(yáng)離子脂質(zhì)納米顆粒表面帶有正電荷，這是因?yàn)槠浜嘘?yáng)離子脂質(zhì)成分，如二油?；谆然@（DOTAP）等，這些陽(yáng)離子脂質(zhì)在溶液中能夠電離出正離子，使納米顆粒表面呈現(xiàn)正電性。而小環(huán)DNA分子由于其磷酸骨架帶負(fù)電荷，在溶液中也帶有負(fù)電荷。根據(jù)靜電引力原理，帶正電荷的納米顆粒與帶負(fù)電荷的小環(huán)DNA之間會(huì)產(chǎn)生靜電吸引作用，從而促使兩者結(jié)合。納米顆粒表面電荷的密度以及小環(huán)DNA的電荷分布等因素對(duì)靜電相互作用有著重要影響。納米顆粒表面電荷密度越高，其與小環(huán)DNA之間的靜電引力就越強(qiáng)，結(jié)合也就越緊密。研究表明，通過(guò)調(diào)整陽(yáng)離子脂質(zhì)納米顆粒中陽(yáng)離子脂質(zhì)的比例，可以改變納米顆粒表面的電荷密度，進(jìn)而影響其與小環(huán)DNA的結(jié)合能力。當(dāng)陽(yáng)離子脂質(zhì)的比例增加時(shí)，納米顆粒表面電荷密度增大，與小環(huán)DNA的結(jié)合效率顯著提高。小環(huán)DNA的電荷分布也會(huì)影響靜電相互作用。如果小環(huán)DNA分子的某些區(qū)域電荷分布較為集中，那么這些區(qū)域與納米顆粒表面電荷的相互作用就會(huì)更強(qiáng)，從而影響小環(huán)DNA在納米顆粒表面的結(jié)合位置和取向。靜電相互作用對(duì)納米顆粒-小環(huán)DNA復(fù)合物的穩(wěn)定性也具有重要作用。在生理環(huán)境中，復(fù)合物需要保持一定的穩(wěn)定性，以確保小環(huán)DNA能夠被安全地遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)。靜電相互作用形成的復(fù)合物在一定程度上能夠抵抗外界環(huán)境的干擾，如核酸酶的降解、血液中蛋白質(zhì)的吸附等。然而，靜電相互作用也存在一定的局限性，它相對(duì)較弱，在某些情況下，如高離子強(qiáng)度的溶液中，靜電引力可能會(huì)被削弱，導(dǎo)致復(fù)合物的穩(wěn)定性下降。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，需要綜合考慮各種因素，優(yōu)化納米顆粒與小環(huán)DNA的靜電相互作用，以提高復(fù)合物的穩(wěn)定性和遞送效率。3.1.2化學(xué)鍵合除了靜電相互作用，化學(xué)鍵合也是靶向納米顆粒與小環(huán)DNA結(jié)合的重要方式之一，主要包括共價(jià)鍵和配位鍵等。共價(jià)鍵是一種通過(guò)共用電子對(duì)形成的強(qiáng)相互作用，能夠使納米顆粒與小環(huán)DNA之間形成非常穩(wěn)定的結(jié)合。在制備靶向納米顆粒時(shí)，可以通過(guò)化學(xué)修飾的方法，在納米顆粒表面引入具有反應(yīng)活性的官能團(tuán)，如氨基、羧基、巰基等。同時(shí)，對(duì)小環(huán)DNA進(jìn)行相應(yīng)的修飾，使其含有能夠與納米顆粒表面官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)。例如，利用碳二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）等試劑，可以將納米顆粒表面的羧基與小環(huán)DNA上的氨基通過(guò)酰胺鍵進(jìn)行共價(jià)連接。這種共價(jià)鍵合方式能夠顯著提高納米顆粒與小環(huán)DNA的結(jié)合穩(wěn)定性，有效防止在遞送過(guò)程中小環(huán)DNA從納米顆粒表面脫落。共價(jià)鍵合還可以精確控制小環(huán)DNA在納米顆粒表面的連接位置和數(shù)量，有利于實(shí)現(xiàn)對(duì)納米顆粒-小環(huán)DNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)和性能的精確調(diào)控。配位鍵是由一個(gè)原子提供孤對(duì)電子，另一個(gè)原子提供空軌道而形成的化學(xué)鍵。在靶向納米顆粒與小環(huán)DNA的結(jié)合中，配位鍵也發(fā)揮著重要作用。一些金屬離子，如鐵離子（Fe3?）、銅離子（Cu2?）等，具有空軌道，能夠與納米顆粒表面或小環(huán)DNA上含有孤對(duì)電子的原子，如氮原子、氧原子等形成配位鍵。以二氧化硅納米顆粒為例，其表面含有豐富的羥基，這些羥基可以與金屬離子發(fā)生配位作用。通過(guò)將小環(huán)DNA與含有能與金屬離子配位的配體結(jié)合，然后再與負(fù)載有金屬離子的二氧化硅納米顆粒相互作用，就可以通過(guò)配位鍵實(shí)現(xiàn)小環(huán)DNA與納米顆粒的結(jié)合。配位鍵的形成不僅可以提高納米顆粒與小環(huán)DNA的結(jié)合穩(wěn)定性，還可以通過(guò)調(diào)節(jié)金屬離子的種類和濃度，實(shí)現(xiàn)對(duì)小環(huán)DNA釋放的控制。例如，在特定的環(huán)境下，如腫瘤組織的微酸性環(huán)境中，金屬離子與配體之間的配位鍵可能會(huì)發(fā)生解離，從而導(dǎo)致小環(huán)DNA的釋放?；瘜W(xué)鍵合在控制小環(huán)DNA釋放方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)設(shè)計(jì)不同的化學(xué)鍵合方式和反應(yīng)條件，可以實(shí)現(xiàn)小環(huán)DNA在特定環(huán)境下的可控釋放。對(duì)于共價(jià)鍵連接的納米顆粒-小環(huán)DNA復(fù)合物，可以利用腫瘤細(xì)胞內(nèi)的特定酶或環(huán)境因素，如pH值、氧化還原電位等，觸發(fā)共價(jià)鍵的斷裂，從而實(shí)現(xiàn)小環(huán)DNA的釋放。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，一些蛋白酶的活性較高，通過(guò)將小環(huán)DNA與納米顆粒通過(guò)對(duì)這些蛋白酶敏感的肽鍵進(jìn)行共價(jià)連接，當(dāng)復(fù)合物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，蛋白酶可以水解肽鍵，使小環(huán)DNA釋放出來(lái)。對(duì)于配位鍵合的復(fù)合物，可以通過(guò)改變環(huán)境中的金屬離子濃度或添加競(jìng)爭(zhēng)性配體等方式，調(diào)節(jié)配位鍵的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)小環(huán)DNA的釋放。在實(shí)際應(yīng)用中，化學(xué)鍵合為傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒提供了一種高效、穩(wěn)定且可控的結(jié)合和釋放方式，有助于提高腫瘤基因治療的效果和安全性。3.1.3其他相互作用除了靜電相互作用和化學(xué)鍵合，氫鍵、疏水作用等其他相互作用在靶向納米顆粒與小環(huán)DNA的結(jié)合中也發(fā)揮著重要作用。氫鍵是一種由氫原子與電負(fù)性較大的原子（如氮、氧、氟等）之間形成的弱相互作用。在納米顆粒與小環(huán)DNA的結(jié)合過(guò)程中，氫鍵可以在納米顆粒表面的官能團(tuán)與小環(huán)DNA分子中的堿基或磷酸基團(tuán)之間形成。例如，納米顆粒表面的羥基（-OH）可以與小環(huán)DNA分子中的腺嘌呤（A）或胸腺嘧啶（T）堿基之間形成氫鍵。這種氫鍵的形成雖然相對(duì)較弱，但在多個(gè)氫鍵協(xié)同作用下，能夠?qū){米顆粒與小環(huán)DNA的結(jié)合起到穩(wěn)定作用。氫鍵還可以影響納米顆粒-小環(huán)DNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，進(jìn)而影響其在體內(nèi)的行為和功能。研究發(fā)現(xiàn)，氫鍵的存在可以使小環(huán)DNA在納米顆粒表面呈現(xiàn)特定的纏繞方式，有利于保護(hù)小環(huán)DNA免受核酸酶的降解，同時(shí)也可能影響小環(huán)DNA進(jìn)入細(xì)胞后的釋放和表達(dá)過(guò)程。疏水作用是指非極性分子或基團(tuán)在水溶液中相互聚集的傾向。一些納米顆粒，如脂質(zhì)納米顆粒和聚合物納米顆粒，具有疏水的內(nèi)核和相對(duì)親水的外殼。小環(huán)DNA分子雖然整體上是親水性的，但其中的堿基部分具有一定的疏水性。在納米顆粒與小環(huán)DNA結(jié)合時(shí)，小環(huán)DNA的堿基部分可能會(huì)與納米顆粒的疏水內(nèi)核發(fā)生疏水相互作用，從而促進(jìn)兩者的結(jié)合。這種疏水作用在納米顆粒與小環(huán)DNA的結(jié)合過(guò)程中起到了輔助作用，與靜電相互作用、氫鍵等相互協(xié)同，共同維持納米顆粒-小環(huán)DNA復(fù)合物的穩(wěn)定性。疏水作用還可以影響納米顆粒-小環(huán)DNA復(fù)合物的溶解性和分散性，對(duì)其在體內(nèi)的循環(huán)和遞送過(guò)程產(chǎn)生影響。如果疏水作用過(guò)強(qiáng)，可能導(dǎo)致復(fù)合物在水溶液中發(fā)生聚集，影響其在體內(nèi)的分布和細(xì)胞攝取效率；而適度的疏水作用則有助于提高復(fù)合物的穩(wěn)定性和靶向性。氫鍵、疏水作用等其他相互作用與靜電相互作用和化學(xué)鍵合相互配合，共同影響著納米顆粒-小環(huán)DNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和性能。它們?cè)诰S持復(fù)合物穩(wěn)定性、促進(jìn)小環(huán)DNA的負(fù)載和保護(hù)、調(diào)節(jié)復(fù)合物在體內(nèi)的行為等方面都具有重要意義。在設(shè)計(jì)和制備傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒時(shí)，需要充分考慮這些相互作用的綜合影響，通過(guò)優(yōu)化納米顆粒的組成和結(jié)構(gòu)，以及小環(huán)DNA的修飾方式，實(shí)現(xiàn)納米顆粒與小環(huán)DNA的高效結(jié)合和穩(wěn)定遞送，為腫瘤基因治療提供更有效的手段。3.2靶向納米顆粒對(duì)小環(huán)DNA的保護(hù)與運(yùn)輸3.2.1保護(hù)小環(huán)DNA免受降解小環(huán)DNA在體內(nèi)外環(huán)境中面臨著多種因素的威脅，如核酸酶的降解、化學(xué)物質(zhì)的破壞以及物理因素的影響等，這些因素會(huì)導(dǎo)致小環(huán)DNA的結(jié)構(gòu)完整性受損，從而影響其在腫瘤基因治療中的效果。靶向納米顆粒作為小環(huán)DNA的載體，能夠有效地保護(hù)小環(huán)DNA免受這些因素的降解，確保其安全、穩(wěn)定地到達(dá)靶細(xì)胞。核酸酶是一類能夠降解核酸的酶，廣泛存在于生物體內(nèi)的各種組織和體液中，如血液、細(xì)胞內(nèi)液和細(xì)胞外液等。當(dāng)小環(huán)DNA進(jìn)入體內(nèi)后，很容易受到核酸酶的攻擊，導(dǎo)致其磷酸二酯鍵斷裂，從而使小環(huán)DNA降解為小分子片段，失去其生物學(xué)活性。靶向納米顆?？梢酝ㄟ^(guò)多種方式抵御核酸酶的降解。一方面，納米顆?？梢詫⑿…h(huán)DNA包裹在其內(nèi)部，形成一個(gè)物理屏障，阻止核酸酶與小環(huán)DNA的接觸。例如，脂質(zhì)納米顆粒能夠通過(guò)自組裝形成雙層膜結(jié)構(gòu)，將小環(huán)DNA包裹在其內(nèi)部的疏水核心中，使小環(huán)DNA免受核酸酶的攻擊。聚合物納米顆粒也可以通過(guò)其高分子鏈的纏繞和包裹作用，保護(hù)小環(huán)DNA不被核酸酶降解。另一方面，納米顆粒的表面性質(zhì)也可以影響核酸酶的活性。一些納米顆粒表面帶有電荷或修飾有特殊的官能團(tuán)，這些電荷或官能團(tuán)可以與核酸酶發(fā)生相互作用，改變核酸酶的構(gòu)象，從而抑制其活性。研究表明，陽(yáng)離子納米顆粒表面的正電荷可以與核酸酶分子表面的負(fù)電荷相互吸引，使核酸酶分子聚集，從而降低其活性。通過(guò)上述方式，靶向納米顆粒能夠有效地保護(hù)小環(huán)DNA免受核酸酶的降解，提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性和半衰期。除了核酸酶，小環(huán)DNA還可能受到化學(xué)物質(zhì)的破壞，如氧化還原劑、酸堿物質(zhì)等。在體內(nèi)，小環(huán)DNA會(huì)接觸到各種具有氧化還原活性的物質(zhì)，如活性氧（ROS）、活性氮（RNS）等，這些物質(zhì)可以攻擊小環(huán)DNA的堿基和磷酸骨架，導(dǎo)致DNA損傷和降解。酸堿物質(zhì)也可能改變小環(huán)DNA的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，影響其生物學(xué)功能。靶向納米顆?？梢酝ㄟ^(guò)其自身的化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，保護(hù)小環(huán)DNA免受化學(xué)物質(zhì)的破壞。納米顆粒的表面修飾可以引入一些具有抗氧化或抗酸堿作用的基團(tuán)，這些基團(tuán)可以中和或清除體內(nèi)的氧化還原劑和酸堿物質(zhì)，從而保護(hù)小環(huán)DNA。在納米顆粒表面修飾抗氧化劑，如維生素E、谷胱甘肽等，可以有效地清除體內(nèi)的ROS，減少其對(duì)小環(huán)DNA的氧化損傷。納米顆粒的結(jié)構(gòu)也可以提供一定的保護(hù)作用。一些納米顆粒具有多層結(jié)構(gòu)，外層結(jié)構(gòu)可以起到屏蔽作用，減少化學(xué)物質(zhì)對(duì)內(nèi)部小環(huán)DNA的接觸和破壞。物理因素，如溫度、剪切力、滲透壓等，也可能對(duì)小環(huán)DNA的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。在體內(nèi)循環(huán)過(guò)程中，小環(huán)DNA會(huì)受到血液流動(dòng)產(chǎn)生的剪切力作用，以及血管壁的摩擦和擠壓，這些物理因素可能導(dǎo)致小環(huán)DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，甚至斷裂。溫度的變化也可能影響小環(huán)DNA的穩(wěn)定性，過(guò)高或過(guò)低的溫度都可能導(dǎo)致DNA的變性和降解。靶向納米顆粒能夠在一定程度上緩沖物理因素對(duì)小環(huán)DNA的影響。納米顆粒的柔韌性和彈性可以使其在受到物理外力作用時(shí)發(fā)生形變，從而分散和緩沖外力，減少對(duì)小環(huán)DNA的損傷。一些納米顆粒具有良好的熱穩(wěn)定性，能夠在一定溫度范圍內(nèi)保持其結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性，從而保護(hù)小環(huán)DNA免受溫度變化的影響。納米顆粒還可以通過(guò)調(diào)節(jié)周圍環(huán)境的滲透壓，維持小環(huán)DNA的穩(wěn)定性。通過(guò)這些方式，靶向納米顆粒能夠有效地保護(hù)小環(huán)DNA免受物理因素的影響，確保其在體內(nèi)的安全運(yùn)輸和穩(wěn)定存在。3.2.2促進(jìn)小環(huán)DNA的細(xì)胞攝取細(xì)胞攝取是小環(huán)DNA發(fā)揮腫瘤基因治療作用的關(guān)鍵步驟之一，其效率直接影響到基因治療的效果。靶向納米顆粒能夠通過(guò)多種機(jī)制提高小環(huán)DNA進(jìn)入細(xì)胞的效率，包括受體介導(dǎo)內(nèi)吞、胞飲作用等，同時(shí)還受到納米顆粒的粒徑、表面電荷、表面修飾等多種因素的影響。受體介導(dǎo)內(nèi)吞是靶向納米顆粒促進(jìn)小環(huán)DNA細(xì)胞攝取的重要機(jī)制之一。許多腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)一些特異性的受體，如表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、葉酸受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體等。靶向納米顆?？梢酝ㄟ^(guò)表面修飾連接相應(yīng)的靶向配體，如抗體、肽段、小分子等，使其能夠與腫瘤細(xì)胞表面的特異性受體特異性結(jié)合。當(dāng)納米顆粒與受體結(jié)合后，會(huì)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)吞作用，形成內(nèi)吞小泡，將納米顆粒及其攜帶的小環(huán)DNA攝入細(xì)胞內(nèi)。以葉酸受體為例，許多腫瘤細(xì)胞，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌等細(xì)胞表面高表達(dá)葉酸受體。將葉酸修飾在納米顆粒表面，制備成葉酸靶向的納米顆粒，當(dāng)這種納米顆粒與腫瘤細(xì)胞接觸時(shí)，葉酸可以與腫瘤細(xì)胞表面的葉酸受體特異性結(jié)合，從而介導(dǎo)納米顆粒通過(guò)受體介導(dǎo)內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞。這種特異性的結(jié)合和內(nèi)吞作用能夠顯著提高納米顆粒及其攜帶的小環(huán)DNA在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的攝取效率，增強(qiáng)基因治療的效果。研究表明，葉酸靶向的納米顆粒攜帶小環(huán)DNA轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞的效率比非靶向納米顆粒提高了數(shù)倍。胞飲作用也是靶向納米顆粒促進(jìn)小環(huán)DNA細(xì)胞攝取的重要方式。胞飲作用是細(xì)胞攝取液體和溶質(zhì)的一種方式，包括巨胞飲和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞飲等。納米顆粒的小尺寸效應(yīng)使其能夠更容易地觸發(fā)細(xì)胞的胞飲作用。當(dāng)納米顆粒與細(xì)胞表面接觸時(shí)，會(huì)引起細(xì)胞膜的局部變形和內(nèi)陷，形成胞飲小泡，將納米顆粒及其攜帶的小環(huán)DNA包裹進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。一些納米顆粒表面的電荷和化學(xué)性質(zhì)也可以影響胞飲作用的發(fā)生。陽(yáng)離子納米顆粒表面的正電荷可以與細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷相互吸引，增強(qiáng)納米顆粒與細(xì)胞膜的相互作用，從而促進(jìn)胞飲作用的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)離子脂質(zhì)納米顆粒能夠通過(guò)胞飲作用高效地將小環(huán)DNA遞送至細(xì)胞內(nèi)，其細(xì)胞攝取效率明顯高于中性或陰離子納米顆粒。納米顆粒的粒徑、表面電荷、表面修飾等因素對(duì)小環(huán)DNA的細(xì)胞攝取效率也有著重要影響。粒徑是影響納米顆粒細(xì)胞攝取的關(guān)鍵因素之一。一般來(lái)說(shuō)，較小粒徑的納米顆粒更容易穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。研究表明，粒徑在10-100nm之間的納米顆粒具有較好的細(xì)胞攝取效率。這是因?yàn)檩^小的納米顆粒能夠更容易地通過(guò)細(xì)胞間隙和細(xì)胞膜上的小孔，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)納米顆粒的粒徑過(guò)大時(shí)，可能會(huì)受到細(xì)胞表面的物理屏障和細(xì)胞內(nèi)吞機(jī)制的限制，導(dǎo)致細(xì)胞攝取效率降低。表面電荷對(duì)納米顆粒的細(xì)胞攝取也具有重要影響。陽(yáng)離子納米顆粒由于其表面帶有正電荷，能夠與細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷相互吸引，增強(qiáng)納米顆粒與細(xì)胞膜的親和力，從而促進(jìn)細(xì)胞攝取。然而，陽(yáng)離子納米顆粒也可能會(huì)引起細(xì)胞膜的損傷和細(xì)胞毒性，因此需要在提高細(xì)胞攝取效率和降低細(xì)胞毒性之間進(jìn)行平衡。陰離子納米顆粒和中性納米顆粒的細(xì)胞攝取效率相對(duì)較低，但它們具有較好的生物相容性。表面修飾是調(diào)節(jié)納米顆粒細(xì)胞攝取效率的重要手段。通過(guò)在納米顆粒表面修飾不同的功能基團(tuán)或靶向配體，可以改變納米顆粒的表面性質(zhì)和生物學(xué)活性，從而影響其細(xì)胞攝取效率。在納米顆粒表面修飾聚乙二醇（PEG）可以增加納米顆粒的親水性和穩(wěn)定性，減少其在體內(nèi)的非特異性吸附和清除，同時(shí)也可以調(diào)節(jié)納米顆粒的細(xì)胞攝取途徑和效率。3.2.3引導(dǎo)小環(huán)DNA到達(dá)腫瘤細(xì)胞靶點(diǎn)傳輸小環(huán)DNA的靶向納米顆粒能夠通過(guò)主動(dòng)靶向和被動(dòng)靶向兩種機(jī)制，引導(dǎo)小環(huán)DNA準(zhǔn)確地到達(dá)腫瘤細(xì)胞靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的精準(zhǔn)治療，提高腫瘤基因治療的效果和安全性。主動(dòng)靶向納米顆粒主要通過(guò)配體-受體結(jié)合的方式實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別和靶向運(yùn)輸。如前文所述，許多腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)一些特異性的受體，這些受體在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移和侵襲等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。主動(dòng)靶向納米顆粒通過(guò)在其表面修飾與腫瘤細(xì)胞表面受體特異性結(jié)合的配體，如抗體、肽段、核酸適配體、小分子等，使納米顆粒能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到腫瘤細(xì)胞表面的受體上。當(dāng)納米顆粒與腫瘤細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，會(huì)引發(fā)一系列的細(xì)胞內(nèi)吞和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，將納米顆粒及其攜帶的小環(huán)DNA攝入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向基因遞送。以抗體修飾的納米顆粒為例，將針對(duì)腫瘤細(xì)胞表面特定抗原的單克隆抗體連接到納米顆粒表面，制備成抗體靶向的納米顆粒。這種納米顆粒能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到表達(dá)該抗原的腫瘤細(xì)胞表面，通過(guò)抗體與抗原之間的高親和力結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)靶向。抗體靶向的納米顆粒不僅能夠提高小環(huán)DNA在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的攝取效率，還能夠減少小環(huán)DNA在正常細(xì)胞中的分布，降低基因治療的副作用。研究表明，在乳腺癌小鼠模型中，將攜帶小環(huán)DNA的抗體靶向納米顆粒通過(guò)尾靜脈注射給藥，納米顆粒能夠特異性地富集到腫瘤組織中，腫瘤組織中的小環(huán)DNA含量明顯高于正常組織，且腫瘤細(xì)胞的攝取效率顯著提高，有效地抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。被動(dòng)靶向納米顆粒則主要利用腫瘤組織的生理特性，如增強(qiáng)滲透和滯留（EPR）效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向運(yùn)輸。腫瘤組織由于快速增殖和代謝，會(huì)形成新生血管。這些新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞間隙較大，血管壁的完整性較差，同時(shí)腫瘤組織的淋巴回流系統(tǒng)也不完善。這些生理特性使得納米顆粒能夠更容易地從血液循環(huán)中滲漏到腫瘤組織中，并在腫瘤組織中長(zhǎng)時(shí)間滯留，從而實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向。納米顆粒的粒徑和表面性質(zhì)對(duì)其利用EPR效應(yīng)實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向起著重要作用。一般來(lái)說(shuō)，粒徑在10-200nm之間的納米顆粒具有較好的EPR效應(yīng)。這是因?yàn)檩^小粒徑的納米顆粒能夠更容易地通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙進(jìn)入腫瘤組織，而較大粒徑的納米顆粒則容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）清除。納米顆粒的表面修飾也可以影響其EPR效應(yīng)。在納米顆粒表面修飾PEG可以增加納米顆粒的親水性和空間位阻，減少其在血液中的非特異性吸附和清除，延長(zhǎng)納米顆粒在血液循環(huán)中的時(shí)間，從而提高其在腫瘤組織中的富集程度。研究表明，PEG修飾的納米顆粒在腫瘤組織中的積累量明顯高于未修飾的納米顆粒。在肝癌小鼠模型中，將攜帶小環(huán)DNA的PEG修飾納米顆粒通過(guò)尾靜脈注射給藥，納米顆粒能夠通過(guò)EPR效應(yīng)有效地在腫瘤組織中富集，腫瘤組織中的小環(huán)DNA含量顯著增加，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的被動(dòng)靶向基因遞送，抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。3.3小環(huán)DNA在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的作用過(guò)程3.3.1小環(huán)DNA的釋放與定位靶向納米顆粒將小環(huán)DNA成功遞送至腫瘤細(xì)胞后，小環(huán)DNA的釋放與定位是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵步驟，這一過(guò)程受到多種因素的影響，并且對(duì)腫瘤基因治療的效果起著決定性作用。納米顆粒進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，小環(huán)DNA的釋放機(jī)制較為復(fù)雜，主要涉及內(nèi)體逃逸和納米顆粒的降解等過(guò)程。當(dāng)納米顆粒通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞