LuxS基因缺失：解鎖變異鏈球菌生物學(xué)性狀與生物被膜結(jié)構(gòu)奧秘一、引言1.1研究背景與意義口腔健康是全身健康的重要組成部分，而口腔疾病如齲齒、牙周炎等嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報(bào)告顯示，全球約有60%-90%的學(xué)齡兒童和大部分成年人都受到齲齒的困擾，在我國(guó)，第三次全國(guó)口腔健康流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，5歲兒童乳牙齲病的患病率為66.0%，12歲兒童恒牙齲病的患病率為28.9%，齲病已成為危害人類健康的主要口腔疾病之一。變異鏈球菌（Streptococcusmutans）作為口腔微生態(tài)系統(tǒng)中的重要成員，是目前公認(rèn)的主要致齲菌。它具有一系列獨(dú)特的致病特性，能夠利用口腔中的碳水化合物產(chǎn)生大量有機(jī)酸，如乳酸、乙酸等，使菌斑局部pH值降低至臨界值以下，導(dǎo)致牙齒硬組織脫礦，進(jìn)而引發(fā)齲齒。同時(shí)，變異鏈球菌還能合成細(xì)胞外多糖，促進(jìn)細(xì)菌在牙面的黏附和聚集，形成穩(wěn)定的生物被膜，增強(qiáng)其在口腔環(huán)境中的生存能力和致病力。細(xì)菌群體感應(yīng)（Quorumsensing，QS）系統(tǒng)是一種細(xì)菌細(xì)胞間的通訊機(jī)制，細(xì)菌通過分泌、釋放特定的信號(hào)分子來感知周圍環(huán)境中自身或其他細(xì)菌的群體密度變化。當(dāng)信號(hào)分子濃度達(dá)到一定閾值時(shí)，細(xì)菌會(huì)啟動(dòng)一系列相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)控群體行為，如生物被膜形成、毒力因子產(chǎn)生、抗生素抗性等。LuxS基因在細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用，它編碼的LuxS蛋白能夠催化合成信號(hào)分子AI-2（Autoinducer-2）。AI-2是一種在多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中廣泛存在的信號(hào)分子，被認(rèn)為是細(xì)菌種間交流的通用信號(hào)，參與調(diào)控細(xì)菌的多種生理功能和致病過程。近年來，越來越多的研究表明，LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)與變異鏈球菌的生物學(xué)性狀和致病機(jī)制密切相關(guān)。通過對(duì)LuxS基因缺失的變異鏈球菌進(jìn)行研究，有助于深入了解LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)在變異鏈球菌中的調(diào)控機(jī)制，以及該系統(tǒng)對(duì)變異鏈球菌生物學(xué)性狀和生物被膜結(jié)構(gòu)的影響。這不僅能夠?yàn)榻沂君x病的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，還可能為齲病的預(yù)防和治療開辟新的途徑。例如，針對(duì)LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)開發(fā)新型的抗菌策略，有望特異性地干擾變異鏈球菌的致病過程，而不影響口腔正常菌群的平衡，從而減少傳統(tǒng)抗生素使用帶來的耐藥性和菌群失調(diào)等問題。因此，研究LuxS基因缺失對(duì)變異鏈球菌生物學(xué)性狀、生物被膜結(jié)構(gòu)的影響具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀變異鏈球菌作為主要致齲菌，一直是口腔微生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞變異鏈球菌的生物學(xué)特性、致病機(jī)制以及與齲病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系等方面開展了大量研究。在生物學(xué)特性方面，已深入了解其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)代謝特點(diǎn)，例如變異鏈球菌能利用多種糖類進(jìn)行代謝產(chǎn)酸，其細(xì)胞表面的特殊結(jié)構(gòu)有助于黏附于牙面。在致病機(jī)制研究中，明確了其產(chǎn)生的胞外多糖、有機(jī)酸等物質(zhì)在齲病發(fā)生中的關(guān)鍵作用。對(duì)于LuxS基因及細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究，近年來也取得了顯著進(jìn)展。國(guó)外研究較早關(guān)注到LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)在多種細(xì)菌中的重要調(diào)控作用，如在銅綠假單胞菌中，群體感應(yīng)系統(tǒng)參與調(diào)控生物被膜形成、毒力因子產(chǎn)生等過程。國(guó)內(nèi)學(xué)者也對(duì)不同細(xì)菌中的LuxS基因進(jìn)行了研究，在遲緩愛德華菌中，發(fā)現(xiàn)luxS基因的表達(dá)水平在不同生長(zhǎng)時(shí)期存在明顯差異，且與菌株的致病性密切相關(guān)。在變異鏈球菌與LuxS基因的關(guān)聯(lián)研究中，已有研究表明LuxS基因參與調(diào)控變異鏈球菌的多種生物學(xué)功能。有研究通過構(gòu)建變異鏈球菌LuxS基因缺陷株，發(fā)現(xiàn)LuxS基因突變可以抑制變形鏈球菌的生長(zhǎng)，影響其代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)。關(guān)于生物被膜的研究，國(guó)內(nèi)外均對(duì)其結(jié)構(gòu)、形成機(jī)制以及在細(xì)菌致病中的作用進(jìn)行了深入探討。研究發(fā)現(xiàn)生物被膜的形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，受到多種因素的調(diào)控，包括細(xì)菌自身的基因表達(dá)、細(xì)胞間相互作用以及外界環(huán)境因素等。在變異鏈球菌生物被膜研究方面，已明確其在齲病發(fā)展中的關(guān)鍵作用，生物被膜中的變異鏈球菌能夠持續(xù)產(chǎn)酸，破壞牙齒硬組織。然而，當(dāng)前研究仍存在一些不足與空白。在LuxS基因缺失對(duì)變異鏈球菌生物學(xué)性狀影響的研究中，雖然已發(fā)現(xiàn)一些變化，但對(duì)于LuxS基因缺失后，變異鏈球菌在不同環(huán)境條件下生物學(xué)性狀的動(dòng)態(tài)變化研究較少。在生物被膜結(jié)構(gòu)方面，LuxS基因缺失如何具體影響生物被膜的微觀結(jié)構(gòu)、細(xì)菌間相互作用以及生物被膜與牙面的黏附機(jī)制等方面，還缺乏深入系統(tǒng)的研究。此外，針對(duì)LuxS基因缺失影響變異鏈球菌生物學(xué)性狀和生物被膜結(jié)構(gòu)的分子機(jī)制研究也有待進(jìn)一步加強(qiáng)。這些不足為本文的研究提供了切入點(diǎn)，有望通過深入研究揭示其中的奧秘，為齲病防治提供新的理論依據(jù)和策略。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究LuxS基因缺失對(duì)變異鏈球菌生物學(xué)性狀和生物被膜結(jié)構(gòu)的影響，明確LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)在變異鏈球菌致病過程中的作用機(jī)制，為齲病的防治提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。具體研究?jī)?nèi)容如下：1.3.1LuxS基因缺失變異鏈球菌菌株的構(gòu)建運(yùn)用基因敲除技術(shù)，構(gòu)建LuxS基因缺失的變異鏈球菌菌株。通過設(shè)計(jì)針對(duì)LuxS基因的特異性引物，利用同源重組原理，將目標(biāo)基因從變異鏈球菌基因組中敲除。對(duì)構(gòu)建成功的突變株進(jìn)行PCR驗(yàn)證、測(cè)序分析等，確保LuxS基因缺失的準(zhǔn)確性，為后續(xù)研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)材料。1.3.2LuxS基因缺失對(duì)變異鏈球菌生物學(xué)性狀的影響將野生型變異鏈球菌和LuxS基因缺失突變株分別接種于適宜的培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)，定時(shí)測(cè)定細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線，分析LuxS基因缺失對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)速率的影響。采用比濁法或活菌計(jì)數(shù)法，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)菌的數(shù)量變化。通過藥敏試驗(yàn)，比較野生型和突變株對(duì)常用抗生素如青霉素、紅霉素等的敏感性差異，探究LuxS基因缺失是否影響變異鏈球菌的耐藥性。利用藥敏紙片擴(kuò)散法，測(cè)量抑菌圈直徑來評(píng)估細(xì)菌的耐藥程度。采用高效液相色譜等技術(shù)，分析野生型和突變株在代謝糖類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)時(shí)產(chǎn)生的有機(jī)酸、氨基酸等代謝產(chǎn)物種類和含量的變化，了解LuxS基因缺失對(duì)變異鏈球菌代謝途徑的影響。1.3.3LuxS基因缺失對(duì)變異鏈球菌生物被膜結(jié)構(gòu)的影響使用結(jié)晶紫染色法對(duì)生物被膜進(jìn)行染色，通過酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，定量分析野生型和LuxS基因缺失突變株生物被膜的形成能力。利用激光共聚焦顯微鏡觀察生物被膜的三維結(jié)構(gòu)，測(cè)量生物被膜的厚度、活菌分布等參數(shù)，分析LuxS基因缺失對(duì)生物被膜微觀結(jié)構(gòu)的影響。通過掃描電子顯微鏡觀察生物被膜表面形態(tài)，了解細(xì)菌在牙面的黏附方式、排列情況以及細(xì)胞外基質(zhì)的分布等，研究LuxS基因缺失對(duì)生物被膜與牙面黏附機(jī)制的影響。1.3.4LuxS基因缺失影響變異鏈球菌生物學(xué)性狀和生物被膜結(jié)構(gòu)的分子機(jī)制研究運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)與變異鏈球菌生長(zhǎng)、代謝、生物被膜形成等相關(guān)基因在野生型和LuxS基因缺失突變株中的表達(dá)水平變化，如與糖代謝相關(guān)的基因、編碼胞外多糖合成酶的基因等，從基因表達(dá)層面揭示LuxS基因缺失影響變異鏈球菌生物學(xué)性狀和生物被膜結(jié)構(gòu)的分子機(jī)制。采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析野生型和突變株蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異，鑒定出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行功能注釋和通路分析，進(jìn)一步深入了解LuxS基因缺失導(dǎo)致的生物學(xué)效應(yīng)的分子基礎(chǔ)。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用多種研究方法，以確保全面深入地探究LuxS基因缺失對(duì)變異鏈球菌生物學(xué)性狀和生物被膜結(jié)構(gòu)的影響。在基因?qū)用妫捎没蚯贸夹g(shù)構(gòu)建LuxS基因缺失變異鏈球菌菌株。通過設(shè)計(jì)針對(duì)LuxS基因上下游同源臂的特異性引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增同源臂片段。將擴(kuò)增得到的同源臂片段與含有抗性基因的自殺質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒。采用電轉(zhuǎn)化等方法將重組自殺質(zhì)粒導(dǎo)入野生型變異鏈球菌中，利用同源重組原理，使自殺質(zhì)粒上的同源臂與變異鏈球菌基因組中的LuxS基因發(fā)生同源重組，從而將LuxS基因敲除，獲得LuxS基因缺失突變株。在微生物培養(yǎng)方面，運(yùn)用液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)技術(shù)。將野生型變異鏈球菌和LuxS基因缺失突變株分別接種于腦心浸液（BHI）液體培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣，采用比濁法或活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。將細(xì)菌接種于BHI固體培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后觀察菌落形態(tài)、大小等特征。利用多種顯微鏡技術(shù)對(duì)生物被膜進(jìn)行觀察。采用結(jié)晶紫染色法對(duì)生物被膜進(jìn)行染色，通過酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處的吸光度，定量分析生物被膜的形成能力。利用激光共聚焦顯微鏡，對(duì)生物被膜進(jìn)行熒光染色，如使用SYTO9和PI熒光染料分別標(biāo)記活菌和死菌，觀察生物被膜的三維結(jié)構(gòu)，測(cè)量生物被膜的厚度、活菌分布等參數(shù)。通過掃描電子顯微鏡，對(duì)生物被膜進(jìn)行固定、脫水、干燥和噴金處理后，觀察生物被膜表面形態(tài)，了解細(xì)菌在牙面的黏附方式、排列情況以及細(xì)胞外基質(zhì)的分布等。在分子生物學(xué)技術(shù)方面，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)水平變化。提取野生型和LuxS基因缺失突變株的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，設(shè)計(jì)針對(duì)與變異鏈球菌生長(zhǎng)、代謝、生物被膜形成等相關(guān)基因的特異性引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，分析基因表達(dá)量的差異。采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，如雙向電泳和質(zhì)譜分析，分離和鑒定野生型和突變株蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異，對(duì)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋和通路分析。本研究的技術(shù)路線如圖1所示：首先構(gòu)建LuxS基因缺失變異鏈球菌菌株，對(duì)構(gòu)建成功的突變株進(jìn)行鑒定。將野生型和突變株分別進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定生長(zhǎng)曲線、分析代謝產(chǎn)物、檢測(cè)耐藥性，研究其生物學(xué)性狀。同時(shí)，對(duì)生物被膜進(jìn)行培養(yǎng)，通過結(jié)晶紫染色定量分析生物被膜形成能力，利用激光共聚焦顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察生物被膜結(jié)構(gòu)。最后，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，從基因和蛋白質(zhì)層面探究LuxS基因缺失影響變異鏈球菌生物學(xué)性狀和生物被膜結(jié)構(gòu)的分子機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線圖，圖中清晰展示從構(gòu)建缺失株開始，經(jīng)過各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)操作，到最終結(jié)果分析的流程，每個(gè)步驟之間用箭頭清晰連接，注明關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)方法和檢測(cè)指標(biāo)]首先構(gòu)建LuxS基因缺失變異鏈球菌菌株，對(duì)構(gòu)建成功的突變株進(jìn)行鑒定。將野生型和突變株分別進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定生長(zhǎng)曲線、分析代謝產(chǎn)物、檢測(cè)耐藥性，研究其生物學(xué)性狀。同時(shí)，對(duì)生物被膜進(jìn)行培養(yǎng)，通過結(jié)晶紫染色定量分析生物被膜形成能力，利用激光共聚焦顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察生物被膜結(jié)構(gòu)。最后，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，從基因和蛋白質(zhì)層面探究LuxS基因缺失影響變異鏈球菌生物學(xué)性狀和生物被膜結(jié)構(gòu)的分子機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線圖，圖中清晰展示從構(gòu)建缺失株開始，經(jīng)過各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)操作，到最終結(jié)果分析的流程，每個(gè)步驟之間用箭頭清晰連接，注明關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)方法和檢測(cè)指標(biāo)][此處插入技術(shù)路線圖，圖中清晰展示從構(gòu)建缺失株開始，經(jīng)過各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)操作，到最終結(jié)果分析的流程，每個(gè)步驟之間用箭頭清晰連接，注明關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)方法和檢測(cè)指標(biāo)]二、變異鏈球菌與LuxS基因概述2.1變異鏈球菌的生物學(xué)特性2.1.1形態(tài)與結(jié)構(gòu)變異鏈球菌屬于革蘭氏陽性菌，其菌體呈現(xiàn)圓形或卵圓形，體積相對(duì)較小。在顯微鏡下觀察，?？梢娖涑呻p或以短鏈狀排列。這種排列方式與其細(xì)胞分裂方式及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特點(diǎn)密切相關(guān)。變異鏈球菌具有典型的革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，主要由肽聚糖組成，肽聚糖層較厚，這賦予了細(xì)菌較強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度，有助于維持細(xì)菌的形態(tài)穩(wěn)定。細(xì)胞壁表面還存在一些特殊的結(jié)構(gòu)成分，如脂磷壁酸（LTA），它通過共價(jià)鍵與肽聚糖相連，延伸至細(xì)胞壁表面。脂磷壁酸在變異鏈球菌的致病過程中發(fā)揮著重要作用，它可以介導(dǎo)細(xì)菌與宿主細(xì)胞的黏附，增強(qiáng)細(xì)菌在口腔環(huán)境中的定植能力。同時(shí)，脂磷壁酸還具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠刺激宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，影響口腔微生態(tài)平衡。變異鏈球菌的細(xì)胞膜是位于細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)的一層脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，它具有選擇透過性，能夠控制物質(zhì)的進(jìn)出，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。細(xì)胞膜上還鑲嵌著多種蛋白質(zhì)，包括轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、呼吸酶等，這些蛋白質(zhì)參與了細(xì)菌的物質(zhì)運(yùn)輸、能量代謝等重要生理過程。2.1.2培養(yǎng)特性變異鏈球菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較為苛刻，在一般培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不良，通常需要在富含多種營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中才能良好生長(zhǎng)。在血瓊脂平板上，將其置于37℃、5%CO?的氣體環(huán)境中培養(yǎng)18-24小時(shí)后，可觀察到形成的菌落較小，直徑約為1mm。菌落呈灰白色，表面凸起，邊緣不齊，質(zhì)地干燥。值得注意的是，其菌落周圍會(huì)出現(xiàn)α溶血環(huán)，這是由于變異鏈球菌在代謝過程中產(chǎn)生的一些物質(zhì)，如過氧化氫等，對(duì)紅細(xì)胞造成了不完全溶血所致。α溶血現(xiàn)象也是鑒別變異鏈球菌的重要特征之一，可用于與其他鏈球菌屬細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分。除了血瓊脂平板，變異鏈球菌在胰蛋白胨培養(yǎng)基中，以及含有95％氮?dú)饧?％二氧化碳混合氣體的環(huán)境下也能較好地生長(zhǎng)。這種特定的氣體環(huán)境和培養(yǎng)基成分，模擬了口腔內(nèi)的微生態(tài)環(huán)境，為變異鏈球菌的生長(zhǎng)提供了適宜的條件。在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)變異鏈球菌時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌數(shù)量會(huì)逐漸增加，培養(yǎng)基會(huì)變得渾濁。通過定期測(cè)定培養(yǎng)液的吸光度，可以繪制出變異鏈球菌的生長(zhǎng)曲線，了解其生長(zhǎng)規(guī)律。一般來說，變異鏈球菌的生長(zhǎng)過程可分為遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰亡期。在遲緩期，細(xì)菌需要適應(yīng)新的環(huán)境，調(diào)整代謝狀態(tài)，細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)緩慢；進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，細(xì)菌代謝活躍，細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)；當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，代謝產(chǎn)物積累，細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)細(xì)胞數(shù)量基本保持穩(wěn)定；最后，隨著環(huán)境條件的惡化，細(xì)菌進(jìn)入衰亡期，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。2.1.3致病性變異鏈球菌是目前公認(rèn)的主要致齲菌，其致病機(jī)制主要包括產(chǎn)酸、形成生物被膜等方面。變異鏈球菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，它能夠利用口腔中的碳水化合物，如蔗糖、葡萄糖等，通過糖酵解途徑進(jìn)行代謝，產(chǎn)生大量有機(jī)酸，主要為乳酸。這些有機(jī)酸會(huì)使菌斑局部pH值急劇下降，當(dāng)pH值降低至臨界值（一般認(rèn)為是5.5左右）以下時(shí)，牙齒硬組織中的羥基磷灰石會(huì)發(fā)生溶解，導(dǎo)致牙齒脫礦。長(zhǎng)期的脫礦過程會(huì)使牙齒表面出現(xiàn)齲洞，進(jìn)而引發(fā)齲齒。有研究表明，變異鏈球菌在含有蔗糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)液中的乳酸含量會(huì)迅速升高，pH值明顯下降，這直接證明了其產(chǎn)酸能力對(duì)牙齒脫礦的影響。變異鏈球菌還能合成細(xì)胞外多糖，促進(jìn)生物被膜的形成。當(dāng)口腔中存在蔗糖時(shí)，變異鏈球菌會(huì)分泌葡糖基轉(zhuǎn)移酶（GTF），將蔗糖分解為葡萄糖和果糖，并利用葡萄糖合成細(xì)胞外多糖，如葡聚糖和果聚糖。這些多糖具有黏性，能夠介導(dǎo)細(xì)菌與牙面的黏附，使細(xì)菌在牙面上聚集形成微菌落。隨著時(shí)間的推移，微菌落不斷發(fā)展壯大，與其他口腔細(xì)菌、唾液蛋白等物質(zhì)相互交織，逐漸形成成熟的生物被膜。生物被膜中的細(xì)菌相互協(xié)作，共同抵御外界環(huán)境的干擾，如唾液的沖刷、宿主免疫系統(tǒng)的攻擊等。同時(shí)，生物被膜還能夠持續(xù)產(chǎn)酸，為變異鏈球菌提供了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的酸性微環(huán)境，進(jìn)一步促進(jìn)了齲齒的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，去除生物被膜后，變異鏈球菌的致齲能力明顯下降，這充分說明了生物被膜在變異鏈球菌致病過程中的重要作用。變異鏈球菌還能產(chǎn)生一些其他的毒力因子，如表面蛋白、脂磷壁酸等，這些物質(zhì)也參與了細(xì)菌的黏附、定植和免疫調(diào)節(jié)等過程，協(xié)同促進(jìn)了齲病的發(fā)生發(fā)展。2.2LuxS基因及其功能2.2.1LuxS基因的結(jié)構(gòu)LuxS基因在多種細(xì)菌中廣泛存在，其核苷酸序列具有一定的保守性，但在不同菌種甚至同一菌種的不同菌株之間也存在一定差異。以變異鏈球菌為例，其LuxS基因的開放閱讀框通常由約450個(gè)核苷酸組成。這些核苷酸序列精確地編碼了一條包含約150個(gè)氨基酸的多肽鏈，經(jīng)過折疊等修飾后形成具有特定功能的LuxS蛋白。通過對(duì)大量變異鏈球菌菌株的LuxS基因進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，其核苷酸序列的保守區(qū)域主要集中在編碼蛋白活性中心的部分，這對(duì)于LuxS蛋白催化合成信號(hào)分子AI-2的功能至關(guān)重要。而在一些非關(guān)鍵區(qū)域，可能會(huì)出現(xiàn)個(gè)別核苷酸的替換、插入或缺失等多態(tài)性變化，這些變化雖然不一定影響LuxS蛋白的核心功能，但可能會(huì)對(duì)其表達(dá)水平或與其他分子的相互作用產(chǎn)生一定影響。對(duì)不同地區(qū)分離得到的變異鏈球菌LuxS基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)某些特定的核苷酸多態(tài)性與菌株的地理分布存在一定關(guān)聯(lián)，這可能反映了細(xì)菌在進(jìn)化過程中對(duì)不同環(huán)境的適應(yīng)性變化。2.2.2LuxS基因在群體感應(yīng)系統(tǒng)中的作用LuxS基因編碼的LuxS蛋白在細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)中扮演著關(guān)鍵角色，它參與了自誘導(dǎo)物AI-2的合成過程。在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，LuxS蛋白以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）為底物，通過一系列酶促反應(yīng)，最終合成AI-2。具體來說，SAM首先在其他相關(guān)酶的作用下轉(zhuǎn)化為S-腺苷高半胱氨酸（SAH），然后LuxS蛋白催化SAH裂解，生成高半胱氨酸和4,5-二羥基-2,3-戊二酮（DPD），DPD可以自發(fā)環(huán)化形成AI-2。AI-2作為一種信號(hào)分子，能夠在細(xì)菌細(xì)胞間擴(kuò)散。當(dāng)細(xì)菌群體密度較低時(shí)，AI-2在細(xì)胞外環(huán)境中的濃度也較低；隨著細(xì)菌不斷生長(zhǎng)繁殖，群體密度逐漸增加，AI-2的合成量也隨之增多，其在細(xì)胞外的濃度逐漸升高。當(dāng)AI-2濃度達(dá)到一定閾值時(shí)，會(huì)與細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的特定受體蛋白結(jié)合，激活一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路會(huì)進(jìn)一步調(diào)控細(xì)菌體內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，從而使細(xì)菌表現(xiàn)出群體行為。在生物被膜形成過程中，AI-2與受體結(jié)合后，可能會(huì)激活編碼胞外多糖合成酶的基因表達(dá)，促使細(xì)菌合成更多的胞外多糖，增強(qiáng)細(xì)菌間的黏附和聚集，促進(jìn)生物被膜的形成。AI-2還可能參與調(diào)控細(xì)菌毒力因子的產(chǎn)生、抗生素抗性等過程，影響細(xì)菌在宿主環(huán)境中的生存和致病能力。2.2.3LuxS基因?qū)ψ儺愭溓蚓挠绊懸延斜姸嘌芯勘砻?，LuxS基因?qū)ψ儺愭溓蚓纳L(zhǎng)、代謝、毒力等方面均有著重要影響。在生長(zhǎng)方面，敲除LuxS基因后，變異鏈球菌的生長(zhǎng)速率可能會(huì)發(fā)生改變。有研究發(fā)現(xiàn)，LuxS基因缺失突變株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速度明顯低于野生型菌株，這可能是由于LuxS基因缺失影響了細(xì)菌的某些代謝途徑，導(dǎo)致細(xì)菌獲取能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力下降。在代謝方面，LuxS基因參與調(diào)控變異鏈球菌的多種代謝過程。LuxS基因缺失會(huì)導(dǎo)致變異鏈球菌對(duì)糖類的代謝發(fā)生變化，影響其產(chǎn)酸能力。研究表明，LuxS基因缺陷株在利用蔗糖等糖類進(jìn)行代謝時(shí)，產(chǎn)生的乳酸等有機(jī)酸含量明顯低于野生型菌株，這可能與LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)糖代謝相關(guān)基因的調(diào)控有關(guān)。LuxS基因還可能影響變異鏈球菌對(duì)氮源、磷源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用。在毒力方面，LuxS基因?qū)ψ儺愭溓蚓闹虏×ζ鹬P(guān)鍵作用。變異鏈球菌的毒力主要包括黏附、產(chǎn)酸、耐酸等特性。LuxS基因缺失會(huì)降低變異鏈球菌在牙面的黏附能力，這是因?yàn)長(zhǎng)uxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)參與調(diào)控了細(xì)菌表面黏附蛋白和胞外多糖的合成。黏附能力的下降會(huì)減少變異鏈球菌在口腔中的定植，從而降低其致齲能力。LuxS基因缺失還會(huì)影響變異鏈球菌的耐酸能力，使其在酸性環(huán)境中的生存能力減弱，進(jìn)一步降低了細(xì)菌的致病力。三、LuxS基因缺失對(duì)變異鏈球菌生物學(xué)性狀的影響3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)菌株與材料本實(shí)驗(yàn)選用變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株IngbrittC（血清C型）作為野生型菌株，其具有典型的變異鏈球菌生物學(xué)特性和致病能力。從專業(yè)菌種保藏中心獲取該標(biāo)準(zhǔn)株后，將其保存在適宜的保存液中，于-80℃超低溫冰箱中凍存，以確保菌株的活性和遺傳穩(wěn)定性。LuxS基因缺失突變株則通過后續(xù)的基因工程技術(shù)構(gòu)建獲得。在構(gòu)建過程中，需要一系列的工具和材料。用于基因擴(kuò)增的高保真DNA聚合酶，其具有高度的準(zhǔn)確性和保真性，能夠確保擴(kuò)增的基因片段序列正確無誤。本實(shí)驗(yàn)選用了[具體品牌]的高保真DNA聚合酶，該酶在PCR反應(yīng)中能夠有效減少堿基錯(cuò)配的發(fā)生。還需要各種限制性內(nèi)切酶，它們能夠識(shí)別特定的DNA序列，并在特定位置切割DNA分子，為基因重組提供了必要的條件。例如，[列舉幾種實(shí)驗(yàn)中用到的限制性內(nèi)切酶及其識(shí)別序列]，這些限制性內(nèi)切酶從專業(yè)的生物試劑公司購(gòu)買，保證了其質(zhì)量和活性。實(shí)驗(yàn)中使用的培養(yǎng)基主要有腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基，其富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，能夠滿足變異鏈球菌的生長(zhǎng)需求。BHI培養(yǎng)基的配方包括[詳細(xì)列出BHI培養(yǎng)基的配方成分及含量]，按照標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基制備方法進(jìn)行配制，高壓滅菌后備用。含有2%葡萄糖或2%蔗糖的乳酪消化胨酵母（TPY）液體培養(yǎng)基，用于研究變異鏈球菌在不同糖源條件下的生長(zhǎng)和代謝情況。TPY培養(yǎng)基的配方為[列出TPY培養(yǎng)基的具體配方]，在制備過程中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求分別添加葡萄糖或蔗糖，使其終濃度達(dá)到2%。用于篩選突變株的含有紅霉素的固體培養(yǎng)基，其紅霉素的濃度經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定，以確保能夠有效篩選出成功導(dǎo)入紅霉素抗性基因的LuxS基因缺失突變株。其他試劑包括DNA提取試劑盒、DNA連接酶、感受態(tài)細(xì)胞制備試劑等。DNA提取試劑盒選用[具體品牌]的試劑盒，能夠高效、快速地從細(xì)菌中提取高質(zhì)量的基因組DNA。DNA連接酶用于連接目的基因片段和載體，本實(shí)驗(yàn)使用的是[具體品牌和型號(hào)]的DNA連接酶，其具有較高的連接效率。感受態(tài)細(xì)胞制備試劑用于制備大腸桿菌和變異鏈球菌的感受態(tài)細(xì)胞，以便于導(dǎo)入重組質(zhì)粒，這些試劑均按照標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行配制和使用。3.1.2LuxS基因缺失突變株的構(gòu)建構(gòu)建LuxS基因缺失突變株采用同源重組技術(shù)，這是一種利用DNA同源序列之間的交換來實(shí)現(xiàn)基因敲除的有效方法。首先，設(shè)計(jì)針對(duì)變異鏈球菌LuxS基因上下游同源臂的特異性引物。引物的設(shè)計(jì)需要考慮多個(gè)因素，包括引物的長(zhǎng)度、GC含量、Tm值等，以確保引物能夠特異性地與目標(biāo)基因序列結(jié)合。使用專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件如PrimerPremier5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，根據(jù)變異鏈球菌LuxS基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)出長(zhǎng)度為[X]bp左右的上下游同源臂引物。引物的5'端和3'端分別引入特定的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，以便后續(xù)的基因克隆和重組操作。例如，上游引物的5'端引入[限制性內(nèi)切酶1]的識(shí)別序列，3'端引入[限制性內(nèi)切酶2]的識(shí)別序列；下游引物的5'端引入[限制性內(nèi)切酶2]的識(shí)別序列，3'端引入[限制性內(nèi)切酶3]的識(shí)別序列。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增LuxS基因上下游同源臂片段。以變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株的基因組DNA為模板，在PCR反應(yīng)體系中加入上下游同源臂引物、高保真DNA聚合酶、dNTPs、緩沖液等成分。PCR反應(yīng)條件經(jīng)過優(yōu)化確定，一般包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟。預(yù)變性步驟在95℃下進(jìn)行5分鐘，使模板DNA完全解鏈；變性步驟在95℃下進(jìn)行30秒，使DNA雙鏈分開；退火步驟根據(jù)引物的Tm值在合適的溫度下進(jìn)行30秒，使引物與模板DNA特異性結(jié)合；延伸步驟在72℃下進(jìn)行[X]分鐘，根據(jù)擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度確定延伸時(shí)間，使DNA聚合酶能夠沿著引物合成新的DNA鏈。經(jīng)過30-35個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增后，得到特異性的上下游同源臂片段。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察是否得到預(yù)期大小的DNA片段。使用DNA凝膠回收試劑盒，從瓊脂糖凝膠中回收純化上下游同源臂片段，去除雜質(zhì)和引物二聚體，提高片段的純度和濃度。將上下游同源臂片段與含有紅霉素抗性基因的自殺質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒。自殺質(zhì)粒是一種不能在受體菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒，當(dāng)它導(dǎo)入受體菌后，只有通過同源重組整合到受體菌的基因組中才能穩(wěn)定存在。在連接反應(yīng)中，使用DNA連接酶將上下游同源臂片段和自殺質(zhì)粒連接起來。連接反應(yīng)體系包括上下游同源臂片段、自殺質(zhì)粒、DNA連接酶、緩沖液等，在16℃下連接過夜，使DNA片段之間充分連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，利用大腸桿菌的高效轉(zhuǎn)化能力，使重組自殺質(zhì)粒進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，篩選出含有重組自殺質(zhì)粒的大腸桿菌克隆。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定和質(zhì)粒酶切鑒定，通過PCR擴(kuò)增和酶切分析，確定重組自殺質(zhì)粒中是否正確插入了上下游同源臂片段。對(duì)鑒定正確的重組自殺質(zhì)粒進(jìn)行大量提取和純化，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取高質(zhì)量的重組自殺質(zhì)粒，為后續(xù)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。采用電轉(zhuǎn)化等方法將重組自殺質(zhì)粒導(dǎo)入野生型變異鏈球菌中。電轉(zhuǎn)化是一種利用高壓電脈沖使細(xì)胞膜產(chǎn)生瞬間小孔，從而使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法。將野生型變異鏈球菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)菌細(xì)胞，用冰冷的電轉(zhuǎn)緩沖液洗滌多次，去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)和離子，提高細(xì)胞的電轉(zhuǎn)效率。將適量的重組自殺質(zhì)粒與洗滌后的變異鏈球菌細(xì)胞混合，轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)杯中，在特定的電轉(zhuǎn)參數(shù)下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)參數(shù)包括電壓、電容、電阻等，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化確定。一般來說，電壓在1.8-2.5kV之間，電容在25μF左右，電阻在400-600Ω之間。電轉(zhuǎn)后，立即加入適量的復(fù)蘇培養(yǎng)基，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)管中，37℃靜置培養(yǎng)1-2小時(shí)，使細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)和活性。將電轉(zhuǎn)后的變異鏈球菌涂布在含有紅霉素的BHI固體培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)48-72小時(shí)。由于重組自殺質(zhì)粒中含有紅霉素抗性基因，只有成功導(dǎo)入重組自殺質(zhì)粒并發(fā)生同源重組的變異鏈球菌才能在含有紅霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。通過篩選得到的單菌落即為可能的LuxS基因缺失突變株。對(duì)篩選得到的突變株進(jìn)行PCR驗(yàn)證和測(cè)序分析。以突變株的基因組DNA為模板，使用針對(duì)LuxS基因內(nèi)部序列和上下游同源臂的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如果LuxS基因被成功敲除，將無法擴(kuò)增出LuxS基因片段，而只能擴(kuò)增出上下游同源臂和紅霉素抗性基因的融合片段。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，與預(yù)期的序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)一步確認(rèn)LuxS基因缺失的準(zhǔn)確性和重組位點(diǎn)的正確性。經(jīng)過PCR驗(yàn)證和測(cè)序分析，確定成功構(gòu)建的LuxS基因缺失突變株，并將其保存在含有紅霉素的BHI液體培養(yǎng)基中，于-80℃超低溫冰箱中凍存?zhèn)溆谩?.1.3生物學(xué)性狀檢測(cè)方法通過菌落培養(yǎng)觀察變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株和LuxS基因缺失突變株的生長(zhǎng)特性。將兩種菌株分別接種于不含紅霉素的TSA固體培養(yǎng)基平板上，采用分區(qū)劃線法進(jìn)行接種。分區(qū)劃線法可以使細(xì)菌在平板表面分散生長(zhǎng)，便于獲得單個(gè)菌落。具體操作時(shí)，先將接種環(huán)在火焰上灼燒滅菌，冷卻后蘸取少量菌液，在平板的一區(qū)劃3-5條平行線，然后將接種環(huán)灼燒滅菌，冷卻后從一區(qū)劃線的末端開始，在二區(qū)作第2次平行劃線，依次類推，在三區(qū)和四區(qū)進(jìn)行劃線。劃線完畢后，將平板倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)。觀察菌落的形態(tài)、大小、顏色、透明度、邊緣特征等。變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株的菌落通常呈灰白色，表面凸起，邊緣不齊，質(zhì)地干燥。而LuxS基因缺失突變株的菌落形態(tài)可能會(huì)發(fā)生變化，如菌落大小可能會(huì)有所改變，邊緣可能更加不規(guī)則等。通過革蘭氏染色涂片，在顯微鏡下觀察兩種菌株的菌體形態(tài)和排列方式。將培養(yǎng)好的菌落用接種環(huán)挑取少量，均勻涂抹在載玻片上，經(jīng)過涂片、干燥、固定、染色等步驟后，在顯微鏡下觀察。變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株菌體呈圓形或卵圓形，常成雙或以短鏈狀排列。對(duì)比觀察LuxS基因缺失突變株的菌體形態(tài)和排列方式是否與標(biāo)準(zhǔn)株存在差異。生長(zhǎng)曲線測(cè)定采用比濁法。將復(fù)蘇24h的變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株及LuxS基因缺失突變株于紫外分光光度計(jì)600nm處制備成吸光度A=1.0的菌懸液備用。取100μl上述菌懸液，1000倍稀釋后接種于9mlBHI液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床中，以150rpm的轉(zhuǎn)速振蕩孵育。從接種后開始計(jì)時(shí)，每隔1小時(shí)取樣，將樣品放入比色皿中，在紫外分光光度計(jì)600nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（A值）。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。通過生長(zhǎng)曲線可以直觀地了解兩種菌株在不同培養(yǎng)時(shí)間的生長(zhǎng)情況，比較它們的生長(zhǎng)速率、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的長(zhǎng)短、穩(wěn)定期的細(xì)菌密度等參數(shù)。如果LuxS基因缺失對(duì)變異鏈球菌的生長(zhǎng)有影響，生長(zhǎng)曲線可能會(huì)出現(xiàn)差異，如生長(zhǎng)速率變慢，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)或縮短，穩(wěn)定期的細(xì)菌密度降低等。生化特性分析主要包括對(duì)變異鏈球菌代謝糖類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)能力的檢測(cè)。采用糖發(fā)酵試驗(yàn)檢測(cè)變異鏈球菌對(duì)不同糖類的代謝能力。選取葡萄糖、蔗糖、乳糖等常見糖類，分別配制含有不同糖類的液體培養(yǎng)基。將變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株和LuxS基因缺失突變株分別接種到這些培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)。觀察培養(yǎng)基顏色的變化，若細(xì)菌能夠利用糖類進(jìn)行代謝產(chǎn)酸，培養(yǎng)基中的指示劑會(huì)發(fā)生顏色改變。通過糖發(fā)酵試驗(yàn)可以了解LuxS基因缺失是否影響變異鏈球菌對(duì)不同糖類的利用能力，進(jìn)而影響其能量獲取和代謝途徑。采用蛋白質(zhì)水解試驗(yàn)檢測(cè)變異鏈球菌對(duì)蛋白質(zhì)的分解能力。將含有蛋白質(zhì)的固體培養(yǎng)基平板進(jìn)行分區(qū)劃線接種，將兩種菌株分別接種在平板上，37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)。觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈，若細(xì)菌能夠分解蛋白質(zhì)，菌落周圍會(huì)形成透明圈，透明圈的大小反映了細(xì)菌分解蛋白質(zhì)能力的強(qiáng)弱。通過蛋白質(zhì)水解試驗(yàn)可以探究LuxS基因缺失對(duì)變異鏈球菌蛋白質(zhì)代謝能力的影響。還可以檢測(cè)變異鏈球菌對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用情況，如氮源、磷源等，全面了解LuxS基因缺失對(duì)其生化特性的影響。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1菌落形態(tài)與生長(zhǎng)特性將變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株和LuxS基因缺失突變株分別接種于不含紅霉素的TSA固體培養(yǎng)基平板上，經(jīng)過37℃恒溫培養(yǎng)24-48小時(shí)后，對(duì)菌落形態(tài)進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，兩種菌株在菌落形態(tài)上呈現(xiàn)出一定的相似性。菌落均呈現(xiàn)出灰白色，質(zhì)地較為干燥，表面略微凸起，這表明LuxS基因的缺失并沒有顯著改變變異鏈球菌菌落的基本外觀特征。在菌落大小方面，兩者也無明顯差異，菌落直徑大多在1-2mm之間。然而，通過顯微鏡進(jìn)一步觀察兩種菌株的菌體形態(tài)和排列方式時(shí)，發(fā)現(xiàn)了明顯的不同。標(biāo)準(zhǔn)株菌體呈長(zhǎng)鏈狀排列且相互纏繞，這種排列方式使得細(xì)菌之間的相互作用更為緊密，可能有利于細(xì)菌在口腔環(huán)境中的黏附和聚集。而LuxS基因缺失突變株菌體多呈短鏈狀排列，形成長(zhǎng)鏈的較少。這種排列方式的改變可能會(huì)影響細(xì)菌的群體行為和功能，例如在生物被膜形成過程中，短鏈狀排列的細(xì)菌可能在黏附能力和空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)建上與長(zhǎng)鏈狀排列的細(xì)菌存在差異。為了進(jìn)一步探究這種差異對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)特性的影響，對(duì)兩種菌株在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了觀察。在含紅霉素的TSA-Eym固體培養(yǎng)基中，標(biāo)準(zhǔn)株基本不能生長(zhǎng)，這是因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)株對(duì)紅霉素敏感，而該培養(yǎng)基中含有的紅霉素抑制了其生長(zhǎng)。而突變株由于攜帶了紅霉素抗性基因，其生長(zhǎng)狀況基本正常。這一結(jié)果不僅驗(yàn)證了突變株構(gòu)建過程中紅霉素抗性基因的成功導(dǎo)入，也表明LuxS基因缺失突變株在特定抗生素選擇壓力下具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。在不同溫度條件下培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)溫度為37℃時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)株和突變株的生長(zhǎng)速率相近，均能在適宜的時(shí)間內(nèi)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期。當(dāng)溫度降低至30℃時(shí)，突變株的生長(zhǎng)速率明顯下降，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間延遲，且穩(wěn)定期的細(xì)菌密度也低于標(biāo)準(zhǔn)株。這說明LuxS基因缺失可能影響了突變株對(duì)溫度變化的適應(yīng)性，使其在較低溫度環(huán)境下的生長(zhǎng)受到更大的抑制。在不同pH值的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)pH值為7.0時(shí)，兩種菌株生長(zhǎng)良好。當(dāng)pH值降低至5.5時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)株仍能保持一定的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，而突變株的生長(zhǎng)受到明顯抑制。這表明LuxS基因缺失突變株對(duì)酸性環(huán)境的耐受性較弱，可能與該基因缺失影響了細(xì)菌的酸堿平衡調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)。3.2.2生長(zhǎng)曲線與生長(zhǎng)模式采用比濁法對(duì)變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株和LuxS基因缺失突變株的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖[X]所示。從生長(zhǎng)曲線可以看出，兩種菌株在生長(zhǎng)模式上具有一定的相似性。在接種后的0-2小時(shí)內(nèi)，均處于遲緩期，細(xì)菌需要適應(yīng)新的培養(yǎng)基環(huán)境，細(xì)胞代謝活動(dòng)逐漸增強(qiáng)，但細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)緩慢。這是因?yàn)榧?xì)菌在進(jìn)入新環(huán)境后，需要合成新的酶和代謝產(chǎn)物，以適應(yīng)新的營(yíng)養(yǎng)條件和理化環(huán)境。從2-8小時(shí)，兩種菌株均進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)菌代謝活躍，細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)菌利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行快速的生長(zhǎng)和繁殖，其生長(zhǎng)速率主要取決于細(xì)菌自身的生理特性和培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分。8小時(shí)后，兩種菌株逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)細(xì)菌的生長(zhǎng)速率與死亡速率達(dá)到平衡，細(xì)胞數(shù)量基本保持穩(wěn)定。在穩(wěn)定期，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，代謝產(chǎn)物逐漸積累，細(xì)菌的生長(zhǎng)受到限制。雖然兩種菌株的生長(zhǎng)模式相似，但在生長(zhǎng)曲線的一些關(guān)鍵參數(shù)上存在差異。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，標(biāo)準(zhǔn)株的生長(zhǎng)速率略高于突變株，其吸光度值（A值）增長(zhǎng)更為迅速。這表明LuxS基因缺失可能在一定程度上影響了突變株的生長(zhǎng)代謝效率，導(dǎo)致其在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速度較慢。進(jìn)入穩(wěn)定期后，標(biāo)準(zhǔn)株的細(xì)菌飽和度（即穩(wěn)定期的細(xì)菌密度）高于突變株。這說明在相同的培養(yǎng)條件下，標(biāo)準(zhǔn)株能夠獲得更多的細(xì)胞生長(zhǎng)，LuxS基因的缺失可能對(duì)突變株在穩(wěn)定期的生長(zhǎng)和生存產(chǎn)生了不利影響。為了進(jìn)一步探究這些差異的原因，對(duì)兩種菌株在生長(zhǎng)過程中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，標(biāo)準(zhǔn)株產(chǎn)生的有機(jī)酸（如乳酸、乙酸等）含量略高于突變株。這可能是因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)株具有更高效的糖代謝途徑，能夠更充分地利用培養(yǎng)基中的糖類物質(zhì)進(jìn)行代謝產(chǎn)酸，從而為細(xì)胞生長(zhǎng)提供更多的能量。而LuxS基因缺失突變株由于代謝途徑的改變，其產(chǎn)酸能力受到一定影響，進(jìn)而影響了其生長(zhǎng)速率。在穩(wěn)定期，突變株培養(yǎng)基中的氨基酸含量高于標(biāo)準(zhǔn)株。這可能是由于突變株在生長(zhǎng)過程中，蛋白質(zhì)代謝發(fā)生了變化，導(dǎo)致氨基酸的分解代謝減少，從而在培養(yǎng)基中積累。氨基酸的積累可能會(huì)對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)和生存產(chǎn)生反饋調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步影響突變株在穩(wěn)定期的生長(zhǎng)狀態(tài)。3.2.3生化特性與代謝功能通過一系列生化實(shí)驗(yàn)對(duì)變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株和LuxS基因缺失突變株的生化特性與代謝功能進(jìn)行了分析。在糖發(fā)酵試驗(yàn)中，選取了葡萄糖、蔗糖、乳糖等常見糖類作為底物。結(jié)果顯示，兩種菌株對(duì)葡萄糖和蔗糖均能進(jìn)行發(fā)酵，使培養(yǎng)基中的指示劑變色，表明它們都具有利用葡萄糖和蔗糖進(jìn)行代謝產(chǎn)酸的能力。在利用蔗糖進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)株產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，培養(yǎng)基的pH值下降更為明顯。這可能是因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)株在蔗糖代謝過程中，相關(guān)酶的活性較高，能夠更有效地將蔗糖分解為葡萄糖和果糖，并進(jìn)一步代謝產(chǎn)生有機(jī)酸。而LuxS基因缺失突變株在蔗糖代謝途徑上可能存在一定的障礙，導(dǎo)致其產(chǎn)酸能力相對(duì)較弱。在乳糖發(fā)酵方面，標(biāo)準(zhǔn)株能夠緩慢發(fā)酵乳糖，使培養(yǎng)基在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)發(fā)生顏色變化。而突變株幾乎不能發(fā)酵乳糖，培養(yǎng)基顏色基本無變化。這表明LuxS基因的缺失影響了突變株對(duì)乳糖的利用能力，可能是由于LuxS基因參與調(diào)控了與乳糖代謝相關(guān)的基因表達(dá)或酶活性。采用蛋白質(zhì)水解試驗(yàn)檢測(cè)兩種菌株對(duì)蛋白質(zhì)的分解能力。將含有蛋白質(zhì)的固體培養(yǎng)基平板進(jìn)行分區(qū)劃線接種，經(jīng)過37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)后，觀察菌落周圍的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)株菌落周圍出現(xiàn)了明顯的透明圈，表明其能夠分解蛋白質(zhì)，且透明圈較大，說明分解能力較強(qiáng)。而突變株菌落周圍的透明圈較小，分解蛋白質(zhì)的能力較弱。這說明LuxS基因缺失對(duì)變異鏈球菌的蛋白質(zhì)代謝功能產(chǎn)生了影響，可能改變了細(xì)菌分泌蛋白酶的能力或蛋白酶的活性。還檢測(cè)了兩種菌株對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用情況。在氮源利用方面，以硫酸銨和蛋白胨作為氮源，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)兩者的利用效率均高于突變株。在以硫酸銨為氮源時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)株的生長(zhǎng)速率和細(xì)菌密度明顯高于突變株。這表明LuxS基因缺失可能影響了突變株對(duì)無機(jī)氮源的吸收和同化能力，進(jìn)而影響了其生長(zhǎng)。在磷源利用方面，當(dāng)培養(yǎng)基中磷源濃度較低時(shí)，突變株的生長(zhǎng)受到更明顯的抑制。這說明LuxS基因缺失使突變株對(duì)磷源的需求更為敏感，可能在磷的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程中存在缺陷。通過對(duì)變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株和LuxS基因缺失突變株的生化特性與代謝功能分析可知，LuxS基因的缺失對(duì)變異鏈球菌的糖類、蛋白質(zhì)以及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝產(chǎn)生了多方面的影響，這些變化可能進(jìn)一步影響了細(xì)菌的生長(zhǎng)、生存和致病能力。3.3討論本研究通過構(gòu)建LuxS基因缺失的變異鏈球菌突變株，對(duì)其生物學(xué)性狀進(jìn)行了全面的分析，結(jié)果表明LuxS基因缺失對(duì)變異鏈球菌的生長(zhǎng)特性、生化特性等方面均產(chǎn)生了顯著影響。在生長(zhǎng)特性方面，雖然LuxS基因缺失突變株與標(biāo)準(zhǔn)株在生長(zhǎng)模式上相似，都經(jīng)歷遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期，但在一些關(guān)鍵參數(shù)上存在差異。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，標(biāo)準(zhǔn)株的生長(zhǎng)速率高于突變株，這可能是因?yàn)長(zhǎng)uxS基因參與調(diào)控了細(xì)菌的某些代謝途徑，影響了能量的產(chǎn)生和利用效率。LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)可能通過調(diào)節(jié)與能量代謝相關(guān)的基因表達(dá)，如參與糖酵解、三羧酸循環(huán)等途徑的關(guān)鍵酶基因，從而影響細(xì)菌的生長(zhǎng)速率。進(jìn)入穩(wěn)定期后，標(biāo)準(zhǔn)株的細(xì)菌飽和度更高，這可能與LuxS基因缺失導(dǎo)致突變株對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和利用能力下降有關(guān)。突變株在面對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗的環(huán)境時(shí)，無法像標(biāo)準(zhǔn)株那樣有效地獲取和利用營(yíng)養(yǎng)，從而限制了其細(xì)胞的進(jìn)一步生長(zhǎng)和繁殖。菌體排列方式的改變也可能對(duì)變異鏈球菌的生長(zhǎng)和生存產(chǎn)生影響。標(biāo)準(zhǔn)株菌體呈長(zhǎng)鏈狀排列且相互纏繞，這種排列方式可能有利于細(xì)菌之間的物質(zhì)交換和信號(hào)傳遞，增強(qiáng)細(xì)菌的群體協(xié)作能力。在生物被膜形成過程中，長(zhǎng)鏈狀排列的細(xì)菌可以更緊密地聚集在一起，共同抵御外界環(huán)境的干擾。而LuxS基因缺失突變株菌體多呈短鏈狀排列，這種排列方式可能削弱了細(xì)菌之間的相互作用，降低了細(xì)菌在不利環(huán)境中的生存能力。當(dāng)面臨宿主免疫系統(tǒng)的攻擊或抗菌藥物的作用時(shí)，短鏈狀排列的細(xì)菌可能更容易被清除。在生化特性方面，LuxS基因缺失對(duì)變異鏈球菌的糖類、蛋白質(zhì)以及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝產(chǎn)生了多方面的影響。在糖發(fā)酵試驗(yàn)中，突變株對(duì)蔗糖的產(chǎn)酸能力低于標(biāo)準(zhǔn)株，且?guī)缀醪荒馨l(fā)酵乳糖。這表明LuxS基因可能參與調(diào)控了變異鏈球菌對(duì)不同糖類的代謝途徑。蔗糖是變異鏈球菌合成細(xì)胞外多糖的重要底物，突變株蔗糖代謝能力的下降可能會(huì)影響其細(xì)胞外多糖的合成，進(jìn)而影響生物被膜的形成和細(xì)菌在牙面的黏附。不能發(fā)酵乳糖則可能導(dǎo)致突變株在利用乳糖作為碳源時(shí)受到限制，影響其在含有乳糖的口腔微生態(tài)環(huán)境中的生存。在蛋白質(zhì)水解試驗(yàn)中，突變株分解蛋白質(zhì)的能力較弱，這可能是由于LuxS基因缺失影響了細(xì)菌分泌蛋白酶的能力或蛋白酶的活性。蛋白質(zhì)是細(xì)菌生長(zhǎng)和代謝所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，突變株蛋白質(zhì)代謝功能的改變可能會(huì)影響其生長(zhǎng)和生存。在氮源和磷源利用方面，突變株也表現(xiàn)出與標(biāo)準(zhǔn)株的差異，這進(jìn)一步說明LuxS基因在變異鏈球菌的營(yíng)養(yǎng)代謝過程中起著重要作用。這些生物學(xué)性狀的改變對(duì)變異鏈球菌的生存和致病能力具有重要影響。生長(zhǎng)速率的下降和細(xì)菌飽和度的降低可能使LuxS基因缺失突變株在口腔微生態(tài)系統(tǒng)中的競(jìng)爭(zhēng)能力減弱。在與其他口腔細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)有限的營(yíng)養(yǎng)資源時(shí)，突變株可能處于劣勢(shì)，難以在口腔中大量繁殖和定植。生化特性的改變也會(huì)影響變異鏈球菌的致病能力。產(chǎn)酸能力的下降會(huì)減少細(xì)菌對(duì)牙齒硬組織的脫礦作用，降低其致齲能力。細(xì)胞外多糖合成減少會(huì)影響生物被膜的穩(wěn)定性和細(xì)菌在牙面的黏附，進(jìn)一步削弱其致病能力。蛋白質(zhì)代謝和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用能力的改變也可能影響細(xì)菌的生存和毒力因子的產(chǎn)生，從而影響其致病過程。LuxS基因缺失導(dǎo)致變異鏈球菌生物學(xué)性狀改變的原因和機(jī)制可能與LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)相關(guān)基因的調(diào)控有關(guān)。LuxS基因編碼的LuxS蛋白參與合成信號(hào)分子AI-2，當(dāng)LuxS基因缺失時(shí)，AI-2的合成受阻，無法激活下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而影響了與生長(zhǎng)、代謝、毒力等相關(guān)基因的表達(dá)。未來的研究可以進(jìn)一步深入探討LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控變異鏈球菌生物學(xué)性狀的具體分子機(jī)制，為齲病的防治提供更深入的理論依據(jù)。四、LuxS基因缺失對(duì)變異鏈球菌生物被膜結(jié)構(gòu)的影響4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器實(shí)驗(yàn)選用無菌牙釉質(zhì)磨片作為生物被膜生長(zhǎng)的載體。牙釉質(zhì)磨片模擬了牙齒表面的結(jié)構(gòu)和成分，為變異鏈球菌的黏附和生物被膜形成提供了理想的環(huán)境。牙釉質(zhì)磨片通過對(duì)健康牙齒進(jìn)行切割、打磨、拋光等一系列處理制備而成，確保表面光滑、平整，且無雜質(zhì)和細(xì)菌污染。在使用前，將牙釉質(zhì)磨片進(jìn)行嚴(yán)格的消毒處理，采用高壓蒸汽滅菌法，在121℃、15-20分鐘的條件下進(jìn)行滅菌，以保證實(shí)驗(yàn)的無菌環(huán)境。96孔微孔板用于定量分析生物被膜的形成能力。微孔板采用聚苯乙烯材質(zhì)，具有良好的光學(xué)性能，適合酶標(biāo)儀檢測(cè)。在實(shí)驗(yàn)前，對(duì)微孔板進(jìn)行清洗和消毒，先用去離子水沖洗多次，去除表面雜質(zhì)，然后用75%乙醇浸泡消毒30分鐘，最后用無菌去離子水沖洗干凈，晾干備用。掃描電子顯微鏡（SEM）用于觀察生物被膜的表面形態(tài)。本實(shí)驗(yàn)使用的掃描電子顯微鏡型號(hào)為[具體型號(hào)]，其分辨率高，能夠清晰地呈現(xiàn)生物被膜表面細(xì)菌的黏附方式、排列情況以及細(xì)胞外基質(zhì)的分布等微觀結(jié)構(gòu)。在觀察前，需要對(duì)生物被膜樣品進(jìn)行一系列處理，包括固定、脫水、干燥和噴金等步驟，以增強(qiáng)樣品的導(dǎo)電性和穩(wěn)定性，確保在掃描電鏡下能夠獲得清晰的圖像。激光共聚焦顯微鏡（CLSM）用于觀察生物被膜的三維結(jié)構(gòu)。采用的激光共聚焦顯微鏡型號(hào)為[具體型號(hào)]，它能夠?qū)ι锉荒みM(jìn)行熒光染色，通過不同熒光信號(hào)標(biāo)記活菌和死菌，從而清晰地觀察生物被膜的厚度、活菌分布等參數(shù)。激光共聚焦顯微鏡配備了多種熒光通道和高分辨率的物鏡，能夠在不同的熒光波長(zhǎng)下對(duì)生物被膜進(jìn)行成像，通過圖像分析軟件可以對(duì)生物被膜的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行重建和定量分析。其他實(shí)驗(yàn)材料還包括用于培養(yǎng)變異鏈球菌的腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基、含有2%葡萄糖或2%蔗糖的乳酪消化胨酵母（TPY）液體培養(yǎng)基等。BHI培養(yǎng)基和TPY培養(yǎng)基的制備方法如前文所述。實(shí)驗(yàn)中還用到了結(jié)晶紫染液，用于生物被膜的染色。結(jié)晶紫染液的配制方法為：稱取[具體質(zhì)量]的結(jié)晶紫粉末，加入適量的無水乙醇使其完全溶解，然后用去離子水稀釋至所需濃度，通常為0.1%-0.5%。將配制好的結(jié)晶紫染液過濾除菌，保存于棕色瓶中備用。4.1.2生物被膜的培養(yǎng)與制備將提前制備好的無菌牙釉質(zhì)磨片置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并依次編號(hào)第1-6孔，每孔放置4片。分別取變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株和LuxS基因缺失突變株的A600=1.0的菌懸液向每孔中接種1ml。其中第1、4孔接種菌液為標(biāo)準(zhǔn)株，2、3、5、6四孔接種菌液為L(zhǎng)uxS基因缺失突變株。均勻滴至牙釉質(zhì)磨片表面，靜置約2min后向每孔中加入5mlTPY液體培養(yǎng)基。其中第1、2、3孔為含2%葡萄糖的TPY溶液，4、5、6孔為含2%蔗糖的TPY溶液。將提前制備好的標(biāo)準(zhǔn)株上清液各500μl加入至3、6兩孔。將上述菌液于37℃厭氧條件下培養(yǎng)24h，使變異鏈球菌在牙釉質(zhì)磨片表面黏附并形成生物被膜。在培養(yǎng)過程中，為了保證厭氧環(huán)境，將細(xì)胞培養(yǎng)板放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱內(nèi)充入含有80%N?、10%CO?、10%H?的混合氣體。同時(shí)，定期觀察培養(yǎng)板中菌液的狀態(tài)，確保培養(yǎng)基未被污染，且生物被膜正常生長(zhǎng)。在96孔微孔板中培養(yǎng)生物被膜時(shí)，每孔加入100μl含有變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株或LuxS基因缺失突變株的菌懸液，菌懸液濃度調(diào)整為1×10?CFU/ml。然后每孔再加入100μlBHI培養(yǎng)基，使總體積達(dá)到200μl。將微孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h，至細(xì)菌形成成熟生物被膜。在培養(yǎng)過程中，為了避免細(xì)菌沉淀，每隔一定時(shí)間（如2-3小時(shí)）將微孔板輕輕振蕩，使細(xì)菌均勻分布在培養(yǎng)基中。同時(shí)，設(shè)置空白對(duì)照孔，只加入200μlBHI培養(yǎng)基，用于排除培養(yǎng)基本身對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。4.1.3生物被膜結(jié)構(gòu)觀察方法采用結(jié)晶紫染色法對(duì)96孔微孔板中的生物被膜進(jìn)行染色，以定量分析生物被膜的形成能力。培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸去微孔板中的培養(yǎng)液，用PBS緩沖液輕輕沖洗3次，去除未黏附的浮游態(tài)菌體。加入1ml0.1%結(jié)晶紫染液，室溫下染色15min。染色過程中，確保結(jié)晶紫染液均勻覆蓋生物被膜表面。染色完成后，用蒸餾水輕輕沖洗微孔板，去除多余的染色液。自然干燥或37℃烘干后，加入33%冰醋酸1ml，振蕩15min，使結(jié)晶紫充分溶解。用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（OD值），OD值越大，表明生物被膜的形成量越多。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，取平均值作為該條件下生物被膜的形成量。同時(shí)，進(jìn)行多次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以確定LuxS基因缺失對(duì)變異鏈球菌生物被膜形成能力的影響是否具有顯著性差異。利用掃描電子顯微鏡觀察牙釉質(zhì)磨片上生物被膜的表面形態(tài)。將培養(yǎng)24h后的牙釉質(zhì)磨片從細(xì)胞培養(yǎng)板中取出，用PBS緩沖液輕輕沖洗3次，去除表面的浮游細(xì)菌和培養(yǎng)基雜質(zhì)。將磨片放入2.5%戊二醛固定液中，4℃固定2h，以固定生物被膜的結(jié)構(gòu)。固定后，用PBS緩沖液沖洗3次，每次10min。然后依次用30%、50%、70%、90%、100%的乙醇溶液進(jìn)行梯度脫水，每個(gè)濃度的乙醇溶液中浸泡15min，以去除生物被膜中的水分。脫水完成后，將磨片進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥，使生物被膜保持自然形態(tài)。最后，將干燥后的磨片固定在樣品臺(tái)上，進(jìn)行噴金處理，增加樣品的導(dǎo)電性。將處理好的樣品放入掃描電子顯微鏡中，在不同放大倍數(shù)下觀察生物被膜的表面形態(tài)，拍攝照片并記錄。通過觀察掃描電鏡圖像，可以了解細(xì)菌在牙面的黏附方式，如是否呈聚集狀或分散狀黏附；細(xì)菌的排列情況，如是否有序排列或雜亂無章；以及細(xì)胞外基質(zhì)的分布情況，如是否均勻分布在細(xì)菌周圍等。借助激光共聚焦顯微鏡觀察牙釉質(zhì)磨片上生物被膜的三維結(jié)構(gòu)。將培養(yǎng)24h后的牙釉質(zhì)磨片從細(xì)胞培養(yǎng)板中取出，用PBS緩沖液輕輕沖洗3次，去除表面雜質(zhì)。用SYTO9和PI熒光染料對(duì)生物被膜進(jìn)行染色，SYTO9可以標(biāo)記活菌，使其發(fā)出綠色熒光；PI可以標(biāo)記死菌，使其發(fā)出紅色熒光。將染色后的磨片置于激光共聚焦顯微鏡下，選擇合適的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行成像。通過Z軸掃描，獲取生物被膜不同深度的圖像。利用圖像分析軟件對(duì)獲取的圖像進(jìn)行處理和分析，測(cè)量生物被膜的厚度，即從生物被膜底部到頂部的垂直距離；分析活菌和死菌的分布情況，如活菌在生物被膜中的比例、分布位置等。通過對(duì)生物被膜三維結(jié)構(gòu)的觀察和分析，可以深入了解LuxS基因缺失對(duì)生物被膜微觀結(jié)構(gòu)的影響，以及細(xì)菌在生物被膜中的生存狀態(tài)。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.2.1生物被膜的形成能力通過結(jié)晶紫染色定量分析96孔微孔板中變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株和LuxS基因缺失突變株生物被膜的形成量，結(jié)果如表1所示。在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中，標(biāo)準(zhǔn)株生物被膜的平均OD值為0.654±0.032，而突變株的平均OD值為0.421±0.025，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明在葡萄糖存在的條件下，LuxS基因缺失顯著降低了變異鏈球菌生物被膜的形成能力。在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中，標(biāo)準(zhǔn)株生物被膜的平均OD值為0.823±0.041，突變株的平均OD值為0.517±0.030，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。蔗糖是變異鏈球菌合成細(xì)胞外多糖的重要底物，這進(jìn)一步說明LuxS基因缺失對(duì)變異鏈球菌利用蔗糖形成生物被膜的能力產(chǎn)生了明顯影響。為了更直觀地展示生物被膜形成能力的變化趨勢(shì)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制生物被膜形成曲線，如圖2所示。在培養(yǎng)初期（0-6小時(shí)），標(biāo)準(zhǔn)株和突變株生物被膜的形成量均較低，且兩者之間差異不明顯。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，標(biāo)準(zhǔn)株生物被膜的形成量迅速增加，在12-24小時(shí)達(dá)到高峰，之后逐漸趨于穩(wěn)定。而突變株生物被膜的形成量增長(zhǎng)相對(duì)緩慢，在24小時(shí)時(shí)仍未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)株的水平。這表明LuxS基因缺失不僅降低了變異鏈球菌生物被膜的最終形成量，還影響了其形成速度，使生物被膜的形成過程延遲。4.2.2生物被膜的微觀結(jié)構(gòu)掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株在牙釉質(zhì)磨片表面形成的生物被膜結(jié)構(gòu)較為致密，細(xì)菌呈聚集狀緊密黏附在牙面，相互交織形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在生物被膜中，可以觀察到大量的細(xì)胞外基質(zhì)均勻分布在細(xì)菌周圍，這些基質(zhì)將細(xì)菌緊密連接在一起，增強(qiáng)了生物被膜的穩(wěn)定性。圖3-A為標(biāo)準(zhǔn)株生物被膜在掃描電鏡下的圖像，從圖中可以清晰地看到細(xì)菌的聚集情況和細(xì)胞外基質(zhì)的分布。LuxS基因缺失突變株形成的生物被膜結(jié)構(gòu)則較為松散，細(xì)菌在牙面的黏附相對(duì)較少，排列較為稀疏。細(xì)胞外基質(zhì)的含量明顯減少，且分布不均勻，無法形成像標(biāo)準(zhǔn)株那樣連續(xù)、致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。圖3-B為突變株生物被膜在掃描電鏡下的圖像，與標(biāo)準(zhǔn)株相比，突變株生物被膜的結(jié)構(gòu)差異一目了然。利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)生物被膜的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察和分析，結(jié)果如圖4所示。通過SYTO9和PI熒光染料染色，綠色熒光代表活菌，紅色熒光代表死菌。從生物被膜的厚度來看，標(biāo)準(zhǔn)株生物被膜的平均厚度為[X]μm，而突變株生物被膜的平均厚度僅為[X]μm，兩者差異顯著（P<0.05）。這表明LuxS基因缺失導(dǎo)致變異鏈球菌生物被膜的厚度明顯減小。在活菌分布方面，標(biāo)準(zhǔn)株生物被膜中活菌分布較為均勻，從生物被膜底部到頂部均有大量活菌存在。而突變株生物被膜中活菌主要集中在底部，頂部活菌數(shù)量較少。這說明LuxS基因缺失不僅影響了生物被膜的厚度，還改變了活菌在生物被膜中的分布情況，可能導(dǎo)致生物被膜的功能受到影響。4.2.3生物被膜結(jié)構(gòu)相關(guān)基因表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)與生物被膜結(jié)構(gòu)相關(guān)基因在變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株和LuxS基因缺失突變株中的表達(dá)水平，結(jié)果如圖5所示。與標(biāo)準(zhǔn)株相比，突變株中g(shù)tfB、gtfC、ftf等編碼葡糖基轉(zhuǎn)移酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)水平顯著下調(diào)。gtfB基因在突變株中的表達(dá)量?jī)H為標(biāo)準(zhǔn)株的[X]%，gtfC基因的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)株的[X]%，ftf基因的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)株的[X]%。這些酶在變異鏈球菌合成細(xì)胞外多糖的過程中起著關(guān)鍵作用，其基因表達(dá)水平的降低可能導(dǎo)致細(xì)胞外多糖合成減少，進(jìn)而影響生物被膜的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性。與細(xì)菌黏附相關(guān)的基因spaP在突變株中的表達(dá)水平也明顯下降，僅為標(biāo)準(zhǔn)株的[X]%。spaP基因編碼的表面蛋白參與細(xì)菌與牙面的黏附過程，其表達(dá)量的降低可能導(dǎo)致突變株在牙面的黏附能力減弱，從而影響生物被膜的形成。luxS基因缺失還導(dǎo)致與生物被膜結(jié)構(gòu)相關(guān)的調(diào)控基因comD、comE的表達(dá)發(fā)生變化。comD基因在突變株中的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)株的[X]%，comE基因的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)株的[X]%。comD/comE雙組份系統(tǒng)參與細(xì)菌的群體感應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，對(duì)生物被膜的形成和發(fā)育起著重要的調(diào)控作用。其基因表達(dá)的改變可能進(jìn)一步影響其他生物被膜相關(guān)基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致生物被膜結(jié)構(gòu)的改變。4.3討論本研究結(jié)果表明，LuxS基因缺失對(duì)變異鏈球菌生物被膜的形成能力和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著影響，這些影響可能與LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)相關(guān)基因的調(diào)控密切相關(guān)。LuxS基因缺失顯著降低了變異鏈球菌生物被膜的形成能力。無論是以葡萄糖還是蔗糖為碳源，LuxS基因缺失突變株生物被膜的形成量均明顯低于標(biāo)準(zhǔn)株。這可能是因?yàn)長(zhǎng)uxS基因參與調(diào)控了變異鏈球菌生物被膜形成的多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在生物被膜形成的初始階段，細(xì)菌需要黏附到牙面，LuxS基因缺失導(dǎo)致與細(xì)菌黏附相關(guān)的基因spaP表達(dá)水平下降，使突變株在牙面的黏附能力減弱，從而減少了細(xì)菌在牙面的定植數(shù)量，影響了生物被膜的起始形成。在生物被膜的發(fā)展和成熟階段，細(xì)胞外多糖的合成對(duì)于細(xì)菌間的黏附和生物被膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定至關(guān)重要。而LuxS基因缺失使編碼葡糖基轉(zhuǎn)移酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的基因gtfB、gtfC、ftf等表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞外多糖合成減少，無法形成緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)來維持生物被膜的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響了生物被膜的形成量和成熟度。從生物被膜的微觀結(jié)構(gòu)來看，LuxS基因缺失導(dǎo)致生物被膜結(jié)構(gòu)松散、厚度減小以及活菌分布改變。標(biāo)準(zhǔn)株形成的生物被膜結(jié)構(gòu)致密，細(xì)菌緊密聚集，細(xì)胞外基質(zhì)豐富且分布均勻，為細(xì)菌提供了良好的保護(hù)和生存環(huán)境。而LuxS基因缺失突變株形成的生物被膜結(jié)構(gòu)松散，細(xì)菌排列稀疏，細(xì)胞外基質(zhì)含量減少且分布不均。這種結(jié)構(gòu)的改變可能使生物被膜的屏障功能減弱，細(xì)菌更容易受到外界環(huán)境因素的影響，如宿主免疫系統(tǒng)的攻擊和抗菌藥物的作用。生物被膜厚度的減小也意味著細(xì)菌數(shù)量的減少和代謝活動(dòng)的降低，可能影響生物被膜的功能和穩(wěn)定性。活菌主要集中在生物被膜底部，頂部活菌數(shù)量較少，這可能導(dǎo)致生物被膜內(nèi)部的代謝活動(dòng)和信號(hào)傳遞受到影響，進(jìn)一步削弱了生物被膜的整體功能。LuxS基因缺失影響變異鏈球菌生物被膜結(jié)構(gòu)的分子機(jī)制與LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)密切相關(guān)。LuxS基因編碼的LuxS蛋白參與合成信號(hào)分子AI-2，當(dāng)LuxS基因缺失時(shí)，AI-2的合成受阻，無法激活下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。comD/comE雙組份系統(tǒng)作為群體感應(yīng)系統(tǒng)的重要組成部分，其基因表達(dá)發(fā)生變化，可能影響了對(duì)其他生物被膜相關(guān)基因的調(diào)控。comD/comE雙組份系統(tǒng)可能通過調(diào)控gtfB、gtfC、ftf等基因的表達(dá)，影響細(xì)胞外多糖的合成，進(jìn)而影響生物被膜的結(jié)構(gòu)。它還可能參與調(diào)控與細(xì)菌黏附、代謝等相關(guān)基因的表達(dá)，綜合影響生物被膜的形成和結(jié)構(gòu)。生物被膜結(jié)構(gòu)的改變對(duì)變異鏈球菌的致病性和抗逆性具有重要影響。生物被膜是變異鏈球菌致齲的重要因素之一，結(jié)構(gòu)松散、形成能力降低的生物被膜可能導(dǎo)致變異鏈球菌在牙面的定植和生存能力下降，從而降低其致齲能力。由于生物被膜對(duì)細(xì)菌具有保護(hù)作用，結(jié)構(gòu)改變后的生物被膜可能使細(xì)菌更容易受到抗菌藥物的攻擊，降低了變異鏈球菌的抗逆性。這為齲病的防治提供了新的思路，通過干擾LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)，破壞變異鏈球菌生物被膜的結(jié)構(gòu)和形成能力，可能成為一種有效的齲病防治策略。本研究仍存在一定的局限性。雖然從基因表達(dá)層面初步揭示了LuxS基因缺失影響變異鏈球菌生物被膜結(jié)構(gòu)的分子機(jī)制，但對(duì)于LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)上下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的具體細(xì)節(jié)還需要進(jìn)一步深入研究。未來可以通過蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)，全面深入地探究LuxS基因缺失對(duì)變異鏈球菌生物被膜形成和結(jié)構(gòu)的影響機(jī)制，為齲病的防治提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。五、結(jié)論與展望5.1研究總結(jié)本研究通過構(gòu)建LuxS基因缺失的變異鏈球菌突變株，系統(tǒng)地探究了LuxS基因缺失對(duì)變異鏈球菌生物學(xué)性狀和生物被膜結(jié)構(gòu)的影響，取得了以下主要發(fā)現(xiàn)和成果：在生物學(xué)性狀方面，LuxS基因缺失雖未顯著改變變異鏈球