EV71疫苗質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)技術(shù)要點(diǎn)

2022年11月16H發(fā)布

引言

手足口病(Hand-fcot-mouthdisease,HFMD；是嬰幼兒人群常見(jiàn)的急性傳染

病，主要表現(xiàn)為發(fā)熱和手、足和口等部位的皮疹或者皰疹，可并發(fā)無(wú)菌性腦膜炎、

腦炎及急性弛緩性麻痹等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，甚至死亡。多種腸道病毒感染可引

起HFMD,腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A組16型(CA16)為引起世

界范圍內(nèi)HFMD爆發(fā)的主要病原體(1)。HFMD中約90%的死亡病例由EV71

感染引起(2),EV71引起的HFMD已成為我國(guó)的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。20

15年，我國(guó)自主研發(fā)的EV71滅活疫苗獲批上市(3)。研究制定EV71疫苗質(zhì)

量控制和評(píng)價(jià)技術(shù)技術(shù)要點(diǎn)，對(duì)規(guī)范并提高我國(guó)EV71疫苗的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)和生產(chǎn)一

致性，保證上市疫苗安全、有效和質(zhì)量可控具有重要意義。

本技術(shù)要點(diǎn)中EV71疫苗是指采用傳代細(xì)胞生產(chǎn)的全病毒滅活疫苗，或者采

用重組DNA技術(shù)將具有免疫保護(hù)性的抗原基因克隆到表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化相應(yīng)

的宿主中表達(dá)的EV71抗原蛋白，經(jīng)過(guò)純化等工藝制備的EV71疫苗。

本技術(shù)要點(diǎn)中凡涉及生物制品質(zhì)量控制的通用要求，均應(yīng)按現(xiàn)行版《中華人

民共和國(guó)藥典》三部有關(guān)規(guī)定執(zhí)行(4)；有關(guān)生產(chǎn)設(shè)施的要求應(yīng)參照國(guó)家食品

藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)2022版《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》執(zhí)行(5)。

本技術(shù)要點(diǎn)僅為對(duì)EV71疫苗進(jìn)行質(zhì)控和評(píng)價(jià)技術(shù)要求的指導(dǎo)性文件，需根

據(jù)技術(shù)的發(fā)展和實(shí)際需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)母隆?/p>

普通考慮

EV71屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬，為無(wú)包膜病毒。EV71顆粒為20面

體的對(duì)稱結(jié)構(gòu)，直徑約24-30納米，由60個(gè)亞單位組成。病毒基因組為單股正

鏈RNA,7400核昔酸擺布，包含有5，-UTR區(qū)和3~PolyA尾。EV71的衣殼蛋

白主要由VP1、VP2、VP3和VP4組成，其中，VP1、VP2和VP3位于病毒衣

殼外部，VP4位于病毒衣殼內(nèi)部。VP1是EV71主要的抗原表位。EV71惟獨(dú)一

個(gè)血清型，依據(jù)VP1區(qū)序列可分為A、B和C3個(gè)基因型以及11個(gè)基因亞型。

我國(guó)臺(tái)灣、香港以及其他國(guó)家或者地區(qū)近年來(lái)流行的主要基因型包括B4、B5、C2、

C4和C5等亞型(6),我國(guó)大陸流行的EV71主要為C4亞型。5歲以下兒童和

嬰幼兒為EV71易感人群(7)。在后脊髓灰質(zhì)炎時(shí)代，EV71已成為對(duì)人類健康

危害最大的腸道病毒(8)。

多個(gè)國(guó)家或者地區(qū)的企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)開(kāi)展了EV71疫苗的研發(fā)，疫苗種類包

括全病毒滅活疫苗、基因工程重組蛋白疫苗、減毒活疫苗和多肽疫苗等(9)。

其中，我國(guó)3家企業(yè)研發(fā)的EV71全病毒滅活疫苗對(duì)EV71感染所致HFMD的

保護(hù)效果分別為97.4%,94.7%和90.0%(10-12)02022年12月，CFDA批

準(zhǔn)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所和北京科興生物制品有限公司生產(chǎn)的

EV71全病毒滅活疫苗上市(3),為我國(guó)及世界范圍控制EV71感染相關(guān)的疾

病，特殊是嚴(yán)重HFMD的爆發(fā)和流行提供了手段。

近年來(lái)HFMD流行病原譜發(fā)生改變，柯薩奇病毒A組6型、A組10型病毒

感染引起HFMD的流行呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，提出了研發(fā)防控HMFD多價(jià)疫苗的需求(1

3,14)0基因工程重組蛋白疫苗中的病毒樣顆粒(VLP)疫苗具有易工業(yè)化規(guī)模

生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)，且在動(dòng)物試驗(yàn)上顯示良好的保護(hù)效果，顯示了研發(fā)EV71VLp疫

苗的可行性(15,16)。

本技術(shù)要點(diǎn)重點(diǎn)關(guān)注EV71疫苗生產(chǎn)的質(zhì)控和評(píng)價(jià)，強(qiáng)調(diào)生產(chǎn)過(guò)程的一致性，

同時(shí)對(duì)研發(fā)階段的疫苗也提出相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和要求，以保證研發(fā)和生產(chǎn)階段中疫苗質(zhì)

控和評(píng)價(jià)方法及標(biāo)準(zhǔn)的銜接。

1.臨床前質(zhì)控和評(píng)價(jià)

應(yīng)依據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）相關(guān)文件以及CFDA《預(yù)防用疫苗臨床前研究

技術(shù)技術(shù)要點(diǎn)》等技術(shù)文件進(jìn)行EV71疫苗臨床前質(zhì)控和評(píng)價(jià)研究（17-19）。

新研發(fā)疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)整體上應(yīng)達(dá)到或者高于上市疫苗的標(biāo)準(zhǔn)，動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)中

疫苗免疫誘導(dǎo)的中和抗體水平和保護(hù)效果應(yīng)與上市疫苗具有可比性。

1.1滅活疫苗毒株和細(xì)胞基質(zhì)

疫苗生產(chǎn)用毒株的篩選和確定是滅活疫苗研發(fā)成功的關(guān)鍵。應(yīng)選擇主要流行

基因型的毒株（目前我國(guó)為C4型）作為疫苗候選株進(jìn)行篩選，重點(diǎn)關(guān)注不同毒

株的交叉保護(hù)能力和遺傳穩(wěn)定性。采用目前世界范圍流行的毒株（B4、B5、C2、

C4和C5等）及國(guó)內(nèi)不同地區(qū)的流行毒株，和/或者構(gòu)建不同基因亞型的假病毒

進(jìn)行保護(hù)能力比較，選擇中和能力強(qiáng)口中和范圍廣的2~3個(gè)毒株作為EV71候

選疫苗株。挑選主要免疫原性區(qū)域（VP1）核甘酸序列一致的毒株進(jìn)行克隆純

化，并規(guī)定代次，建立主種子批和工作種子批。進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、發(fā)酵、收獲、

純化及滅活工藝等適應(yīng)性研究，選擇工藝適應(yīng)性和免疫原性較好的候選疫苗株

作為疫苗生產(chǎn)株。檢定項(xiàng)目應(yīng)包括鑒別試驗(yàn)、病毒滴定、免疫原性、無(wú)菌檢查、

外源因子和遺傳穩(wěn)定性等項(xiàng)，各級(jí)種子批VP1區(qū)核甘酸序列不應(yīng)發(fā)生改變，同

時(shí)具有相近的病毒滴度和免疫原性。應(yīng)依據(jù)現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》中的要求，建

立符合規(guī)定的細(xì)胞庫(kù)用于生產(chǎn)。

1.2基因工程重組蛋白疫苗菌毒株和細(xì)胞庫(kù)

量（LD50）的基礎(chǔ)上，研究獲得疫苗動(dòng)物保護(hù)的半數(shù)有效劑量（ED50）?？蛇x

用上市疫苗作為對(duì)照，也可比對(duì)報(bào)導(dǎo)的疫苗乳鼠保護(hù)ED50,綜合評(píng)定疫苗架護(hù)

效果（21）。在進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)應(yīng)考慮方法的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，如標(biāo)準(zhǔn)毒株、標(biāo)準(zhǔn)物

質(zhì)以及標(biāo)準(zhǔn)化的動(dòng)物模型等。

1.4疫苗質(zhì)量特性研究和規(guī)程制定

應(yīng)依據(jù)現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》三部中人用疫苗總論、基因重組產(chǎn)品總論以及相

關(guān)技術(shù)要點(diǎn)等要求，結(jié)合自身生產(chǎn)工藝特點(diǎn)等，進(jìn)行EV71疫苗質(zhì)量特性研究。

內(nèi)容應(yīng)包括理化結(jié)構(gòu)確證、雜質(zhì)及純度分析、生物活性研究等。在進(jìn)行全面質(zhì)量

特性研究的基礎(chǔ)上建立疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

EV71的中和表位主要包括3個(gè)區(qū)域，位于病毒的5次對(duì)稱軸附近：VP1的

G-H環(huán)、H-I環(huán)和VP2的E-F環(huán)等（22）。對(duì)滅活疫苗，需重點(diǎn)關(guān)注與已上市疫

苗結(jié)構(gòu)和活性的一致性，包括疫苗中實(shí)心（F）和空心（E）顆粒的比例、比活、

誘導(dǎo)中和抗體能力以及動(dòng)物保護(hù)效果等指標(biāo)；對(duì)于基因重組VLP疫苗，應(yīng)對(duì)V

LP蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒別和分析，包拈SDS或者N-末端測(cè)序等方法進(jìn)行

VLP份子量和構(gòu)成測(cè)定，采用特異的多抗或者單克隆抗體鑒別VP1等抗原基因

表達(dá)的

目標(biāo)蛋白，氨基酸序列分析、肽圖等方法鑒別VLP的一級(jí)結(jié)構(gòu)；采用原子力和

透射電子顯微鏡，以及動(dòng)態(tài)光散射等方法測(cè)定EV71VLp的會(huì)萃性；應(yīng)用結(jié)構(gòu)

生物學(xué)或者免疫學(xué)手段分析VLP保護(hù)性結(jié)構(gòu)位點(diǎn)，研究不同條件下抗原結(jié)構(gòu)改

變引起免疫原性的降低等。應(yīng)分析VLP疫苗與滅活疫苗中E顆粒結(jié)構(gòu)以及免

疫原性的相似性，探討保護(hù)位點(diǎn)與滅活疫苗抗原的差異，比對(duì)相同蛋白含量或

者相同活性單位時(shí)免疫原性包括交叉保護(hù)能力的差異。

火活疫苗標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)不低于已上市疫苗，如主種子批和，作種子批VP1區(qū)核甘酸

序列應(yīng)與原始種子一致，EV71抗原顆粒特異性峰按面積歸一化法計(jì)算純度(高

效液相色譜法，HPLC)應(yīng)在95.0%以上，Vero細(xì)胞宿主蛋白和殘存DNA每劑

不超過(guò)設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)等。EV71疫苗原液的F、E顆粒與疫苗免疫原性有關(guān)，F(xiàn)顆

粒具有更好的免疫原性(23),研發(fā)滅活疫苗時(shí)建議考慮建立相應(yīng)的檢測(cè)方法，

制定F及E顆粒比例的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。在工藝相關(guān)雜質(zhì)控制方面，當(dāng)應(yīng)用DNA醐去

除殘留宿主細(xì)胞DNA時(shí)，除應(yīng)關(guān)注殘留DNA酶的質(zhì)控外，應(yīng)考慮小片段DNA

的生物學(xué)效應(yīng)及對(duì)免疫的影響，必要時(shí)應(yīng)研究相應(yīng)的檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)(24)。

應(yīng)考慮建立VLP疫苗菌株或者細(xì)胞表達(dá)目的蛋白的鑒別、表達(dá)量和遺傳穩(wěn)定

性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)構(gòu)鑒別是VLP疫苗質(zhì)控的重點(diǎn)，需在系統(tǒng)鑒別VLP抗原的基礎(chǔ)

上，選擇確定科學(xué)、可行的結(jié)構(gòu)鑒別方法和標(biāo)準(zhǔn)，如定期N-末端測(cè)序方法等。

建立并驗(yàn)證檢測(cè)殘留菌株細(xì)胞蛋白、核酸成份、添加的有機(jī)溶劑、疫苗純度以

及效力等指標(biāo)的方法，并初步制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)探討國(guó)家EV71疫苗抗原含

量和效力測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品是否適宜于所研發(fā)的制品，必要時(shí)應(yīng)建立相應(yīng)的參考品或者

對(duì)照品。此外，應(yīng)參考已上市的重組類疫苗及重組類治療用生物制品的相關(guān)要

求進(jìn)行質(zhì)量控制。

疫苗研發(fā)時(shí)應(yīng)關(guān)注過(guò)程控制，在完成工藝優(yōu)化和驗(yàn)證后，可將EV71疫苗抗

原含量或者比活作為一致性監(jiān)測(cè)的主要指標(biāo)，采集不同批次檢測(cè)數(shù)據(jù)，擬定疫苗

生產(chǎn)中關(guān)鍵質(zhì)控點(diǎn)的抗原含量或者比活的一致性可接受范圍。

1.5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究和應(yīng)用

疫苗質(zhì)量評(píng)價(jià)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)密不可分，惟獨(dú)采用統(tǒng)一的標(biāo)示方式，不同國(guó)家或

者地區(qū)的疫苗管理、珊發(fā)、生產(chǎn)及使用者在比較疫苗的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)，如活性

或者效力時(shí)才干具有可比性。因此，在疫苗研發(fā)階段即應(yīng)重視建立及應(yīng)用疫苗標(biāo)

準(zhǔn)物質(zhì),

以保證質(zhì)量的一致性和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。用于評(píng)價(jià)與臨床免疫保護(hù)效果相關(guān)的

疫苗關(guān)鍵質(zhì)量屬性，如活性或者效力測(cè)定時(shí)所用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，原則上應(yīng)來(lái)自可溯源

至臨床試驗(yàn)時(shí)具有切當(dāng)保護(hù)效果的原料批次。企業(yè)應(yīng)采用已建立國(guó)家的EV71

疫苗抗原標(biāo)準(zhǔn)品、中和抗體標(biāo)準(zhǔn)品、效力標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行疫苗的質(zhì)控和評(píng)價(jià)。在完

成工藝優(yōu)化后，可考慮制備一批EV71疫苗抗原作為疫苗工作對(duì)照品，用于對(duì)

其后研制批次疫苗的質(zhì)量比對(duì)。對(duì)企業(yè)自建的檢測(cè)方法，應(yīng)考慮建立相應(yīng)的工

作參考品或者對(duì)照品。

2.疫苗生產(chǎn)質(zhì)控和評(píng)價(jià)

2.1疫苗生產(chǎn)中質(zhì)控考慮要點(diǎn)

目前上市的EV71疫苗為純化、滅活的EV71全病毒抗原，經(jīng)氫氧化鋁佐劑

吸附制備而成的疫苗。批準(zhǔn)生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)分別為人二倍體細(xì)胞及Ver。細(xì)胞。

疫苗生產(chǎn)實(shí)施全過(guò)程質(zhì)量控制，要求對(duì)EV71疫苜生產(chǎn)過(guò)程的每一工藝環(huán)節(jié)，以

及使用的每一種原輔材料進(jìn)行質(zhì)控，并對(duì)關(guān)鍵步驟及其工藝參數(shù)建立控制范圍，

建立關(guān)鍵中間產(chǎn)物質(zhì)控指標(biāo)。依據(jù)WHO和我國(guó)對(duì)疫苗批簽發(fā)的相關(guān)要求，對(duì)E

V71疫苗活性成份和雜質(zhì)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性定量檢測(cè)數(shù)據(jù)，以及疫苗質(zhì)控和檢測(cè)所

使用的標(biāo)準(zhǔn)品、工作參考品及對(duì)照品均進(jìn)行趨勢(shì)分析，以最大程度保證生產(chǎn)疫苗

的批間一致性。在EV71疫苗成品效力檢定方面，設(shè)定了體內(nèi)效力和體外相對(duì)效

力雙質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，為將來(lái)用體外相對(duì)效力替代體內(nèi)效力提供基礎(chǔ)。

2.2疫苗標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

目前已建立的國(guó)家疫苗標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包括：EV71血清中和抗體國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品、EV

71疫苗抗原國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品和EV71疫苗效力測(cè)定國(guó)家參考品。第一代EV71血清中

和抗體國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（2022國(guó)生標(biāo)字0024）,為健康人血清經(jīng)凍干分裝制備而成,

包括強(qiáng)陽(yáng)性(1000U)、弱陽(yáng)性和陰性質(zhì)控品組成，用于疫苗誘導(dǎo)中和抗體測(cè)定

的質(zhì)控。EV71疫苗抗原國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(2022國(guó)生標(biāo)字0023),為應(yīng)用Vero細(xì)胞

基質(zhì)制備的EV71全病毒抗原(1600U/ml),用于疫苗抗原活性測(cè)定的質(zhì)控(2

5)oEV71疫苗效力測(cè)定國(guó)家參考品(2022國(guó)生參字0074),為應(yīng)用Vero細(xì)胞

基質(zhì)制備的EV71全病毒滅活疫苗，經(jīng)III期疫苗臨床試驗(yàn)獲得臨床保護(hù)效果的

數(shù)據(jù)，同時(shí)具有較好的穩(wěn)定性，用于疫苗成品效力檢定的質(zhì)控(26)。

2022年，WHO生物制品標(biāo)準(zhǔn)化專家委員會(huì)批準(zhǔn)第一代EV71血清中和抗體

國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品(1stISforanti-EV71serum(Human),批號(hào)：14/140),該標(biāo)準(zhǔn)品

為健康人血清經(jīng)凍干分裝制備而成，每支含1000IU,用于EV71疫苗誘導(dǎo)中和

抗體測(cè)定的質(zhì)控；以及低效價(jià)EV71國(guó)際參考品(批號(hào)：13/238),300IU/支，

作為實(shí)驗(yàn)質(zhì)控品(27)c目前EV71疫苗抗原國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品正在研制中。建議疫苗

生產(chǎn)企業(yè)依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品建立用于產(chǎn)品放行質(zhì)控的參考品或者對(duì)照品，應(yīng)注意標(biāo)

準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)定的可溯源性。

2.3生產(chǎn)用原材料

EV71疫苗生產(chǎn)中應(yīng)用的種子批、細(xì)胞基質(zhì)，培養(yǎng)基/培養(yǎng)液等原材料的質(zhì)控

標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》的相關(guān)要求。應(yīng)使用批準(zhǔn)的工作種子批代次生產(chǎn)

疫苗。主種子批和工作種子批應(yīng)測(cè)定病毒滴度，疫苗株的主要保護(hù)蛋白VP1區(qū)

核甘酸序列在不同種子批之間應(yīng)不發(fā)生改變，以保證遺傳穩(wěn)定性，免疫原性檢測(cè)

標(biāo)準(zhǔn)為應(yīng)用1針程序免疫小鼠，中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率應(yīng)大于80%o應(yīng)進(jìn)行無(wú)菌榜查、

支原體檢查和外源因子檢查，保證無(wú)細(xì)菌、真菌、支原體及外源因子污染。

惟獨(dú)經(jīng)批準(zhǔn)的細(xì)胞基質(zhì)才干用于EV71疫苗生產(chǎn)，疫苗生產(chǎn)中應(yīng)用的細(xì)胞基

質(zhì)包括已批準(zhǔn)的二倍體和Ver。細(xì)胞。WHO建議疫苗生產(chǎn)企業(yè)盡可能采用150

代作為Vero細(xì)胞的限定代次(28)。主細(xì)胞庫(kù)至少需進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄病毒實(shí)驗(yàn)、牛

源或者豬源病毒檢查、致瘤性試驗(yàn)、無(wú)菌檢查、支原體檢查和外源因子檢查等，

同時(shí)應(yīng)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)用牛血清的來(lái)源進(jìn)行限定。

2.4病毒接種、培養(yǎng)和收獲

取EV71疫苗工作種子批毒種，按規(guī)定的MOI接種細(xì)胞基質(zhì)，依據(jù)批準(zhǔn)的溫

度、時(shí)間培養(yǎng)病毒并收獲。單個(gè)收獲物的儲(chǔ)存應(yīng)在批準(zhǔn)的條件和時(shí)限內(nèi)。同一細(xì)

胞批生產(chǎn)的病毒液合并為病毒收獲液。病毒收獲液應(yīng)按照連續(xù)生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)入后續(xù)

的純化處理工藝。樣品收獲后應(yīng)立刻進(jìn)行抽樣檢定。

2.5收獲物檢定

收獲物的關(guān)鍵檢定項(xiàng)目包含病毒滴定、抗原含量和蛋白含量測(cè)定，以及無(wú)菌

檢查和支原體檢查等項(xiàng)，應(yīng)分別符合批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)。生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)提供收獲次數(shù)中單

個(gè)生產(chǎn)收獲物，以及合并收獲物的各自一致性檢測(cè)數(shù)據(jù)，并應(yīng)符合已批準(zhǔn)的體現(xiàn)

質(zhì)量一致性的標(biāo)準(zhǔn)。

2.6純化工藝

應(yīng)采用批準(zhǔn)的工藝進(jìn)行EV71疫苗抗原的純化，如色譜柱層析等。純化的病

毒液可進(jìn)行合并和適當(dāng)濃縮。純化病毒液經(jīng)濾膜過(guò)濾即為疫苗原液。當(dāng)EV71疫

苗原液因等待檢測(cè)結(jié)果需暫存時(shí)，應(yīng)依據(jù)前期穩(wěn)定性研究的結(jié)果，按批準(zhǔn)的保存

方式和時(shí)間保存。

2.7病毒滅活及驗(yàn)證

應(yīng)采用批準(zhǔn)的經(jīng)驗(yàn)證的滅活劑和工藝進(jìn)行EV71病毒的滅活，在限定總蛋白

含量下，采用一定濃度的滅活劑，在確定的最佳溫度下滅活足夠時(shí)間，保證EV

71病毒得到充分滅活。對(duì)每一個(gè)病毒滅活容器均取樣進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)，

按

規(guī)定量，將EV71滅活液接種適宜細(xì)胞基質(zhì)，35~37℃培養(yǎng)5、7天，凍融后同

法再盲傳2代，顯微鏡觀察每代次應(yīng)均無(wú)CPE。

2.8原液檢定

應(yīng)采用批準(zhǔn)的EV71鑒別實(shí)驗(yàn)、抗原含量等檢測(cè)方法對(duì)原液和中間產(chǎn)物進(jìn)行

質(zhì)控。抗原含量的檢測(cè)多采用ELISA方法，需應(yīng)用國(guó)家抗原標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)控和

含量賦值（U）,也可自建對(duì)照品以監(jiān)測(cè)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于EV71疫苗為

鋁佐劑吸附疫苗，在成品中受佐劑以及蛋白稀釋等因素影響的檢定項(xiàng)目需在原液

階段進(jìn)行。疫苗相關(guān)工藝雜質(zhì)如牛血清白蛋白殘留量、Ver。細(xì)胞蛋白殘留量和

DNA殘留量，殘留添加物如有機(jī)溶劑聚乙二醇6000、聚山梨酯80或者Triton-

Xi00^,以及非限制性核酸內(nèi)切酶限度檢定均應(yīng)符合批準(zhǔn)的限度。疫苗抗原純

度檢測(cè)時(shí)原液中目標(biāo)蛋白的純度應(yīng)不低于95.0%。應(yīng)采用適宜的方法測(cè)定原液

中可能潛在雜質(zhì)蛋白的含量或者比例，如SDS或者HPLC方法等。應(yīng)關(guān)

注抗原降解產(chǎn)物的鑒別和檢測(cè)，考慮制定可接受的范圍。病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)，

將細(xì)胞盲傳3代，應(yīng)不得浮現(xiàn)細(xì)胞病變。應(yīng)證明無(wú)細(xì)菌、真菌、分枝桿菌和支

原體污染。

2.9半成品配制和檢定

依據(jù)每批疫苗按抗原定量配制的要求，基于原液中EV71抗原的測(cè)定含量，

以及成品疫苗的目標(biāo)劑量，加入稀釋液及氫氧化鋁吸附劑，配制成目標(biāo)劑量的半

成品。由于EV71疫苗為鋁佐劑吸附產(chǎn)品，半成品檢定時(shí)除檢測(cè)無(wú)菌、pH和氫

氧化鋁外，應(yīng)測(cè)定EV71抗原吸附率。

2.10成品分裝和檢定

依據(jù)企業(yè)注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)和現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》進(jìn)行分裝、包裝和檢定。自建的方

法需經(jīng)批準(zhǔn)，應(yīng)用藥典的方法需經(jīng)過(guò)驗(yàn)證。疫苗成品質(zhì)控項(xiàng)目包括EV71疫苗鑒

別實(shí)驗(yàn)、外觀、裝量、無(wú)菌檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查和異常毒性等指標(biāo)；理化項(xiàng)目

包括pH,氫氧化鋁含量，游離甲醛含量以及滲透壓摩爾濃度等指標(biāo)。細(xì)胞培養(yǎng)

液中添加抗生素時(shí)，需檢測(cè)成品中抗生素殘留量。疫苗的效力測(cè)定包括體內(nèi)效力

(ED50)以及體外相對(duì)效力，并測(cè)定中和抗體應(yīng)答。疫苗抗原含量和中和抗體

水平測(cè)定時(shí)需應(yīng)用國(guó)家抗原和中和抗體標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)控和賦值?？乖炕蛘咝?/p>

力測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)的確定應(yīng)綜合考慮檢測(cè)方法的誤差，半成品配制操作過(guò)程中可能存

在的偏差，以及成品在有效期內(nèi)可接受的抗原降解。

2.11穩(wěn)定性評(píng)價(jià)、儲(chǔ)存和有效期

EV71疫苗為鋁佐劑吸附疫苗，具有較好的穩(wěn)定性。疫苗穩(wěn)定性評(píng)價(jià)應(yīng)依據(jù)

WHO相關(guān)文件和現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》中人用疫苗總論等要求進(jìn)行(4,29)。穩(wěn)

定性評(píng)價(jià)的類型包括實(shí)時(shí)條件下、加速穩(wěn)定性、極端條件下及熱穩(wěn)定性研究，其

中實(shí)時(shí)條件下穩(wěn)定性研究為最基本的研究，疫苗獲批后生產(chǎn)階段普通選擇在實(shí)時(shí)

條件下的穩(wěn)定性研究。按照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》(2022年修訂)中持續(xù)

穩(wěn)定性考察要求進(jìn)行。通常情況下至少每年應(yīng)當(dāng)考察一個(gè)批次。中間產(chǎn)物穩(wěn)定性

評(píng)價(jià)目的為確定中間產(chǎn)物儲(chǔ)存的條件和時(shí)間。成品穩(wěn)定性評(píng)價(jià)則是確定疫苗的保

持條件和有效期，并保證有效期內(nèi)疫苗的有效性和安全性。EV71疫苗中間產(chǎn)物

和疫苗成品的儲(chǔ)存條件和時(shí)間應(yīng)依據(jù)批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。EV71疫苗為鋁佐劑吸附

疫苗，嚴(yán)禁凍結(jié)，因鋁佐劑疫苗遭凍結(jié)后將永久性破壞免疫原性。

3.疫苗批簽發(fā)

疫苗批簽發(fā)，是指國(guó)家食品藥品監(jiān)管部門對(duì)預(yù)防性疫苗在每批制品出廠上市

前或者進(jìn)口時(shí)，由指定的藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行審核、檢驗(yàn)及簽發(fā)的制度(30)。我

國(guó)疫苗批簽發(fā)主要采用資料審核和樣品檢驗(yàn)相結(jié)合的形式。在批簽發(fā)過(guò)程中，應(yīng)

特殊重視對(duì)關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)的趨勢(shì)分析。應(yīng)用趨勢(shì)分析可發(fā)現(xiàn)某些批次疫苗浮現(xiàn)偏

差，啟動(dòng)調(diào)查并采取措施；考察生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)生的變更對(duì)制品的影響（如工作種

子批、設(shè)備）以及在一定生產(chǎn)周期內(nèi)疫苗質(zhì)量的變化趨勢(shì)。因此疫苗批簽發(fā)是確

定疫苗生產(chǎn)一致性，保證上市疫苗有效性、安全性的必要手段。

3.1EV71疫苗批創(chuàng)造及檢定記錄摘要應(yīng)包括的主要內(nèi)容及關(guān)鍵參數(shù)

企業(yè)應(yīng)向批簽發(fā)藥檢機(jī)構(gòu)提供每批EV71疫苗的批創(chuàng)造及檢定記錄摘要，批

創(chuàng)造及檢定記錄摘要應(yīng)涵蓋生產(chǎn)、檢定過(guò)程中各環(huán)節(jié)的主要參數(shù)、經(jīng)批準(zhǔn)的企業(yè)

名稱、地址，及所生產(chǎn)疫苗的品種、批量和批號(hào)等，所提供的信息應(yīng)確定、并可

追溯。注明成品中起始材料、中間產(chǎn)物及半成品各個(gè)組分的失效日期；以生產(chǎn)流

程圖的方式，確認(rèn)疫苗起始材料、中間產(chǎn)物、半成品和成品的惟一、合理的生產(chǎn)

流程，生產(chǎn)流程應(yīng)能追溯主要組分生產(chǎn)全過(guò)程；疫苗生產(chǎn)用毒株、二倍體細(xì)胞或

者Vero細(xì)胞基質(zhì)的名稱和代次應(yīng)與批準(zhǔn)的一致；證實(shí)疫苗生產(chǎn)工藝及規(guī)模、質(zhì)

控檢測(cè)方法、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，中間產(chǎn)物的批號(hào)、批量、保存條件等數(shù)據(jù)與批準(zhǔn)的相

同。關(guān)鍵工藝步驟操作參數(shù)、關(guān)鍵中間產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果、目的產(chǎn)物收率應(yīng)在可按

受范圍內(nèi)；依據(jù)所提供的相關(guān)信息確認(rèn)疫苗中活性組分含量等的理論值和實(shí)際值;

提供疫苗起始材料、中間產(chǎn)物、半成品和成品的檢測(cè)結(jié)果和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，包括每

項(xiàng)檢定的結(jié)果；應(yīng)提供檢測(cè)的起始日期、方法、關(guān)鍵試劑，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、工作參

號(hào)品和對(duì)照品的列表以及相關(guān)的制備、標(biāo)定和穩(wěn)定性等關(guān)鍵信息。

3.2EV71疫苗批簽發(fā)趨勢(shì)分析的技術(shù)要求

對(duì)EV71疫苗關(guān)鍵中間產(chǎn)物及成品活性成份和雜質(zhì)的定量檢測(cè)數(shù)據(jù)，均應(yīng)進(jìn)

行趨勢(shì)分析，如收獲液病毒滴度，原液抗原含量、蛋白含量、純度，成品體外相

對(duì)效力、體內(nèi)效力、理化指標(biāo)以及可定量檢測(cè)的雜質(zhì)等項(xiàng)目；對(duì)于疫苗質(zhì)控和檢

測(cè)中所使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、工作參考品及對(duì)照品也應(yīng)進(jìn)行趨勢(shì)分析。

生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)對(duì)EV71疫苗檢驗(yàn)的所有關(guān)鍵性定量數(shù)據(jù)繪制趨勢(shì)分析圖。當(dāng)疫

苗檢測(cè)批次結(jié)果的數(shù)量少于40個(gè)，應(yīng)在至少6個(gè)連續(xù)批檢驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上計(jì)算

平均值和SD值，每一個(gè)新的結(jié)果可添加并重新計(jì)算平均值和SD值。當(dāng)批次結(jié)

果數(shù)量等于或者多于40個(gè)時(shí)，應(yīng)根據(jù)至少10批不同原液得到最初的40個(gè)結(jié)

果確定平均值和SD值。在其后持續(xù)進(jìn)行趨勢(shì)分析中再也不隨新增檢驗(yàn)結(jié)果重

新計(jì)算平均值，避免因引入新的檢測(cè)數(shù)據(jù)而發(fā)生偏移。

生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)確定疫苗質(zhì)控關(guān)鍵項(xiàng)目趨勢(shì)分析的警戒限和行動(dòng)限。當(dāng)浮現(xiàn)1批

疫苗檢驗(yàn)結(jié)果超出行動(dòng)限，3個(gè)連續(xù)批疫苗超出警戒限，或者趨勢(shì)有嚴(yán)重漂移，

以及連續(xù)3至5批疫苗在均值一側(cè)且接近警戒限時(shí)，應(yīng)啟動(dòng)調(diào)查，查找分析原

因，評(píng)估對(duì)疫苗質(zhì)量的影響風(fēng)險(xiǎn)，確定相關(guān)批次疫苗是否予以放行，批簽發(fā)機(jī)

構(gòu)依據(jù)同樣的原則決定是否予以簽發(fā)。

應(yīng)開(kāi)展標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和對(duì)照品的趨勢(shì)分析，目的是為監(jiān)測(cè)EV71疫苗標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的

活性，以進(jìn)行檢定實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)控。包括對(duì)應(yīng)用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測(cè)定值，以及對(duì)企

業(yè)用于疫苗質(zhì)控和檢測(cè)所自建工作參考品、對(duì)照品測(cè)定值的趨勢(shì)分析等，應(yīng)繪制

趨勢(shì)分析圖，規(guī)定相應(yīng)的警戒限和行動(dòng)限。

應(yīng)定期完成疫苗趨勢(shì)分析和報(bào)告。EV71疫苗生產(chǎn)企業(yè)和批簽發(fā)機(jī)構(gòu)分別每

半年或者一年將各自檢測(cè)關(guān)鍵項(xiàng)目的數(shù)據(jù)與前期數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。需比較批簽發(fā)機(jī)

構(gòu)與生產(chǎn)企業(yè)的數(shù)據(jù)，結(jié)果分析時(shí)應(yīng)考慮兩者檢定時(shí)的時(shí)間差異。

4.起草單位和致謝

起草單位：中國(guó)食品藥品檢定研究院生物制品檢定所肝炎病毒疫苗室

致謝：提出修改意見(jiàn)的各位專家及3家EV71疫苗生產(chǎn)企業(yè)

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