ICS65.150

CCSB50

DB42

湖北省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB42/T2242—2024

水產(chǎn)品中羧甲基賴氨酸的測(cè)定液相色譜法

DeterminationofNε-carboxymethyl-L-lysineinaquaticproducts

—Liquidchromatographymethod

2024-05-14發(fā)布2024-07-14實(shí)施

湖北省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB42/T2242—2024

目次

前言................................................................................III

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3術(shù)語(yǔ)和定義.........................................................................1

4原理...............................................................................1

5試劑與材料.........................................................................1

6儀器與設(shè)備.........................................................................2

7樣品制備與保存.....................................................................3

8測(cè)定步驟...........................................................................3

9精密度.............................................................................4

10檢出限與定量限....................................................................5

附錄A（規(guī)范性）水產(chǎn)品的試樣制備.....................................................6

附錄B（資料性）羧甲基賴氨酸衍生物高效液相色譜圖.....................................7

I

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。

本文件起草單位：湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所、湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加

工與核農(nóng)技術(shù)研究所、湖北省市場(chǎng)監(jiān)督管理局行政許可技術(shù)評(píng)審中心、湖北農(nóng)科質(zhì)標(biāo)檢測(cè)科技有限公司。

本文件主要起草人：胡西洲、劉騫、葉蕓、彭西甜、陳學(xué)玲、張仙、彭茂民、呂昂、陳鑫、朱坤淼、

劉軍、路磊、周有祥、彭立軍。

本文件實(shí)施應(yīng)用中的疑問(wèn)，可咨詢湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳，電話郵箱：hbsnab@126.com，

對(duì)本文件的有關(guān)修改意見(jiàn)建議請(qǐng)反饋至湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，電話：027-

87389465，郵箱：zhibiaosuo204@163.com。

III

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水產(chǎn)品中羧甲基賴氨酸的測(cè)定液相色譜法

1范圍

本文件描述了用液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中羧甲基賴氨酸含量的原理、試劑與材料、儀器與設(shè)備、樣

品制備與保存、測(cè)定步驟、精密度、檢出限與定量限。

本文件適用于魚、蝦、蟹類等水產(chǎn)品中羧甲基賴氨酸含量的測(cè)定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T30891水產(chǎn)品抽樣規(guī)范

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

羧甲基賴氨酸Nε-carboxymethyl-L-lysine（CML）

由葡萄糖與賴氨酸發(fā)生非酶催化反應(yīng)生成的一種典型糖化終末產(chǎn)物。

4原理

試樣脫脂后經(jīng)硼氫化鈉還原、蛋白水解反應(yīng)，水解產(chǎn)物通過(guò)固相萃取后經(jīng)衍生，再用高效液相色譜

分離，熒光檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法定量。

5試劑與材料

試劑

5.1.1三氯甲烷（CHCl3，CAS號(hào)：67-66-3）：分析純。

5.1.2丙酮（CH3COCH3，CAS號(hào)：67-64-1）：分析純。

5.1.3鹽酸（HCl，CAS號(hào)：7647-01-0）：分析純。

5.1.4氫氧化鈉（NaOH，CAS號(hào)：1310-73-2）：分析純。

5.1.5磷酸二氫鈉（NaH2PO4，CAS號(hào)：7558-80-7）：分析純。

5.1.6硼氫化鈉（NaBH4，CAS號(hào)：16940-66-2）：分析純。

5.1.7鄰苯二甲醛（C8H6O2，CAS號(hào)：643-79-8）：分析純。

5.1.83-巰基丙酸（C3H6O2S，CAS號(hào)：107-96-0）分析純。

5.1.9甲醇（CH3OH，CAS號(hào)：67-56-1）：色譜純。

5.1.10乙腈（CH3CN，CAS號(hào)：75-05-8）：色譜純。

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5.1.11甲酸（HCOOH，CAS號(hào)：64-18-6）：分析純。

5.1.12硼酸（H3BO3，CAS號(hào)：11113-50-1）：分析純。

5.1.13十水合四硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O，CAS號(hào)：1303-96-4）：分析純。

5.1.14水（H2O，CAS號(hào)：7732-18-5）：為符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

溶液配制

5.2.16mol/L鹽酸溶液：取50mL鹽酸（見(jiàn)5.1.3），用水溶解并定容至100mL。

5.2.20.1mol/L鹽酸溶液：取1.67mL鹽酸（見(jiàn)5.2.1），用水溶解并定容至100mL。

5.2.30.1mol/L氫氧化鈉溶液：稱取2.00g氫氧化鈉（見(jiàn)5.1.4），用水溶解并定容至500mL。

5.2.40.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.8）：稱取0.12g磷酸二氫鈉（見(jiàn)5.1.5），加水溶解并稀釋至

100mL，用0.1moL/L的氫氧化鈉（見(jiàn)5.2.3）調(diào)pH至7.8。

5.2.50.1mol/L硼酸鈉緩沖液（pH10.2）：稱取0.49g硼酸（見(jiàn)5.1.12）和0.19g十水合四硼酸鈉

（見(jiàn)5.1.13），用水溶解并定容至100mL，用0.1moL/L氫氧化鈉溶液（見(jiàn)5.2.3）調(diào)pH至10.2。

5.2.62mol/L硼氫化鈉溶液：稱取7.57g硼氫化鈉（見(jiàn)5.1.6），用0.1mol/L氫氧化鈉溶液（見(jiàn)

5.2.3）溶解并定容至100mL。

5.2.7衍生化試劑：取80mg鄰苯二甲醛（見(jiàn)5.1.7），加入7.0mL0.1mol/L硼酸鈉緩沖溶液（見(jiàn)

5.2.5）和125μL3-巰基丙酸（見(jiàn)5.1.8）和1mL乙腈（見(jiàn)5.1.10），使其完全溶解，混勻，于4℃下

保存，有效期為3個(gè)月。

5.2.8丙酮-三氯甲烷溶液（3+1，體積比）：取300mL丙酮（見(jiàn)5.1.2）和100mL三氯甲烷（見(jiàn)5.1.1），

混勻。

5.2.9水-乙腈-甲醇溶液（10+45+45，體積比）：取450mL乙腈（見(jiàn)5.1.10）、450mL甲醇（見(jiàn)5.1.9）

和100mL水，混勻。

5.2.10甲醇-0.1%甲酸水溶液：取500mL甲醇（見(jiàn)5.1.9），加入0.5mL甲酸（見(jiàn)5.1.11），混勻。

標(biāo)準(zhǔn)品

羧甲基賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號(hào)：5746-04-3），純度≥98%。

標(biāo)準(zhǔn)品的配制

5.4.1羧甲基賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1000mg/L）：準(zhǔn)確稱取適量羧甲基賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.1mg）

至棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻。將溶液轉(zhuǎn)至棕色玻璃容器中，-18℃下保存，有效

期為6個(gè)月。

5.4.2羧甲基賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（1.0mg/L）：準(zhǔn)確量取羧甲基賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.1mL于100

mL棕色容量瓶中，用0.1mol/L鹽酸溶液（見(jiàn)5.2.2）稀釋并定容至100mL，混勻。將溶液轉(zhuǎn)至棕色玻

璃容器中，4℃下保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

材料

5.5.1固相萃取柱，C18填料，容積6mL，填充物500mg。

5.5.2微孔濾膜，有機(jī)系，孔徑0.2μm。

6儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：配熒光檢測(cè)器。

分析天平：感量0.01mg和0.01g。

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離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于5000r/min。

固相萃取裝置。

氮吹儀。

渦旋震蕩器。

烘箱（可控溫）。

7樣品制備與保存

樣品制備按附錄A的規(guī)定執(zhí)行，符合GB/T30891的要求，制備后的樣品于-18℃下保存。

8測(cè)定步驟

樣品前處理

8.1.1脫脂

稱取2g（精確至0.01g）試樣置于50mL離心管中，加入20mL丙酮-三氯甲烷溶液（見(jiàn)5.2.8），充

分混勻，以5000r/min離心5min，棄去上清液；再次加入20mL丙酮-三氯甲烷溶液（見(jiàn)5.2.8），重復(fù)一

次，得蛋白沉淀。

8.1.2硼氫化鈉還原

在蛋白沉淀中加入1.6mL硼酸鈉緩沖液（見(jiàn)5.2.5）、400μL硼氫化鈉溶液（見(jiàn)5.2.6），靜置8h。

8.1.3水解

將還原后的樣品溶液轉(zhuǎn)至安瓿瓶中，加入8mL鹽酸溶液（見(jiàn)5.2.2），氮?dú)獗Ｗo(hù)下密封，于110℃烘

箱中水解24h。

8.1.4凈化

冷卻后取出水解液，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液（見(jiàn)5.2.3）將pH調(diào)至中性；依次用5mL甲醇（見(jiàn)5.1.9）

和水依次通過(guò)固相萃取柱，量取5mL水解液，以1.0mL/min的流速通過(guò)固相萃取柱（見(jiàn)5.5.1），再用5

mL水去除雜質(zhì)，擠干小柱后用5mL甲醇-0.1%甲酸水溶液（見(jiàn)5.2.10）洗脫，收集洗脫液至刻度離心管

中，氮吹至干后用1mL0.1mol/L鹽酸溶液（見(jiàn)5.2.2）復(fù)溶，待衍生。

8.1.5衍生化

量取200μL上述溶液，加入500μL硼酸鈉緩沖液（見(jiàn)5.2.5），混勻，再加入20μL衍生化試劑（見(jiàn)

5.2.7），渦旋2min，取上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜（5.5.2）過(guò)濾后，待測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

量取羧甲基賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（1.0mg/L）和標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1000mg/L），用鹽酸溶液（見(jiàn)5.2.2）

稀釋，配成濃度為0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L、10mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)

工作溶液，各取200μL上述系列溶液，其余步驟同“8.1.5”。

儀器參考條件

8.3.1色譜柱：C18柱，4.6mm×250mm,粒徑5.0μm；或性能相當(dāng)者。

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8.3.2流動(dòng)相：A，0.01mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（見(jiàn)5.2.4）；B，水-乙腈-甲醇溶液（見(jiàn)5.2.9），

梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

8.3.3流速：1.0mL/min。

8.3.4柱溫：30℃。

8.3.5熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)340nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm。

8.3.6進(jìn)樣體積：10μL。

表1梯度洗脫參考條件

時(shí)間/minA/%B/%

0982

1.90982

18.106040

18.600100

25.300100

26.00982

30.00982

定量測(cè)定

在上述色譜工作條件下，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液與試樣的衍生物交替進(jìn)樣，采用標(biāo)準(zhǔn)工作溶液?jiǎn)吸c(diǎn)或多點(diǎn)校

正，外標(biāo)法定量。試樣溶液中待測(cè)物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器測(cè)定的線性范圍內(nèi)，當(dāng)試樣的上機(jī)液濃度超過(guò)

線性范圍時(shí)，需根據(jù)測(cè)定濃度，稀釋后進(jìn)行重新測(cè)定。典型的羧甲基賴氨酸衍生物的高效液相色譜圖參

見(jiàn)附錄B。

數(shù)據(jù)處理

試樣中羧甲基賴氨酸的含量ω，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，單位為毫克每千克（mg/kg），按公式（1）計(jì)算。

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