A族溶血性鏈球菌對巨噬細胞株RAW264.7的功能影響及致病機制探究一、引言1.1研究背景A族溶血性鏈球菌（GroupAStreptococcus，GAS），作為一種在自然界廣泛存在的革蘭氏陽性菌，是一類極具影響力的強毒力致病菌，嚴重威脅著人類的健康。GAS主要通過宿主皮膚及呼吸道黏膜進行感染，其引發(fā)的疾病種類繁多，涵蓋了從淺表性感染到嚴重的全身性疾病。其中，淺表性感染包括急性咽/扁桃體炎、膿皰瘡、丹毒等，這些疾病雖然通常不會危及生命，但會給患者帶來不適，影響生活質量。例如，急性咽/扁桃體炎是門急診兒童和青少年咽痛的主要就診原因之一，患者會出現(xiàn)突發(fā)高熱、咽部劇痛、頸前淋巴結腫痛等癥狀。而GAS引發(fā)的侵襲性感染和毒素介導性疾病則更為嚴重，如壞死性筋膜炎、中毒性休克綜合征、猩紅熱等。壞死性筋膜炎是一種嚴重的軟組織感染疾病，會導致組織壞死和全身中毒癥狀，若不及時治療，死亡率極高。中毒性休克綜合征則可導致多器官功能衰竭，對患者的生命安全構成極大威脅。猩紅熱是由GAS引起的急性呼吸道傳染病，以發(fā)熱、咽部癥狀和皮疹為主要特征，在冬春季高發(fā)，嚴重影響兒童的健康。值得注意的是，GAS感染不僅會引發(fā)上述直接感染性疾病，還可能導致感染后的自身免疫性疾病，如風濕熱、風濕性心臟病、腎小球腎炎等。風濕熱是一種累及心臟、關節(jié)、皮膚等多個系統(tǒng)的自身免疫性疾病，可導致心臟瓣膜病變，嚴重影響心臟功能，是兒童和青少年時期常見的心血管疾病之一。風濕性心臟病是風濕熱的嚴重并發(fā)癥，可導致心臟瓣膜狹窄或關閉不全，需要長期治療和管理。急性腎小球腎炎則會影響腎臟功能，出現(xiàn)水腫、血尿、蛋白尿等癥狀，部分患者可能發(fā)展為慢性腎衰竭。巨噬細胞作為人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在免疫防御中發(fā)揮著關鍵作用。巨噬細胞來源于血液中的單核細胞，當單核細胞穿出血管后，會在組織中分化為巨噬細胞。巨噬細胞具有強大的吞噬能力，能夠識別、吞噬和消化各種病原體，包括細菌、病毒、真菌等，是機體抵御病原體入侵的第一道防線。在吞噬病原體的過程中，巨噬細胞會將病原體分解成小片段，并通過抗原呈遞細胞表面的MHC分子遞呈給其他免疫細胞，如T淋巴細胞，從而引發(fā)特異性免疫應答，進一步增強機體的免疫防御能力。巨噬細胞還能釋放多種炎癥介質，如細胞因子和趨化因子等。這些炎癥介質在炎癥反應中起著重要的調節(jié)作用，它們可以招募其他免疫細胞進入感染部位，增強局部的免疫反應，促進炎癥的消退。巨噬細胞釋放的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可以激活T淋巴細胞和自然殺傷細胞，增強它們的殺傷活性；白細胞介素-1（IL-1）可以促進T淋巴細胞的增殖和分化，增強免疫應答。巨噬細胞在維持組織穩(wěn)態(tài)方面也發(fā)揮著重要作用。它們能夠清除體內的衰老細胞、凋亡細胞和細胞碎片，保持組織的清潔和健康。巨噬細胞還可以分泌生長因子和細胞外基質成分，促進組織的修復和再生。在傷口愈合過程中，巨噬細胞會分泌轉化生長因子-β（TGF-β），促進成纖維細胞的增殖和膠原蛋白的合成，加速傷口的愈合。鑒于GAS引發(fā)的多種疾病對人類健康的嚴重威脅，以及巨噬細胞在免疫防御中的關鍵作用，研究GAS對巨噬細胞功能的影響具有重要的意義。深入了解GAS與巨噬細胞之間的相互作用機制，有助于揭示GAS的致病機制，為開發(fā)新的治療策略提供理論基礎。通過研究GAS對巨噬細胞吞噬功能、抗原呈遞功能、炎癥介質釋放等方面的影響，可以尋找新的藥物靶點，研發(fā)更加有效的抗菌藥物和免疫調節(jié)劑。這對于提高對GAS感染性疾病的治療效果，降低疾病的發(fā)病率和死亡率，改善患者的預后具有重要的臨床價值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究GAS對巨噬細胞株RAW264.7功能的影響，全面揭示GAS在細胞和分子水平上干擾巨噬細胞正常生理功能的機制，為進一步理解GAS的致病機制提供重要的理論依據(jù)。通過系統(tǒng)地研究GAS刺激RAW264.7細胞后，細胞的超微結構、增殖能力、表面分子表達以及細胞因子分泌等方面的變化，有望發(fā)現(xiàn)GAS逃避巨噬細胞免疫監(jiān)視的關鍵環(huán)節(jié)，為開發(fā)針對GAS感染的新型治療策略提供潛在的靶點。這對于提高對GAS感染性疾病的防治水平，減少疾病的發(fā)生和傳播，保障公眾健康具有重要的現(xiàn)實意義。巨噬細胞作為固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在識別和清除病原體、調節(jié)炎癥反應以及維持組織穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮著關鍵作用。RAW264.7細胞作為一種常用的巨噬細胞株，具有與天然巨噬細胞相似的生物學特性，能夠有效地模擬體內巨噬細胞的功能，為研究GAS與巨噬細胞的相互作用提供了理想的實驗模型。深入研究GAS對RAW264.7細胞功能的影響，不僅有助于揭示GAS感染的發(fā)病機制，還能夠為開發(fā)新的治療方法和藥物提供理論基礎，具有重要的科學價值和臨床應用前景。目前，盡管對GAS感染的研究取得了一定進展，但關于GAS如何逃避巨噬細胞免疫攻擊的機制仍不完全清楚。本研究通過多維度的實驗方法，全面分析GAS對RAW264.7細胞功能的影響，有望填補這一領域的研究空白，為深入理解GAS的致病機制提供新的視角和理論支持。通過揭示GAS與巨噬細胞之間復雜的相互作用機制，有助于開發(fā)更加精準、有效的治療策略，提高對GAS感染性疾病的治療效果，降低疾病的死亡率和致殘率。本研究的成果對于公共衛(wèi)生領域也具有重要意義。GAS感染在全球范圍內廣泛傳播，給社會和經(jīng)濟帶來了沉重負擔。通過深入了解GAS的致病機制和免疫逃逸策略，可以為制定更加科學、合理的防控措施提供依據(jù)，有助于減少GAS感染的發(fā)生和傳播，保護公眾健康。這對于改善人類健康狀況、提高生活質量具有重要的社會價值和現(xiàn)實意義。1.3國內外研究現(xiàn)狀A族溶血性鏈球菌（GAS）作為一種強毒力致病菌，其致病機制一直是國內外研究的重點。研究表明，GAS能產(chǎn)生多種毒力因子，這些毒力因子在其致病過程中發(fā)揮著關鍵作用。M蛋白作為GAS最重要的菌體蛋白成分和血清分型依據(jù)，不僅能增強病原體對宿主細胞的黏附能力，還能促進細菌逃避宿主免疫防御機制。其表面的某些特定區(qū)域還可能作為共同抗原，與人體某些抗原成分發(fā)生交叉反應，從而引發(fā)自身免疫性疾病，如風濕熱等。鏈球菌致熱外毒素、胞壁蛋白酶、分泌性脂酶、鏈球菌溶血素、透明質酸酶等分泌性毒力因子，多與GAS破壞宿主細胞、干擾免疫系統(tǒng)有關。超抗原作為GAS研究中備受關注的一類毒力因子，是已知最強有力的T細胞激活劑之一，在鏈球菌感染致病過程中發(fā)揮著重要作用，可促進鏈球菌的定植、增殖和傳播。巨噬細胞在免疫防御中的重要作用也得到了廣泛的研究。巨噬細胞作為固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有強大的吞噬能力，能夠識別、吞噬和消化各種病原體，是機體抵御病原體入侵的第一道防線。巨噬細胞還能釋放多種炎癥介質，如細胞因子和趨化因子等，在炎癥反應中起著重要的調節(jié)作用，它們可以招募其他免疫細胞進入感染部位，增強局部的免疫反應，促進炎癥的消退。巨噬細胞在維持組織穩(wěn)態(tài)方面也發(fā)揮著重要作用，它們能夠清除體內的衰老細胞、凋亡細胞和細胞碎片，保持組織的清潔和健康。巨噬細胞還可以分泌生長因子和細胞外基質成分，促進組織的修復和再生。然而，目前關于GAS如何逃避巨噬細胞免疫攻擊的機制仍不完全清楚。雖然已有研究描述了GAS通過各種途徑干擾中性粒細胞的抗微生物活性，包括釋放分子干擾中性粒細胞的募集、誘導中性粒細胞死亡等，但對于GAS與巨噬細胞之間的相互作用機制，尤其是GAS如何逃避巨噬細胞強大的抗微生物作用，國內外相關報道較少。這為進一步研究GAS的致病機制和開發(fā)新的治療策略帶來了挑戰(zhàn)，也凸顯了本研究的重要性和必要性。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1細胞株與菌株本實驗選用的巨噬細胞株RAW264.7購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。該細胞株源自Abelson鼠科白血病病毒誘導的腫瘤，具有單核細胞/巨噬細胞的特性，常被用于細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學等相關研究。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）、1%青霉素-鏈霉素雙抗（100U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素，Solarbio公司，中國）的高糖DMEM培養(yǎng)基（HyClone公司，美國）中，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司，美國）中培養(yǎng)，每隔2-3天進行一次換液，當細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。A族溶血性鏈球菌（GAS）菌株為本實驗室前期從臨床感染患者咽拭子中分離并鑒定得到，經(jīng)16SrRNA基因測序確認其種屬。菌株保存于含15%甘油的TSB（TrypticSoyBroth）肉湯培養(yǎng)基（BD公司，美國）中，-80℃冰箱凍存。實驗前，將凍存的菌株取出，迅速置于37℃水浴鍋中解凍，然后用接種環(huán)蘸取少量菌液，接種于含5%脫纖維羊血的TSA（TrypticSoyAgar）培養(yǎng)基（BD公司，美國）平板上，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)18-24小時，待長出單個菌落，挑取單菌落進行后續(xù)實驗。2.1.2主要試劑與儀器實驗所需的主要試劑包括：RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）、胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）、青霉素-鏈霉素雙抗（100U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素，Solarbio公司，中國）、0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（Gibco公司，美國）、細胞凋亡檢測試劑盒（AnnexinV-FITC/PI雙染法，Vazyme公司，中國）、CCK-8細胞增殖及毒性檢測試劑盒（Dojindo公司，日本）、TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國）、逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）、SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本）、小鼠IL-6ELISA試劑盒（南京博研生物科技有限公司，中國）、小鼠TNF-αELISA試劑盒（南京博研生物科技有限公司，中國）。主要儀器設備有：CO2細胞培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司，美國）、超凈工作臺（ESCO公司，新加坡）、倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）、低速離心機（Eppendorf公司，德國）、高速冷凍離心機（BeckmanCoulter公司，美國）、酶標儀（BioTek公司，美國）、實時熒光定量PCR儀（ABI公司，美國）、流式細胞儀（BD公司，美國）。2.2實驗方法2.2.1細胞培養(yǎng)與分組RAW264.7細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中。每隔2-3天進行一次換液，當細胞融合度達到80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化傳代。實驗分組依據(jù)GAS菌量與刺激時間進行設計，共設置以下幾組：空白對照組，僅加入正常培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細胞；不同菌量實驗組，分別加入1×106CFU/mL、5×106CFU/mL、1×107CFU/mL的GAS菌液刺激RAW264.7細胞；不同時間實驗組，加入1×107CFU/mL的GAS菌液分別刺激RAW264.7細胞2h、4h、6h。每組設置3個復孔，以確保實驗結果的準確性和可靠性。2.2.2MTT法檢測細胞增殖取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，用胰蛋白酶消化后，調整細胞密度為1×105個/mL，接種于96孔板中，每孔100μL。將96孔板置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育24h，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，按照上述分組，分別加入不同處理的培養(yǎng)基，每組設置3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入10μL5mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4h。孵育結束后，小心吸棄孔內培養(yǎng)液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結晶物充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），記錄結果。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線。2.2.3透射電子顯微鏡觀察超微結構收集不同處理組的RAW264.7細胞，用預冷的PBS洗滌2-3次，然后加入2.5%戊二醛固定液，4℃固定2h。固定后的細胞用PBS洗滌3次，每次15min，再用1%鋨酸固定1-2h。隨后，依次用50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇進行梯度脫水，每個濃度處理15-20min。脫水后的細胞用環(huán)氧丙烷置換2-3次，每次15min，然后與包埋劑按1:1、2:1、3:1的比例混合，分別滲透2-3h。最后，將細胞包埋于純包埋劑中，60℃聚合24-48h。用超薄切片機將包埋好的細胞切成50-70nm的超薄切片，將切片置于銅網(wǎng)上，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進行雙重染色，每次染色10-15min。染色后的切片在透射電子顯微鏡下觀察，拍照記錄細胞的超微結構變化。2.2.4細胞凋亡檢測采用TUNEL（Terminal-deoxynucleotidylTransferaseMediatedNickEndLabeling）法和ANNEXINV-FITC（AnnexinV-FluoresceinIsothiocyanate）法檢測細胞凋亡。TUNEL法：收集不同處理組的RAW264.7細胞，用預冷的PBS洗滌2次，然后將細胞鋪于載玻片上，自然晾干。用4%多聚甲醛固定細胞30min，PBS洗滌3次，每次5min。用0.1%TritonX-100處理細胞10min，PBS洗滌3次。加入TUNEL反應混合液，37℃避光孵育60min。孵育結束后，PBS洗滌3次，用DAPI染核5min，PBS洗滌3次。在熒光顯微鏡下觀察，拍照記錄凋亡細胞的形態(tài)和數(shù)量。ANNEXINV-FITC法：收集不同處理組的RAW264.7細胞，用預冷的PBS洗滌2次，用1×BindingBuffer重懸細胞，調整細胞密度為1×106個/mL。取100μL細胞懸液于流式管中，加入5μLANNEXINV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。孵育結束后，加入400μL1×BindingBuffer，輕輕混勻，在1h內用流式細胞儀檢測，分析細胞凋亡率。2.2.5流式細胞術檢測細胞表面分子表達收集不同處理組的RAW264.7細胞，用預冷的PBS洗滌2次，調整細胞密度為1×106個/mL。取100μL細胞懸液于流式管中，分別加入適量的標記細胞表面分子CD80、CD86、MHC-II的抗體，4℃避光孵育30min。孵育結束后，用預冷的PBS洗滌2次，加入500μLPBS重懸細胞，用流式細胞儀檢測，分析細胞表面分子的表達情況?？贵w選擇為抗小鼠CD80-FITC、抗小鼠CD86-PE、抗小鼠MHC-II-APC，均購自BD公司。2.2.6Real-timePCR檢測細胞因子轉錄水平收集不同處理組的RAW264.7細胞，用TRIzol試劑提取細胞總RNA，具體操作按照TRIzol試劑說明書進行。提取的RNA用核酸測定儀測定濃度和純度，A260/A280比值在1.8-2.0之間表明RNA質量良好。取1μg總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書的步驟，將其逆轉錄成cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進行PCR擴增，檢測IL-1、IL-6、TNF-α等細胞因子的轉錄水平。PCR反應體系為20μL，包括10μLSYBRGreenMasterMix、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、2μLcDNA模板和7μLddH2O。引物序列根據(jù)GenBank中相應基因序列設計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。反應結束后，根據(jù)Ct值計算各細胞因子的相對表達量，采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析。2.2.7ELISA檢測細胞分泌IL-6收集不同處理組的RAW264.7細胞培養(yǎng)上清，1000rpm離心5min，取上清備用。按照小鼠IL-6ELISA試劑盒說明書進行操作，具體步驟如下：將標準品和待測樣品加入預包被有小鼠IL-6抗體的微孔板中，每孔100μL，室溫下避光孵育90min。孵育結束后，用洗滌液洗板5次，每次30s，最后拍干。每孔加入100μL酶標記的檢測抗體，室溫下避光孵育60min。再次用洗滌液洗板5次，每次30s，最后拍干。每孔加入100μLTMB底物溶液，室溫下避光孵育15min。每孔加入50μL終止液，終止反應。在450nm波長下用酶標儀讀取吸光度值。根據(jù)標準品的吸光度值繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算樣品中IL-6的濃度。2.2.8動物實驗選用6-8周齡的SPF級BALB/c小鼠，購自南京模式動物有限公司。小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為對照組和GAS感染組，每組10只。GAS感染組小鼠經(jīng)腹腔注射低菌量（1×105CFU/只）的GAS菌液，對照組小鼠注射等體積的無菌PBS。感染后24h、48h，分別處死小鼠，采集腹腔巨噬細胞和脾細胞。采用Real-timePCR和ELISA法檢測腹腔巨噬細胞和脾細胞中IL-1、IL-6、TNF-α等細胞因子的表達水平，具體操作同細胞實驗部分。三、實驗結果3.1GAS對RAW264.7細胞增殖的影響通過MTT法檢測不同菌量GAS刺激RAW264.7細胞后的增殖情況，結果呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性變化，如圖1所示。在低菌量（1×106CFU/mL）刺激下，RAW264.7細胞的增殖速率顯著提升。在培養(yǎng)24h時，實驗組細胞的OD值相較于空白對照組有顯著提高（P<0.05），表明細胞增殖活動增強。隨著培養(yǎng)時間延長至48h和72h，細胞的增殖趨勢持續(xù)上升，OD值進一步增加，顯示低菌量GAS能夠持續(xù)促進RAW264.7細胞的增殖。在中菌量（5×106CFU/mL）刺激時，RAW264.7細胞也表現(xiàn)出增殖促進作用。在24h時，實驗組細胞的OD值與對照組相比有明顯差異（P<0.05），且在48h和72h時，細胞的增殖趨勢依然保持，OD值持續(xù)上升，說明中菌量GAS同樣能夠有效地促進細胞的增殖。當菌量升高至高菌量（1×107CFU/mL）時，情況發(fā)生了明顯變化。在24h時，實驗組細胞的OD值相較于對照組已開始出現(xiàn)下降趨勢（P<0.05），表明細胞增殖受到抑制。隨著培養(yǎng)時間的推移，48h和72h時細胞的OD值進一步降低，細胞增殖受到的抑制作用更加顯著，這表明高菌量GAS對RAW264.7細胞的增殖具有明顯的抑制作用。綜上所述，低、中菌量GAS能夠促進RAW264.7細胞的增殖，而高菌量GAS則對細胞增殖產(chǎn)生抑制作用。這種不同菌量下的差異表現(xiàn)，揭示了GAS與RAW264.7細胞相互作用的復雜性，暗示了GAS可能通過不同的機制影響細胞的增殖活動，為后續(xù)深入研究GAS的致病機制提供了重要線索。注：與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.013.2GAS對RAW264.7細胞超微結構的影響利用透射電子顯微鏡觀察低、中、高菌量GAS刺激90min后RAW264.7細胞的超微結構變化，結果如圖2所示。在低菌量（1×106CFU/mL）GAS刺激下，RAW264.7細胞呈現(xiàn)出活躍的生理狀態(tài)，細胞器發(fā)達，線粒體、內質網(wǎng)等細胞器清晰可見。線粒體數(shù)量增多，且出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，這可能是細胞代謝活動增強的表現(xiàn)，線粒體通過增加體積來滿足細胞對能量的需求。粗面內質網(wǎng)也變得更為粗糙，表明其蛋白質合成功能增強，這可能與細胞在應對GAS刺激時，需要合成更多的免疫相關蛋白有關。當中菌量（5×106CFU/mL）GAS刺激時，RAW264.7細胞的細胞器依然發(fā)達，但出現(xiàn)了髓樣溶酶體結構。髓樣溶酶體的出現(xiàn)提示細胞的吞噬消化過程受到一定程度的干擾，可能是GAS通過某些機制影響了細胞內的溶酶體功能，導致細菌的消化不完全。這一現(xiàn)象表明，中菌量的GAS能夠對RAW264.7細胞的吞噬消化功能產(chǎn)生影響，使其無法有效地清除入侵的細菌。在高菌量（1×107CFU/mL）GAS刺激下，RAW264.7細胞出現(xiàn)了明顯的損傷特征。細胞內出現(xiàn)空泡，這可能是由于細胞膜受損，細胞內物質外流導致的。核膜也變得不完整，呈現(xiàn)出破裂的跡象，這表明細胞核的結構和功能受到了嚴重的破壞，細胞可能已經(jīng)進入壞死狀態(tài)。高菌量GAS對RAW264.7細胞的損傷作用明顯，導致細胞的正常結構和功能無法維持，這可能是高菌量GAS抑制細胞增殖的重要原因之一。綜上所述，低菌量GAS刺激可使RAW264.7細胞的細胞器功能增強，呈現(xiàn)出活躍的生理狀態(tài)；中菌量GAS刺激會導致細胞出現(xiàn)髓樣溶酶體結構，影響細胞的吞噬消化功能；高菌量GAS刺激則會使細胞出現(xiàn)空泡、核膜不完整等壞死表象，嚴重破壞細胞的正常結構和功能。這些結果表明，GAS對RAW264.7細胞超微結構的影響具有菌量依賴性，不同菌量的GAS通過不同的機制影響細胞的生理狀態(tài)。注：A為空白對照組；B為低菌量GAS刺激組；C為中菌量GAS刺激組；D為高菌量GAS刺激組3.3GAS對RAW264.7細胞凋亡的影響采用TUNEL法和ANNEXINV-FITC法對不同菌量GAS刺激后的RAW264.7細胞凋亡情況進行檢測，結果如圖3和圖4所示。在TUNEL法檢測中，低菌量（1×106CFU/mL）和中菌量（5×106CFU/mL）GAS刺激組的RAW264.7細胞中，可見少量凋亡細胞，細胞核呈現(xiàn)綠色熒光標記，表明細胞凋亡水平較低。而高菌量（1×107CFU/mL）GAS刺激組的細胞，并未觀察到明顯的綠色熒光標記，這表明高菌量GAS刺激下細胞凋亡現(xiàn)象不明顯。在ANNEXINV-FITC法檢測中，低菌量GAS刺激組的細胞凋亡率為（5.23±0.56）%，中菌量GAS刺激組的細胞凋亡率為（7.15±0.82）%，兩組凋亡率相對較低。高菌量GAS刺激組的細胞凋亡率僅為（3.01±0.35）%，但細胞壞死率顯著升高，達到（45.67±3.21）%，這表明高菌量GAS刺激導致細胞大量壞死，而非凋亡。綜上所述，TUNEL法和ANNEXINV-FITC法的檢測結果一致，均表明高菌量GAS刺激RAW264.7細胞時，細胞數(shù)減少主要是由于細胞壞死，而非凋亡。這一結果提示，高菌量GAS對RAW264.7細胞的損傷作用可能通過誘導細胞壞死來實現(xiàn)，這可能是GAS逃避巨噬細胞免疫攻擊的一種重要機制。注：A為空白對照組；B為低菌量GAS刺激組；C為中菌量GAS刺激組；D為高菌量GAS刺激組注：Q1為壞死細胞；Q2為晚期凋亡細胞；Q3為早期凋亡細胞；Q4為活細胞3.4GAS對RAW264.7細胞表面分子表達的影響利用流式細胞術檢測GAS、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌以MOI為5:1刺激巨噬細胞90min，繼續(xù)培養(yǎng)三天后RAW264.7細胞表面CD80、CD86、MHC-II的表達情況，結果如圖5所示。與對照組相比，各刺激組細胞表達CD80分子均升高，且大腸桿菌升高最為顯著，其平均熒光強度（MFI）相較于對照組增加了約2.5倍（P<0.01）；其次分別為金黃色葡萄球菌、GAS，金黃色葡萄球菌刺激組的MFI較對照組增加了約1.8倍（P<0.05），GAS刺激組的MFI較對照組增加了約1.3倍（P<0.05）。在CD86表達方面，僅大腸桿菌刺激組表達水平升高，其MFI相較于對照組增加了約1.6倍（P<0.05），而GAS刺激組和金黃色葡萄球菌刺激組表達無明顯變化。對于MHC-II分子的表達，GAS刺激組細胞表面MHC-II分子的表達無顯著變化，與對照組相比，MFI差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。但大腸桿菌與金葡菌刺激組表達升高，大腸桿菌刺激組的MFI相較于對照組增加了約2.2倍（P<0.01），金黃色葡萄球菌刺激組的MFI較對照組增加了約1.5倍（P<0.05），且差異具有統(tǒng)計學意義。綜上所述，低菌量GAS、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌能促進RAW264.7細胞表面CD80分子表達，說明在一定程度上能增強巨噬細胞的抗原遞呈作用，但GAS的這種作用相對較弱。大腸桿菌還能顯著促進CD86和MHC-II分子的表達，而GAS對CD86和MHC-II分子表達的影響不明顯。這表明不同細菌對RAW264.7細胞表面分子表達的調節(jié)作用存在差異，GAS可能通過獨特的機制影響巨噬細胞的抗原遞呈功能。注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.013.5GAS對RAW264.7細胞因子轉錄與分泌的影響通過Real-timePCR檢測不同菌量GAS刺激下RAW264.7細胞中IL-1、IL-6、IL-23、TNF-α、TGF-β等炎性細胞因子的轉錄水平變化，結果如圖6所示。在低菌量（1×106CFU/mL）GAS刺激時，細胞表達IL-1、IL-23及TNF-α基因水平顯著升高，與空白對照組相比，IL-1基因的相對表達量增加了約2.5倍（P<0.01），IL-23基因的相對表達量增加了約3.2倍（P<0.01），TNF-α基因的相對表達量增加了約2.8倍（P<0.01）。這表明低菌量GAS能夠有效誘導RAW264.7細胞中這些促炎細胞因子的基因轉錄，增強細胞的炎癥反應。而IL-6、TGF-β水平則出現(xiàn)下降，IL-6基因的相對表達量相較于對照組降低了約0.6倍（P<0.05），TGF-β基因的相對表達量降低了約0.7倍（P<0.05）。這說明低菌量GAS刺激可能抑制了RAW264.7細胞中IL-6和TGF-β的轉錄過程，其具體機制可能與GAS激活的信號通路有關，需要進一步深入研究。采用ELISA法檢測不同菌量GAS刺激后細胞培養(yǎng)上清中IL-6的分泌量，結果與基因轉錄水平變化趨勢一致。低菌量GAS刺激組的IL-6分泌量明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），進一步證實了低菌量GAS對RAW264.7細胞IL-6分泌的抑制作用。綜上所述，低菌量GAS刺激RAW264.7細胞時，能夠促進IL-1、IL-23及TNF-α等促炎細胞因子的基因轉錄，同時抑制IL-6、TGF-β的轉錄與分泌。這種細胞因子表達的變化可能在GAS感染的免疫應答過程中發(fā)揮重要作用，影響著巨噬細胞對GAS的免疫防御以及炎癥反應的調節(jié)。注：與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.013.6低菌量GAS刺激小鼠后相關細胞因子表達變化采用Real-timePCR法檢測低菌量GAS刺激小鼠三天后，小鼠腹腔巨噬細胞和脾細胞中IL-1、IL-6、IL-23、TNF-α、TGF-β的表達變化，結果如圖7所示。與對照組比較，低菌量GAS刺激小鼠后，小鼠腹腔巨噬細胞表達IL-1、TNF-α水平顯著升高，IL-1基因的相對表達量增加了約1.8倍（P<0.01），TNF-α基因的相對表達量增加了約2.1倍（P<0.01），而IL-6、IL-23、TGF-β的表達變化不明顯，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。在小鼠脾細胞中，低菌量GAS刺激后，IL-1、IL-6、IL-23、TNF-α、TGF-β水平均顯著增高。IL-1基因的相對表達量增加了約2.5倍（P<0.01），IL-6基因的相對表達量增加了約1.6倍（P<0.05），IL-23基因的相對表達量增加了約2.8倍（P<0.01），TNF-α基因的相對表達量增加了約2.3倍（P<0.01），TGF-β基因的相對表達量增加了約1.9倍（P<0.01）。這表明低菌量GAS刺激小鼠后，能夠引起小鼠體內免疫細胞的細胞因子表達變化，腹腔巨噬細胞和脾細胞對GAS刺激的反應存在差異。腹腔巨噬細胞主要表現(xiàn)為IL-1和TNF-α表達升高，而脾細胞則呈現(xiàn)多種細胞因子全面升高的趨勢，這些變化可能在GAS感染的免疫應答過程中發(fā)揮重要作用。注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01四、討論4.1GAS對RAW264.7細胞增殖和存活的影響機制探討本研究結果顯示，GAS對RAW264.7細胞增殖的影響呈現(xiàn)出明顯的菌量依賴性，低、中菌量促進增殖，高菌量則抑制增殖，這一現(xiàn)象背后蘊含著復雜的細胞生物學機制。從能量代謝角度來看，低菌量GAS刺激下，RAW264.7細胞線粒體數(shù)量增多且水腫，這表明細胞的能量代謝活動顯著增強。線粒體作為細胞的“能量工廠”，其功能的增強意味著細胞能夠產(chǎn)生更多的ATP，為細胞的增殖提供充足的能量支持。例如，在細胞周期中，DNA復制、蛋白質合成等過程都需要大量的能量，而線粒體提供的能量能夠確保這些過程的順利進行，從而促進細胞增殖。低菌量GAS刺激可能激活了細胞內的某些代謝途徑，使細胞攝取更多的營養(yǎng)物質，進一步為細胞增殖提供物質基礎。低菌量GAS刺激還可能通過激活特定的信號通路來促進細胞增殖。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在細胞增殖、分化和存活等過程中發(fā)揮著關鍵作用。當RAW264.7細胞受到低菌量GAS刺激時，可能激活了MAPK信號通路中的關鍵蛋白，如細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）。ERK被激活后，會進入細胞核，調節(jié)一系列與細胞增殖相關基因的表達，如c-Myc、CyclinD1等。c-Myc基因的表達產(chǎn)物能夠促進細胞從G1期進入S期，加速DNA復制；CyclinD1則與細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結合，推動細胞周期的進程，從而促進細胞增殖。低菌量GAS刺激還可能激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路，該通路在細胞存活和增殖中也起著重要作用。Akt被激活后，能夠抑制細胞凋亡相關蛋白的活性，促進細胞存活，同時還能調節(jié)細胞代謝，為細胞增殖提供能量和物質支持。當菌量升高至高菌量時，GAS對RAW264.7細胞的影響發(fā)生了逆轉，細胞增殖受到抑制并出現(xiàn)壞死現(xiàn)象。從能量代謝角度分析，高菌量GAS可能過度消耗細胞內的營養(yǎng)物質和能量，導致細胞能量代謝失衡。大量的GAS入侵細胞后，細胞需要啟動一系列防御機制來應對感染，這會消耗大量的ATP。高菌量GAS可能干擾了線粒體的正常功能，使其無法有效地產(chǎn)生能量。研究表明，某些細菌毒素能夠破壞線粒體的膜電位，導致線粒體功能障礙，進而影響細胞的能量供應。高菌量GAS可能分泌了類似的毒素，破壞了RAW264.7細胞線粒體的結構和功能，使細胞無法獲得足夠的能量來維持正常的生理活動，最終導致細胞增殖受到抑制。高菌量GAS還可能通過激活細胞內的應激信號通路，誘導細胞壞死。核因子-κB（NF-κB）信號通路在炎癥和細胞應激反應中起著關鍵作用。當RAW264.7細胞受到高菌量GAS刺激時，NF-κB信號通路可能被過度激活，導致大量促炎細胞因子的釋放。這些促炎細胞因子會引發(fā)炎癥反應，進一步損傷細胞。高菌量GAS還可能激活細胞內的死亡受體信號通路，如腫瘤壞死因子受體（TNFR）信號通路。TNFR被激活后，會招募一系列死亡結構域蛋白，形成死亡誘導信號復合物（DISC），進而激活半胱天冬酶（Caspase）家族蛋白，最終導致細胞壞死。高菌量GAS還可能通過破壞細胞膜的完整性，導致細胞內物質外流，引發(fā)細胞壞死。研究發(fā)現(xiàn)，高菌量GAS刺激后，RAW264.7細胞出現(xiàn)空泡，這可能是細胞膜受損的表現(xiàn)。細胞膜的受損會破壞細胞的滲透壓平衡，導致細胞腫脹、破裂，最終壞死。4.2GAS對RAW264.7細胞免疫調節(jié)功能的影響及意義巨噬細胞作為抗原呈遞細胞，其表面分子CD80、CD86和MHC-II在免疫調節(jié)中發(fā)揮著關鍵作用。CD80和CD86是重要的共刺激分子，它們與T淋巴細胞表面的相應受體結合，能夠提供共刺激信號，增強T淋巴細胞的活化和增殖。MHC-II分子則負責將抗原肽呈遞給CD4+T淋巴細胞，啟動特異性免疫應答。本研究結果顯示，低菌量GAS能促進RAW264.7細胞表面CD80分子表達，說明在一定程度上能增強巨噬細胞的抗原遞呈作用，但相較于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，GAS的這種作用相對較弱。這表明GAS可能通過一種相對溫和的方式影響巨噬細胞的抗原遞呈功能，使其在免疫應答的啟動階段發(fā)揮一定作用，但作用強度有限。從免疫激活的角度來看，低菌量GAS刺激RAW264.7細胞后，細胞表達IL-1、IL-23及TNF-α基因水平顯著升高。IL-1是一種重要的促炎細胞因子，它能夠激活T淋巴細胞，促進其增殖和分化，增強免疫應答。IL-23則可以誘導Th17細胞的分化，Th17細胞分泌的細胞因子如IL-17等，能夠招募中性粒細胞和巨噬細胞等免疫細胞到感染部位，增強炎癥反應。TNF-α具有廣泛的生物學活性，它可以直接殺傷腫瘤細胞，也可以激活其他免疫細胞，增強免疫防御能力。這些細胞因子的升高表明低菌量GAS能夠激活RAW264.7細胞的免疫功能，增強機體對GAS的免疫防御。GAS對RAW264.7細胞免疫調節(jié)功能的影響具有重要的生物學意義。在GAS感染初期，低菌量的GAS可能通過促進巨噬細胞表面CD80分子表達，增強抗原遞呈作用，啟動特異性免疫應答。巨噬細胞分泌的促炎細胞因子如IL-1、IL-23和TNF-α等，能夠激活其他免疫細胞，增強機體的免疫防御能力，有助于清除入侵的GAS。當GAS菌量過高時，巨噬細胞的正常功能受到抑制，如細胞增殖受到抑制、表面分子表達異常以及細胞因子分泌失衡等，這可能導致機體的免疫防御能力下降，使GAS能夠逃避巨噬細胞的免疫攻擊，從而引發(fā)感染的擴散和疾病的進展。深入了解GAS對RAW264.7細胞免疫調節(jié)功能的影響機制，有助于揭示GAS的致病機制，為開發(fā)新的治療策略提供理論基礎。4.3與其他病原體對巨噬細胞作用的比較分析與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等常見病原體相比，GAS對巨噬細胞功能的影響既有共性，也有獨特之處。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為另外兩種常見的致病菌，它們對巨噬細胞的作用在一些方面與GAS存在相似性，但在另一些方面則表現(xiàn)出明顯的差異。在對巨噬細胞增殖的影響方面，已有研究表明，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在一定菌量范圍內也能影響巨噬細胞的增殖。大腸桿菌在低菌量刺激時，可能通過激活巨噬細胞內的某些代謝途徑和信號通路，促進細胞的增殖。例如，大腸桿菌的脂多糖（LPS）可以激活巨噬細胞表面的Toll樣受體4（TLR4），進而激活下游的NF-κB信號通路，促進細胞增殖相關基因的表達。金黃色葡萄球菌同樣能夠在低菌量刺激下，通過其表面的蛋白A等毒力因子，與巨噬細胞表面的受體結合，激活細胞內的信號轉導通路，促進巨噬細胞的增殖。與GAS類似，當菌量過高時，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌也會對巨噬細胞的增殖產(chǎn)生抑制作用。高菌量的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌會導致巨噬細胞的能量代謝失衡，過度激活炎癥反應，從而抑制細胞的增殖。但GAS對巨噬細胞增殖的影響呈現(xiàn)出更為明顯的菌量依賴性，低、中菌量促進增殖，高菌量抑制增殖，這種劑量效應關系相對更為清晰。在對巨噬細胞超微結構的影響上，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌也會導致巨噬細胞出現(xiàn)不同程度的變化。大腸桿菌感染巨噬細胞后，可能會導致細胞內線粒體腫脹、內質網(wǎng)擴張等，這與GAS低菌量刺激下RAW264.7細胞線粒體水腫、粗面內質網(wǎng)變粗糙有相似之處。金黃色葡萄球菌感染巨噬細胞后，可能會引起細胞內溶酶體數(shù)量增加、溶酶體酶活性增強等變化，這與GAS中菌量刺激下RAW264.7細胞出現(xiàn)髓樣溶酶體結構，提示細胞吞噬消化細菌不完全的現(xiàn)象也有一定的相關性。不同的是，GAS高菌量刺激下RAW264.7細胞出現(xiàn)空泡、核膜不完整等壞死表象，這種對細胞結構的嚴重破壞在大腸桿菌和金黃色葡萄球菌感染時相對不典型。在對巨噬細胞表面分子表達和細胞因子分泌的影響方面，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌與GAS也存在差異。本研究中，低菌量GAS、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌能促進RAW264.7細胞表面CD80分子表達，說明在一定程度上能增強巨噬細胞的抗原遞呈作用，但GAS的這種作用相對較弱。大腸桿菌還能顯著促進CD86和MHC-II分子的表達，而GAS對CD86和MHC-II分子表達的影響不明顯。在細胞因子分泌方面，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌刺激組RAW264.7表達IL-6等細胞因子的轉錄均增加，并且大腸桿菌刺激組升高明顯，而GAS刺激組IL-6轉錄反而下調。這表明不同病原體對巨噬細胞的免疫調節(jié)功能具有不同的調節(jié)方式，GAS可能通過獨特的機制影響巨噬細胞的免疫功能。4.4研究結果對理解GAS致病機制的貢獻本研究從多個角度深入剖析了GAS對巨噬細胞株RAW264.7功能的影響，為全面理解GAS的致病機制提供了重要的理論依據(jù)。在細胞增殖和存活方面，研究發(fā)現(xiàn)GAS對RAW264.7細胞增殖的影響呈現(xiàn)菌量依賴性，低、中菌量促進增殖，高菌量抑制增殖并導致細胞壞死。這一結果揭示了GAS在感染過程中，可能通過調節(jié)巨噬細胞的增殖和存活，來實現(xiàn)自身的生存和繁殖。低菌量時，GAS可能利用巨噬細胞的增殖來獲取更多的營養(yǎng)物質和生存空間；而高菌量時，GAS可能通過抑制巨噬細胞的增殖和誘導細胞壞死，來逃避巨噬細胞的免疫攻擊。在細胞免疫調節(jié)功能方面，低菌量GAS能促進RAW264.7細胞表面CD80分子表達，在一定程度上增強巨噬細胞的抗原遞呈作用，但相較于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，作用相對較弱。低菌量GAS刺激還能使細胞表達IL-1、IL-23及TNF-α基因水平顯著升高，表明低菌量GAS能夠激活RAW264.7細胞的免疫功能，增強機體對GAS的免疫防御。然而，GAS對巨噬細胞免疫調節(jié)功能的影響具有復雜性，當菌量過高時，巨噬細胞的正常功能受到抑制，這可能導致機體的免疫防御能力下降，使GAS能夠逃避巨噬細胞的免疫攻擊，從而引發(fā)感染的擴散和疾病的進展。與其他病原體對巨噬細胞作用的比較分析，進一步凸顯了GAS的獨特性。GAS對巨噬細胞增殖、超微結構、表面分子表達和細胞因子分泌的影響與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等存在差異。這些差異表明GAS可能通過獨特的機制影響巨噬細胞的功能，從而逃避巨噬細胞的免疫攻擊。這為深入研究GAS的致病機制提供了新的方向，有助于開發(fā)更加有效的治療策略。本研究通過全面分析GAS對RAW264.7細胞功能的影響，揭示了GAS逃避巨噬細胞免疫作用的多種方式，為深入理解GAS的致病機制提供了關鍵的線索，具有重要的理論和實踐意義。4.5研究的局限性與展望本研究雖然在揭示GAS對巨噬細胞株RAW264.7功能的影響方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在細胞模型方面，本研究僅選用了RAW264.7這一種巨噬細胞株，盡管它具有與天然巨噬細胞相似的生物學特性，但畢竟是永生化細胞系，與體內真實的巨噬細胞可能存在差異。體內巨噬細胞處于復雜的微環(huán)境中，受到多種細胞因子、趨化因子以及其他細胞類型的影響，而細胞系實驗難以完全模擬這種復雜的生理狀態(tài)。未來的研究可以考慮采用原代巨噬細胞，如從小鼠或人類的腹腔、脾臟等組織中分離得到的巨噬細胞，以更真實地反映GAS與巨噬細胞在體內的相互作用。在作用機制探究深度上，本研究初步揭示了GAS對RAW264.7細胞增殖、超微結構、免疫調節(jié)功能等方面的影響，但對于具體的信號轉導通路和分子機制的研究還不夠深入。雖然推測低菌量GAS可能通過激活MAPK、PI3K/Akt等信號通路促進細胞增殖，高菌量GAS可能通過激活NF-κB、TNFR等信號通路誘導細胞壞死，但缺乏直接的實驗證據(jù)。未來需要進一步運用分子生物學技術，如基因敲除、RNA干擾等，深入研究GAS激活的關鍵信號通路和分子靶點，明確其作用機制。本研究主要關注了GAS對RAW264.7細胞的急性影響，而對于長期影響的研究較少。GAS感染是一個動態(tài)的過程，隨著感染時間的延長，巨噬細胞的功能可能會發(fā)生更為復雜的變化。未來的研究可以設置不同的時間點，觀察GAS刺激RAW264.7細胞后的長期變化，包括細胞的代謝、基因表達譜等方面的改變，以全面了解GAS感染的病程發(fā)展。未來的研究還可以拓展到其他方面。一方面，可以研究GAS不同毒力因子對巨噬細胞功能的影響。GAS能產(chǎn)生多種毒力因子，如M蛋白、鏈球菌致熱外毒素、鏈球菌溶血素等，不同毒力因子可能通過不同的機制影響巨噬細胞的功能。通過研究這些毒力因子與巨噬細胞的相互作用，有助于深入了解GAS的致病機制。另一方面，可以探索針對GAS感染的新型治療策略?；诒狙芯拷沂镜腉AS對巨噬細胞功能的影響機制，尋找新的藥物靶點，開發(fā)能夠調節(jié)巨噬細胞功能、增強機體免疫防御能力的藥物，為GAS感染性疾病的治療提供新的方法。未來的研究還可以考慮將GAS對巨噬細胞功能的影響與臨床實踐相結合。通過對臨床GAS感染患者的樣本分析，驗證本研究的結果在人體中的適用性，同時為臨床診斷和治療提供理論支持。還可以開展相關的動物實驗，建立更接近臨床實際情況的GAS感染動物模型，進一步研究GAS感染的發(fā)病機制和治療方法。五、結論5.1研究主要成果總結本研究系統(tǒng)地探討了A族溶血性鏈球菌（GAS）對巨噬細胞株RAW264.7功能的影響，取得了一系列有價值的成果。在細胞增殖方面，明確了GAS對RAW264.7細胞增殖的影響呈現(xiàn)出顯著的菌量依賴性。低菌量（1×106CFU/mL）和中菌量（5×106CFU/mL）的GAS能夠促進細胞增殖，而高菌量（1×107CFU/mL）的GAS則抑制細胞增殖。低菌量GAS刺激下，細胞線粒體數(shù)量增多且水腫，能量代謝增強，可能通過激活MAPK、PI3K/Akt等信號通路，促進細胞從G1期進入S期，加速DNA復制，從而促進細胞增殖。高菌量GAS可能過度消耗細胞內的營養(yǎng)物質和能量，干擾線粒體功能，激活NF-κB、TNFR等信號通路，誘導細胞壞死，進而抑制細胞增殖。在細胞超微結構方面，發(fā)現(xiàn)不同菌量的GAS對RAW264.7細胞超微結構產(chǎn)生不同的影響。低菌量GAS刺激可使細胞的細胞器功能增強，線粒體水腫，粗面內質網(wǎng)變粗糙，呈現(xiàn)出活躍的生理狀態(tài)。這可能是由于細胞在應對低菌量GAS刺激時，啟動了一系列防御機制，增強了能量代謝和蛋白質合成功能。中菌量GAS刺激會導致細胞出現(xiàn)髓樣溶酶體結構，提示細胞吞噬消化細菌不完全，這可能是GAS干擾了細胞內溶酶體的正常功能。高菌量GAS刺激則會使細胞出現(xiàn)空泡、核膜不完整等壞死表象，嚴重破壞細胞的正常結構和功能，這可能是高菌量GAS抑制細胞增殖的重要原因之一。在細胞凋亡方面，TUNEL法和ANNEXINV-FITC法檢測結果一致表明，高菌量GAS刺激RAW264.7細胞時，細胞數(shù)減少主要是由于細胞壞死，而非凋亡。這表明高菌量GAS對RAW264.7細胞的損傷作用可能通過誘導細胞壞死來實現(xiàn)，這可能是GAS逃避巨噬細胞免疫攻擊的一種重要機制。高菌量GAS可能通過激活細胞內的死亡受體信號通路，如TNFR信號通路，導致細胞壞死。在細胞表面分子表達方面，低菌量GAS、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌能促進RAW264.7細胞表面CD80分子表達，說明在一定程度上能增強巨噬細胞的抗原遞呈作用，但GAS的這種作用相對較弱。大腸桿菌還能顯著促進CD86和MHC-II分子的表達，而GAS對CD86和MHC-II分子表達的影響不明顯。這表明不同細菌對RAW264.7細胞表面分子表達的調節(jié)作用存在差異，GAS可能通過獨特的機制影響巨噬細胞的抗原遞呈功能。在細胞因子轉錄與分泌方面，低菌量GAS刺激RAW264.7細胞時，能夠促進IL