單增李斯特氏菌PFGE操作程序分子量標(biāo)準(zhǔn)Braenderup沙門氏菌H9812的操作程序參照《非傷寒沙門氏菌PFGE操作程序》。分子量標(biāo)準(zhǔn)Braenderup沙門氏菌H9812的操作程序參照《非傷寒沙門氏菌PFGE操作程序》。生物安全：根據(jù)相關(guān)要求，處理所有被污染的塑料制品、玻璃制品、移液管、刀片等。第0天菌株接種挑取新鮮單個(gè)菌落，劃線接種血瓊脂平板，37℃第1天plug的制備打開恒溫振蕩水浴器（54℃），恒溫水浴鍋（55℃～60制備TE緩沖液。注意：TE緩沖液用于制備plug瓊脂糖、懸浮細(xì)胞、洗滌裂解后的plug。制備1%SeaKemGold：1%SDS瓊脂糖，以備制作PFGEplug。將20%的SDS置于55℃～60℃稱取0.25gSeaKemGold（SKG）瓊脂糖，加入100mL錐形瓶。加入23.5mLTE緩沖液，輕輕振蕩，使瓊脂糖充分?jǐn)U散。蓋上蓋子（切勿太緊），微波加熱30s，輕輕混合，每隔5s～10s重復(fù)一次，直到瓊脂糖完全溶解。加入SDS之前，錐形瓶置于55℃～60℃加入1.25mL的20%SDS（預(yù)熱至55℃～60℃），混合均勻，55℃～60在比濁管上標(biāo)記相應(yīng)的菌株編號。分別在標(biāo)記的比濁管中加入約2mL～3mL的TE，使用無菌棉簽從瓊脂平板上刮取適量細(xì)菌，均勻懸浮于TE中。調(diào)節(jié)菌懸液濃度：bioMérieuxVitek比濁計(jì)：透光度≈17%～18%（Falcon2054管）；或，分光光度計(jì)：610nm，吸光度1.00；或，DadeMicroscan濁度計(jì)：0.40～0.45（Falcon2054管）0.58～0.63（Falcon2057管）。取200μL調(diào)節(jié)好的菌懸液加入相應(yīng)的1.5mL微量離心管中。如果菌懸液處于室溫，可直接加入瓊脂糖；如果菌懸液溫度較低，應(yīng)置于37℃每個(gè)微量離心管加入10μL的溶菌酶溶液（20mg/mL），用槍頭輕輕混勻，放入55℃～60℃注意：溶化的溶菌酶儲(chǔ)存液（20mg/mL）應(yīng)在冰/冰盒里。使用前適量融化，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，丟棄所有融化的溶菌酶溶液。從55℃～60℃水浴中，取出裝有菌每管再加入10μL的蛋白酶K（濃度為20mg/mL），用槍頭輕輕混勻。注意：蛋白酶K要置于冰/冰盒里。使用前適量融化，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，丟棄所有融化的蛋白酶K。每管中再加入200μL溶化的1%SKG:1%SDS瓊脂糖；用槍頭輕輕混勻。注意：混勻過程中，應(yīng)避免氣泡的產(chǎn)生。使用過程中，溶化的1%SKG：1%SDS瓊脂糖置于55℃～60℃立即將上述混合物加入plug模具，室溫凝固10min～15min，或4℃注意：混合物加入模具時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。使用一次性制膠模具，可制作3個(gè)～4個(gè)plug。如果選擇可重復(fù)使用的plug模具時(shí)，需要用400μL菌懸液、20μL溶菌酶（濃度為20mg/mL）、20μL蛋白酶K（濃度為20mg/mL）、400μL的1%SKG：1%SDS瓊脂糖，可制作2個(gè)plug。細(xì)菌的裂解注意：同一菌株的3個(gè)～4個(gè)plug可以放在同一個(gè)50mL的管中裂解。在50mL的聚丙烯screw-cap管上做好標(biāo)記。配制細(xì)胞裂解液（CLB）。按照下表，計(jì)算CLB/蛋白酶K緩沖液的體積：每管需要5mL的CLB。每管CLB需要25μL蛋白酶K（濃度為20mg/mL）。把需要的CLB和蛋白酶K加入適當(dāng)?shù)娜萜髦校靹?。菌株?shù)量CLB蛋白酶K（20mg/mL）15mL25μL1365mL325μL1575mL375μL20100mL500μL注意：CLB中蛋白酶K溶液的終濃度是0.1mg/mL，與加入到菌懸液中的濃度（0.5mg/mL）不同。每個(gè)50mL的管中加入5mL的CLB/蛋白酶K緩沖液。如果需要，用刀片削去模具頂部多余的膠。一次性模具：撕掉模具下面的膠帶，用小鏟將plug移入相應(yīng)的screw-cap管中。可重復(fù)使用的模具：打開模具，用小鏟的寬頭部分將plug移入相應(yīng)的screw-cap管中。注意：保證plug在液面下，切勿貼在管壁上。碎膠、膠帶、模具、小鏟或刀片等（被污染的）應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)臏缇幚?。?4℃50℃Plug的清洗將恒溫振蕩水浴器溫度調(diào)至50℃從恒溫振蕩水浴器中拿出screw-cap管，蓋上GreenScreenedCaps，倒掉CLB。注意：將管倒置在吸水紙上，盡量排干管內(nèi)液體。以下操作與此相同。每管中加入預(yù)熱至50℃的無菌超純水10mL～15mL，50注意：要確保plug在液面下而不在管壁或蓋子上。以下操作與此相同。倒掉超純水，用預(yù)熱至50℃倒掉超純水，用預(yù)熱至50℃的TE緩沖液10mL～15mL洗滌，50倒掉TE，用預(yù)熱至50℃倒掉最后的洗滌液，加上5mL～10mLTE?？芍苯舆M(jìn)行酶切或放置在4℃保存?zhèn)溆谩Ｒ部捎玫镀裵lug直接切成2mm寬的膠塊，轉(zhuǎn)移至裝有TE緩沖液的1.5mL微量離心管中，4第2天plug中DNA的酶切在1.5mL的微量離心管上標(biāo)記相應(yīng)的菌株編號，并標(biāo)記3管或4管（15孔膠）H9812。按照下表1：10稀釋10×緩沖液。試劑μL/膠塊μL/12膠塊μL/13膠塊μL/16膠塊無菌超純水18021602340288010×緩沖液20240260320總體積200240026003200注意：緩沖液要放在冰/冰盒里。不同的限制性內(nèi)切酶使用的緩沖液不同，請根據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行選擇。每個(gè)1.5mL的微量離心管中加入200μL的1×緩沖液。將plug小心地從TE中取出，置于干凈的培養(yǎng)皿上。用刀片切下2.0mm寬的膠塊，并轉(zhuǎn)移到含有1×緩沖液的微量離心管中，確保膠塊在液面下。將剩余的膠塊放入原來的TE緩沖液中，4℃將微量離心管放入37℃溫育后，用槍頭吸出緩沖液。注意：避免損傷和吸出膠塊。按照下表，配制酶切混合液【限制性內(nèi)切酶AscⅠ（30U/膠塊）或ApaⅠ（37.5U/膠塊）】，混勻。（1）AscⅠ酶切混合液試劑μL/膠塊μL/7膠塊μL/13膠塊無菌超純水130.5913.51696.510×緩沖BSA1.510.519.5AscⅠ（10U/μL）32139總體意：限制性內(nèi)切酶一直放在冰/冰盒中。使用前從冰箱中取出，用后立即放入-20℃（2）ApaⅠ酶切混合液試劑μL/Plug切片μL/7Plug切片μL/13Plug切片滅菌超純水132.75929.251725.7510×緩沖BSA1.510.519.5酶（50U/μl）0.755.259.75總體意：限制性內(nèi)切酶一直放在冰/冰盒中。使用前從冰箱中取出，用后立即放入-20℃每管中加入150μL限制性內(nèi)切酶混合液。蓋上蓋子，在試驗(yàn)臺(tái)上輕磕管子的底部，保證膠塊在液面下。酶切溫度和時(shí)間：AscⅠ：37℃ApaⅠ：25℃在酶切反應(yīng)結(jié)束之前的0.5h就開始準(zhǔn)備制膠操作的1～4步，這樣就可以在倒膠之前，使液體膠的溫度冷卻至55～60℃酶切片段的電泳制膠調(diào)節(jié)水浴溫度為55～60℃制備0.5×TBE緩沖液。用0.5×TBE制備1%SKG瓊脂糖（15孔膠）：稱取1.5g的SKG瓊脂糖加入300mL的錐形瓶中。加入150mL的0.5×TBE，輕輕混勻。蓋上蓋子，微波加熱60s，輕輕混勻，每隔10s～15s重復(fù)一次，直到瓊脂糖完全溶化。置于55℃～60℃注意：取加熱后的錐形瓶，需帶上防熱手套。取2mL左右溶化的1%SKG瓊脂糖放入1.5mL微量離心管中，置于55℃～60℃注意：保證制膠模具【Bio-Rad，貨號170-3704（21cm×14cm）】放置在水平桌面上。調(diào)整梳子的高度，使梳子齒與膠槽底面平行（相隔約2mm）。從37℃或25從管中取出膠塊；把梳子放在膠槽上面，把膠塊加在梳子齒上：把H9812放在第1、8、15個(gè)或第1、5、10、15個(gè)梳子齒上。將樣品置于其他梳子齒上。用吸水紙吸去膠塊上多余的緩沖液，室溫下風(fēng)干10min～15min。將梳子放入膠槽，保證所有的膠塊都位于梳齒的底部。從膠槽的下部中央緩慢倒入溶化的55℃～60℃在膠凝固30min～45min后移去梳子。使用溶化的55℃～60℃電泳用2L左右的純水清洗電泳槽，并排出液體。保證電泳槽水平放置。否則，調(diào)整電泳槽底部的旋鈕。注意：不要接觸電極。將黑色的膠框放在電泳槽內(nèi)。加入2L～2.2L新配制的0.5×TBE，蓋上蓋子。在電泳之前30min，打開主機(jī)、泵（設(shè)置為≈70，這時(shí)緩沖液的流速約為1L/min）和冷凝器（14℃注意：開機(jī)順序?yàn)橹鳈C(jī)-泵-冷凝器。保證電泳液在管道中正常循環(huán)。確保冷凝器預(yù)設(shè)溫度為14℃打開膠槽的旋鈕和邊框，取出凝固好的膠，清除膠四周和底部多余的碎膠。小心把膠放入電泳槽。蓋上蓋子。注意：確保電泳液實(shí)際溫度為14℃必要時(shí)，可加入硫脲（硫脲儲(chǔ)存液的濃度1mol/L，1:10000稀釋，即在2200mL0.5×TBE中加入220μL儲(chǔ)存液），以防止DNA的降解。硫脲具有毒性，廢棄的加有硫脲的電泳液應(yīng)妥善處理。設(shè)置電泳參數(shù)。CHEF-mapper型脈沖場凝膠電泳儀AscⅠ或ApaⅠ酶切“AutoAlgorithm”模式：Lowmw——49kbHighmw——450kbRuntime：20hInitialswitchtime=4.0s；Finalswitchtime=40.0s第3天圖像的獲取結(jié)束電泳：關(guān)機(jī)順序?yàn)槔淠?泵-主機(jī)。取出膠，置于盛放400mLEB溶液的盒子中（EB儲(chǔ)存液的濃度10mg/mL，1:10000稀釋，即在400mL水中加入40μL儲(chǔ)存液）。在振蕩器上染色30min。注意：E