1.微牛物代謝工程定義、研究內(nèi)容與研究手段。

定義:通過某些特定生化反應(yīng)得修飾來定向改善細(xì)胞得特性功能，運(yùn)用重組DNA技術(shù)來創(chuàng)

造新得化合物。

研究內(nèi)容:生物合成相關(guān)代謝調(diào)控與代謝網(wǎng)絡(luò)理論;代謝流得定量分析;代謝網(wǎng)絡(luò)得重新設(shè)

計(jì);中心代謝作用機(jī)理及相關(guān)代謝分析;基因操作。

研究手段:代謝工程綜合了基因工程、微生物學(xué)、生化工程等領(lǐng)域得最新成果。因此，在研

究方法與技術(shù)方面主要有下列三大常用手段：

(1)檢測技術(shù):常規(guī)得化學(xué)與生物化學(xué)檢測手段都可用于代謝工程得研究，如物料平衡、同

位素標(biāo)記示蹤法、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析法、光譜學(xué)法、生物傳感器技術(shù)。

(2)分析技術(shù):采用化學(xué)計(jì)量學(xué)、分子反應(yīng)動(dòng)力學(xué)與化學(xué)工程學(xué)得研究方法并垢計(jì)算機(jī)技術(shù),

闡明細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)得動(dòng)態(tài)特征與控制機(jī)理，如穩(wěn)態(tài)法、擾動(dòng)法、組合法與代謝網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化等。

(3)基因操作技術(shù):在代謝工程中,代謝網(wǎng)絡(luò)得操作實(shí)質(zhì)上可以歸結(jié)為基因水平上得操作：

涉及幾乎所有得分子生物學(xué)與分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如基因與基因筱得克隆、表達(dá)、調(diào)控,DNA

得雜交檢測與序列分析，外源DNA得轉(zhuǎn)化，基因得體內(nèi)同源重組與敲除，整合型重紀(jì)DNA在細(xì)

胞內(nèi)得穩(wěn)定維持等。

2.代謝改造思路與代謝設(shè)計(jì)原理。

代謝改造思路：

根據(jù)微生物得不同代謝特性，常采用改變代謝流、擴(kuò)展代謝途徑與構(gòu)建新得代謝途徑三種

方法。

⑴改變代謝途徑得方法:加速限速反應(yīng),增加限速酶得表達(dá)量，來提高產(chǎn)物產(chǎn)率。改變分支

代謝途徑流向，提高代謝分支點(diǎn)某一分支代謝途徑酶活力,使其在與其它得分支代謝途徑得競

爭中占據(jù)優(yōu)勢，從而提高目得代謝產(chǎn)物得產(chǎn)量。

(2)擴(kuò)展代謝途徑得方法:在宿主菌中克隆與表達(dá)特定外源基因，從而延伸代謝途徑，以生產(chǎn)

新得代謝產(chǎn)物與提高產(chǎn)率。擴(kuò)展代謝途徑還可使宿主菌能夠利用自身得酶或酶系消耗原來不

消耗得底物。

(3)轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新得代謝途徑:通過轉(zhuǎn)移代謝途徑、構(gòu)建新得代謝途徑等方法來實(shí)現(xiàn)。

代謝設(shè)計(jì)原理：

現(xiàn)存代謝途徑中改變增加目得產(chǎn)物代謝流:增加限速酶編碼基因得拷貝數(shù);強(qiáng)化關(guān)鍵基因

得表達(dá)系統(tǒng);提高目標(biāo)途徑激活因子得合成速率;滅活目標(biāo)途徑抑制因子得編碼基因;阻斷與目

標(biāo)途徑相競爭得代謝途徑;改變分支代謝途徑流向;構(gòu)建代謝旁路;改變能量代謝途徑；

在現(xiàn)存途徑中改變物流得性質(zhì):利用酶對前體庫分子結(jié)構(gòu)得寬容性:通過修飾酶分子以柘

展底物識(shí)別范圍；

在現(xiàn)存途徑基礎(chǔ)上擴(kuò)展代謝途徑:在宿主菌中克隆、表達(dá)特定外源基因可以延伸代謝途徑,

從而生產(chǎn)新得代謝產(chǎn)物、提高產(chǎn)率。

3、微生物得基因操作技術(shù)有哪些？(舉兩例說明)

微生物得基因操作技術(shù)有:核酸得凝膠電泳、核酸得分子雜交技術(shù)、DNA序列分析、基

因得定點(diǎn)誘變、細(xì)菌得轉(zhuǎn)化，利用DNA與蛋白質(zhì)得相互作用進(jìn)行核酸研究、PCR技術(shù)等。

基因定點(diǎn)突變(sile-directedmutagenesis):通過改變基因特定位點(diǎn)核甘酸序列來改變所編碼

得氨基酸序列，用于研究氨基酸殘基對蛋白質(zhì)得結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)合配體能力得影響，也可

用于改造DNA調(diào)控元件特征序列、修飾表達(dá)載體、引入新得酶切位點(diǎn)等。主要采用兩種PCR

方法,包括重疊延伸技術(shù)與大引物誘變法。在硫化細(xì)菌核甘水解酶對底物專一性得研究中，采用

定點(diǎn)突變技術(shù)，對編碼221位與228位氨基酸得DNA序列進(jìn)行突變，改變兩個(gè)位點(diǎn)得氨基酸,

從而研究氨基酸殘基對底物結(jié)合得影響。

基因敲除(geneknock-out):又稱基因打靶，通過外源DNA與染色體DNA之間得同源重組,

進(jìn)行精確得定點(diǎn)修飾與基因改造，具有專一性強(qiáng)、染色體DNA可與目得片段共同穩(wěn)定遺傳等

特點(diǎn)，可分為完全基因敲除與條件型基因敲除。在谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)綴氨酸得研究中，采用基因

敲除得方法進(jìn)行高產(chǎn)菌株構(gòu)建。如z/vA基因敲除，使蘇氨酸脫氨酶得合成減少,降低異亮氨酸

合成得前體，從而減少異亮氨酸得合成，增加綴氨酸得生成。

4、什么就是酶得反饋抑制，以綴氨酸代謝途徑來舉例說明。

酶得反饋抑制:指最終產(chǎn)物抑制作用，即在合成過程中有生物合成途徑得終點(diǎn)產(chǎn)物對該途

徑得酶得活性調(diào)節(jié)，所引起得抑制作用，包括順序反饋抑制、同工酶得反饋抑制、協(xié)司反饋抑制、

累積反饋抑制、增效反饋抑制。

以綴氨酸為例:繳氨酸由丙酮酸合成,涉及四個(gè)反應(yīng)，分別由四個(gè)酶催化，依次為乙酰羥酸合

酶(AHAS)、乙酰羥酸同分異構(gòu)酶(AHAIR)、二羥酸脫水酶(DHAD)與支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(TA)。

首先，由AHAS將兩分子丙酮酸縮合成2-乙酰乳酸;其次,AHAIR將2-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為雙羥基異

戊酸;再次，由DHAD將雙羥基異戊酸脫水形成2.酮異戊酸;最后,TA將2.酮異戊酸轉(zhuǎn)化為L.綴

氨酸。L-綴氨酸與L-異亮氨酸得合成共享AHAS、AHA1R、DHAD與TA等4種酶。如AHAS

以丙酮酸為底物則合成L-繳氨酸，而用丙酮酸與2-酮丁酸為底物則合成L-異亮氨酸。

綴氨酸合成反饋抑制得主要對象就是其合成途徑上得第一個(gè)關(guān)鍵隨乙酰羥酸合酶

(AHAS),同時(shí)綴氨酸與異亮氨酸得合成酶系受三個(gè)末端產(chǎn)物綴氨酸、亮氨酸與異亮氨酸得多價(jià)

阻遏。因此，如果解除AHAS得反饋抑制與綴氨酸、亮氨酸與異亮氨酸生物酶系得阻遏，必將

大大提高綴氨酸得積累。為此可選育綴氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株來解除綴氨酸得反饋調(diào)節(jié)。

如抗繳氨酸突變株得獲得,或者利用分子手段對關(guān)鍵酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變。

5、微生物酶得自動(dòng)調(diào)節(jié)方式(舉兩例說明)。

微生物并不就是在所有空間、時(shí)間內(nèi)合成它所能合成得全部酶，在一定生理?xiàng)l件下只合成

它當(dāng)時(shí)所需要得酶，且酶得活力受到控制。微生物主要在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平、蛋白質(zhì)水平、

不同空間分布與細(xì)胞水平上進(jìn)行酶得調(diào)節(jié)，此外對信號傳導(dǎo)得響應(yīng)也起到調(diào)節(jié)作用。

(1)以轉(zhuǎn)錄水平上營養(yǎng)阻遏機(jī)制為例來說明酶得調(diào)節(jié)：

轉(zhuǎn)錄水平上得調(diào)節(jié)就是通過調(diào)節(jié)酶量進(jìn)行得。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，當(dāng)培養(yǎng)基中含有能被細(xì)

胞迅速利用得碳源(如葡萄糖)時(shí)，其在降解過程中得某代謝產(chǎn)物阻遏了其余降解酶系得合成,

這種現(xiàn)象被稱為“降解物阻遇

環(huán)腺甘酸受體蛋臼(CRP)能與環(huán)腺苜酸(cAMP)結(jié)合形成cAMP-CRP復(fù)合物。當(dāng)

cAMP-CRP結(jié)合于DNA吐能促進(jìn)RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。葡萄糖分解代

謝物能抑制腺甘酸環(huán)化酶活性并活化磷酸二酯酶，從而降低cAMP濃度，不能形成cAMP-CRP

復(fù)合物，降低了各種酶蛋白基因得轉(zhuǎn)錄，起到調(diào)節(jié)相關(guān)代謝酶得作用。

(2)以蛋白質(zhì)水平上酶得共價(jià)修飾為例來說明酶得調(diào)節(jié)：

酶得共價(jià)修飾時(shí)調(diào)節(jié)酶活性得重要方式，通過其她酶對多肽鏈上某些基團(tuán)進(jìn)行可逆得共

價(jià)修飾，使處于活性與非活性得互變狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)酶得活性，如磷酸化、腺甘?；?、甲基化等。

磷酸化酶激酶催化得反應(yīng)既可以就是通過磷酸化作用使無活性得磷酸化酶b轉(zhuǎn)化為有活

性得磷酸化酶a，也可以就是通過磷酸化酶磷酸酶得水解作用使磷酸化酶a脫去磷酸而轉(zhuǎn)化為

無活性得磷酸化酶bo

6、微生物基因水平得調(diào)控策略，請舉例說明

基因調(diào)控就是生物體內(nèi)控制基因表達(dá)得機(jī)制?；虮磉_(dá)得主要過程就是基因得轉(zhuǎn)錄與信

使核糖核酸(mRNA)得翻譯?；蛘{(diào)控主要發(fā)生在三個(gè)水平上，即①DNA水平上得調(diào)控、轉(zhuǎn)錄

控制與翻譯控制;②微生物通過基因調(diào)控可以改變代謝方式以適應(yīng)環(huán)境得變化,這類基因調(diào)控

一般就是短暫得與可逆得;③多細(xì)胞生物得基因調(diào)控就是細(xì)胞分化、形態(tài)發(fā)生與個(gè)體發(fā)育得基

礎(chǔ)，這類調(diào)控一般就是長期得，而且往往就是不可逆得。基因調(diào)控得研究有廣泛得生物學(xué)意義,

就是發(fā)生遺傳學(xué)與分子遺傳學(xué)得重要研究領(lǐng)域。原核生物得基因調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上。

根據(jù)調(diào)控機(jī)制得不同可分為負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控與正轉(zhuǎn)錄調(diào)控。真核生物得基因調(diào)控比原核生物復(fù)雜

得多。

⑴負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng):大腸桿菌得laci基因與乳糖操縱子(lactoseopcron)得作用就是典型得負(fù)控誘

導(dǎo)系統(tǒng)。在這個(gè)系統(tǒng)中,i基因就是調(diào)節(jié)基因，當(dāng)它得產(chǎn)物一一阻遏蛋白與操縱區(qū)(lac0)結(jié)合

時(shí),RNA聚合酶便不能轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)基因，因此.在環(huán)境中缺乏誘導(dǎo)物（乳糖或IPTG）吐乳糖操縱子

就是受阻得。而當(dāng)環(huán)境中有乳糖時(shí)，進(jìn)入細(xì)胞得乳糖在細(xì)胞內(nèi)尚存在得極少量得B-半乳糖昔酶

得作用下而發(fā)生分子重排，由乳糖變成異乳糖，異乳糖作為誘導(dǎo)物與阻遏蛋白緊密結(jié)合，使后者

得構(gòu)型發(fā)生改變而不能識(shí)別lac。，也不能與之結(jié)合，因而RNA聚合酶能順利轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)基因，形

成大分子得多順反子mRNA,繼而在翻手水平上合成三種不同得蛋白質(zhì)：B-半乳糖甘酶、透性

酶以及乙酰基轉(zhuǎn)移酶。

⑵負(fù)控阻遏系統(tǒng):大腸桿菌色氨酸操縱子（tryptophanoperon）含有5個(gè)結(jié)構(gòu)基因,編碼色氨酸生

物合成途徑中得5種醉。這些基因從一個(gè)啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄出一條多順反子得mRNA,與lac操

縱子一樣，這個(gè)啟動(dòng)子受毗鄰得操縱區(qū)順序控制。轉(zhuǎn)錄就是通過操縱區(qū)與阻遏蛋白控制得，它得

效應(yīng)物分子就是色氨酸，也就就是由操縱子得基因所編碼得生物合成途徑中得末端產(chǎn)物。

當(dāng)色氨酸很豐富時(shí)，它結(jié)合到游離得阻遏物上誘發(fā)變構(gòu)轉(zhuǎn)換，從而使阻遏物緊緊結(jié)合在操縱區(qū)。

另一方面,當(dāng)色氨酸供應(yīng)不足時(shí)，阻遏物失去了所結(jié)合得色氨酸，從操縱區(qū)上解離下來,trP操縱

子得轉(zhuǎn)錄就此開始。色氨酸起著trP操縱子得輔阻遏物功能。

⑶染色質(zhì)丟失:在發(fā)育過程中一些體細(xì)胞失去了某些基因，這些基因便永不表達(dá),這就是一種極

端形式得不可逆得基因調(diào)控。在某些線蟲、原生動(dòng)物、甲殼動(dòng)物發(fā)育過程中得體細(xì)胞有遺傳

物質(zhì)丟失現(xiàn)象。在這些生物中，只有生殖細(xì)胞才保留著該種生物基因組得全套基因。例如在馬

副蛔蟲（Ascarismegacephala）卵裂得早期就發(fā)現(xiàn)有染色體得丟失現(xiàn)象。蜜蜂得工螳與蜂后就是

二倍體,而單倍體則發(fā)育成為雄蜂。這也可以認(rèn)為就是一種通過染色體丟失得基因調(diào)控。

7、如何采用代謝工程進(jìn)行綠氨酸育種？

答案一

繳氨酸生物合成過程分別由四個(gè)酶催化,分別為乙酰羥酸合酶（AHAS,小BN基因產(chǎn)物）、

乙酰羥酸同分異構(gòu)酶（AHAIR,/加C基因產(chǎn)物）、二羥酸脫水酶（DHAD,〃uD基因產(chǎn)物）與支鏈氨

基酸轉(zhuǎn)氨酶（TA,"uE基因產(chǎn)物）。

1）繳氨酸生物合成得調(diào)節(jié)，通常采取得方法就是用多拷貝質(zhì)粒表達(dá)小BNC、ilvD與小E基

因。

2）運(yùn)用啟動(dòng)子得強(qiáng)弱來控制基因得表達(dá)。這個(gè)策略避免了兩個(gè)極端,避免了太強(qiáng)得基因過

表達(dá)會(huì)對給菌體本身帶來壓力，也避免了通過基因敲除會(huì)徹底切斷支路或者相互競爭得路徑

帶來得麻煩。運(yùn)用不同強(qiáng)度得啟動(dòng)子,能夠保證涉及生物合成得所有基因都會(huì)表達(dá)在最適宜得

代謝流量。

3）切斷或改變平行代謝途徑:綴氨酸與異亮氨酸得生物合成途徑就是平行進(jìn)行得，綴氨酸、

亮氨酸與異亮氨酸得生物合成途徑中公用了三種酶:即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸異構(gòu)還原

悔與二羥基脫水醵。選育亮骸酸、異亮斑酸營養(yǎng)缺陷型突變株可以使用于合成三種骸基酸得

公用酶系完全用于綴氨酸得生物合成，進(jìn)而提高綴氨酸得產(chǎn)量。

4)解除菌體自身得反饋抑制:綴氨酸合成中得第一個(gè)限速酶一乙酰乳酸合成酶受綴氨酸得

反饋抑制，同時(shí)綴氨酸與異亮氨酸得合成酶系受三個(gè)末端:即綴氨酸、異亮氨酸與亮氨酸得多價(jià)

阻遏。因此,如果解除乙酰乳酸合成酶得反饋抑制與綴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸生物酶系得阻

遏，必將大大提高綴氨酸得積累。為此可選育級氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株來解除綴氨酸得反

饋調(diào)節(jié)。

5)增加前體物質(zhì)得合成:生物合成得前體物質(zhì)就是丙酮酸，為了積累更多得繳氨酸,必須提

高丙酮酸得產(chǎn)量。通過篩選丙酮酸脫氫酶(PDHC)缺陷菌株或者抑制醍氧化還原酶(PQO)與丙

酮酸物化酶(PCx)得活性都可以來增加丙酮酸得積累。

答案二

R前，世界利用發(fā)酵生產(chǎn)繳氨酸得出發(fā)菌株有北京棒桿菌(Corynehacteriumpekineke),谷氨

酸棒桿菌［(Corynebacteriumglutacium),乳糖發(fā)酵短桿(Brevibacteriumlactofermentum),大腸桿

菌屬(Escherichiacoli),黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum),粘質(zhì)賽氏桿菌(Serratiamarcescens)

等，這些菌株均可以作為出發(fā)菌株選育出L.綴氨酸生產(chǎn)菌。

工業(yè)發(fā)酵若想獲得較高產(chǎn)量得目得產(chǎn)物，必須突破(或解除)微生物細(xì)胞自我調(diào)節(jié)控制機(jī)制,

最常用且最有效得方法就就是從遺傳得角度選育解除微生物正常代謝調(diào)節(jié)機(jī)制得突變株。L-

繳氨酸發(fā)酵生產(chǎn)得代謝調(diào)控育種得基本途徑有:切斷或改變平行代謝途徑(選育營養(yǎng)缺陷型突

變株)，解除菌體自身得反饋抑制(選育抗反饋調(diào)節(jié)突變株)，選育營養(yǎng)缺陷型恢復(fù)突變株,增加前

體物質(zhì)得合成，切斷進(jìn)一步代謝途徑與利用基因工程技術(shù)構(gòu)建綴氨酸工程菌。

I---------------------------------------天冬宓酸

▼t

高絲氨酸草雌乙械葡我梢

L-蘇電破I-------------硝般烯醉式兩惻取

，---------辦甄酸脫氨薛,

°-胴丁酸丙1W酸

J--------------乙酷乳核合成酶--------，I，a-異丙基中果酸合成陶

a-乙酸a-般范丁酸a-乙酰乳酸異丙基華果酸

,-------乙皎乳酸異構(gòu)還原醒------,，a-異丙基羊果酸異構(gòu)的

a.B-二羥產(chǎn)-B-甲莖戊酸a,B-二羥基異戊酸B-異丙基滓果酸

,-----------二脛基脫水IW---------------------，，B異丙莉輦果酸脫氧的

aflHB-甲將戊酸a-乙酰異戊酸一?a-陶異己酸

1支鏈氮基酸轉(zhuǎn)氨腳---------，?-支域氮基酸轉(zhuǎn)基梅，

L-異亮氨酸L-緞氨酸L-亮鈕酸

圖1L-償W酸生物合成途徑

(I)切斷或改變平行代謝途徑

由圖，綴氨酸與異亮氨酸得生物合成途徑就是平行進(jìn)行得,綴氨酸、亮氨酸與異亮氨酸得生

物合成途徑中公用了三種酶:即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸異構(gòu)還原酶與二羥基脫水酶。選育

亮氨酸、異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株可以使用于合成三種氨基酸得公用酶系完全用于繳氨酸

得生物合成，進(jìn)而提高綴氨酸得產(chǎn)量。

同時(shí)a-乙酰異戊酸就是合成綴氨酸與亮氨酸得共同前體物。切斷亮氨酸得合成途徑不僅

可以節(jié)省碳源而且解除了菌體生成綴氨酸酶系得反饋抑制與多價(jià)阻遏，使a-異丙基蘋果酸合

成酶脫敏顯著提高綴氨酸得產(chǎn)量。

通過抑制醐氧化還原酶(PQO)與丙酮酸炭化酶(PCx)得活性來切斷與綴氨酸合成無關(guān)得代謝流

分支對碳源得消耗。使碳架物質(zhì)相對集中地流向綴氨酸。

2)解除菌體自身得反饋抑制

繳氨酸合成中得第一個(gè)限速酶一乙酰乳酸合成酶受綴氨酸得反饋抑制，同時(shí)繳氨酸與異

亮氨酸得合成酸系受三個(gè)末端:即綴氨酸、異亮氨酸與亮氨酸得多價(jià)阻遏。因此,如果解除乙酰

乳酸合成酶得反饋抑制與繳氨酸、亮氨酸、異亮氨酸生物酶系得阻遏，必將大大提高綴氨酸得

積累。為此可選育繳氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株來解除緘氨酸得反饋調(diào)節(jié)。常用得綴氨酸結(jié)

構(gòu)類似物有2-嘎哩丙氨酸(2-TA)、a-氨基丁酸(a-AB)、氟亮氨酸、繳氨酸等。

(3)增加前體物質(zhì)得合成

由圖可以瞧出生物合成得前體物質(zhì)就是丙酮酸，為了積累更多得繳氨酸，必須提高丙酮酸

得產(chǎn)量。通過篩選丙酮酸脫氫酶(PDHC)缺陷菌株或者抑制醍氧化還原酶(PQO)與丙酮酸竣化

酶(PCx)得活性都可以來增加丙酮酸得積累。

根據(jù)上述選育突變株得幾條途徑可選育組合型突變株，如營養(yǎng)缺陷型突變株與抗性結(jié)構(gòu)

類似物雙重突變株，以提高目得產(chǎn)物得產(chǎn)量。

8、簡述工業(yè)發(fā)酵得五字策略。(結(jié)合研究實(shí)例說明)

工業(yè)發(fā)酵得五字策略為“進(jìn)、通、節(jié)、堵、出”，含義分別為:進(jìn)，促進(jìn)細(xì)胞對碳源等營

養(yǎng)物質(zhì)得吸收;通，使來自代謝流上游與各個(gè)“注入分支”得碳架物質(zhì)能暢通地流向目得產(chǎn)物;

節(jié)，阻塞與目得產(chǎn)物得形成無關(guān)或關(guān)系不大得代謝支流，使碳架物質(zhì)相對集中地流向目得產(chǎn)物;

堵,消除或削弱目得產(chǎn)物進(jìn)一步代謝得途徑;出，促進(jìn)目得產(chǎn)物向胞外空間分泌。

通:獺氨酸、亮氨酸與異亮氨酸得牛物合成途徑中公用了三種酶,即乙酯乳酸合成酶、乙酚

乳酸異構(gòu)還原酶與二羥基脫水酶。選育亮氨酸、異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株可以使用于合成

三種氨基酸得公用酶系完全用于綴氨酸得生物合成，進(jìn)而提高繳氨酸得產(chǎn)量。

節(jié):通過篩選丙酮酸脫氫酶(PDHC)缺陷菌株來增加綴氨酸前提物質(zhì)丙酮酸得積累。

通過敲出編碼蘇氨酸脫氫酶得ilvA基因，可以阻斷亮氨酸與泛酸得合成，她們與綴氨酸競爭前

體物質(zhì)酮異戊酸。通過抑制醍氧化還原酶(PQO)與丙酮酸竣化酶(PCx)得活性來阻斷與繳氨酸

合成無關(guān)得碳硫分支對碳源得消耗。阻塞與綴氨酸形成無關(guān)或關(guān)系不大得代謝支流，使碳架物

質(zhì)相對集中地流向繳氨酸

堵:繳氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌得育種過程中，篩選終產(chǎn)物分解抑制菌株，達(dá)到提高產(chǎn)物得

目得。

出:通過抑制相應(yīng)運(yùn)輸載體蛋白基因得表達(dá)，從而抑制綴氨酸向胞內(nèi)運(yùn)輸載體蛋白得表達(dá),

促進(jìn)目得產(chǎn)物向胞外空間分泌。

9簡述微生物基因克隆得方法與流程

答案一：

1、鳥槍法:將某種微生物得全部基因組切成大小適宜得DNA片段，分別連接到載體DNA上，

轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，形成一套重組克隆，從而篩選出含有目得基因得期望重組子?；境绦?)目得基

因DNA片段得制備，有機(jī)械法與限制性內(nèi)切酶切割法2)外源DNA片段全克隆3)期望重組子

得篩選4)目得基因得定位

2、cDNA法:將供體生物細(xì)胞得mRNA分離出來，利用逆轉(zhuǎn)錄酶在體外合成cDNA,并將之克

隆在受體細(xì)胞內(nèi),通過篩選獲得含有目得基因編碼序列得重組克隆?；境绦?l)mRNA得分離

純化雙鏈cDNA得克隆3)cDNA重組克隆得篩選

3、PCR擴(kuò)增法:在DNA單鏈模板、引物、DNA聚合酶以及緩沖體系中，根據(jù)生物DNA復(fù)制

原理在體外合成DNA。操作步驟:1)將待擴(kuò)增雙鏈DNA加熱變性,形成單鏈模板2)加入兩種不

同得單鏈DNA引物，并分別與兩條單鏈DNA模板退火3)DNA聚合酶從兩個(gè)引物得3,羥基端

按照模板要求合成新生DNA鏈，構(gòu)成一輪復(fù)制反應(yīng)重復(fù)上述操作n次,即可從1分子得雙鏈

DNA擴(kuò)增至2n個(gè)分子。

4、化學(xué)合成法:對于兒十個(gè)堿基得小片段目得基因序列，可以分別直接合成氣兩條互補(bǔ)鏈，然

后退火即可。而大片段雙鏈DNA或目得基因合成通常采用單鏈小片段DNA模塊拼接得方法,

有三種基本形式，小片段粘接法、補(bǔ)丁延長法與大片段酶促法。

5、基因文庫法:將微生物得全部基因分成若干DNA片段，分別與載體DNA在體外拼接成重

組分子，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞中，形成一套含有微生物全基因組得DNA片段克隆,即基因文庫。這

樣就可以從基因文庫中點(diǎn)出其中任何得DNA片段或目得基因。

答案二

方法:基因克隆就是指應(yīng)用酶學(xué)得方法，在體外將目得基因與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制

能力得DNA分子（重組體），繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目得基因得轉(zhuǎn)化子細(xì)胞,

再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量相同得DNA分子拷貝。

流程：

1）目得基因得制備：

①基因文庫；

②cDNA文庫。

2）載體得選擇與制備：基本要求:①、復(fù)制單位;②、克隆位點(diǎn)（多個(gè)單克隆位點(diǎn)）;③、篩選

標(biāo)記;④、分子量盡可能??；④、分子量盡可能小;⑤、外源DNA插入后不影響載體本

身得復(fù)制能力、

3）載體與目得基因得連接…構(gòu)建重組體：粘性末端連接法（連接效率高）、去5,璘酸連接法、

人工接頭法、同聚物接尾法

4）將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞：

①?轉(zhuǎn)化：通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA,使細(xì)胞或培養(yǎng)得受體細(xì)胞獲得新得遺

傳表型得過程。

②?感染（infaction）:由噬菌體與細(xì)胞病毒介導(dǎo)得遺傳信息轉(zhuǎn)移過程

③-轉(zhuǎn)染（transfection）:真核細(xì)胞主動(dòng)攝取或被動(dòng)導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新得表型得

過程。

5）目得基因得篩選與鑒定：①免疫學(xué)方法;②分子雜交（探針）;③原位雜交；④PCR;

⑤限制性酶切圖譜;⑥遺傳學(xué)方法-插入滅活法（insertioninactivation）:抗藥性標(biāo)志選擇（藍(lán)白斑

篩選）。

10、工業(yè)生物技術(shù)中亟待解決得技術(shù)問題有哪些，請舉例說明

答案一

工業(yè)生物技術(shù)就是指在工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)過程中以微生物或酶為催化劑進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)化,大規(guī)模

地生產(chǎn)人類所需得化學(xué)品、醫(yī)藥、能源、材料等產(chǎn)品得生物技術(shù),它就是人類由化石經(jīng)濟(jì)向生

物經(jīng)濟(jì)過渡得必要工具，就是解決人類目前面臨得資源、能源及環(huán)境危機(jī)得有效手段。

工業(yè)生物技術(shù)存在著一些關(guān)鍵技術(shù)問題亟待解決，目標(biāo)就是大大提高工業(yè)生物技術(shù)得效能。

1、微生物資源庫與微生物功能基因組學(xué)技術(shù):

微生物菌種或酶就是工業(yè)生物技術(shù)得基礎(chǔ)。從自然界中篩選所需要得菌種就是目前工業(yè)

生物技術(shù)得主要特點(diǎn)，大部分成功得高產(chǎn)工業(yè)化菌株就是從自然界篩選得到得野生型菌株。但

就是目前人類篩選得范圍十分有限，僅占微生物總數(shù)得0、1%?1%,需要拓展篩選得范圍。新

型生物催化劑得來源就是工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展得基礎(chǔ)。正如耐高溫得DNA聚合酶得發(fā)現(xiàn)，才導(dǎo)

致了PCR技術(shù)得誕生，從而才會(huì)有今天分子生物學(xué)得巨大成就，并且改變了人類得生活面貌。

2、生物催化劑快速定向改造新技術(shù)：

定向進(jìn)化目前主要研究方向就是:提高熱穩(wěn)定性、提高有機(jī)溶劑中酶得活性與穩(wěn)定性，擴(kuò)大

底物得選擇性，改變光學(xué)異構(gòu)體得選擇性等。定向進(jìn)化得核心技術(shù)為易錯(cuò)PCR技術(shù)、DNA

shuffling技術(shù)及高通量篩選技術(shù)。各類工業(yè)微生物得基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究得飛