第47講微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用主講人：飛哥生物學(xué)選擇性必修三《生物技術(shù)與工程》4.3對(duì)動(dòng)物早期胚胎或配子進(jìn)行顯微操作和處理以獲得目標(biāo)個(gè)體4.3.1簡(jiǎn)述胚胎形成經(jīng)過(guò)了受精及早期發(fā)育等過(guò)程4.3.2簡(jiǎn)述胚胎工程包括體外受精、胚胎移植和胚胎分制等技術(shù)內(nèi)容要求——植物細(xì)胞工程目錄Contents01微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)02微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用00微生物微生物是難以用肉眼觀察的微小生物的統(tǒng)稱，包括細(xì)菌、真菌、病毒及一些原生生物等。本章中提及的微生物主要指用于發(fā)酵的細(xì)菌和真菌。原核生物無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)：病毒真核生物微生物細(xì)菌藍(lán)細(xì)菌放線菌支原體衣原體等原生生物：

低等藻類、原生動(dòng)物真菌：酵母菌、霉菌、食用真菌有細(xì)胞結(jié)構(gòu)00微生物00微生物分散的微生物在適宜的周體培養(yǎng)基表而或內(nèi)部可以繁殖形成肉眼可見(jiàn)的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，這就是菌落。01微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用1.培養(yǎng)基的配制1.培養(yǎng)基概念：人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。固體培養(yǎng)基：不含凝固劑（如瓊脂）、呈液體狀態(tài)的培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基：含凝固劑（如瓊脂）、呈固體狀態(tài)的培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基。2.培養(yǎng)基作用：用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物。（①提供微生物繁殖所需各種營(yíng)養(yǎng)，②異養(yǎng)微生物的能源）3.培養(yǎng)基類型（物理性質(zhì)分類）：盛有液體培養(yǎng)基的錐形瓶（左）和長(zhǎng)有酵母菌菌落的固體培養(yǎng)基（右）劃分標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基種類特點(diǎn)用途物理性質(zhì)化學(xué)成分用途不加凝固劑加凝固劑，如瓊脂工業(yè)生產(chǎn)觀察微生物的運(yùn)動(dòng)、分類鑒定微生物分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)、保藏菌種含化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)培養(yǎng)基成分明確分類、鑒定在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì),以抑制不需要的微生物的生長(zhǎng),促進(jìn)所需要的微生物的生長(zhǎng)培養(yǎng)、分離出特定微生物在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品，用以鑒別不同種類的微生物鑒別不同種類微生物選擇培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基01微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用1.培養(yǎng)基的配制01微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用1.培養(yǎng)基的配制雖然各種培養(yǎng)基的配方不同，但一般都含有水、碳源（提供碳元素的物質(zhì)）、氮源（提供氮元素的物質(zhì)）和無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。如表：細(xì)菌培養(yǎng)基。在提供上述幾種主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及O2的需求。例如，在培養(yǎng)乳酸桿菌時(shí)，需要在培養(yǎng)基中添加維生素在培養(yǎng)霉菌時(shí)，需要將培養(yǎng)基調(diào)至酸性；在培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，需要將培養(yǎng)基調(diào)至中性或弱堿性；在培養(yǎng)厭氧微生物時(shí)需要提供無(wú)氧的條件。01微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用1.培養(yǎng)基的配制01微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用2.無(wú)菌技術(shù)消毒：是指使用較為溫和的物理、化學(xué)和生物等方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分微生物。滅菌：則是指使用強(qiáng)烈的理化方法殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。消毒和滅菌工作主要包括兩個(gè)方面：對(duì)操作的空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒；將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌。常用的消毒方法有煮沸消毒、巴氏消毒等；滅菌方法有濕熱滅菌、干熱滅菌和灼燒滅菌等。無(wú)菌技術(shù)除用來(lái)防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來(lái)微生物污染外，還能避免操作者被微生物感染。芽孢：細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體，芽孢壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。孢子：有繁殖作用的無(wú)性生殖細(xì)胞01微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用2.無(wú)菌技術(shù)（1）消毒①最常用的是煮沸消毒法，針對(duì)某些實(shí)驗(yàn)器具、餐具、飲用水等，采用在100℃煮沸5~10min的方法，達(dá)到消毒的目的。②巴氏消毒法：62-65℃下煮30min或80-90℃下煮30s-1min。③化學(xué)藥劑消毒法：用70%酒精擦拭雙手；氯氣消毒水源。④紫外線消毒法：用紫外燈照射30min接種室、接種箱、超凈工作臺(tái)01微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用2.無(wú)菌技術(shù)（1）消毒煮沸消毒法巴氏消毒法化學(xué)藥劑消毒法紫外線消毒法01微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用2.無(wú)菌技術(shù)（2）滅菌①高壓滅菌的操作方法1.首先將內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架平齊。2.放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免妨礙蒸汽流通而影響滅菌效果。錐形瓶與試管口不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包裹瓶口的紙而透入棉塞。3.加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)。擰緊固定蓋子的螺栓，注意要同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，不漏氣。4.加熱滅菌鍋，打開(kāi)排氣閥，使水沸騰，排除鍋內(nèi)的冷空氣。等冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐步上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，控制熱源，按照滅菌所要求的時(shí)間，維持壓力。5.到滅菌時(shí)間后，切斷熱源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降到零時(shí)，打開(kāi)排氣閥，旋松螺栓，打開(kāi)蓋子，取出滅菌物品。如果提前打開(kāi)排氣閥，鍋內(nèi)壓力突然下降，滅菌容器內(nèi)的液體會(huì)沖出容器，造成污染。01微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用2.無(wú)菌技術(shù)（2）滅菌②干熱滅菌將滅菌物品放入密閉容器如干熱滅菌箱，在160~170℃的熱空氣中維持2~3h可以達(dá)到滅菌的目的。耐高溫的和需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（如吸管、培養(yǎng)皿）、金屬用具等，可以采用這種方法滅菌。③灼燒滅菌將微生物的接種工具，如涂布器、接種環(huán)、接種針或其他金屬用具，直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒，可以迅速?gòu)氐椎販缇?。此外，在接種過(guò)程中，試管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通過(guò)火焰灼燒來(lái)滅菌。01微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用2.無(wú)菌技術(shù)01微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用3.基本操作——配制培養(yǎng)基、滅菌配制培養(yǎng)基：稱取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000ml，加熱煮沸至馬鈴薯軟爛，用紗布過(guò)濾。向?yàn)V液中加入20g葡萄糖、15-20g瓊脂，用蒸餾水定容至1000ml。原料稱量、溶解→調(diào)節(jié)pH→分裝、包扎→滅菌滅菌：將配制好的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，加棉塞，包上牛皮紙，并用皮筋勒緊，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在壓力為100KPa、溫度為121℃的條件下，滅菌15~30min。將5~8套培養(yǎng)皿包成一包，用幾層牛皮紙包緊，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160~170℃滅菌2h。01微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用3.基本操作——倒平板01微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用3.基本操作——接種和分離純培養(yǎng)：由單一個(gè)體繁殖所獲得的微生物群體稱為純培養(yǎng)物，獲得純培養(yǎng)物的過(guò)程就是純培養(yǎng)。將特定的微生物個(gè)體從同種微生物群體中或者從混雜的微生物群體中分離出來(lái)的技術(shù)，叫作微生物的分離。接種：指在無(wú)菌條件下將微生物或含菌材料轉(zhuǎn)移到合適其生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)基中的過(guò)程。接種工具：接種針——用于穿刺接種；接種環(huán)——用于斜面接種或平板劃線接種；玻璃涂布器——用于涂布平板接種；01微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用3.基本操作——接種和分離稀釋涂布平板法

穿刺接種法

斜面接種法

平板劃線法01微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用3.基本操作——接種和分離平板劃線法01微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用3.基本操作——接種和分離平板劃線法劃線法接種后獲得的酵母菌菌落連續(xù)劃線分區(qū)劃線培養(yǎng)：完成平板劃線后，待菌液被培養(yǎng)基吸收，將接種后的平板和一個(gè)未接種的平板倒置，放入28℃左右（培養(yǎng)溫度因酵母菌種類的不同而稍有差異）的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h。01微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用3.基本操作——接種和分離稀釋涂布平板法01微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用3.基本操作——接種和分離稀釋涂布平板法滴加菌液涂布器涂布01微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用3.基本操作——接種和分離稀釋涂布平板法02微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)1.選擇培養(yǎng)基與鑒別培養(yǎng)基種類特點(diǎn)用途舉例選擇培養(yǎng)基允許______________________，同時(shí)___________________________________從眾多微生物中分離所需的微生物加入青霉素分離得到酵母菌和霉菌鑒別培養(yǎng)基根據(jù)微生物的代謝特點(diǎn)在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品，進(jìn)而產(chǎn)生特定的顏色或其他變化鑒別不同種類的微生物用伊紅—亞甲藍(lán)培養(yǎng)基鑒別大腸桿菌特定種類的微生物生長(zhǎng)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)02微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)2.微生物的計(jì)數(shù)間接計(jì)數(shù)法稀釋涂布平板法除可以用于分離微生物外，也常用來(lái)統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目。當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)單菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)為30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。樣品的稀釋度將直接影響平板上的菌落數(shù)目。在實(shí)際操作中，通常選用一定稀釋范圍的樣品液進(jìn)行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)為30～300、適于計(jì)數(shù)的平板。在同一稀釋度下，應(yīng)至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值。每g樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×MC代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)；V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(mL)；M代表稀釋倍數(shù)。02微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)2.微生物的計(jì)數(shù)間接計(jì)數(shù)法例.某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中測(cè)得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每g樣品中的菌落數(shù)是（涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積為0.1mL)（）A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B02微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)2.微生物的計(jì)數(shù)間接計(jì)數(shù)法判斷培養(yǎng)基的制備是否合格（有無(wú)被雜菌污染）：將未接種的培養(yǎng)基同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用：完全培養(yǎng)基（營(yíng)養(yǎng)成分齊全）接種后培養(yǎng)觀察菌落數(shù)目。設(shè)置對(duì)照:主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。02微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)2.微生物的計(jì)數(shù)間接計(jì)數(shù)法02微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)2.微生物的計(jì)數(shù)直接計(jì)數(shù)法利用特定的細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)，然后再計(jì)算一定體積的樣品中微生物的數(shù)量，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果一般是活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和。細(xì)菌計(jì)數(shù)板和血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)原理相同。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板比細(xì)菌計(jì)數(shù)板厚，常用于相對(duì)較大的酵母菌細(xì)胞、霉菌孢子等的計(jì)數(shù)。用細(xì)菌計(jì)數(shù)板可對(duì)細(xì)菌等較小的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。02微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)3.土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)

尿素是有機(jī)物，不能直接被植物的根吸收。土壤中有尿素分解菌，其合成的_______能將尿素分解為_(kāi)____，氨溶于水會(huì)電離出NH4+，才能被植物的根吸收。脲酶分解尿素的反應(yīng)式為：脲酶氨2NH3+CO2尿素[CO(NH2)2]選擇培養(yǎng)基：是指允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。例如，在培養(yǎng)基中加入_________，可用于選擇培養(yǎng)真菌；在培養(yǎng)基中加入高濃度的鹽水，可用于選擇培養(yǎng)金黃色葡萄球菌；不加氮源的無(wú)氮培養(yǎng)基可用于選擇培養(yǎng)_________生物；不加碳源的培養(yǎng)基可用于選擇培養(yǎng)_____生物；以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基可用于選擇培養(yǎng)______________；以纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基可用于選擇培養(yǎng)_______________?？股毓痰责B(yǎng)尿素分解菌纖維素分解菌02微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)3.土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)(1)土壤取樣(3)樣品的稀釋與涂布平板02微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)3.土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)(4)微生物的培養(yǎng)、觀察與計(jì)數(shù)(5)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)(2)制備培養(yǎng)基①取土樣的用具在使用前都需要滅菌。②應(yīng)在酒精燈的火焰旁稱取土壤，并在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。③在稀釋土壤溶液的過(guò)程中，每一步都要在酒精燈火焰旁操作。本實(shí)驗(yàn)使用的平板和試管比較多。為避免混淆，最好使用前就做好標(biāo)記。①培養(yǎng)皿的標(biāo)記：注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期以及平板上培養(yǎng)樣品的稀釋度等。②試管的標(biāo)記：將已經(jīng)進(jìn)行過(guò)稀釋操作的試管，按稀釋度遞增的順序，依次放在試管架的另一行。微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)02

思考1、1g土的體積約為_(kāi)___ml，10g土加入到90ml無(wú)菌水，相當(dāng)于稀釋了____倍。

思考2、假如104稀釋度下涂布的3個(gè)平板的菌落數(shù)分別為42、40和38，則1ml稀釋液中的菌株數(shù)為_(kāi)________，104稀釋度的試管中的菌株數(shù)為_(kāi)________，102稀釋度的試管中的菌株數(shù)為_(kāi)________，101稀釋度的錐形瓶中的菌株數(shù)為_(kāi)________。101稀釋度的試管中的菌株來(lái)自于10g土，所以1g土中的菌株數(shù)為_(kāi)_____