PAGE本科生畢業(yè)設(shè)計(論文)中文題目中文題目杜仲活性成分槲皮素的藥理分析PAGE16摘要杜仲葉是一種杜仲科植物，別名玉絲皮、絲棉樹、絲棉皮，與杜仲皮有著相同的有效成分以及藥理作用。杜仲葉的來源更加豐富，成本更加低廉，具有極佳的開發(fā)利用前景。可從杜仲葉中提取出槲皮素，也具有極大的藥用價值和經(jīng)濟價值。研究目的：觀察槲皮素對斑馬魚軟骨細胞修復的影響。方法：交配AB魚系斑馬魚，選取發(fā)育正常的受精后6h（6hpf）胚胎加入含有0、25μg/ml、50μg/ml、75ug/ml、100μg/ml、125μg/mlEDTA的魚液中培養(yǎng)72h后換不加EDTA的魚液培養(yǎng)72h，進行染色拍照。同時選取發(fā)育正常的受精后6h（6hpf）胚胎加入含有100μg/mlEDTA的魚液中培養(yǎng)72h后換含0、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml槲皮素的魚液中培養(yǎng)72h，進行染色拍照并測定斑馬魚軟骨中的蛋白濃度、SOD、CAT酶活及MDA含量。結(jié)果：說明EDTA能夠明顯抑制斑馬魚軟骨細胞的活性,斑馬魚變性軟骨細胞模型建立成功。模型組及不同濃度槲皮素組組間相比，吸光度值均有顯著性差異,不同濃度的槲皮素均可明顯促進變性軟骨細胞的修復。結(jié)論：槲皮素具有抗氧化性，能夠顯著促進斑馬魚軟骨細胞修復。關(guān)鍵詞：杜仲葉，槲皮素，軟骨細胞，修復Pharmacologicalanalysisofquercetin,theactiveingredientfromEucommiaulmoidesAbstractEucommiaulmoidesleafisakindofdumidaceaeplant,aliassilkcottontree,silkcottonbark,yusilkbark.Theresourceisricher,thecostislower,havebetterdevelopmentandutilizationforeground.Quercetincanbeextractedfromit,whichhasgreatmedicinalvalueandeconomicvalue.Objective:Toobservetheeffectofquercetinonchondrocyterepairinzebrafish.Methods:tomatezebrafishoffishlineAB,addembryoswithnormaldevelopmentat6h(6hpf)afterfertilizationintothefishfluidcontaining0,25μg/ml,50μg/ml,75μg/ml,100μg/mlland125μg/mlEDTAfor72h,andthenchangethemintofishfluidwithoutEDTAfor72h,andtakepicturesforstaining.Atthesametime,embryoswithnormaldevelopmentat6h(6hpf)afterfertilizationwereaddedtothefishsolutioncontaining100μg/mlEDTAandculturedfor72h,andthenthefishsolutioncontaining0,1μg/ml,2μg/ml,4μg/ml,and6μg/mlquercetinwasculturedfor72h,andthenstainedandphotographed.Results:edtacansignificantlyinhibittheproliferationofchondrocytes.Thereweresignificantdifferencesinabsorbancevaluesbetweenthemodelgroupandthequercetingroupatdifferentconcentrations.Quercetinatdifferentconcentrationscouldsignificantlypromotetheproliferationofdenaturedchondrocytes,andtheproliferationeffectwaspositivelycorrelatedwiththeconcentrationofquercetingroup.Proteinconcentration,SOD,MODandCATenzymeactivitiesinzebrafishcartilageweredetermined.Conclusion:Quercetinhasantioxidantpropertiesandcansignificantlypromotechondrocyterepairinzebrafish.Keywords：Eucommiafolium,Quercetin,Chondrocyte,Repair

目錄TOC\o"1-3"\h\z摘要 IAbstract II目錄 III6544999561引言1杜仲葉的研究現(xiàn)況 111854960721.2杜仲葉活性成分槲皮素的研究意義 12792052381.3杜仲葉活性成分槲皮素的研究現(xiàn)況4斑馬魚軟骨模型在骨骼疾病研究中的應(yīng)用 29545700291.5研究目的及意義 317556343132材料與方法 45205888112.1藥物及試劑 46877685992.2主要儀器 415698552392.3動物 45729148312.4實驗方法 414262639162.4.1斑馬魚的處理方法 414262639162.4.2槲皮素對斑馬魚總超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性和丙二醛含量的影響 416843354332.5數(shù)據(jù)處理 54961876773結(jié)果與分析 77472860383.1槲皮素對EDTA處理下的斑馬魚軟骨與硬骨的影響 711785177183.2槲皮素對斑馬魚超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響 1011056101453.3槲皮素對斑馬魚過氧化氫酶（CAT）活力的影響 1019611931713.4槲皮素對斑馬魚丙二醛（MDA）含量的影響 114結(jié)論與討論 1217927674624.1結(jié)論 錯誤!未定義書簽2討論 錯誤!未定義書簽。參考文獻 15致謝 161引言杜仲（Eucommiafolium）為杜仲科杜仲屬植物，是我們國家所特有的一種樹木品種。杜仲在我國分布極為廣泛，周政賢等在二十世紀70~80年代經(jīng)過走訪調(diào)查，提出杜仲在我國十五個省(區(qū))都有分布，加之各地人們對杜仲不斷的引種和馴化，它的分布地點得到了進一步的擴張。杜仲葉是一種杜仲科植物，與杜仲皮有著相同的有效成分和藥理作用。并且杜仲葉的來源更加豐富，成本更加低廉，具有很好的開發(fā)利用價值以及前景。在植物分類學上，杜仲屬杜仲科杜仲屬，僅一屬一種，極為珍稀。杜仲是中國一種名貴的滋補藥材，由于人們一直以來用杜仲皮入藥，加上杜仲資源較為稀缺，所以人們開始用利用杜仲葉（EucommiaeFolium）代替杜仲皮入藥?，F(xiàn)代藥理研究表明，杜仲葉具有降壓、心血管保護、預(yù)防肥胖、調(diào)節(jié)血脂、抗炎、抗疲勞、增強免疫、抗病毒、延緩衰老、等作用，與杜仲皮的藥理作用基本一致，藥用功能基本相同。臨床上杜仲葉主要應(yīng)用于降壓、治療婦產(chǎn)科疾病等。槲皮素作為杜仲葉的活性成分，因此也具有多種藥理作用，杜仲及杜仲葉具有多種藥理活性，且在臨床上也有一定的應(yīng)用，是一味極具開發(fā)價值的中藥材。杜仲葉的研究現(xiàn)況杜仲在我國的藥用研究歷史上時間悠久，傳統(tǒng)上主要是用杜仲皮入藥。然而，杜仲樹生長需要長達十年以上才能夠進行第一次剝皮取藥，剝皮后又需間隔三到四年后才能夠再次剝皮取藥，并且剝皮后如果對杜仲樹的培養(yǎng)護理不當會極易造成皮剝樹死的嚴重后果，不利于對杜仲資源利用的可持續(xù)發(fā)展。為了能夠很好的解決杜仲藥材緊缺的問題，急需開辟新的杜仲用藥部位。國內(nèi)的許多學者對杜仲葉和杜仲皮的活性成分以及藥理作用進行比較研究分析，結(jié)果表明，杜仲葉和杜仲皮的活性成分基本上一致，藥理作用也基本上相同，若可以再通過進一步的研究，完全有望在臨床上實現(xiàn)以杜仲葉代替杜仲皮。杜仲葉的成熟在夏秋季節(jié)，且每年杜仲葉的產(chǎn)量巨大，通過合理的采摘并不會影響到杜仲樹的繼續(xù)健康生長，有利于杜仲資源的可持續(xù)健康發(fā)展。杜仲葉內(nèi)含有豐富的（黃酮類化合物）、綠原酸、苯丙素、環(huán)烯醚萜、多糖等活性成分，且具有抗疲勞、抗氧化、防治骨質(zhì)疏松、保護心腦血管、增強免疫力、降血壓血脂等多種的藥理作用。1.2杜仲葉活性成分槲皮素的研究意義在中國有著兩千多年藥用歷史的杜仲，它的皮和膠都已經(jīng)得到了較為充分的開發(fā)和研究，但是作為藥用資源更加豐富的杜仲葉卻常常被人們作為動物的飼料來直接飼喂給家禽、家畜或者直接被廢棄處理，并未對它加以有效的合理利用，造成了藥用資源的一種極大浪費。杜仲葉中的黃酮含量很高，從中提取含有黃酮物質(zhì)的方法多種多樣，且具有良好的生物活性，是一個很好的天然植物的黃酮來源。所以，在將杜仲葉中黃酮物質(zhì)提取出來加以利用后，可以再把杜仲葉的殘渣加工成動物飼料等產(chǎn)品達到二次利用，這對杜仲葉資源的充分利用、深度綜合可持續(xù)開發(fā)以及天然植物黃酮的廣泛應(yīng)用將產(chǎn)生重要影響。本文的撰寫以期為杜仲葉資源的深度可持續(xù)綜合開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。同時，杜仲葉資源的開發(fā)，還將有效促進杜仲林的種植與保護，保護環(huán)境的同時也能提高自然資源利用率，有利于當?shù)貥滢r(nóng)們的收入增加，帶動種植運輸?shù)刃袠I(yè)的發(fā)展，產(chǎn)生顯著的環(huán)境效益、社會效益和經(jīng)濟效益。1.3杜仲葉活性成分槲皮素的研究現(xiàn)況作為杜仲葉的主要活性成分——槲皮素是一種具有多種生物活性的黃酮類化合物，是黃酮類化合物的主要成分，具有極高的藥用和醫(yī)學價值。在植物界中，含有槲皮素的中草藥約有百種，在許多植物的花、果實以及葉子中廣泛分布，如中藥銀杏葉、杜仲葉等。槲皮素具有抗氧化、抗過敏、抗炎、抗病毒、抗菌，抑制惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移、清除體內(nèi)自由基等許多方面的藥理作用，也有著改善腦循環(huán)、擴張動脈和抗血小板活化因子、降低毛細血管通透性、祛痰止咳及脆性等等的生物活性，能有效提高生物體的免疫能力、增強心肌收縮力、降低膽固醇、降低血壓、抗過敏、舒張腸平滑肌和免疫抑制的作用。作為一種低毒性的植物黃酮類化合物，槲皮素也因為它的抗氧化性特點從而得到學者們?nèi)找鎻V泛的關(guān)注。但目前對槲皮修復軟骨細胞的研究仍較少，進一步研究是有必要的，應(yīng)該增加各種與人類軟骨密切相關(guān)的能進行大量臨床試驗的動物臨床前期模型研究，研究槲皮素對軟骨組織是否亦具有修復的藥理作用，和槲皮素的長期使用是否對人體應(yīng)用安全以及毒副作用。1.4斑馬魚軟骨模型在骨骼疾病研究中的應(yīng)用斑馬魚與人類基因的同源性可高達85%之多，它的信號傳導通路和人類的基本相似，生物結(jié)構(gòu)以及生理功能和哺乳動物也非常相似，并且有著個體小、生長周期短(24小時內(nèi)器官就可形成）、實驗周期短、實驗花費用低、體外受精、易觀察（魚體透明）、易繁殖（一次可產(chǎn)卵150至200枚）以及實驗所用藥劑量微?。樾∈笥盟幜康?/100~1/1000）等許多優(yōu)點，因此斑馬魚作為研究軟骨的生物模型的優(yōu)勢很突出。斑馬魚是探究軟骨細胞發(fā)育中常用的動物模型，因為其有著發(fā)育快、胚胎透明易觀察等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于軟骨細胞發(fā)育的研究當中。斑馬魚屬于硬骨魚類，它的軟骨組織和人類的透明軟骨組織相似。斑馬魚的軟骨細胞主要集中分布在頭部位置，來源于顱腦神經(jīng)嵴細胞(CNC)，包括七對咽顱軟骨弓(下領(lǐng)弓、舌弓及五對鰓弓或1-7軟骨弓)以及腦顱軟骨，而在脊椎及魚鰭中未發(fā)現(xiàn)經(jīng)典類型的軟骨細胞。斑馬魚軟骨細胞是由CNC衍生而來的，它的生長發(fā)育主要可分為三個階段：細胞的形成、細胞的成熟和細胞的凋亡。在受精后的第1天，胚胎中腦及后腦中的神經(jīng)嵴細胞往咽顱和腦顱的軟骨進行區(qū)域遷移，在這之后，這些細胞會被內(nèi)、外胚層細胞包裹，接著通過一系列的信號分子誘導，CNC會分化為早期的軟骨細胞，這個分化過程被稱軟骨縮合間。在受精后的2到3天內(nèi)，軟骨細胞會繼續(xù)增殖且產(chǎn)生大量富含膠原蛋白及粘多糖的細胞外基質(zhì)，逐漸形成軟骨弓。隨著軟骨細胞的繼續(xù)發(fā)育，軟骨細胞開始肥大，并能夠合成標志著成熟的Ihh等分子，這一階段被稱軟骨細胞的成熟。從受精后的6到7天開始，已經(jīng)發(fā)育成熟的軟骨細胞會出現(xiàn)調(diào)亡的情況，伴隨著細胞外基質(zhì)鈣化及成骨細胞的遷入，軟骨組織會慢慢的形成鈣化骨，稱這一階段為軟骨內(nèi)成骨。本文實驗主要利用EDTA處理培養(yǎng)斑馬魚使其軟骨細胞變性，再利用杜仲葉提取物槲皮素修復斑馬魚的受損軟骨。1.5研究的目的及意義在我國的中藥研究史上，杜仲有著兩千多年的悠久藥用歷史，傳統(tǒng)上使用杜仲皮入藥，經(jīng)現(xiàn)代醫(yī)學的研究表明，杜仲具有良好的降壓、抑菌、消炎、抑癌、鎮(zhèn)靜安神等多種功效。近年來的研究表明，杜仲葉和杜仲皮的主要化學成分基本上一致，使得杜仲葉代替杜仲皮入藥成為了可能。本試驗以南昌本地實驗室杜仲葉提取物槲皮素為原料，探索了杜仲葉中活性成分槲皮素的抗氧化性以及對骨骼修復的作用。2材料與方法2.1藥物及試劑培養(yǎng)基;蛋白質(zhì)定量測試盒（貨號:A045-2考馬斯亮藍法）；微量丙二醛（MDA）測試盒(貨號：003-2TBA法）；過氧化氫酶（CAT）測試盒（貨號：A007-1可見光法）；總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒；阿爾新藍（alcianblue8GX）試劑；茜素紅（alizarinredS）試劑；杜仲葉提取物槲皮素（本實驗室制備）；2.2主要儀器電子天平：TP-3102（北京賽利斯儀器有限公司）；離心機(KDC-1044低速離心機)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司生產(chǎn)；光學顯微鏡（上海光學XTZ-D）；可見光分光光度計（V-1500PC型）；離心機(KDC-1044低速離心機)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司生產(chǎn)；漩渦混合機；凈化工作臺。2.3動物動物：AB魚系斑馬魚2.4實驗方法2.4.1斑馬魚的處理方法在實驗室條件下，將AB魚系斑馬魚置于盛有標準魚液玻璃魚缸內(nèi)繁殖。使AB魚系斑馬魚進行交配，選取發(fā)育正常的受精后6h（6hpf）胚胎加入含有0、25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、125μg/mlEDTA的魚液中培養(yǎng)72h后換不加EDTA的標準魚液培養(yǎng)72h，進行染色拍照（軟骨使用阿爾新藍試劑，硬骨使用茜素紅試劑）。同時選取發(fā)育正常的受精后6h（6hpf）胚胎加入含有100μg/mlEDTA的魚液中培養(yǎng)72h后換含0、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml槲皮素的魚液中培養(yǎng)72h，進行染色拍照（軟骨使用阿爾新藍試劑，硬骨使用茜素紅試劑），并選取斑馬魚軟骨組織進行超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性、丙二醛含量數(shù)值測試。2.4.2槲皮素對斑馬魚總超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性和丙二醛的影響以標準魚液作為空白組，100μg/mlEDTA作為對照組。再分別配置濃度為1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml槲皮素的魚液，每組放入相同數(shù)量的斑馬魚。將已在100μg/mlEDTA的魚液中培養(yǎng)72h后的斑馬魚分別放入加有0、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml槲皮素的魚液中培養(yǎng)72h。隨機選取待測三條斑馬魚加生理鹽水250μl研磨，冰水浴條件下機械勻漿，2500r/min，離心十分鐘，取上清液，生理鹽水按1

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4比例稀釋成2%濃度組織勻漿，待測。混勻，靜置10分鐘，波長595nm，光徑1cm，雙蒸水調(diào)零，測定各管吸光度值。使用購自南京建城生物工程研究所的總蛋白定量試劑盒（考馬斯亮藍），通過考馬斯亮藍法（蛋白質(zhì)分子具有一基團，當標紅色的考馬斯亮藍顯色劑加入蛋白標準液或樣品中時，考馬斯亮藍染料上的明離子與蛋白用結(jié)合，使溶液變?yōu)樗{色，通過測定吸光度可計算出蛋白含量）進行測定。單位為gprot/L。用公式（1）計算待測蛋白濃度。超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)，簡稱：SOD。SOD是一種源自于\t"/item/%E8%B6%85%E6%B0%A7%E5%8C%96%E7%89%A9%E6%AD%A7%E5%8C%96%E9%85%B6/_blank"生命體的活性物質(zhì)，能夠?qū)ι矬w在\t"/item/%E8%B6%85%E6%B0%A7%E5%8C%96%E7%89%A9%E6%AD%A7%E5%8C%96%E9%85%B6/_blank"新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)進行分解消除。因此對人體內(nèi)不斷地提供適量的SOD可以起到抗衰老的特殊效果。當生命體受到了一定的刺激后，在自由基的誘導下，一般會出現(xiàn)SOD暫時性的增長現(xiàn)象，隨著SOD的大量消耗，SOD會快速降低到較低水平。在生物體內(nèi)SOD活性酶是一種非常重要的自由基清除劑，活性酶能夠有效的提高細胞活性。超氧化物歧化酶(SOD)對機體的氧化與抗氧化的相對平衡起著非常重要的作用，它能清除生物體內(nèi)超氧陰離子自由基(O-)從而保護細胞免受損傷。因此SOD活力的高低與衰老、腫瘤、炎癥、自身免疫病、血液病、心血管病、腎臟病、消化系統(tǒng)疾病、輻射、藥物作用等有著密切的聯(lián)系，用公式（2）計算出SOD含量，比較不同濃度槲皮素組SOD含量的變化情況。丙二醛（MDA）是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生會加劇膜的損傷，因此在生物體衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是一個常用性指標，可通過MDA的含量變化來了解膜脂過氧化的程度，從而間接測定膜系統(tǒng)的受損程度以及生物體的抗逆性。在生物體內(nèi)，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，其氧化終產(chǎn)物為丙二醛，會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細胞毒性。因此，初始的一個活性氧會造成許多脂類分解產(chǎn)物的產(chǎn)生，在這些分解產(chǎn)物當中，一部分是無害的，而另一部分會造成細胞的代謝紊亂以及功能性障礙，甚至死亡。測定MDA含量時采用TBA法，在532nm處按照說明說進行測定各管吸光度。用公式（3）計算出MDA含量，比較不同濃度槲皮素組MDA含量的變化情況。MDA的測定常常與SOD的測定相互配合，SOD活力的高低間接反應(yīng)了機體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反應(yīng)了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度，通過SOD與MDA的結(jié)果分析有助于醫(yī)學、生物學、藥理及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展。過氧化氫酶（CAT）是一種酶類清除劑，又稱為觸酶，它可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內(nèi)的過氧化氫，從而使細胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的\t"/item/%E8%BF%87%E6%B0%A7%E5%8C%96%E6%B0%A2%E9%85%B6/_blank"關(guān)鍵酶之一。氫氧自由基(OH)

是化學性質(zhì)最活潑的活性氧，它幾乎與細胞內(nèi)的每一類有機物如糖、氨基酸、磷脂、核苷酸和有機酸等都能反應(yīng)，并且有非常高的速度常數(shù)，因此它的破壞性極強。但它可以被過氧化氫酶CAT分解，保護機體細胞穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境及細胞的正常生活，因而可以通過測定CAT活性判斷不同濃度槲皮素下軟骨組織抗氧性強弱程度。根據(jù)測試盒，過氧化氫酶（CAT）分解H2O2的反應(yīng)可通過加入鉬酸銨而迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物，在405nm處測定其生成量，用公式（4）計算出CAT活性，比較不同濃度槲皮素組CAT含量的變化情況。2.5數(shù)據(jù)處理試驗所得數(shù)據(jù)用MicrosoftOfficeExcel2010程序處理,并用MicrosoftOfficeExcel2010程序制作表格以及柱狀圖。3分析與結(jié)論3.1槲皮素對EDTA處理下的斑馬魚軟骨與硬骨的影響如圖1所示在光學顯微鏡下，阿爾新藍將斑馬魚軟骨染成藍色，茜素紅將斑馬魚硬骨染成紅色，由圖1軟骨組織切片可以看到，EDTA會對斑馬魚軟骨組織進行破壞，且在100μg/ml濃度下的EDTA培養(yǎng)過的斑馬魚的軟骨受損情況較為明顯且并未變得特別畸形。超過100μg/ml濃度下EDTA培養(yǎng)的斑馬魚受損情況嚴重且畸形。說明EDTA會使斑馬魚軟骨組織變形。如圖2所示，阿爾新藍將斑馬魚軟骨染成藍色，茜素紅將斑馬魚硬骨染成紅色，由圖2軟骨組織切片可以看到，在4μg/ml濃度下槲皮素魚液培養(yǎng)的斑馬魚軟骨組織得到修復，與空白組差異不大，在6μg/ml濃度下槲皮素魚液培養(yǎng)的斑馬魚軟骨組織變形。因此可以得出由EDTA培養(yǎng)的斑馬變性軟骨組織隨適量槲皮素的濃度增加而逐步修復。說明適量槲皮素有助于骨骼修復。但是過量槲皮素對軟骨組織的修復反而有害。Control25Control25μg/ml50ug/ml75μg/ml100μg/ml125μg/mlCartilagehardboneFigure1EffectofEDTAtreatmentonzebrafishcartilageandhardboneCartilageCartilagehardboneEDTAQuercetin（μg/ml）－－100－1001100210041006圖2槲皮素對EDTA處理的斑馬魚軟骨與硬骨的影響Figure2EffectofquercetinonEDTA-treatedzebrafishcartilageandhardbone3.2槲皮素對斑馬魚超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響如圖4所示，選取發(fā)育正常的受精后6h（6hpf）胚胎加入含有100μg/mlEDTA的魚液中培養(yǎng)72h后，100μg/mlEDTA處理過的斑馬魚SOD活性低于空白組，說明EDTA使斑馬魚發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，對自由基清除劑SOD產(chǎn)生損傷，細胞活力降低，凋亡增加。同時用0、1、2、4、6μg/ml的槲皮素魚液培養(yǎng)該組斑馬魚，用不同濃度槲皮素組對比空白組，發(fā)現(xiàn)4μg/ml槲皮素組SOD活力最趨近于空白組SOD活力，軟骨組織得到修復。而槲皮素濃度在6μg/ml范圍時，SOD活性又超過空白組，可能是由于過量的槲皮素會導致氧化反應(yīng)的增強，說明，雖然槲皮素具有抗氧化性，但是過量的槲皮素對軟骨組織的修復有害無利。圖4槲皮素對斑馬魚SOD活性的影響Fig.4EffectofquercetinonSODactivityinzebrafish3.3槲皮素對斑馬魚過氧化氫酶（CAT）活力的影響如圖5所示，選取發(fā)育正常的受精后6h（6hpf）胚胎加入含有100μg/mlEDTA的魚液中培養(yǎng)72h后，斑馬魚在100μg/mlEDTA魚液的培養(yǎng)下，CAT活性低于空白組，說明EDTA會抑制斑馬魚體內(nèi)的CAT活性，軟骨細胞活力降低，凋亡增加。同時用0、1、2、4、6μg/ml的槲皮素魚液培養(yǎng)該組斑馬魚，在1μg/ml槲皮素魚液組的培養(yǎng)下CAT活力大于空白組，隨著濃度的加大，CAT活力雖然逐漸降低，但均高于空白組，濃度在4μg/ml范圍內(nèi)，斑馬魚體內(nèi)CAT活性最接近空白組，6ug/ml實驗組CAT活力過強。EDTA魚液培養(yǎng)斑馬魚會抑制CAT活性，使斑馬魚軟骨變性。CAT活力的增強會對軟骨組織修復有一定的治療效果。以斑馬魚CAT活性變化為指標，說明槲皮素可以緩解EDTA對軟骨組織中過氧化氫酶活性的抑制影響。槲皮素濃度在6μg/ml范圍時，CAT活性遠高于空白組，說明，雖然槲皮素具有抗氧化性，但是過量的槲皮素會促進氧化反應(yīng)，產(chǎn)生代謝廢物，CAT活性迅速增加。因此在在4μg/ml的槲皮素濃度下，斑馬魚軟骨細胞中CAT活性恢復最接近空白組，修復效果最好。圖5槲皮素對斑馬魚CAT活性的影響Fig.5EffectofquercetinonCATactivityofzebrafish3.4槲皮素對斑馬魚丙二醛（MDA）含量的影響如圖6所示，選取發(fā)育正常的受精后6h（6hpf）胚胎加入含有100μg/mlEDTA的魚液中培養(yǎng)72h后，100μg/mlEDTA魚液培養(yǎng)的斑馬魚軟骨細胞中的MDA含量遠低于空白組，說明EDTA使斑馬魚軟骨細胞變性，無法進行正常的細胞代謝產(chǎn)生丙二醛。同時用0、1、2、4、6μg/ml的槲皮素魚液培養(yǎng)該組斑馬魚，發(fā)現(xiàn)隨槲皮素濃度的增加，MDA含量逐漸恢復正常，接近于空白組，當槲皮素濃度處于6μg/ml時，MDA含量超過空白組，可能是由于過量的槲皮素會促進氧化反應(yīng)所導致的。在4μg/ml的槲皮素濃度下，斑馬魚軟骨組織恢復最接近空白組，修復效果最好。圖6槲皮素對斑馬魚MDA含量的影響Fig.6EffectsofquercetinonMDAcontentinzebrafish4結(jié)論與討論4.1結(jié)論1、用含有0、25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、125μg/mlEDTA的魚液培養(yǎng)正常受精后6h（6hpf）斑馬魚胚胎，染色拍照觀察后發(fā)現(xiàn)在100μg/ml的濃度范圍內(nèi)斑馬魚軟骨受損情況較為明顯，且魚未變得特別畸形，用該種濃度下處理進行修復的修復狀態(tài)較好。超過100μg/ml濃度范圍，則槲皮素難以修復，低于100μg/ml濃度范圍，則槲皮素修復情況不明顯。2、SOD活性先升高后下降，4μg/ml濃度時SOD活性接近空白組，到達6μg/ml后，SOD活性又升高。MDA含量隨槲皮素濃度增加而逐漸趨于空白組，4μg/ml濃度時，MDA含量接近空白組，到達6μg/ml后，MDA含量繼續(xù)升高。4、CAT活性隨槲皮素濃度增加而逐漸趨于空白組，4μg/ml濃度時，CAT活性接近空白組，到達6μg/ml后，CAT活性又升高。5、使用含EDTA魚液培養(yǎng)過的斑馬魚，SOD、CAT、MDA含量降低，低于空白組，軟骨細胞存活率降低，細胞變性。使用含有槲皮素的魚液培養(yǎng)EDTA處理過的斑馬魚，軟骨細胞存活率升高，細胞增殖能力恢復，SOD、CAT、MAD含量升高，逐漸趨于正常值，修復軟骨組織。隨濃度升高變化更明顯。結(jié)論槲皮素對軟骨細胞氧化應(yīng)激損傷有保護作用，對軟骨細胞修復具有顯著效果。6、槲皮素可抑制EDTA：EDTA處理可導致斑馬魚軟骨受損，而槲皮素可使斑馬魚軟骨修復，槲皮素長期應(yīng)用可能提高斑馬魚軟骨組織抗氧化功能，但不可過量。4.2討論通過對蛋白濃度、CAT活性、SOD活性和MDA含量的測定，可以發(fā)現(xiàn)，EDTA會抑制體內(nèi)CAT、SOD活性，同時降低體內(nèi)MDA含量，會使斑馬魚軟骨細胞變性，存活率降低。SOD活性和MDA含量基本都隨著槲皮素濃度的增加而趨向空白組數(shù)值，說明機體細胞新成代謝加快，軟骨組織得到修復，可以推測出斑馬魚軟骨變性組織有所減輕。其中4μg/ml濃度時的SOD、CAT活性、MDA含量均接近空白組，推測可能是因為在4μg/ml槲皮素濃度時更有利于軟骨修復，6μg/ml可能超過槲皮素修復軟骨的最適濃度。且EDTA對CAT有著抑制作用，而CAT活性通過加入槲皮素從而增加，說明槲皮素對EDTA有著抑制作用，CAT活性得到恢復，CAT活性的增加對炎癥的減輕也有著一定的促進作用。CAT活性、SOD活性和MDA含量都與機體抗氧化性相關(guān)，綜合分析槲皮素對CAT活性、SOD活性和MDA含量的影響，說明槲皮素有抗氧化作用，能增強機體的抗氧化性，對軟骨細胞修復有著促進作用。槲皮素濃度在4μg/ml時機體對斑馬魚軟骨細胞的修復效果最好。有研究發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎是一種慢性的關(guān)節(jié)疾病，其特點是骨質(zhì)增生以及關(guān)節(jié)軟骨的破壞變性[1]。有研究表明，骨性關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生原因和繼續(xù)發(fā)展都與氧化應(yīng)激緊密聯(lián)系在一起[2]。生物體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要原因是活性氧(ROS)的產(chǎn)生與抗氧化酶降解ROS的能力失去相對平衡[3]。氧化應(yīng)激時指生物體遭受有害物質(zhì)刺激時會產(chǎn)生過多的自由基(freeradical)、活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)或活性氮(reactivenitrogenspecies,RNS)并可能伴隨有生物體的抗氧化能力降低，導致生物體自身無法對ROS或RNS進行有效的清除，使得體內(nèi)ROS或RNS含量上升，破壞了機體原有的氧化/還原相對平衡狀態(tài)，因此導致組織和細胞的氧化損傷，從而發(fā)生疾病的病理過程。杜仲葉中的活性成分槲皮素，能夠有效地抑制細胞的炎性反應(yīng)以及氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物能夠清除活性氧(ROS)自由基，包括羥自由基(-OH)、超氧陰離子(-O2-)和單線態(tài)氧(1O2)，這與黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中的3，7-羥基有關(guān)。槲皮素為其提供氫原子，使其鄰二酚羥基經(jīng)單電子轉(zhuǎn)移方式直接清除羥自由基和超氧陰離子，自身形成更加穩(wěn)定的分子內(nèi)氫鍵，從而能夠有效的阻止不飽和脂肪酸、花生四烯酸的過氧化，降低自由基對生物膜的破壞性[5]。本研究利用EDTA誘導軟骨細胞發(fā)生氧化應(yīng)激，使其變性，同時給予以槲皮素干預(yù)，探討槲皮素對軟骨細胞氧化應(yīng)激的保護作用，為槲皮素修復軟骨細胞提供實驗依據(jù)。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，在EDTA破壞軟骨細胞的同時給予斑馬魚按0、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/mll濃度的槲皮素魚液進行分組培養(yǎng)，對EDTA有害物質(zhì)引起的軟骨細胞損傷有修復作用，可使軟骨組織中丙二醛(malondiadehyde,MDA)含量恢復常值，SOD、CAT活性恢復常值，表明槲皮素對斑馬魚軟骨細胞的修復相關(guān)。目前的研究表明幾乎所有的臨床和實驗性軟骨受損中都有氧化應(yīng)激的存在，且常常伴隨著抗氧化力降低，比如過氧化脂質(zhì)的積聚，抗氧化酶的活性降低等，氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的活性氧自由基與氮自由基是導致軟骨細胞凋亡、軟骨細胞外基質(zhì)降解的主要原因，而使用抗氧化劑進行治療可減輕(修復)這種癥狀。本實驗中EDTA誘導的斑馬魚軟骨組織中SOD、CAT活性明顯降低，MDA含量明顯低于常值，軟骨細胞變性，存活率降低，但杜仲提取物槲皮素組SOD、CAT活性明顯升高，MDA含量增加恢復常值，說明杜仲葉中活性成分槲皮素(黃酮類)對軟骨的修復可能由于其抗氧化性。杜仲葉活性成分槲皮素(黃酮類)中的主要成分是黃酮甙，其母核中含有還原性羥基功能基團，可以捕捉脂質(zhì)過氧自由基、脂氧自由基以及烷自由基等，為這些氧自由基提供氫原子，從而達到終止自由基連鎖反應(yīng)鏈的目的，阻止和抑制氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的病理性加劇，緩解氧自由基及脂質(zhì)過氧化對軟骨細胞的損傷。結(jié)合本文的實驗結(jié)果，可以認為杜仲葉提取物槲皮素(黃酮類)是一個具有很高開發(fā)價值前景的軟骨修復類藥物，值得進一步深入研究和開發(fā)。參考文獻ValdesAM,SpectorTD.Thegeneticepidemiologyofosteoarthritis.CurrOpinRheumatol,2010,22:139-143.ValéryAfonso,RomualdChampy,DragoslavMitrovic,PascalCollin,AbderrahimLomri.Reactiveoxygenspeciesandsuperoxidedismutases:Roleinjointdiseases[J].JointBoneSpine,2007,74(4).LeeJW,DavisJM.Futureapplicationsofantioxidantsinprematureinfants.CurtOpinediatr,2011,23:161-166.QueLL,W