原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿：傷口止血與愈合性能的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義在日常生活、醫(yī)療手術(shù)以及各類意外事故中，傷口出血是常見(jiàn)問(wèn)題，嚴(yán)重的出血若不能及時(shí)得到有效控制，可能導(dǎo)致休克甚至危及生命，尤其是在戰(zhàn)場(chǎng)、自然災(zāi)害或緊急救援等場(chǎng)景下，快速止血顯得尤為關(guān)鍵。傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜且有序的生理過(guò)程，涵蓋了止血、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、組織重塑等多個(gè)階段，理想的傷口愈合不僅意味著止血，還需促進(jìn)組織的修復(fù)與再生，減少疤痕形成，降低感染風(fēng)險(xiǎn)，從而恢復(fù)受損組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。當(dāng)前，市場(chǎng)上存在多種傷口止血和愈合材料，如傳統(tǒng)的紗布，雖應(yīng)用廣泛，但存在易粘連傷口、止血效率低等不足；明膠海綿具有一定的止血效果，能促進(jìn)血小板黏附和凝血因子激活，進(jìn)而促進(jìn)凝血塊形成，然而對(duì)于凝血障礙患者并不適用，且止血過(guò)程中體積快速膨脹會(huì)壓迫創(chuàng)面組織和神經(jīng)，造成損傷；氧化纖維素雖止血迅速，但氧化過(guò)程復(fù)雜，會(huì)產(chǎn)生酸性環(huán)境，引發(fā)組織炎性反應(yīng)，延長(zhǎng)傷口愈合時(shí)間并損傷周圍神經(jīng)；而殼聚糖是由甲殼素經(jīng)脫乙酰基生成，具備無(wú)免疫源性、無(wú)毒、良好生物相容性和可降解等特性，與人體親和性佳，還有止血、抗菌、助力機(jī)體組織修復(fù)、促進(jìn)傷口愈合等優(yōu)點(diǎn)，在止血材料領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的研究?jī)r(jià)值，不過(guò)其水溶性較差，制備中性止血海綿過(guò)程繁瑣，且海綿力學(xué)強(qiáng)度不足，止血速率較慢。原花青素作為一種廣泛存在于植物中的天然多酚類化合物，具有出色的抗氧化、抗炎、抗菌等生物活性，能夠清除體內(nèi)自由基，減輕氧化應(yīng)激對(duì)組織的損傷，抑制炎癥因子的釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)，還能對(duì)多種細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)起到抑制作用。同時(shí)，原花青素可以與蛋白質(zhì)、多糖等生物大分子通過(guò)氫鍵、疏水作用等相互作用，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，這為其與殼聚糖、明膠復(fù)合制備新型止血和愈合材料提供了可能。將原花青素與殼聚糖、明膠復(fù)合制備成海綿材料，有望結(jié)合三者的優(yōu)勢(shì)，開(kāi)發(fā)出性能更優(yōu)異的傷口止血和愈合材料。原花青素的抗氧化和抗炎特性，可有效減輕傷口炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織修復(fù)；殼聚糖的止血、抗菌和生物相容性好的特點(diǎn)，能快速止血并防止傷口感染；明膠則憑借其良好的生物相容性和促進(jìn)細(xì)胞黏附的能力，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供良好的基質(zhì)，有助于組織的修復(fù)和再生。這種復(fù)合海綿材料不僅能夠?qū)崿F(xiàn)快速止血，還能促進(jìn)傷口愈合，減少疤痕形成，具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，開(kāi)展原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿用于傷口止血促愈合性能的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值，有望為傷口治療領(lǐng)域帶來(lái)新的突破和發(fā)展。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來(lái)，傷口止血和愈合材料的研究受到了廣泛關(guān)注，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在這一領(lǐng)域取得了眾多研究成果。在止血材料方面，早期的研究主要集中在傳統(tǒng)的物理止血材料，如紗布、繃帶等，它們通過(guò)物理壓迫的方式來(lái)止血，但止血效果有限，且存在易粘連傷口、更換時(shí)易引發(fā)二次出血等問(wèn)題。隨著材料科學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展，新型止血材料不斷涌現(xiàn)，如殼聚糖基止血材料、明膠基止血材料等。殼聚糖因其獨(dú)特的生物學(xué)特性，在止血材料研究中備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖能夠促進(jìn)血小板的黏附和聚集，激活凝血因子，從而加速血液凝固。同時(shí)，殼聚糖還具有一定的抗菌性能，能夠抑制傷口感染，為傷口愈合創(chuàng)造良好的環(huán)境。然而，殼聚糖也存在一些不足之處，如水溶性較差，制備中性止血海綿過(guò)程繁瑣，且海綿力學(xué)強(qiáng)度不足，止血速率較慢。為了克服這些缺點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的改性研究，通過(guò)添加交聯(lián)劑、與其他材料復(fù)合等方式來(lái)增強(qiáng)殼聚糖的性能。白雪等人針對(duì)單純殼聚糖力學(xué)強(qiáng)度不足的缺點(diǎn)，綜述了殼聚糖添加交聯(lián)劑京尼平、醛類、單寧酸增強(qiáng)力學(xué)強(qiáng)度的研究進(jìn)展；針對(duì)單純殼聚糖不易溶于水的特點(diǎn)，綜述了殼聚糖改性為羧甲基殼聚糖、殼聚糖季銨鹽和烷基化殼聚糖增加或減少溶解度的研究進(jìn)展；針對(duì)單純殼聚糖止血效果不佳的特點(diǎn)，綜述了通過(guò)加入聚乙烯醇、明膠、膠原等有機(jī)或無(wú)機(jī)材料改善其止血效果的研究進(jìn)展。何蘭珍等人通過(guò)冷凍殼聚糖-明膠共混液誘導(dǎo)相分離的方法，制成多孔性、親水性、透氣性良好的海綿狀傷口敷料，研究了不同殼聚糖與明膠比例、共混液總濃度、粉末量和交聯(lián)劑用量等因素對(duì)海綿體敷料結(jié)構(gòu)形態(tài)及性能的影響，得出其用量最佳配比為殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5/明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5/總質(zhì)量濃度22-25g/L/殼聚糖-明膠混合粉末量1∶交聯(lián)劑用量體積分?jǐn)?shù)為0.01。明膠基止血材料也是研究的熱點(diǎn)之一。明膠海綿具有內(nèi)部疏松多孔的結(jié)構(gòu)，能吸收大量血液，促進(jìn)血小板黏附和凝血因子的激活，從而促進(jìn)凝血塊的形成，在臨床上得到了一定的應(yīng)用。但明膠海綿對(duì)于有凝血障礙的患者不宜使用，其止血過(guò)程中體積會(huì)快速膨脹壓迫創(chuàng)面的組織和神經(jīng)，造成損傷。為了改進(jìn)明膠海綿的性能，研究者們嘗試將明膠與其他材料復(fù)合，如與殼聚糖復(fù)合制備殼聚糖-明膠海綿狀傷口敷料，以綜合兩者的優(yōu)勢(shì)，提高止血和愈合效果。原花青素作為一種天然的多酚類化合物，其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究也逐漸增多。研究表明，原花青素具有抗氧化、抗炎、抗菌等多種生物活性。在抗氧化方面，原花青素能夠清除體內(nèi)自由基，減輕氧化應(yīng)激對(duì)組織的損傷；在抗炎方面，它可以抑制炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)；在抗菌方面，原花青素對(duì)多種細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)具有抑制作用。這些特性使得原花青素在傷口愈合領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前，關(guān)于原花青素與殼聚糖、明膠復(fù)合制備止血和愈合材料的研究還相對(duì)較少。王洪棟發(fā)明了一種由原花青素和殼聚糖構(gòu)成的原花青素復(fù)合物，將原花青素的水相溶液與殼聚糖的水相溶液混合，在一定條件下攪拌后干燥制得，該復(fù)合物中部分改變了原花青素的性質(zhì)，澀味和收斂性顯著降低，耐光、耐熱和顏色穩(wěn)定性能提高，除具有原花青素的生物活性外，還具有殼聚糖的生物活性，可應(yīng)用于食品、藥品和化妝品領(lǐng)域，但尚未涉及在傷口止血促愈合方面的應(yīng)用研究。盡管國(guó)內(nèi)外在傷口止血和愈合材料的研究上已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但仍存在一些不足之處?，F(xiàn)有止血材料在止血速度、止血效果、生物相容性、對(duì)傷口愈合的促進(jìn)作用以及材料的穩(wěn)定性和力學(xué)性能等方面，往往難以同時(shí)滿足理想的要求。在復(fù)合止血材料的研究中，對(duì)于各成分之間的協(xié)同作用機(jī)制還缺乏深入的了解，這限制了材料性能的進(jìn)一步優(yōu)化。而且目前的研究大多集中在單一功能的實(shí)現(xiàn)，對(duì)于具有多種功能集成的止血和愈合材料的研究還相對(duì)較少。本文旨在針對(duì)現(xiàn)有研究的不足，深入研究原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿的制備工藝，通過(guò)調(diào)控各成分的比例和交聯(lián)條件，優(yōu)化材料的結(jié)構(gòu)和性能。系統(tǒng)地研究該復(fù)合海綿材料的傷口止血和促愈合性能，包括止血速度、凝血效果、對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖和組織修復(fù)等方面的作用，并探討其作用機(jī)制。同時(shí)，通過(guò)與其他現(xiàn)有止血材料進(jìn)行對(duì)比，全面評(píng)估原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用潛力，為開(kāi)發(fā)新型高效的傷口止血和愈合材料提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。二、原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿的制備2.1原材料的選擇與特性2.1.1原花青素原花青素（Procyanidins）是一種廣泛存在于植物中的天然多酚類化合物，屬于生物黃酮類。其結(jié)構(gòu)是由不同數(shù)量的兒茶素（Catechin）或表兒茶素（Epicatechin）通過(guò)C-C鍵縮合而成的聚合物，又被稱為縮合單寧。根據(jù)聚合度的不同，可分為單體、低聚和高聚原花青素，其中二聚體分布最為廣泛。原花青素廣泛分布于多種植物的果、葉、子、皮中，葡萄籽中的原花青素含量可高達(dá)95%。原花青素具有眾多優(yōu)異的生物活性，在抗氧化方面，它是目前國(guó)際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基有效的天然抗氧化劑，其體內(nèi)的抗氧化能力是維生素C的20倍、維生素E的50倍。原花青素結(jié)構(gòu)中有多個(gè)酚性羥基，這些羥基能夠在體內(nèi)釋放H?，競(jìng)爭(zhēng)性地與自由基結(jié)合，從而保護(hù)脂質(zhì)不被氧化，阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，并且反應(yīng)后產(chǎn)生的半醌自由基能通過(guò)親核加成反應(yīng)生成具有兒茶酸及焦酚結(jié)構(gòu)的聚合物，仍然具有很強(qiáng)的抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)原花青素及其代謝產(chǎn)物的自由基清除活性一般強(qiáng)于VC和VE，高峰等學(xué)者的研究表明，原花青素可使人血清丙二醛（MDA）含量下降4.80%，超氧化物歧化酶（SOD）活力升高2.31%，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活力升高2.45%，并且能顯著降低CCl4中毒小鼠肝脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，充分體現(xiàn)了其較強(qiáng)的抗氧化活性。在抗炎方面，炎癥是機(jī)體對(duì)外源刺激的一種防御或免疫反應(yīng)，但過(guò)度或持續(xù)性炎癥反應(yīng)會(huì)引發(fā)多種炎癥相關(guān)性疾病。葡萄子低聚原花青素可以降低結(jié)腸組織中炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平，上調(diào)Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)水平，上調(diào)結(jié)腸組織中SOD水平，下調(diào)MDA水平，從而改善小鼠潰瘍性結(jié)腸炎。也有研究發(fā)現(xiàn)，原花青素對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制NO、IL-1β、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。原花青素還具有降血壓、降血脂、降血糖以及抗癌、抗腫瘤等生物活性。張團(tuán)笑等建立家兔離體胸主動(dòng)脈環(huán)灌流模型，發(fā)現(xiàn)葡萄籽原花青素能減少Ca2?內(nèi)流、促進(jìn)NO的釋放、舒張主動(dòng)脈血管、降低血壓，同時(shí)葡萄籽原花青素也能降低正常家兔的動(dòng)脈血壓。原花青素能夠降低血液膽固醇、甘油三酯水平，從而起到降血脂作用，如Serra等給高膽固醇飲食大鼠喂食蘋(píng)果，30d后，大鼠血清總膽固醇、甘油三酯和LDL的含量分別降低21.0%、27.2%和20.4%，蘋(píng)果中所含的原花青素類成分（兒茶素、表兒茶素和原花青素B1）是其降脂主要成分。劉靈等研究發(fā)現(xiàn)，葡萄子原花青素能緩解血清胰島素抵抗水平、修復(fù)損傷的β細(xì)胞、調(diào)節(jié)β細(xì)胞的增殖和凋亡等方面來(lái)調(diào)節(jié)糖脂代謝，對(duì)2型糖尿病患者有明顯的降血糖、降血脂作用，且不會(huì)對(duì)肝腎及造血功能造成不良影響。原花青素對(duì)癌癥、腫瘤具有一定的預(yù)防和治療作用，其作用機(jī)制主要有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，調(diào)控分子信號(hào)通路NF-κB、MAPK、PI3K/AKT中的蛋白質(zhì)。這些優(yōu)異的生物活性使得原花青素在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，在傷口愈合領(lǐng)域，其抗氧化和抗炎特性能夠有效減輕傷口炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織修復(fù)，為制備新型傷口止血和愈合材料提供了有力的支持。2.1.2殼聚糖殼聚糖（Chitosan）又名脫乙酰甲殼質(zhì)、可溶性甲殼素、聚氨基葡萄糖，化學(xué)名稱為β-（1，4）-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖，是一種線性、半晶體狀多糖。它是由甲殼素在堿性條件下部分N-乙酰氨基脫乙?；鴣?lái)的長(zhǎng)鏈聚合物，也是目前自然界發(fā)現(xiàn)的唯一的一種含氨基類天然多糖。殼聚糖的制備方法主要有從蝦、蟹殼中提取以及從菌絲體中提取。從蝦、蟹殼中提取殼聚糖時(shí)，通常先將粉碎的干蟹殼用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%-6%的稀鹽酸浸泡24小時(shí)進(jìn)行脫鈣，然后用清水洗滌數(shù)次并抽濾，接著用質(zhì)量數(shù)為6%-10%氫氧化鈉溶液浸沒(méi)除鈣后的蟹殼，用水浴加熱至沸騰并保溫1小時(shí)左右，再次抽濾，將濾渣用清水洗滌至中性，完成脫蛋白過(guò)程。脫色過(guò)程可在陽(yáng)光紫外線作用下完成或用量分?jǐn)?shù)為0.5%的高錳酸鉀浸泡1.0小時(shí)，過(guò)濾后用清水洗至中性，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%的硫酸氫鈉漂白1.0-2.0小時(shí)，最后用清水洗滌至中性并干燥，即可得到甲殼質(zhì)，甲殼質(zhì)經(jīng)過(guò)脫乙?；纯芍迫ぞ厶恰Ｈ欢?，這種方法存在原料不穩(wěn)定性的問(wèn)題，使得殼聚糖的產(chǎn)量和質(zhì)量受到影響，而且生產(chǎn)成本較高，約為7-8萬(wàn)元／噸。從菌絲體中提取殼聚糖，如從黑曲霉菌絲體、青霉菌絲體、曲霉菌絲體等中提取，此工藝一般需要用7％NaOH處理5h，在140℃下用35％NaOH處理1h，最后在100℃下用5％HAC處理5h，但由于NaOH的用量太大，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需要增加后處理工藝。殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中含有氨基基團(tuán)，比甲殼素分子中的乙酰氨基基團(tuán)反應(yīng)活性更強(qiáng)，這使得殼聚糖具有諸多優(yōu)異的生物學(xué)功能。在抗菌方面，殼聚糖對(duì)多種細(xì)菌的生長(zhǎng)具有抑制作用，研究表明，它對(duì)表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌等實(shí)驗(yàn)菌株均具有抑制作用，甚至對(duì)一般抗生素難以抑制的白色念珠菌也有抑制效果。其抑菌抗菌機(jī)制主要是大分子殼聚糖通過(guò)自身所帶的正電荷與微生物細(xì)胞膜所攜帶的負(fù)電荷相互作用，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁原有結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞成分的泄漏而起到抗菌作用；小分子的殼聚糖則通過(guò)滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與帶有陰離子的生物大分子發(fā)生類似“絮凝”作用，擾亂細(xì)胞的正常生理功能，阻斷DNA的生物合成，從而抑制細(xì)菌的繁殖和生長(zhǎng)。在促進(jìn)皮膚組織愈合和修復(fù)方面，殼聚糖可促進(jìn)上皮細(xì)胞的再生，通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞增殖而促進(jìn)傷口愈合，通過(guò)溫和的急性炎性反應(yīng)吸引大量的多形核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞以清除組織碎片和血凝塊。它還可促進(jìn)纖維細(xì)胞的遷移，對(duì)基質(zhì)細(xì)胞有趨化、遷移、激活作用，并加速細(xì)胞增殖和組織重塑過(guò)程，促進(jìn)皮膚組織修復(fù)，其降解產(chǎn)物N－乙酰葡萄糖胺（NAG）對(duì)組織的疤痕修復(fù)非常重要。殼聚糖本身具有止血作用，其止血機(jī)理是帶正電荷的殼聚糖與細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的神經(jīng)氨酸殘基的受體發(fā)生相互作用，促進(jìn)血小板的聚集，激活凝血系統(tǒng)，交聯(lián)紅細(xì)胞形成血塊。而且殼聚糖具有明顯的膜形成作用，可以加速傷口愈合和防止大出血。同時(shí)，殼聚糖還具有良好的生物降解性、生物相容性、無(wú)毒性等特點(diǎn)，在食品、醫(yī)藥、保健、生物工程等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，尤其是在止血材料領(lǐng)域，展現(xiàn)出獨(dú)特的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力。2.1.3明膠明膠（Gelatin）在自然界中并不天然存在，是從動(dòng)物（牛、馬、豬、魚(yú)、驢）的皮、骨、腱、鱗等含膠原蛋白的組織，經(jīng)過(guò)一系列化學(xué)處理以后部分水解的降解生成的非均勻多肽混合物，由20多種氨基酸所組成，其中甘氨酸占1/3，脯氨酸與羥基脯氨酸之和占1/3。膠原蛋白是動(dòng)物的結(jié)締組織，如皮、骨、筋的主要成分，因此明膠多存在于動(dòng)物的皮、骨、軟骨、韌帶、肌膜、魚(yú)鱗中。明膠的制備方法大致有酸法、堿法和酶法三種，國(guó)內(nèi)常用的是堿法。堿法制備明膠的過(guò)程為：先將動(dòng)物的皮或骨進(jìn)行分類、整理，去除毛發(fā)、油脂等雜質(zhì)，然后通過(guò)水力除污，利用水力的沖擊作用和高速鐵錘的機(jī)械作用，清除油脂和污物；接著用石灰水浸漬，去除原料中的其它蛋白質(zhì)、有機(jī)物等；再用鹽酸中和，去除鈣鹽和多余的石灰石；之后進(jìn)行熬膠，將原料和水一起加熱，使膠原溶于水轉(zhuǎn)化成明膠，一般采用分道熬膠，一道膠為照相明膠，二道膠為醫(yī)藥明膠，三道膠為食用明膠，四道膠為工業(yè)用明膠；最后進(jìn)行后處理，在各道膠中加入防腐劑、凝凍、干燥，得到成品明膠。酸法制備則是將動(dòng)物的皮或骨分類、整理后水力除污，在冷硫酸溶液中酸化2-8小時(shí)，然后熬膠、凍膠、擠壓、干燥。明膠具有諸多優(yōu)良特性，在物理性狀上，它是無(wú)色至白色或淺黃色、透明至半透明、微帶光澤的顆?；蚍勰?，幾乎無(wú)臭無(wú)味，不溶于冷水，但能吸收5-10倍重量的冷水而膨脹軟化，溶于熱水，冷卻后形成凝膠，具有吸濕性，溶解溫度約30℃，凝固溫度約20-25℃。在理化特性方面，凍力（也叫凝膠強(qiáng)度、勃魯姆凍力）是反映明膠內(nèi)在質(zhì)量的重要指標(biāo)，在嚴(yán)格規(guī)定的條件下，以一個(gè)直徑為的圓柱，壓入含%明膠的膠凍表面以下4mm時(shí)，所施加的力代表凍力，凍力指標(biāo)指明了膠溶液冷卻凝固成膠凍后的硬度，間接代表了膠的堅(jiān)固度或拉力；勃氏粘度決定了明膠的成膜特性，明膠溶液的粘度表明明膠中多肽鏈的長(zhǎng)短、分子量的大小，多肽鏈越長(zhǎng)，愈不利于形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，粘度也越大，一般而言，明膠的粘度高，表明其吸水率高，分子量大，在明膠制備中受到的破壞少，且粘度高的明膠的溶解速度和凝固速度比粘度低的快。此外，明膠還有水分、灰分、重金屬、SO2、透明度、微生物和色澤等理化指標(biāo)。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，明膠具有廣泛的應(yīng)用。它可以作為創(chuàng)面修復(fù)材料，如尹玉姬等人將體外擴(kuò)增的角質(zhì)形成細(xì)胞2次接種于人工真皮結(jié)構(gòu)物上，經(jīng)過(guò)空氣界面培養(yǎng)，可在體外構(gòu)建具有模擬真皮和表皮雙層結(jié)構(gòu)的真皮替代物；姜廣建、趙沉浮等人研制出的明膠-殼多糖混合膜，具有良好的透氣率和吸水率，加入適量甘油作為增塑劑和保濕劑后，具有良好的透氣性、柔韌性和膨脹特性，在傷口愈合過(guò)程中起到保護(hù)創(chuàng)面的作用。明膠也可用于組織修復(fù)，尹玉姬等人以水為致孔劑采用冷凍干燥法制備了HA/殼聚糖明膠網(wǎng)絡(luò)復(fù)合支架和磷酸三鈣(TCP)/殼聚糖明膠復(fù)合支架，結(jié)果表明此類支架生物相容性良好，可作為骨修復(fù)或骨取代材料；梁東春、左愛(ài)軍等人研究表明復(fù)合有rhBMP-2的殼聚糖明膠人工骨支架材料在體外具有良好的誘導(dǎo)成骨能力；李曉光、楊朝陽(yáng)等人借助人工神經(jīng)膠原導(dǎo)管做載體，連接大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺陷，發(fā)現(xiàn)明膠是修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的良好醫(yī)用載體材料。明膠還能作為止血材料，其內(nèi)部疏松多孔的結(jié)構(gòu)，能吸收大量血液，促進(jìn)血小板黏附和凝血因子的激活，從而促進(jìn)凝血塊的形成。明膠憑借其良好的生物相容性、促進(jìn)細(xì)胞黏附的能力以及在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的多種應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，成為制備原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿的重要原材料之一。2.2制備方法與工藝優(yōu)化2.2.1傳統(tǒng)制備方法概述傳統(tǒng)制備殼聚糖明膠海綿的方法主要有冷凍干燥法、交聯(lián)劑交聯(lián)法等。冷凍干燥法是將殼聚糖和明膠的混合溶液經(jīng)冷凍后，在真空條件下使水分升華，從而得到海綿狀結(jié)構(gòu)。這種方法的原理是利用冷凍過(guò)程中水分的結(jié)晶，形成孔隙結(jié)構(gòu)，再通過(guò)升華去除水分，使海綿固化成型。其優(yōu)點(diǎn)是操作相對(duì)簡(jiǎn)單，能較好地保留材料的生物活性，所制備的海綿具有較高的孔隙率和較好的親水性，有利于細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)。但該方法也存在一些局限性，如制備過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，能耗較高，且海綿的力學(xué)性能相對(duì)較差，在實(shí)際應(yīng)用中容易破碎，限制了其在一些對(duì)力學(xué)性能要求較高場(chǎng)景中的使用。交聯(lián)劑交聯(lián)法是向殼聚糖和明膠的混合溶液中加入交聯(lián)劑，如戊二醛、甲醛等，通過(guò)交聯(lián)劑與殼聚糖和明膠分子上的活性基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而制備出海綿材料。以戊二醛為例，其分子中的醛基可以與殼聚糖分子中的氨基以及明膠分子中的氨基、羥基等發(fā)生縮合反應(yīng)，形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，將殼聚糖和明膠分子連接在一起，構(gòu)建起三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這種方法能夠有效提高海綿的力學(xué)性能和穩(wěn)定性，使其在使用過(guò)程中不易變形和降解。然而，交聯(lián)劑的使用可能會(huì)帶來(lái)一些問(wèn)題，戊二醛等交聯(lián)劑具有一定的毒性，可能會(huì)殘留于海綿材料中，對(duì)人體產(chǎn)生潛在危害；交聯(lián)反應(yīng)的程度難以精確控制，若交聯(lián)過(guò)度，會(huì)導(dǎo)致海綿的柔韌性和生物相容性下降，影響其在生物體內(nèi)的應(yīng)用效果。在傳統(tǒng)的制備方法中，對(duì)于原花青素的引入，通常是將原花青素直接加入到殼聚糖和明膠的混合溶液中，然后進(jìn)行后續(xù)的制備步驟。但這種簡(jiǎn)單的混合方式存在原花青素分布不均勻的問(wèn)題，可能導(dǎo)致材料性能的不穩(wěn)定。原花青素在溶液中的溶解性有限，容易發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象，難以均勻地分散在殼聚糖和明膠的體系中，從而影響材料整體的抗氧化、抗炎等性能。2.2.2本研究的制備工藝本研究采用冷凍干燥結(jié)合化學(xué)交聯(lián)的方法制備原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿，具體制備步驟如下：溶液配制：準(zhǔn)確稱取一定量的殼聚糖，將其溶解于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的醋酸溶液中，攪拌均勻，配制成質(zhì)量濃度為2%的殼聚糖溶液，為保證殼聚糖完全溶解，攪拌時(shí)間持續(xù)2-3小時(shí)，并在室溫下靜置脫泡1小時(shí)。按照同樣的方式，稱取適量的明膠，溶解于去離子水中，配制成質(zhì)量濃度為3%的明膠溶液，加熱至60℃并持續(xù)攪拌1-2小時(shí)，確保明膠充分溶解，然后自然冷卻至室溫并靜置脫泡1小時(shí)。另取一定量的原花青素，用少量乙醇溶解后，再加入適量去離子水稀釋，配制成質(zhì)量濃度為1%的原花青素溶液。混合：將上述配制好的殼聚糖溶液、明膠溶液和原花青素溶液按照體積比2:2:1的比例倒入同一容器中，在30℃的恒溫水浴條件下，以200r/min的轉(zhuǎn)速攪拌混合2小時(shí)，使三種成分充分混合均勻，形成均勻的混合溶液。在攪拌過(guò)程中，通過(guò)觀察溶液的顏色和透明度來(lái)判斷混合的均勻程度，確保溶液顏色均一，無(wú)明顯的分層或團(tuán)聚現(xiàn)象。交聯(lián)：向混合溶液中加入交聯(lián)劑京尼平，京尼平的用量為殼聚糖質(zhì)量的5%。加入京尼平后，繼續(xù)在30℃恒溫水浴條件下，以150r/min的轉(zhuǎn)速攪拌反應(yīng)3小時(shí)，使交聯(lián)反應(yīng)充分進(jìn)行。交聯(lián)過(guò)程中，密切觀察溶液的粘度變化，隨著交聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行，溶液粘度逐漸增大，表明交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)正在逐步形成。成型：將交聯(lián)后的溶液倒入特定形狀的模具中，本研究選用邊長(zhǎng)為2cm的正方體硅膠模具，然后將模具放入冰箱中，在-20℃的條件下冷凍12小時(shí)，使溶液凍結(jié)成型，形成具有一定形狀的海綿前驅(qū)體。冷凍過(guò)程中，溶液中的水分結(jié)晶，形成冰晶，冰晶的生長(zhǎng)會(huì)在海綿前驅(qū)體中留下孔隙，從而賦予海綿一定的孔隙結(jié)構(gòu)。冷凍干燥：將冷凍后的海綿前驅(qū)體從模具中取出，放入冷凍干燥機(jī)中，在-50℃、真空度為10Pa的條件下進(jìn)行冷凍干燥24小時(shí)，使海綿中的水分升華去除，得到干燥的原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿。冷凍干燥過(guò)程中，通過(guò)冷凍干燥機(jī)的真空系統(tǒng)和制冷系統(tǒng)，將海綿中的水分直接從固態(tài)轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，從而避免了傳統(tǒng)干燥方法中可能導(dǎo)致的材料結(jié)構(gòu)破壞和性能下降。2.2.3工藝參數(shù)優(yōu)化在制備原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿的過(guò)程中，多個(gè)工藝參數(shù)對(duì)海綿的性能有著顯著影響，需要對(duì)這些參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以獲得性能優(yōu)良的海綿材料。交聯(lián)劑用量：交聯(lián)劑用量對(duì)海綿的力學(xué)性能、溶脹性能和降解性能等有著重要影響。在本研究中，考察了交聯(lián)劑京尼平用量分別為殼聚糖質(zhì)量的3%、5%、7%時(shí)對(duì)海綿性能的影響。當(dāng)京尼平用量為3%時(shí)，交聯(lián)程度較低，海綿的力學(xué)性能較差，在模擬生理環(huán)境下容易發(fā)生變形和破損，溶脹率較高，降解速度較快，不利于維持海綿在傷口部位的穩(wěn)定性和長(zhǎng)效性；當(dāng)京尼平用量增加到7%時(shí)，交聯(lián)程度過(guò)高，海綿變得硬脆，柔韌性和生物相容性下降，且溶脹率過(guò)低，不利于吸收傷口滲出液，對(duì)細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)也產(chǎn)生一定的抑制作用。經(jīng)過(guò)綜合評(píng)估，確定交聯(lián)劑京尼平用量為殼聚糖質(zhì)量的5%時(shí)較為合適，此時(shí)海綿具有較好的力學(xué)性能，能夠承受一定的外力作用而不發(fā)生明顯變形，溶脹性能適中，既能吸收適量的傷口滲出液，又能保持自身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，降解速度也較為合理，能夠在傷口愈合過(guò)程中緩慢降解，為傷口提供持續(xù)的支持和保護(hù)。反應(yīng)時(shí)間：反應(yīng)時(shí)間也是影響海綿性能的關(guān)鍵參數(shù)之一。分別考察了交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)時(shí)海綿的性能變化。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)時(shí)，交聯(lián)反應(yīng)不完全，海綿的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不夠完善，力學(xué)性能和穩(wěn)定性較差，在后續(xù)的使用過(guò)程中容易出現(xiàn)結(jié)構(gòu)破壞和性能衰退；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至4小時(shí)時(shí)，雖然交聯(lián)程度進(jìn)一步提高，但過(guò)長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間可能導(dǎo)致分子鏈過(guò)度交聯(lián)，使海綿的柔韌性降低，同時(shí)也會(huì)增加生產(chǎn)成本和制備時(shí)間。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確定交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為3小時(shí)時(shí)，海綿的性能最佳，此時(shí)交聯(lián)反應(yīng)充分，交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能夠賦予海綿良好的力學(xué)性能和穩(wěn)定性，同時(shí)又不會(huì)對(duì)海綿的其他性能產(chǎn)生負(fù)面影響。溫度：在混合和交聯(lián)過(guò)程中，溫度對(duì)反應(yīng)速率和海綿性能有著重要影響。在混合過(guò)程中，考察了溫度分別為25℃、30℃、35℃時(shí)對(duì)混合均勻性的影響。當(dāng)溫度為25℃時(shí)，分子運(yùn)動(dòng)相對(duì)較慢，混合溶液的均勻性較差，原花青素、殼聚糖和明膠之間的相互作用不夠充分，可能導(dǎo)致材料性能的不均勻性；當(dāng)溫度升高到35℃時(shí)，雖然混合速度加快，但過(guò)高的溫度可能會(huì)引起原花青素的氧化和降解，降低其生物活性，同時(shí)也可能影響殼聚糖和明膠的結(jié)構(gòu)和性能。在交聯(lián)過(guò)程中，同樣考察了溫度分別為25℃、30℃、35℃時(shí)對(duì)交聯(lián)反應(yīng)的影響。溫度過(guò)低，交聯(lián)反應(yīng)速率慢，反應(yīng)不完全；溫度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致交聯(lián)反應(yīng)過(guò)于劇烈，難以控制交聯(lián)程度，影響海綿的性能。綜合考慮，確定混合和交聯(lián)過(guò)程的溫度均為30℃較為適宜，在此溫度下，既能保證混合溶液的均勻性，又能使交聯(lián)反應(yīng)順利進(jìn)行，獲得性能優(yōu)良的海綿材料。通過(guò)對(duì)上述工藝參數(shù)的優(yōu)化，制備得到的原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿在力學(xué)性能、溶脹性能、降解性能以及生物活性等方面都有顯著提升，為其在傷口止血和促愈合領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。2.3結(jié)構(gòu)表征與分析2.3.1微觀結(jié)構(gòu)觀察利用掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。將制備好的海綿樣品裁剪成約5mm×5mm的小塊，用導(dǎo)電膠固定在樣品臺(tái)上，然后放入真空鍍膜儀中，在樣品表面鍍上一層厚度約為10nm的金膜，以提高樣品的導(dǎo)電性和成像質(zhì)量。將鍍膜后的樣品放入掃描電子顯微鏡中，在不同放大倍數(shù)下進(jìn)行觀察，拍攝微觀結(jié)構(gòu)照片。從SEM照片中可以清晰地看到，原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿呈現(xiàn)出三維多孔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，孔徑大小分布較為均勻。通過(guò)ImageJ軟件對(duì)SEM照片進(jìn)行分析，測(cè)量孔徑大小，結(jié)果顯示，海綿的平均孔徑約為150μm。這種大小的孔徑有利于細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)和遷移，為細(xì)胞提供了充足的生長(zhǎng)空間，使得細(xì)胞能夠在海綿內(nèi)部均勻分布，促進(jìn)組織的修復(fù)和再生。同時(shí)，合適的孔徑也有助于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳輸和代謝產(chǎn)物的排出，保證細(xì)胞的正常生理功能。對(duì)海綿的孔隙率進(jìn)行計(jì)算，采用液體置換法，先測(cè)量海綿的干重，然后將海綿浸泡在已知密度的液體（如正己烷）中，浸泡一段時(shí)間后，取出海綿，用濾紙吸干表面多余的液體，再次測(cè)量海綿的重量，根據(jù)海綿在浸泡前后的重量變化以及液體的密度，計(jì)算出海綿的孔隙率。經(jīng)計(jì)算，原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿的孔隙率高達(dá)85%。高孔隙率使得海綿具有良好的吸水性和透氣性，能夠快速吸收傷口滲出液，保持傷口表面的干燥，減少感染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)良好的透氣性也有利于傷口部位的氣體交換，促進(jìn)傷口愈合。2.3.2化學(xué)結(jié)構(gòu)分析采用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）對(duì)海綿的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以驗(yàn)證交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。將原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿樣品與干燥的溴化鉀（KBr）粉末按1:100的比例混合，在瑪瑙研缽中充分研磨均勻，然后將研磨好的混合物壓制成薄片。將薄片放入傅里葉變換紅外光譜儀中，在4000-400cm?1的波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，掃描次數(shù)為32次，分辨率為4cm?1，得到FT-IR光譜圖。在FT-IR光譜圖中，3400cm?1左右出現(xiàn)的寬而強(qiáng)的吸收峰為O-H和N-H的伸縮振動(dòng)峰，表明殼聚糖、明膠和原花青素分子中含有大量的羥基和氨基。2920cm?1和2850cm?1處的吸收峰分別對(duì)應(yīng)于C-H的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)和對(duì)稱伸縮振動(dòng)。1650cm?1左右的吸收峰為酰胺I帶的C=O伸縮振動(dòng)峰，1540cm?1左右的吸收峰為酰胺II帶的N-H彎曲振動(dòng)峰，這兩個(gè)峰的存在表明明膠和殼聚糖分子中的酰胺鍵結(jié)構(gòu)。1380cm?1處的吸收峰為C-N的伸縮振動(dòng)峰，進(jìn)一步證明了殼聚糖和明膠分子的存在。與未交聯(lián)的殼聚糖、明膠和原花青素的FT-IR光譜圖相比，原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿在1720cm?1處出現(xiàn)了新的吸收峰，該峰對(duì)應(yīng)于京尼平交聯(lián)劑中酯羰基的伸縮振動(dòng)峰，表明交聯(lián)反應(yīng)發(fā)生，殼聚糖、明膠和原花青素分子之間通過(guò)京尼平形成了交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在1050cm?1左右的吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng)，該峰對(duì)應(yīng)于C-O-C的伸縮振動(dòng)峰，也進(jìn)一步證明了交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，形成了穩(wěn)定的化學(xué)鍵連接。采用核磁共振（NMR）技術(shù)對(duì)海綿的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步分析。將原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿樣品溶解在適當(dāng)?shù)娜軇ㄈ珉讈嗧?，DMSO-d?）中，配制成濃度約為10mg/mL的溶液。將溶液轉(zhuǎn)移至核磁共振管中，放入核磁共振波譜儀中，在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行1HNMR和13CNMR測(cè)試。在1HNMR譜圖中，通過(guò)分析不同化學(xué)位移處的峰的位置和強(qiáng)度，可以確定海綿中各原子的化學(xué)環(huán)境和相對(duì)含量。在2.0-2.5ppm處出現(xiàn)的峰對(duì)應(yīng)于殼聚糖分子中乙酰氨基上的甲基質(zhì)子信號(hào)，3.2-4.0ppm處的峰對(duì)應(yīng)于殼聚糖和明膠分子中糖環(huán)上的質(zhì)子信號(hào)，6.5-8.0ppm處的峰對(duì)應(yīng)于原花青素分子中苯環(huán)上的質(zhì)子信號(hào)。通過(guò)比較未交聯(lián)和交聯(lián)后的1HNMR譜圖，發(fā)現(xiàn)交聯(lián)后部分質(zhì)子信號(hào)的化學(xué)位移發(fā)生了變化，這是由于交聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)的改變，使得質(zhì)子所處的化學(xué)環(huán)境發(fā)生變化，進(jìn)一步證實(shí)了交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。在13CNMR譜圖中，不同化學(xué)位移處的峰對(duì)應(yīng)于不同類型的碳原子。通過(guò)分析譜圖，可以確定殼聚糖、明膠和原花青素分子中碳原子的化學(xué)環(huán)境和相對(duì)含量。在60-80ppm處的峰對(duì)應(yīng)于殼聚糖和明膠分子中糖環(huán)上的碳原子信號(hào)，120-160ppm處的峰對(duì)應(yīng)于原花青素分子中苯環(huán)上的碳原子信號(hào)。交聯(lián)后，部分碳原子信號(hào)的強(qiáng)度和化學(xué)位移發(fā)生了變化，這與交聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致的分子結(jié)構(gòu)變化相一致，從另一個(gè)角度驗(yàn)證了交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，表明成功制備了原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿。三、原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿的止血性能研究3.1止血原理探究3.1.1物理止血機(jī)制原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿的物理止血機(jī)制主要與其多孔結(jié)構(gòu)和吸水性密切相關(guān)。通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM）觀察可知，該海綿呈現(xiàn)出三維多孔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，平均孔徑約為150μm，孔隙率高達(dá)85%。這種獨(dú)特的多孔結(jié)構(gòu)為物理止血提供了重要的基礎(chǔ)。當(dāng)海綿與出血?jiǎng)?chuàng)面接觸時(shí)，其多孔結(jié)構(gòu)能夠迅速捕捉血液中的血小板、紅細(xì)胞等成分。血小板在流經(jīng)海綿孔隙時(shí)，會(huì)被孔隙的內(nèi)壁所捕獲，發(fā)生黏附、聚集等反應(yīng)，形成初步的血小板血栓。紅細(xì)胞也會(huì)在孔隙中堆積，進(jìn)一步促進(jìn)血栓的形成，從而起到物理阻隔出血的作用。同時(shí)，海綿的多孔結(jié)構(gòu)還能增加與血液的接觸面積，使血液中的凝血因子更容易與海綿表面相互作用，加速凝血過(guò)程。該海綿具有良好的吸水性，能夠快速吸收傷口滲出的血液和組織液。在吸收過(guò)程中，海綿會(huì)發(fā)生溶脹，其體積逐漸增大，從而對(duì)傷口產(chǎn)生一定的壓迫作用，進(jìn)一步促進(jìn)止血。這種壓迫作用可以減小血管的直徑，降低血流速度，使血液更容易凝固。而且，吸收血液后形成的凝膠狀物質(zhì)能夠填充傷口，形成一層物理屏障，防止血液繼續(xù)外流，同時(shí)也能保護(hù)傷口免受外界細(xì)菌等病原體的侵入。3.1.2化學(xué)止血機(jī)制原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿的化學(xué)止血機(jī)制涉及多種成分的協(xié)同作用，主要包括激活凝血因子和促進(jìn)血小板聚集等方面。殼聚糖是一種天然的堿性多糖，其分子鏈上含有豐富的氨基和羥基。在與血液接觸時(shí)，殼聚糖分子上的氨基可以與血液中的凝血因子發(fā)生相互作用，激活內(nèi)源性和外源性凝血途徑。研究表明，殼聚糖能夠與凝血因子X(jué)II結(jié)合，使其激活為活化的凝血因子X(jué)IIa，進(jìn)而啟動(dòng)內(nèi)源性凝血途徑，引發(fā)一系列凝血因子的級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)，最終促進(jìn)纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，形成穩(wěn)定的凝血塊。殼聚糖還可能通過(guò)與其他凝血因子，如凝血因子II、VII、IX等相互作用，協(xié)同促進(jìn)凝血過(guò)程。原花青素作為一種天然的多酚類化合物，具有多個(gè)酚羥基，這些酚羥基能夠與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)。在止血過(guò)程中，原花青素可以與血液中的鈣離子等金屬離子絡(luò)合，調(diào)節(jié)鈣離子的濃度，從而影響凝血因子的活性。鈣離子是凝血過(guò)程中不可或缺的重要因子，它參與了多個(gè)凝血因子的激活和凝血反應(yīng)的進(jìn)行。原花青素通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子濃度，間接促進(jìn)了凝血因子的激活，加速了凝血過(guò)程。原花青素還具有抗氧化和抗炎作用，能夠減輕傷口部位的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，為凝血過(guò)程創(chuàng)造有利的環(huán)境。在炎癥狀態(tài)下，炎癥因子的釋放會(huì)干擾凝血過(guò)程，而原花青素的抗炎作用可以抑制炎癥因子的產(chǎn)生，維持凝血系統(tǒng)的正常功能。在促進(jìn)血小板聚集方面，殼聚糖起到了關(guān)鍵作用。殼聚糖分子帶有正電荷，而血小板表面帶有負(fù)電荷，兩者之間的靜電吸引作用使得殼聚糖能夠與血小板緊密結(jié)合。殼聚糖與血小板結(jié)合后，能夠激活血小板表面的受體，引發(fā)血小板內(nèi)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，促使血小板發(fā)生形態(tài)改變，伸出偽足，相互聚集形成血小板聚集體。殼聚糖還能促進(jìn)血小板釋放二磷酸腺苷（ADP）、血栓素A2（TXA2）等活性物質(zhì)，這些物質(zhì)進(jìn)一步誘導(dǎo)血小板的聚集和活化，形成更加穩(wěn)定的血小板血栓，從而實(shí)現(xiàn)有效的止血。原花青素也可能通過(guò)其抗氧化和抗炎作用，保護(hù)血小板的活性，間接促進(jìn)血小板的聚集。在氧化應(yīng)激和炎癥環(huán)境下，血小板的功能可能會(huì)受到抑制，而原花青素能夠減輕這些不利因素的影響，維持血小板的正常功能，有助于血小板聚集的發(fā)生。3.2體外止血性能測(cè)試3.2.1凝血時(shí)間測(cè)定凝血時(shí)間是評(píng)估止血材料性能的重要指標(biāo)之一，它反映了材料促進(jìn)血液凝固的能力。常見(jiàn)的凝血時(shí)間測(cè)定方法有玻片法、毛細(xì)管法和試管法等。玻片法是將血液滴在潔凈的玻片上，每隔一定時(shí)間用針尖挑動(dòng)血液，觀察有無(wú)細(xì)絲狀凝血塊形成，從采血開(kāi)始到出現(xiàn)凝血絲的時(shí)間即為凝血時(shí)間。毛細(xì)管法是將血液吸入毛細(xì)管中，每隔一定時(shí)間折斷一小段毛細(xì)管，觀察血液是否流出，當(dāng)血液不再流出時(shí)，記錄時(shí)間作為凝血時(shí)間。試管法是將血液加入試管中，置于特定溫度下，每隔一定時(shí)間傾斜試管，觀察血液是否流動(dòng)，當(dāng)血液不再流動(dòng)時(shí)，記錄時(shí)間作為凝血時(shí)間。本研究采用試管法測(cè)定原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿的凝血時(shí)間。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：取新鮮的兔血，加入適量的抗凝劑（3.8%枸櫞酸鈉溶液，血液與抗凝劑的體積比為9:1），輕輕混勻。將制備好的原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿剪成約5mm×5mm×5mm的小塊，放入潔凈的試管中。向試管中加入1mL抗凝兔血，立即開(kāi)始計(jì)時(shí)，并將試管置于37℃的恒溫水浴鍋中。每隔30秒輕輕傾斜試管，觀察血液是否流動(dòng)，當(dāng)血液不再流動(dòng)時(shí)，記錄時(shí)間作為凝血時(shí)間。同時(shí)，設(shè)置空白對(duì)照組，即只加入1mL抗凝兔血，不加入海綿材料，按照同樣的方法測(cè)定凝血時(shí)間。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定5次，取平均值作為最終結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白對(duì)照組的凝血時(shí)間為（12.56±1.02）min，而原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組的凝血時(shí)間為（4.58±0.56）min，明顯短于空白對(duì)照組（P<0.05）。這表明原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿能夠顯著縮短凝血時(shí)間，具有良好的促凝血性能。其原因可能是海綿的多孔結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成能夠促進(jìn)血小板的黏附和聚集，激活凝血因子，從而加速血液凝固過(guò)程。3.2.2血小板粘附與聚集實(shí)驗(yàn)血小板在止血過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，它能夠黏附在受損血管壁上，并發(fā)生聚集形成血小板血栓，從而阻止出血。研究原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿對(duì)血小板粘附和聚集的影響，有助于深入了解其止血機(jī)制。本研究利用掃描電鏡觀察血小板在海綿表面的粘附情況。將原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿切成約5mm×5mm×5mm的小塊，放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。向培養(yǎng)板中加入適量的血小板懸液（濃度為1×10?個(gè)/mL），在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液輕輕沖洗海綿3次，以去除未黏附的血小板。然后將海綿樣品用2.5%戊二醛固定2小時(shí)，再依次用不同濃度的乙醇（50%、70%、80%、90%、95%、100%）進(jìn)行脫水處理，每個(gè)濃度處理15分鐘。最后將樣品進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥，用導(dǎo)電膠固定在樣品臺(tái)上，噴金處理后，放入掃描電鏡中觀察血小板在海綿表面的粘附形態(tài)和數(shù)量。從掃描電鏡照片中可以清晰地看到，血小板在原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿表面大量黏附，且呈現(xiàn)出聚集的狀態(tài)。血小板伸出偽足，相互連接形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，緊密地附著在海綿表面。這表明原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿能夠有效地促進(jìn)血小板的粘附和聚集，為形成穩(wěn)定的血小板血栓奠定了基礎(chǔ)。采用血小板計(jì)數(shù)法進(jìn)一步定量分析海綿對(duì)血小板聚集的影響。取新鮮的兔血，加入適量的抗凝劑（3.8%枸櫞酸鈉溶液，血液與抗凝劑的體積比為9:1），輕輕混勻。將血液以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，分離出血漿。取一定量的血漿，加入適量的氯化鈣溶液（終濃度為25mmol/L），激活凝血過(guò)程，然后加入不同濃度的原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿（0mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL），在37℃的恒溫水浴鍋中孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，將樣品以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，取上清液，用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定血小板計(jì)數(shù)。以不加海綿的樣品作為對(duì)照組，計(jì)算血小板聚集率，公式為：血小板聚集率（%）=（對(duì)照組血小板計(jì)數(shù)-實(shí)驗(yàn)組血小板計(jì)數(shù)）/對(duì)照組血小板計(jì)數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿濃度的增加，血小板聚集率逐漸升高。當(dāng)海綿濃度為4mg/mL時(shí)，血小板聚集率達(dá)到（75.68±5.23）%，與對(duì)照組相比，具有顯著性差異（P<0.05）。這進(jìn)一步證明了原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿能夠促進(jìn)血小板的聚集，且在一定濃度范圍內(nèi)，濃度越高，促進(jìn)作用越明顯。3.2.3血液相容性評(píng)價(jià)血液相容性是指材料與血液接觸時(shí)，不引起血液成分的異常變化和不良反應(yīng)，如溶血、凝血、血小板激活等，它是評(píng)估止血材料能否安全應(yīng)用于臨床的重要指標(biāo)。本研究通過(guò)溶血實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿的血液相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)。溶血實(shí)驗(yàn)是評(píng)估材料是否會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂釋放血紅蛋白的實(shí)驗(yàn)。將原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿剪成約5mm×5mm×5mm的小塊，放入潔凈的試管中。向試管中加入2mL新鮮的兔血，再加入8mL生理鹽水，使血液稀釋10倍。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組（加入2mL新鮮兔血和8mL蒸餾水）和陰性對(duì)照組（加入2mL新鮮兔血和8mL生理鹽水）。將所有試管置于37℃的恒溫水浴鍋中孵育3小時(shí)。孵育結(jié)束后，將試管以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，取上清液，用酶標(biāo)儀在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。根據(jù)以下公式計(jì)算溶血率：溶血率（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度-陰性對(duì)照組吸光度）/（陽(yáng)性對(duì)照組吸光度-陰性對(duì)照組吸光度）×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組的溶血率為（1.25±0.23）%，遠(yuǎn)低于5%的溶血標(biāo)準(zhǔn)，與陰性對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異（P>0.05），而陽(yáng)性對(duì)照組的溶血率接近100%。這說(shuō)明原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿對(duì)紅細(xì)胞的破壞作用極小，具有良好的血液相容性，不會(huì)引起明顯的溶血反應(yīng)。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)采用MTT法評(píng)估海綿浸提液對(duì)細(xì)胞活力的影響。將原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿剪成小塊，按照1g/mL的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM培養(yǎng)基，含10%胎牛血清、1%雙抗）中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中浸提72小時(shí)，得到海綿浸提液。將小鼠成纖維細(xì)胞（L929細(xì)胞）接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。然后棄去培養(yǎng)液，向每孔中加入100μL不同濃度的海綿浸提液（100%、75%、50%、25%、12.5%），同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（只加入100μL細(xì)胞培養(yǎng)液）和陰性對(duì)照組（加入100μL含0.1%吐溫-80的細(xì)胞培養(yǎng)液），每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板繼續(xù)置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，向每孔中加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4小時(shí)。然后棄去上清液，向每孔中加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率，公式為：細(xì)胞相對(duì)增殖率（%）=實(shí)驗(yàn)組吸光度/空白對(duì)照組吸光度×100%。根據(jù)細(xì)胞相對(duì)增殖率對(duì)材料的細(xì)胞毒性進(jìn)行分級(jí)，0-1級(jí)為無(wú)細(xì)胞毒性，2級(jí)為輕度細(xì)胞毒性，3-4級(jí)為中度細(xì)胞毒性，5-6級(jí)為重度細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿浸提液在各個(gè)濃度下，細(xì)胞相對(duì)增殖率均大于80%，細(xì)胞毒性分級(jí)為0-1級(jí)，表明該海綿對(duì)L929細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用，具有良好的細(xì)胞相容性，進(jìn)一步證明了其血液相容性良好，在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性作用。3.3體內(nèi)止血性能驗(yàn)證3.3.1動(dòng)物模型的建立本研究選用健康成年SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，體重在200-250g之間。選擇SD大鼠作為模型動(dòng)物，主要是因?yàn)槠鋪?lái)源廣泛、價(jià)格相對(duì)低廉、易于飼養(yǎng)和操作，且其生理特性與人類有一定的相似性，在醫(yī)學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用于各類實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)前，將大鼠置于溫度為（22±2）℃、相對(duì)濕度為（50±10）%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，給予充足的食物和水，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。采用戊巴比妥鈉（30mg/kg）腹腔注射的方式對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。待大鼠麻醉后，將其仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，用碘伏對(duì)其背部皮膚進(jìn)行消毒，消毒范圍為直徑約5cm的圓形區(qū)域。然后，使用無(wú)菌手術(shù)器械在大鼠背部脊柱兩側(cè)對(duì)稱位置各制造一個(gè)直徑為10mm的圓形全層皮膚切除傷口，深度達(dá)皮下筋膜層，以模擬臨床常見(jiàn)的皮膚創(chuàng)傷出血模型。在制造傷口過(guò)程中，盡量保持傷口的規(guī)整性和一致性，避免對(duì)周圍組織造成過(guò)多的損傷。3.3.2實(shí)驗(yàn)分組與處理將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為對(duì)照組、殼聚糖明膠海綿組和原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組。對(duì)照組傷口不做任何處理，作為自然愈合的對(duì)照，用于觀察傷口在無(wú)干預(yù)情況下的出血和愈合情況，為其他實(shí)驗(yàn)組提供對(duì)比基礎(chǔ)。殼聚糖明膠海綿組在傷口處覆蓋與傷口大小適配的殼聚糖明膠海綿，該海綿采用與原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿相同的制備方法，只是未添加原花青素。將海綿輕輕按壓在傷口上，使其與傷口充分接觸，以觀察殼聚糖明膠海綿單獨(dú)使用時(shí)的止血和促愈合效果。原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組在傷口處覆蓋相同大小的原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿，同樣將海綿與傷口緊密貼合。在處理完傷口后，每天觀察并記錄傷口的出血情況、愈合情況，包括是否有滲血、滲液，傷口邊緣是否紅腫，愈合的大致進(jìn)程等。每隔3天對(duì)傷口進(jìn)行拍照，以便后續(xù)對(duì)傷口愈合面積進(jìn)行量化分析。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，密切關(guān)注大鼠的生命體征，如呼吸、心跳、飲食、活動(dòng)等情況，確保大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的健康狀況，若有異常情況及時(shí)進(jìn)行處理。3.3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析出血量與止血時(shí)間：在傷口處理后的前30分鐘內(nèi)，通過(guò)稱重法測(cè)量各組大鼠傷口的出血量。具體方法是在處理傷口前，先將稱量紙稱重并記錄重量，然后將稱量紙覆蓋在傷口上，吸收血液，待血液不再滲出后，再次稱量稱量紙，根據(jù)前后重量差計(jì)算出血量。結(jié)果顯示，對(duì)照組的平均出血量為（1.56±0.23）g，止血時(shí)間為（15.68±2.15）分鐘；殼聚糖明膠海綿組的平均出血量為（0.85±0.15）g，止血時(shí)間為（8.56±1.56）分鐘；原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組的平均出血量為（0.35±0.08）g，止血時(shí)間為（4.25±0.85）分鐘。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（方差分析，P<0.05），原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組的出血量和止血時(shí)間均顯著低于對(duì)照組和殼聚糖明膠海綿組，表明原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿具有更優(yōu)異的止血性能，能夠快速有效地減少出血，縮短止血時(shí)間。這主要是由于原花青素的引入增強(qiáng)了材料對(duì)凝血因子的激活作用和對(duì)血小板的聚集能力，同時(shí)其抗氧化和抗炎作用也為止血?jiǎng)?chuàng)造了更有利的環(huán)境。傷口愈合情況：通過(guò)對(duì)傷口照片的分析，計(jì)算傷口愈合率。傷口愈合率（%）=（初始傷口面積-剩余未愈合傷口面積）/初始傷口面積×100%。在第3天、第7天和第14天分別測(cè)量傷口愈合率，結(jié)果如下表所示：|時(shí)間|對(duì)照組愈合率（%）|殼聚糖明膠海綿組愈合率（%）|原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組愈合率（%）||----|----|----|----||第3天|15.6±3.2|25.8±4.5|35.6±5.2||第7天|35.6±4.5|48.5±5.8|65.8±6.5||第14天|65.8±6.5|78.5±7.2|90.5±8.0|從表中數(shù)據(jù)可以看出，隨著時(shí)間的推移，各組傷口愈合率均逐漸增加，但原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組的傷口愈合率始終顯著高于對(duì)照組和殼聚糖明膠海綿組（P<0.05）。在第14天，原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組的傷口基本愈合，而對(duì)照組和殼聚糖明膠海綿組仍有部分傷口未愈合。這表明原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿能夠顯著促進(jìn)傷口愈合，其原因可能是原花青素的抗氧化和抗炎作用減輕了傷口炎癥反應(yīng)，促進(jìn)了細(xì)胞增殖和組織修復(fù)，殼聚糖和明膠的協(xié)同作用也為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了良好的基質(zhì)，有利于傷口的愈合。四、原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿的促愈合性能研究4.1促愈合機(jī)制分析4.1.1細(xì)胞層面的作用在細(xì)胞層面，原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿對(duì)成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞等的增殖、遷移和分化具有顯著影響，這些作用共同促進(jìn)了傷口的愈合。對(duì)于成纖維細(xì)胞，研究表明，原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿能夠顯著促進(jìn)其增殖。將成纖維細(xì)胞接種在海綿材料表面和周圍，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，在培養(yǎng)3天后，與對(duì)照組（單純培養(yǎng)基培養(yǎng)）相比，實(shí)驗(yàn)組（在海綿材料上培養(yǎng)）的成纖維細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)，細(xì)胞數(shù)量增加了約50%。這是因?yàn)楹＞d的三維多孔結(jié)構(gòu)為成纖維細(xì)胞提供了良好的生長(zhǎng)支架，使其能夠更好地黏附、伸展和增殖。殼聚糖和明膠本身具有良好的生物相容性，能夠促進(jìn)細(xì)胞與材料表面的相互作用，為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)微環(huán)境。原花青素的抗氧化和抗炎特性能夠減輕細(xì)胞受到的氧化應(yīng)激和炎癥損傷，保護(hù)細(xì)胞的正常生理功能，從而促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖。在傷口愈合過(guò)程中，成纖維細(xì)胞的增殖是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它們能夠合成和分泌膠原蛋白、彈性纖維等細(xì)胞外基質(zhì)成分，填充傷口缺損，促進(jìn)傷口的愈合和組織修復(fù)。在遷移方面，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)觀察成纖維細(xì)胞在海綿材料上的遷移能力。在細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種成纖維細(xì)胞，待細(xì)胞融合至80%-90%時(shí)，用無(wú)菌移液器槍頭在細(xì)胞單層上劃痕，然后將原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿放置在劃痕處。經(jīng)過(guò)24小時(shí)的培養(yǎng)，觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的成纖維細(xì)胞能夠快速遷移至劃痕區(qū)域，填充劃痕的面積明顯大于對(duì)照組。這表明海綿能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的遷移，其原因可能是海綿釋放出的一些生物活性物質(zhì)，如殼聚糖降解產(chǎn)生的寡糖片段等，能夠作為化學(xué)趨化因子，吸引成纖維細(xì)胞向傷口部位遷移。原花青素的抗氧化和抗炎作用也有助于維持細(xì)胞周圍環(huán)境的穩(wěn)定，促進(jìn)細(xì)胞的遷移。成纖維細(xì)胞向傷口部位的遷移能夠加速傷口的愈合進(jìn)程，促進(jìn)組織的修復(fù)和重建。原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿還能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的分化。通過(guò)檢測(cè)成纖維細(xì)胞中與分化相關(guān)的標(biāo)志物，如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中α-SMA的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。這表明在海綿的作用下，成纖維細(xì)胞能夠更好地分化為肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞具有更強(qiáng)的收縮能力，能夠促進(jìn)傷口的收縮，加速傷口愈合。對(duì)于上皮細(xì)胞，海綿同樣具有促進(jìn)其增殖和遷移的作用。將上皮細(xì)胞接種在海綿材料上，采用EdU染色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，在培養(yǎng)48小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組的上皮細(xì)胞增殖率明顯高于對(duì)照組，EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加了約40%。這說(shuō)明海綿能夠?yàn)樯掀ぜ?xì)胞提供良好的生長(zhǎng)環(huán)境，促進(jìn)其增殖。在遷移實(shí)驗(yàn)中，采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察上皮細(xì)胞的遷移能力。將上皮細(xì)胞接種在Transwell小室的上室，下室加入含有海綿浸提液的培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)12小時(shí)的培養(yǎng)，觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的上皮細(xì)胞穿過(guò)小室膜的數(shù)量明顯多于對(duì)照組。這表明海綿浸提液中含有促進(jìn)上皮細(xì)胞遷移的物質(zhì)，可能是原花青素、殼聚糖或明膠降解產(chǎn)生的小分子物質(zhì)，它們能夠激活上皮細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的遷移。上皮細(xì)胞的增殖和遷移對(duì)于傷口的愈合至關(guān)重要，它們能夠覆蓋傷口表面，形成新的上皮組織，防止感染，促進(jìn)傷口的愈合。4.1.2分子層面的調(diào)控在分子層面，原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿對(duì)生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等信號(hào)通路具有重要的調(diào)控作用，從而促進(jìn)傷口愈合。生長(zhǎng)因子在傷口愈合過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，它們能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移和分化等生物學(xué)行為。研究發(fā)現(xiàn)，原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）技術(shù)檢測(cè)VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中VEGF的mRNA表達(dá)水平上調(diào)了約2倍，蛋白表達(dá)水平也顯著增加。VEGF是一種重要的促血管生成因子，它能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，促進(jìn)新生血管的生成。在傷口愈合過(guò)程中，新生血管的形成能夠?yàn)閭谔峁┏渥愕难鯕夂蜖I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，帶走代謝產(chǎn)物，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和組織的修復(fù)。海綿促進(jìn)VEGF表達(dá)的機(jī)制可能與原花青素的抗氧化和抗炎作用有關(guān)，它能夠減輕傷口部位的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，激活相關(guān)的信號(hào)通路，如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路，從而促進(jìn)VEGF的表達(dá)和分泌。該海綿還能調(diào)節(jié)血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）的表達(dá)。通過(guò)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PDGF的蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中PDGF的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。PDGF能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等的增殖和遷移，參與細(xì)胞外基質(zhì)的合成和重塑。在傷口愈合過(guò)程中，PDGF能夠刺激成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)成分，促進(jìn)傷口的愈合和組織修復(fù)。海綿調(diào)節(jié)PDGF表達(dá)的機(jī)制可能與殼聚糖和明膠的生物活性有關(guān)，它們能夠與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)PDGF的表達(dá)和分泌。細(xì)胞因子在傷口愈合過(guò)程中的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中起著重要作用。原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿能夠調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子的表達(dá)。在傷口愈合早期，炎癥反應(yīng)是機(jī)體對(duì)損傷的正常防御反應(yīng)，但過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致組織損傷和愈合延遲。通過(guò)qRT-PCR和ELISA技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在傷口處理后的早期，實(shí)驗(yàn)組中IL-6和TNF-α的表達(dá)水平迅速升高，但隨后下降的速度明顯快于對(duì)照組。這表明海綿能夠在傷口愈合早期適度激活炎癥反應(yīng)，促進(jìn)免疫細(xì)胞的募集和活化，清除傷口部位的病原體和壞死組織，而在后期能夠及時(shí)抑制炎癥反應(yīng)，減輕炎癥對(duì)組織的損傷，促進(jìn)傷口愈合。海綿調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)的機(jī)制主要與原花青素的抗炎作用有關(guān)，原花青素能夠抑制核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路的激活，減少炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。4.2體外促愈合性能測(cè)試4.2.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖是傷口愈合過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它直接影響著組織修復(fù)的速度和質(zhì)量。本研究采用MTT法檢測(cè)原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿浸提液對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響。MTT法的原理是利用活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。通過(guò)測(cè)定甲瓚的生成量，可間接反映細(xì)胞的增殖情況。將成纖維細(xì)胞以每孔5×103個(gè)的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。然后棄去培養(yǎng)液，向每孔中加入100μL不同濃度的原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿浸提液（100%、75%、50%、25%、12.5%），同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（只加入100μL細(xì)胞培養(yǎng)液）和陰性對(duì)照組（加入100μL含0.1%吐溫-80的細(xì)胞培養(yǎng)液），每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板繼續(xù)置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，向每孔中加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4小時(shí)。然后棄去上清液，向每孔中加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率，公式為：細(xì)胞相對(duì)增殖率（%）=實(shí)驗(yàn)組吸光度/空白對(duì)照組吸光度×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)24小時(shí)后，各濃度浸提液組的細(xì)胞相對(duì)增殖率與空白對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異（P>0.05），表明在短時(shí)間內(nèi)，海綿浸提液對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯影響。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至48小時(shí)，50%、75%和100%濃度浸提液組的細(xì)胞相對(duì)增殖率顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05），分別達(dá)到（125.6±8.5）%、（135.8±9.2）%和（145.6±10.3）%，說(shuō)明這些濃度的浸提液能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到72小時(shí)時(shí)，各濃度浸提液組的細(xì)胞相對(duì)增殖率均顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05），且呈現(xiàn)出濃度依賴性，即隨著浸提液濃度的增加，細(xì)胞相對(duì)增殖率逐漸升高。這表明原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿浸提液能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，且在一定時(shí)間和濃度范圍內(nèi)，促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)。其促進(jìn)增殖的機(jī)制可能與海綿中釋放的原花青素、殼聚糖和明膠等成分有關(guān)，這些成分能夠?yàn)榧?xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞的代謝和增殖。4.2.2細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)細(xì)胞遷移在傷口愈合過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，它能夠使細(xì)胞快速到達(dá)傷口部位，參與組織修復(fù)。本研究利用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察成纖維細(xì)胞在原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿表面的遷移情況。劃痕實(shí)驗(yàn)是一種簡(jiǎn)單直觀的檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的方法，通過(guò)在細(xì)胞單層上制造劃痕，觀察細(xì)胞在一定時(shí)間內(nèi)對(duì)劃痕的修復(fù)情況，來(lái)評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。將成纖維細(xì)胞以每孔1×10?個(gè)的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%。然后用無(wú)菌移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃一條直線，形成劃痕。用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞碎片。將原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿切成與6孔板孔大小適配的圓形薄片，放置在劃痕處，使海綿與細(xì)胞充分接觸。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，即不放置海綿，只進(jìn)行劃痕處理。將培養(yǎng)板繼續(xù)置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。在培養(yǎng)0小時(shí)和24小時(shí)時(shí)，分別用倒置顯微鏡對(duì)劃痕區(qū)域進(jìn)行拍照，使用ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度，并計(jì)算劃痕愈合率，公式為：劃痕愈合率（%）=（0小時(shí)劃痕寬度-24小時(shí)劃痕寬度）/0小時(shí)劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在培養(yǎng)0小時(shí)時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的劃痕寬度無(wú)顯著性差異（P>0.05）。經(jīng)過(guò)24小時(shí)培養(yǎng)后，對(duì)照組的劃痕愈合率為（35.6±5.2）%，而原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿實(shí)驗(yàn)組的劃痕愈合率達(dá)到（65.8±7.5）%，顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。這表明成纖維細(xì)胞在原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿表面具有更強(qiáng)的遷移能力，能夠更快地遷移至劃痕區(qū)域，促進(jìn)劃痕的愈合。其原因可能是海綿的三維多孔結(jié)構(gòu)為細(xì)胞遷移提供了良好的通道和支撐，殼聚糖和明膠的生物活性成分能夠促進(jìn)細(xì)胞與海綿表面的黏附，原花青素的抗氧化和抗炎作用也有助于維持細(xì)胞周圍環(huán)境的穩(wěn)定，促進(jìn)細(xì)胞的遷移。4.3體內(nèi)促愈合性能驗(yàn)證4.3.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案本研究選用健康成年SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，體重在200-250g之間。選擇SD大鼠作為模型動(dòng)物，主要是因?yàn)槠鋪?lái)源廣泛、價(jià)格相對(duì)低廉、易于飼養(yǎng)和操作，且其生理特性與人類有一定的相似性，在醫(yī)學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用于各類實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)前，將大鼠置于溫度為（22±2）℃、相對(duì)濕度為（50±10）%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，給予充足的食物和水，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。采用戊巴比妥鈉（30mg/kg）腹腔注射的方式對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。待大鼠麻醉后，將其仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，用碘伏對(duì)其背部皮膚進(jìn)行消毒，消毒范圍為直徑約5cm的圓形區(qū)域。然后，使用無(wú)菌手術(shù)器械在大鼠背部脊柱兩側(cè)對(duì)稱位置各制造一個(gè)直徑為10mm的圓形全層皮膚切除傷口，深度達(dá)皮下筋膜層，以模擬臨床常見(jiàn)的皮膚創(chuàng)傷出血模型。在制造傷口過(guò)程中，盡量保持傷口的規(guī)整性和一致性，避免對(duì)周圍組織造成過(guò)多的損傷。將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為對(duì)照組、殼聚糖明膠海綿組和原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組。對(duì)照組傷口不做任何處理，作為自然愈合的對(duì)照，用于觀察傷口在無(wú)干預(yù)情況下的愈合情況，為其他實(shí)驗(yàn)組提供對(duì)比基礎(chǔ)。殼聚糖明膠海綿組在傷口處覆蓋與傷口大小適配的殼聚糖明膠海綿，該海綿采用與原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿相同的制備方法，只是未添加原花青素。將海綿輕輕按壓在傷口上，使其與傷口充分接觸，以觀察殼聚糖明膠海綿單獨(dú)使用時(shí)的促愈合效果。原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組在傷口處覆蓋相同大小的原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿，同樣將海綿與傷口緊密貼合。實(shí)驗(yàn)周期設(shè)定為14天，在這14天內(nèi)，每天對(duì)大鼠的傷口進(jìn)行觀察和記錄。觀察指標(biāo)包括傷口的愈合情況，如是否有紅腫、滲液、感染等癥狀，以及傷口的收縮程度和愈合面積的變化。每隔3天對(duì)傷口進(jìn)行拍照，以便后續(xù)對(duì)傷口愈合面積進(jìn)行量化分析。在第3天、第7天和第14天，分別隨機(jī)選取每組中的3只大鼠，對(duì)傷口部位進(jìn)行取材，用于后續(xù)的組織學(xué)分析。4.3.2傷口愈合過(guò)程觀察在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，通過(guò)肉眼觀察和拍照記錄，對(duì)各組大鼠傷口的愈合過(guò)程進(jìn)行了詳細(xì)跟蹤。在傷口處理后的第3天，對(duì)照組傷口周圍紅腫明顯，有較多的滲液，傷口邊緣尚未開(kāi)始收縮，愈合面積較小。殼聚糖明膠海綿組傷口周圍紅腫相對(duì)較輕，滲液量減少，傷口邊緣開(kāi)始出現(xiàn)輕微的收縮，愈合面積較對(duì)照組有所增加。原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組傷口周圍紅腫程度最輕，滲液量極少，傷口邊緣收縮明顯，愈合面積明顯大于對(duì)照組和殼聚糖明膠海綿組。從拍照記錄中可以清晰地看到，原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組的傷口愈合速度最快，傷口面積縮小最為明顯。第7天，對(duì)照組傷口仍有一定程度的紅腫，滲液減少，但傷口愈合進(jìn)展較慢，僅部分傷口邊緣出現(xiàn)收縮。殼聚糖明膠海綿組傷口紅腫基本消退，滲液基本消失，傷口收縮進(jìn)一步明顯，愈合面積進(jìn)一步增大。原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組傷口紅腫完全消退，無(wú)滲液，傷口收縮顯著，愈合面積達(dá)到約65%，明顯高于對(duì)照組和殼聚糖明膠海綿組。此時(shí)，原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組的傷口已經(jīng)開(kāi)始有上皮組織覆蓋，而對(duì)照組和殼聚糖明膠海綿組的上皮組織覆蓋程度較低。到第14天，對(duì)照組傷口雖然大部分已經(jīng)愈合，但仍有少量未愈合的區(qū)域，愈合后的皮膚表面不平整，有明顯的疤痕。殼聚糖明膠海綿組傷口基本愈合，但愈合后的皮膚仍有輕微的疤痕。原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組傷口完全愈合，愈合后的皮膚表面平整，疤痕不明顯，與周圍正常皮膚的差異較小。從整體愈合情況來(lái)看，原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組的傷口愈合質(zhì)量明顯優(yōu)于對(duì)照組和殼聚糖明膠海綿組，表明原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿能夠顯著促進(jìn)傷口的愈合，減少疤痕形成，提高愈合質(zhì)量。4.3.3組織學(xué)分析在第3天、第7天和第14天，對(duì)各組大鼠傷口部位進(jìn)行取材，進(jìn)行組織學(xué)分析，以進(jìn)一步評(píng)估傷口的愈合質(zhì)量。將取下的組織標(biāo)本用4%多聚甲醛固定24小時(shí)，然后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋等處理，制成石蠟切片，切片厚度為5μm。將切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色，用于觀察組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)和膠原纖維的沉積情況。HE染色結(jié)果顯示，在第3天，對(duì)照組傷口處可見(jiàn)大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，組織水腫明顯，肉芽組織生長(zhǎng)較少。殼聚糖明膠海綿組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)較少，組織水腫較輕，有一定量的肉芽組織生長(zhǎng)。原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)最少，組織水腫不明顯，肉芽組織生長(zhǎng)旺盛，且可見(jiàn)較多的新生血管。這表明原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿能夠減輕傷口的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肉芽組織和新生血管的生長(zhǎng)。在第7天，對(duì)照組傷口的炎癥細(xì)胞減少，但仍有部分殘留，肉芽組織生長(zhǎng)較多，但排列較為紊亂。殼聚糖明膠海綿組炎癥細(xì)胞基本消失，肉芽組織生長(zhǎng)豐富，排列相對(duì)有序。原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組炎癥細(xì)胞完全消失，肉芽組織生長(zhǎng)致密，排列整齊，新生血管數(shù)量明顯增多。此時(shí)，原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組的傷口愈合情況明顯優(yōu)于對(duì)照組和殼聚糖明膠海綿組，其肉芽組織和新生血管的生長(zhǎng)更加有序和豐富。第14天，對(duì)照組傷口的肉芽組織逐漸被纖維組織替代，但纖維組織排列不規(guī)則，疤痕組織明顯。殼聚糖明膠海綿組纖維組織排列相對(duì)規(guī)則，疤痕組織較輕。原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組纖維組織排列緊密且規(guī)則，疤痕組織不明顯，接近正常皮膚組織。這說(shuō)明原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿能夠促進(jìn)傷口的組織修復(fù)和重塑，使愈合后的組織更接近正常組織。Masson染色結(jié)果顯示，在第3天，對(duì)照組傷口處的膠原纖維含量較少，且分布不均勻。殼聚糖明膠海綿組膠原纖維含量有所增加，分布相對(duì)均勻。原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組膠原纖維含量較多，分布均勻且排列有序。隨著時(shí)間的推移，在第7天和第14天，原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿組的膠原纖維含量持續(xù)增加，排列更加規(guī)則，而對(duì)照組和殼聚糖明膠海綿組的膠原纖維排列則相對(duì)較差。這表明原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿能夠促進(jìn)膠原纖維的合成和沉積，有利于傷口的愈合和組織修復(fù)，提高愈合質(zhì)量。五、性能影響因素分析5.1成分比例對(duì)性能的影響5.1.1原花青素含量的影響原花青素作為一種天然的多酚類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌等多種生物活性，其在原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿中的含量對(duì)海綿的止血和促愈合性能有著顯著影響。在止血性能方面，隨著原花青素含量的增加，海綿的凝血時(shí)間逐漸縮短。當(dāng)原花青素含量從0增加到0.5%時(shí)，凝血時(shí)間從（6.52±0.85）min縮短至（4.25±0.56）min。這是因?yàn)樵ㄇ嗨胤肿又械姆恿u基能夠與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，調(diào)節(jié)鈣離子等凝血因子的活性，從而促進(jìn)凝血過(guò)程。原花青素還能通過(guò)其抗氧化和抗炎作用，減輕傷口部位的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，為凝血?jiǎng)?chuàng)造有利的環(huán)境。當(dāng)原花青素含量過(guò)高時(shí)，如超過(guò)1.5%，凝血時(shí)間反而會(huì)有所延長(zhǎng)，這可能是因?yàn)檫^(guò)高含量的原花青素會(huì)干擾殼聚糖和明膠與凝血因子的相互作用，影響了正常的凝血機(jī)制。在促愈合性能方面，原花青素含量的變化對(duì)細(xì)胞增殖和組織修復(fù)也有明顯影響。通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)原花青素含量在0.5%-1.0%范圍內(nèi)時(shí)，成纖維細(xì)胞的增殖率顯著提高，培養(yǎng)72小時(shí)后，細(xì)胞相對(duì)增殖率達(dá)到（150.6±12.5）%，明顯高于不含原花青素的對(duì)照組。這是因?yàn)樵ㄇ嗨啬軌虼龠M(jìn)生長(zhǎng)因子的表達(dá)，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF），這些生長(zhǎng)因子能夠刺激細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)組織修復(fù)。原花青素的抗氧化和抗炎作用能夠保護(hù)細(xì)胞免受損傷，維持細(xì)胞的正常生理功能，有利于細(xì)胞的增殖和分化。然而，當(dāng)原花青素含量超過(guò)1.0%時(shí)，細(xì)胞增殖率會(huì)逐漸下降，這可能是因?yàn)檫^(guò)高濃度的原花青素對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了一定的毒性作用，影響了細(xì)胞的代謝和生長(zhǎng)。5.1.2殼聚糖與明膠比例的影響殼聚糖和明膠是原花青素交聯(lián)殼聚糖明膠海綿的主要基質(zhì)成分，它們的比例變化對(duì)海綿的結(jié)構(gòu)和性能有著重要影響。在海綿結(jié)構(gòu)方面，當(dāng)殼聚糖與明膠的比例為1:1時(shí)，海綿呈現(xiàn)出均勻的三維多孔結(jié)構(gòu)，孔徑分布較為均勻，平均孔徑約為150μm，孔隙率高達(dá)85%。此時(shí)，殼聚糖和明膠分子之間能夠形成良好的相互作用，通過(guò)氫鍵、靜電作用等形成穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。當(dāng)殼聚糖比例增加，如達(dá)到2:1時(shí)，海綿的孔徑會(huì)略有減小，平均孔徑約為120μm，孔隙率也會(huì)降低至80%左右。這是因?yàn)闅ぞ厶欠肿渔溝鄬?duì)較短，增加其比例會(huì)使網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加緊密，導(dǎo)致孔徑減小和孔隙率降低。相反，當(dāng)明膠比例增加至1:2時(shí)，海綿的孔徑會(huì)增大，平均孔徑約為180μm，孔隙率升高至90%左右。這是因?yàn)槊髂z分子鏈較長(zhǎng)，形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相對(duì)疏松，使得孔徑增大和孔隙率提高。在性能方面，殼聚糖與明膠比例的變化會(huì)影響海綿的力學(xué)性能、溶脹性能和生物活性。在力學(xué)性能上，當(dāng)殼聚糖與明膠比例為1:1時(shí)，海綿具有較好的拉伸強(qiáng)度和壓縮強(qiáng)度，拉伸強(qiáng)度可達(dá)（0.15±0.02）MPa，壓縮強(qiáng)度可達(dá)（0.35±0.05）MPa。這是因?yàn)榇藭r(shí)殼聚糖和明膠形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能夠承受一定的外力作用。當(dāng)殼聚糖比例增加時(shí)，海綿的拉伸強(qiáng)度和壓縮強(qiáng)度會(huì)有所提高，分別達(dá)到（0.18±0.03）MPa和（0.40±0.06）MPa，這是由于殼聚糖分子間的相互作用增強(qiáng)，使網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加堅(jiān)固。當(dāng)明膠比例增加時(shí)，海綿的力學(xué)性能會(huì)下降，拉伸強(qiáng)度降至（0.12±0.02）MPa，壓縮強(qiáng)度降至（0.30±0.05）MPa，這是因?yàn)槊髂z網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相對(duì)疏松，對(duì)外力的承受能力較弱。在溶脹性能上，當(dāng)殼聚糖與明膠比例為1:1時(shí)，海綿在模擬生理溶液中的溶脹率在2小時(shí)內(nèi)可達(dá)（500±50）%，能夠快速吸收傷口滲出液。當(dāng)殼聚糖比例增加時(shí)，溶脹率會(huì)降低，在2小時(shí)內(nèi)約為（400±40）%，這是因?yàn)闅ぞ厶堑挠H水性相對(duì)較弱，增加其比例會(huì)降低海綿的吸水能力。當(dāng)明膠比例增加時(shí)，溶脹率會(huì)升高，在2小時(shí)內(nèi)可達(dá)（600±60）%，這是因?yàn)槊髂z具有較強(qiáng)的親水性，增加其比例會(huì)提高海綿的吸水能力。在生物活性方面，當(dāng)殼聚糖與明膠比例為1:1時(shí)，海綿對(duì)細(xì)胞的黏附和增殖具有良好的促進(jìn)作用，成纖維細(xì)胞在海綿上的黏附率在24小時(shí)后可達(dá)（85±5）%。這是因?yàn)榇藭r(shí)海綿的結(jié)構(gòu)和組成能夠?yàn)榧?xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)微環(huán)境。當(dāng)殼聚糖比例增加時(shí)，由于殼聚糖本身具有一定的抗菌性，海綿的抗菌性能會(huì)增強(qiáng)，但對(duì)細(xì)胞的黏附率可能會(huì)略有下降，在24小時(shí)后約為（80±4）%，這可能是因?yàn)檫^(guò)高的殼聚糖含量會(huì)影響細(xì)胞與海綿表面的相互作用。當(dāng)明膠比例增加時(shí)，海綿對(duì)細(xì)胞的黏附率會(huì)有所提高，在24小時(shí)后可達(dá)（90±5）%，但抗菌性能會(huì)相對(duì)減弱，這是因?yàn)槊髂z的抗菌性較弱，增加其比例會(huì)降低海綿整體的抗菌能