(12)發(fā)明專利(10)授權(quán)公告號CN116328042B(65)同一申請的已公布的文獻號(43)申請公布日2023.06.27(73)專利權(quán)人上海大學地址200444上海市寶山區(qū)上大路99號(72)發(fā)明人張海光胡鑫立胡慶夕(74)專利代理機構(gòu)武漢同譽知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司42320專利代理師萬娟A61L27/22(2006.01)A61L27/50(2006.01)A61L27/52(2006.01)A61L27/54(2006.01)B33Y70/10(2020.01)(56)對比文件(54)發(fā)明名稱一種組織工程水凝膠支架及其制備方法和本發(fā)明屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種組織工程水凝膠支架及其制備方法和應(yīng)用。所述組織工程水凝膠支架包括含有骨髓間充質(zhì)干細胞和內(nèi)皮細胞的膠原蛋白微球和由甲基丙烯?；髂z交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)和纖維蛋白形成的水凝膠，所述膠原蛋白微球分散在所述水凝膠中，其中，所述甲基丙烯?；髂z交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中甲基丙烯酰化明膠和所述纖維蛋白的質(zhì)量比為3-8:1。本發(fā)明的組織工程水凝膠支架力學性能好，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，適用于3D打印技術(shù)領(lǐng)域以制備復雜結(jié)構(gòu)的組織功能支架，且能保證負載的種子細胞(BMSCs和組織工程水凝膠支架材料▲FIBHUVECBMSCs載多細胞微球GeMA-LAP光交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)21.一種組織工程水凝膠支架，其特征在于，包括含有骨髓間充質(zhì)干細胞和內(nèi)皮細胞的膠原蛋白微球和由甲基丙烯?；髂z交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)和纖維蛋白形成的水凝膠，所述膠原蛋白微球分散在所述水凝膠中，其中，所述甲基丙烯?；髂z交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中甲基丙烯?；髂z和所述纖維蛋白的質(zhì)量比為5:1;組織工程水凝膠支架的制備方法，包括以下步驟：S1、將含有骨髓間充質(zhì)干細胞和內(nèi)皮細胞的細胞懸液加入到膠原蛋白溶液中，得到微球前體溶液，通過微流控技術(shù)，采用油包水結(jié)構(gòu)制備膠原蛋白液滴，將所述膠原蛋白液滴固S2、將所述膠原蛋白微球置于雜交生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到細胞活性良好的膠原蛋白微球溶液；S3、將甲基丙烯?；髂z溶液和纖維蛋白溶液混合，所述甲基丙烯酰化明膠和所述纖維蛋白的質(zhì)量比為5:1,再加入引發(fā)劑，得到水凝膠前聚體溶液；S4、將所述膠原蛋白微球溶液和所述水凝膠前聚體溶液混合，得到生物墨水，將所述生物墨水置于10-18℃下預(yù)冷15-20min,使其從液態(tài)變?yōu)槟z態(tài)；S5、將凝膠態(tài)生物墨水注入裝有點膠針頭的生物3D打印機供料裝置中，利用直寫打印工藝，打印成型為纖維絲，所述纖維絲橫截面每平方毫米含有3-12個膠原蛋白微球，之后紫外光下固化，得到組織工程水凝膠支架；步驟S1中，所述微球前體溶液中細胞濃度為4×10?-8×10?個/mL,且所述內(nèi)皮細胞和所述骨髓間充質(zhì)干細胞的濃度比為1:1-5,所述膠原蛋白濃度為8-11mg/mL;通過微流控技術(shù)，采用油包水結(jié)構(gòu)制備膠原蛋白液滴時，以所述微球前體溶液為分散相，無菌礦物油為連續(xù)相，所述分散相的泵入流速為5-30μL/min,所述連續(xù)相的泵入流速為2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程水凝膠支架，其特征在于，所述膠原蛋白為I型膠原蛋白；所述甲基丙烯酰化明膠交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)為甲基丙烯?；髂z光交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，由甲基丙烯?；髂z在光引發(fā)劑的作用下交聯(lián)聚合而成。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程水凝膠支架，其特征在于，步驟S4中，將所述膠原蛋白微球溶液和所述水凝膠前聚體溶液按體積比4:1混合，得到所述生物墨水。4.如權(quán)利要求1-3任一項所述的組織工程水凝膠支架在制備組織工程支架中的應(yīng)用。3一種組織工程水凝膠支架及其制備方法和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明涉及組織工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種組織工程水凝膠支架及其制備方法和應(yīng)用。背景技術(shù)[0002]骨組織在人體中起著至關(guān)重要的作用，例如保護各種器官，維持造血，儲存礦物老相關(guān)的疾病等均可造成骨缺損。近年來，骨缺損的發(fā)病率逐年增加，由于缺乏血管和神經(jīng)，骨損傷一旦發(fā)生，其自我修復能力十分有限，這就需要外科骨移植來恢復其結(jié)構(gòu)完整性和功能性。臨床上自體骨移植和同種異體骨移植等手術(shù)方法是治療嚴重骨缺損的主要方法，臨床最常用有自體骨移植、同種異體骨移植等手術(shù)方法，然而經(jīng)過大量的臨床驗證，前述方法存在諸多弊端，如：有限的可用性、供體部位的發(fā)病率和疼痛、高失敗率和疾病傳播的風險等等。[0003]伴隨著組織工程學科的發(fā)展，結(jié)合細胞、生物相容性支架和生長因子的組織工程策略構(gòu)建的骨組織工程移植技術(shù)具有獨特的優(yōu)勢，其原理是將生物相容性好、有骨傳導能力并在體內(nèi)可生物降解的支架與具有誘骨活性的自體治療性細胞(如骨髓間充質(zhì)干細胞)和/或細胞因子有機結(jié)合，構(gòu)建有生命的骨組織工程移植物，植入缺損部位，其具有骨傳導和誘導的雙重特性，更加有利于修復缺損的骨組織，而且在迅速成骨的同時植入的支架材料逐漸降解，最終被人體代謝吸收。因此，基于骨組織工程移植技術(shù)的治療策略方案為骨缺損的修復提供了全新的思路和方法。骨組織工程移植技術(shù)主要研究支架材料、種子細胞和細胞因子。其中，支架材料作為骨組織再生的框架，其特性直接影響種子細胞的生物學特架材料的設(shè)計與開發(fā)已經(jīng)成為骨損傷修復的研究熱點。常用的金屬、陶瓷等骨損傷修復材料的力學性能與人體骨相差甚遠，植入后容易造成應(yīng)力屏蔽，導致周圍骨組織松動，還容易產(chǎn)生排異反應(yīng)。水凝膠是以水為分散介質(zhì)，親水性而又不溶于水的且能夠吸收大量水分、具有交聯(lián)結(jié)構(gòu)的高分子聚合物材料，具有良好的水滲透性和生物相容性，在體內(nèi)外可重現(xiàn)天然組織微環(huán)境，可以維持良好的細胞活力并促進細胞增殖、遷移與分化，作為移植物可以減少不良反應(yīng)，因而在生物醫(yī)學中受到越來越多的關(guān)注。[0004]隨著3D打印技術(shù)的快速發(fā)展，利用3D打印技術(shù)構(gòu)建精準的三維立體結(jié)構(gòu)的水凝膠支架更能模擬人體的骨組織結(jié)構(gòu)，為水凝膠應(yīng)用于骨組織工程移植物提供了強有力的支持。目前開發(fā)用于3D打印的水凝膠支架材料各有優(yōu)缺點，如天然膠原和纖維蛋白水凝膠組織相容性較好，但機械性能差，抗壓強度一般低于1.6MPa;可降解的聚乳酸等合成材料力學性能可控，但組織相容性差。此外，骨組織工程移植支架打印通常采用先打印后交聯(lián)的方法，一方面，力學性能差將導致交聯(lián)之前支架結(jié)構(gòu)容易塌陷，降低支架的保真度，另一方面交聯(lián)過程會影響負載在水凝膠支架中的種子細胞的活性，且因受到打印過程中的剪切力對細胞的損傷，負載在水凝膠支架中的種子細胞在交聯(lián)之后的存活率一般為40%左右，大大4降低了成骨效果和修復功能。因此，研發(fā)一種用于骨損傷修復的生物相容性好、力學性能優(yōu)異、細胞存活率高的水凝膠支架材料具有重要意義。發(fā)明內(nèi)容[0005]針對以上現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明提供了一種組織工程水凝膠支架及其制備方法，并提供了該組織工程水凝膠支架在組織工程支架尤其是骨組織工程移植支架中領(lǐng)域的應(yīng)用，以解決或至少緩解現(xiàn)有技術(shù)中的部分或全部技術(shù)問題。[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：[0007]本發(fā)明第一方面提供了一種組織工程水凝膠支架，包括含有骨髓間充質(zhì)干細胞和內(nèi)皮細胞的膠原蛋白微球和由甲基丙烯?；髂z交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)和纖維蛋白形成的水凝膠，所述膠原蛋白微球分散在所述水凝膠中，其中，所述甲基丙烯?；髂z交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中甲基丙烯?；髂z和所述纖維蛋白的質(zhì)量比為3-8:1。[0008]進一步地，所述甲基丙烯?；髂z交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中甲基丙烯酰化明膠和所述纖維蛋白的質(zhì)量比為5:1。[0009]進一步地，所述組織工程水凝膠支架的橫截面每平方毫米含有3-12個所述膠原蛋[0010]進一步地，所述膠原蛋白微球內(nèi)部含有細胞懸液，所述細胞懸液的細胞濃度為4×[0011]更進一步地，所述細胞懸液中所述內(nèi)皮細胞和所述骨髓間充質(zhì)干細胞的濃度比為[0012]進一步地，所述膠原蛋白為I型膠原蛋白。[0013]進一步地，所述甲基丙烯?；髂z交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)為甲基丙烯酰化明膠光交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。[0014]更進一步地，所述甲基丙烯?；髂z光交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)由甲基丙烯?；髂z在光引發(fā)劑的作用下交聯(lián)聚合而成。[0015]本發(fā)明第二方面提供了如上所述的組織工程水凝膠支架的制備方法，包括以下步[0016]S1、將含有骨髓間充質(zhì)干細胞和內(nèi)皮細胞的細胞懸液加入到膠原蛋白溶液中，得到微球前體溶液，通過微流控技術(shù)，采用油包水結(jié)構(gòu)制備膠原蛋白液滴，將所述膠原蛋白液滴固化之后除去油相，制得膠原蛋白微球；[0017]S2、將所述膠原蛋白微球置于雜交生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到細胞活性良好的膠原蛋白微球溶液；[0018]S3、將甲基丙烯?；髂z溶液和纖維蛋白溶液混合，所述甲基丙烯?；髂z和所述纖維蛋白的質(zhì)量比為3-8:1,再加入引發(fā)劑，得到水凝膠前聚體溶液；[0019]S4、將所述膠原蛋白微球溶液和所述水凝膠前聚體溶液混合，得到述生物墨水置于低溫下使其從液態(tài)變?yōu)槟z態(tài)；[0020]S5、通過3D打印技術(shù)將所述生物墨水打印成型，固化得到組織工程水凝膠支架。[0021]進一步地，步驟S1中，所述微球前體溶液中細胞濃度為4×10?-8×10?個/mL,且所述內(nèi)皮細胞和所述骨髓間充質(zhì)干細胞的濃度比為1:1-5,所述膠原蛋白濃度為8-11mg/mL。[0022]進一步地，步驟S1中，通過微流控技術(shù)，采用油包水結(jié)構(gòu)制備膠原蛋白液滴時，以5所述微球前體溶液為分散相，無菌礦物油為連續(xù)相，所述分散相的泵入流速為5-30μL/min,所述連續(xù)相的泵入流速為50-300μL/min,制備得到的所述膠原蛋白微球直徑為150-350μm。胎牛血清和1%雙抗，所述雙抗包括青霉素和鏈霉素。[0024]進一步地，步驟S4中，將所述膠原蛋白微球溶液和所述水凝膠前聚體溶液按體積比4:1混合，得到所述生物墨水，將所述生物墨水置于10-18℃下預(yù)冷15-20min,使其從液態(tài)變?yōu)槟z態(tài)。2-5mm/s的打印速度擠出凝膠態(tài)所述生物墨水，在紫外輻射燈下照射15-20s,光固化功率為30%-50%,固化得到所述組織工程水凝膠支架，所述組織工程水凝膠支架橫截面每平方毫米含有3-12個所述膠原蛋白微球。[0026]本發(fā)明第三方面提供了的如上所述的組織工程水凝膠支架或如上所述的組織工程水凝膠支架的制備方法制備得到的組織工程水凝膠支架在制備組織工程支架中的應(yīng)用。[0027]本發(fā)明的優(yōu)點及積極效果為：[0028]本發(fā)明的組織工程水凝膠支架力學性能好，抗壓強度高，其抗壓強度高達1.8MPa以上，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，適用于3D打印技術(shù)領(lǐng)域以制備復雜結(jié)構(gòu)的組織功能支架，且能保證負載的種子細胞(BMSCs和HUVECs)成活率高，其細胞成活率高達80%以上，且成活細胞活性好，具有良好的預(yù)血管化網(wǎng)絡(luò)形成能力和成骨分化效果，骨修復性能優(yōu)異，在臨床上具有良好的應(yīng)用前景。附圖說明[0029]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單的介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。[0030]圖1為本發(fā)明實施例的組織工程水凝膠支架的組成結(jié)構(gòu)示意圖；[0031]圖2為本發(fā)明實施例的膠原蛋白微球的制備流程圖；[0032]圖3為本發(fā)明實施例的組織工程水凝膠支架以及由其制備的組織工程支架的制備流程圖。具體實施方式[0033]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進行進一步詳細說明。此處所描述的實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。[0034]根據(jù)本發(fā)明包含的信息，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說可以輕而易舉地對本發(fā)明的精確描述進行各種改變，而不會偏離所附權(quán)利要求的精神和范圍。應(yīng)該理解，本發(fā)明的范圍不局限于所限定的過程、性質(zhì)或組分，因為這些實施方案以及其他的描述僅僅是為了示意性說明本發(fā)明的特定方面。實際上，本領(lǐng)域或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員明顯能夠?qū)Ρ景l(fā)明實施方式作出的各種改變都涵蓋在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。[0035]為了更好地理解本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍，在本發(fā)明中所用的表示用量、6除非特別說明，否則在說明書和所附權(quán)利要求書中所列出的數(shù)字參數(shù)都是近似值，其可能會根據(jù)試圖獲得的理想性質(zhì)的不同而加以改變。各個數(shù)字參數(shù)至少應(yīng)被看作是根據(jù)所報告有”等類似詞語的含義是非限制性的，即可加入不影響結(jié)果的其它步驟和其它成分。[0036]為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更為明顯易懂，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施例做詳細說明。[0037]本發(fā)明實施例提供了一種組織工程水凝膠支架，如圖1所示，包括含有骨髓間充質(zhì)干細胞和內(nèi)皮細胞的膠原蛋白微球和由甲基丙烯?；髂z交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)和纖維蛋白形成的水凝膠，所述膠原蛋白微球分散在所述水凝膠中，其中，所述甲基丙烯?；髂z交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中甲基丙烯?；髂z和所述纖維蛋白的質(zhì)量比為3-8:1。[0038]本發(fā)明中，通過膠原蛋白包裹骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)和內(nèi)皮細胞(HUVECs),膠原蛋白屬于溫敏交聯(lián)凝膠材質(zhì)，在4℃是液體狀態(tài)，當溫度上升至37℃時則轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)，進而形成含有骨髓間充質(zhì)干細胞和內(nèi)皮細胞的載多細胞膠原蛋白微球結(jié)構(gòu)(圖1中簡稱為載多細胞微球),之后通過將膠原蛋白微球與甲基丙烯?；髂z(GelMA)和纖維蛋白(FIB)溶液混合，再通過光固化或熱固化形成由甲基丙烯?；髂z交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)和纖維蛋白組成的水凝膠，膠原蛋白微球分散其中，得到本發(fā)明的組織工程水凝膠支架。本發(fā)明的組織工程水凝膠支架具備以下特性：[0039]1、良好的生物相容性：膠原蛋白和纖維蛋白是細胞外基質(zhì)微環(huán)境的兩種主要組成部分，且甲基丙烯?；髂z含有膠原蛋白部分水解產(chǎn)生的明膠網(wǎng)絡(luò)，三者之間具有優(yōu)良的相容性，且與人體組織的生物相容性好，可大大降低由其制成的組織工程支架植入后發(fā)生[0040]2、優(yōu)良的力學性能：纖維蛋白作為一種無定形纖維狀的彈性固體，其與GelMA混合，在Ge1MA交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)形成后，許多纖維蛋白結(jié)合緊密形成纖維蛋白多聚體，分散在GelMA交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中可提高支架材料的力學性能、機械強度。此外，將本身具有良好的抗壓強度的膠原蛋白微球分散在水凝膠結(jié)構(gòu)中，可進一步提高材料的力學性能、機械強度，因此，通過膠原蛋白微球、纖維蛋白多聚體和GelMA交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的配合，本發(fā)明的組織工程水凝膠支架的抗壓[0041]3、良好的細胞活力和高的細胞成活率：本發(fā)明采用膠原蛋白作為外基質(zhì)可以保護細胞并高密度混合BMSCs和HUVECs,與常見的使用光交聯(lián)材料水凝膠作為微球基質(zhì)相比，使用膠原蛋白作為微球外基質(zhì)直接使用37℃水浴即可固化成球，可避免其內(nèi)的細胞液滴受紫外燈照射固化成球時對細胞造成的傷害，有利于提高微球內(nèi)細胞的活性和成活率，而且，膠原蛋白微球分散在水凝膠結(jié)構(gòu)中，水凝膠結(jié)構(gòu)能夠緩沖外力對微球的擠壓，維持微球形態(tài)，進而起到減少外力如采用3D打印技術(shù)打印成型過程中剪切力對細胞產(chǎn)生的損傷，進一步提高細胞的活性和成活率，也有利于提高材料中細胞的濃度。經(jīng)檢測，本發(fā)明制備的組織工程水凝膠支架經(jīng)3D打印成型后中細胞的存活率達到80%以上。以實現(xiàn)預(yù)血管網(wǎng)絡(luò)的生成；另一方面，纖維蛋白與GelMA交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)形成的水凝膠可以在植入初期為骨缺損區(qū)提供支撐作用，為細胞的增值和分化提高穩(wěn)定的環(huán)境，由此有助于體外培7養(yǎng)的BMSCs和HUVECs細胞產(chǎn)生自發(fā)組裝的血管網(wǎng)絡(luò)，高效誘導血管生成并促進成骨細胞分化，以有效解決大塊骨組織工程支架預(yù)血管化網(wǎng)絡(luò)以防止中心骨組織壞死的問題，使新生骨組織可以盡快修復缺損區(qū)。[0043]綜上，本發(fā)明的組織工程水凝膠支架力學性能好，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，適用于3D打印技術(shù)領(lǐng)域以制備復雜結(jié)構(gòu)的組織功能支架，且能保證負載的種子細胞(BMSCs和HUVECs)成活率高，活性好，具有良好的預(yù)血管化網(wǎng)絡(luò)形成能力和成骨分化效果，骨修復性能優(yōu)異，在臨床上具有良好的應(yīng)用前景。[0044]組織工程水凝膠支架的固化成型主要依賴甲基丙烯?；髂z交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，纖維蛋白結(jié)合緊密形成的纖維蛋白多聚體則是提高支架機械強度的主要因素。兩者的比例范圍可以為3-8:1,隨著甲基丙烯?；髂z交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)比例的提升，支架的成型狀態(tài)越好，但由于支架中纖維蛋白多聚體比例的降低，其抗壓強度會逐漸下降，因此，綜合考慮水凝膠支架的成型狀態(tài)和抗壓性能，優(yōu)選地，所述甲基丙烯?；髂z交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中甲基丙烯?；髂z和所述纖維蛋白的質(zhì)量比為4-7:1,更優(yōu)選為5:1。[0045]通常組織工程水凝膠支架打印成型之后以纖維絲狀態(tài)存在，纖維絲的橫截面所含微球數(shù)量會影響其力學性能，進而影響由纖維絲制成的組織工程支架的機械強度(組織工程支架在植入體內(nèi)后受到的力是一個面承受的壓力，即抗壓強度)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，一般而言，纖維絲橫截面所含的膠原蛋白微球個數(shù)越多則制備出來的支架力學性能越好，但還需要綜合考慮膠原蛋白微球大小對內(nèi)部細胞存活率的影響，微球大小適中時，其形態(tài)為規(guī)則球體且分散均勻，這種狀態(tài)下的膠原蛋白微球本身力學性能就較好，其內(nèi)部細胞存活率也較好?？蛇x地，纖維絲橫截面每平方毫米含有3-12個所述膠原蛋白微球，優(yōu)選含有膠原蛋白微球4-10個，所述膠原蛋白微球直徑為150-350μm,此時能夠兼顧細胞成活率和力學性能的同步提升。[0046]可選地，所述膠原蛋白微球內(nèi)部含有細胞懸液，所述細胞懸液中的細胞濃度為4×10?-8×10?個/mL,即所述細胞懸液中骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)和內(nèi)皮細胞(HUVECs)總的細胞濃度為4×10?-8×10?個/mL。[0047]所述膠原蛋白微球中兩種細胞的生長狀態(tài)會一定程度上影響水凝膠支架材料中的細胞存活率，為了提高細胞活性、更好地誘導成骨分化和形成預(yù)血管化網(wǎng)絡(luò)，在較佳的實施方式中，所述細胞懸液中所述內(nèi)皮細胞(HUVECs)和所述骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)的濃髓間充質(zhì)干細胞的濃度比為1:2-4,更優(yōu)選為1:3.前述比例下，各細胞的生長狀態(tài)最佳，成骨分化效果好。[0048]用于制備上述所述的膠原蛋白微球所用的膠原蛋白為I型膠原蛋白。[0049]可選地，所述甲基丙烯?；髂z交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)為甲基丙烯?；髂z光交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，具體可由甲基丙烯?；髂z在光引發(fā)劑的作用下交聯(lián)聚合而成?？梢岳斫獾氖牵庖l(fā)劑在聚合溫度下受光激發(fā)分解成自由基，自由基引發(fā)甲基丙烯?；髂z(GelMA)分子鏈之間相互聚合，本發(fā)明對光引發(fā)劑的種類不作特殊的限定。[0050]在一些具體地實施方式中，所述光引發(fā)劑具體可以為苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基磷酸鋰(LAP)。GelMA是一種光敏生下交聯(lián)固化，由此，可通過3D打印技術(shù)將本發(fā)明的水凝膠材料打印成三維支架，后通過光固8化成型。[0051]本發(fā)明另一實施例提供了如上所述的組織工程水凝膠支架的制備方法，參見圖2-3,包括以下步驟：[0052]S1、制備膠原蛋白微球：將含有骨髓間充質(zhì)干細胞和內(nèi)皮細胞的細胞懸液加入到膠原蛋白溶液中，得到微球前體溶液，通過微流控技術(shù)，采用油包水結(jié)構(gòu)制備膠原蛋白液滴，將所述膠原蛋白液滴固化之后除去油相，制得膠原蛋白微球；[0053]S2、培養(yǎng)膠原蛋白微球：將所述膠原蛋白微球置于雜交生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到細胞活性良好的膠原蛋白微球溶液；[0054]S3、制備水凝膠前聚體溶液：將甲基丙烯?；髂z溶液和纖維蛋白溶液混合，所述甲基丙烯?；髂z和所述纖維蛋白的質(zhì)量比為3-8:1,再加入引發(fā)劑，得到水凝膠前聚體溶[0055]S4、制備打印用生物墨水：將所述膠原蛋白微球溶液和所述水凝膠前聚體溶液混合，得到生物墨水，將所述生物墨水置于低溫下使其從液態(tài)變?yōu)槟z態(tài)，以用于后續(xù)打??；[0056]S5、打印成型：通過3D打印技術(shù)將所述生物墨水打印成型，固化得到組織工程水凝膠支架。[0057]所述組織工程水凝膠支架的制備方法與如上所述的組織工程水凝膠支架相對于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)勢相同，在此不再贅述。[0058]需要說明的是，本發(fā)明雖然對上述的制備過程步驟S1-S3進行了順序上的限定，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當知道，此順序限定僅用于描述目的和便于理解，不表示本發(fā)明必須依照該順序進行。如S1、S3彼此之間并沒有順序上的先后關(guān)系[0059]可選地，步驟S1中，所述微球前體溶液中細胞濃度為4×10?-8×10?個/mL,且所述內(nèi)皮細胞和所述骨髓間充質(zhì)干細胞的濃度比為1:1-5,所述膠原蛋白濃度為8-11mg/mL。[0060]微流控技術(shù)為制備微球的常用技術(shù)，其基本原理是互不相溶的兩相溶液(如水相和油相)在微通道中交匯，在外力或流動的剪切力的作用下被分割成微米級乳液液滴，最后揮去溶劑固化得到微球的方法。具體而言，在本發(fā)明中，以微球前體溶液作為分散相(水相),無菌礦物油作為連續(xù)相(油相),將分散相泵入微流控裝置的一級入口，并將連續(xù)相以正交方向泵入二級入口，進行油包水乳化來生成包含兩種細胞的膠原蛋白液滴，然后將形成的膠原蛋白液滴在微通道中用37℃水浴固化，最后在裝置的出口處收集成型的直徑為150-350μm的載多細胞的膠原蛋白微球，之后通過多次洗滌除去殘留的礦物油即可。[0061]所使用礦物油物一般采用醫(yī)學領(lǐng)域的無菌礦物油(無水，純度99.9%),如石蠟油。[0062]需要注意的是，連續(xù)相與分散相的流速不一樣，則對分散相溶液產(chǎn)生的剪切力不一樣，導致形成液滴的大小不一樣，當使用不同的流速配比時，相鄰兩液滴間的距離也會不一樣，最終導致形成的微球形態(tài)和分散性不一樣，微球形態(tài)不規(guī)則及分散效果差會導致內(nèi)部包含細胞受到一定程度的損傷，進而導致細胞的存活率降低。如何調(diào)控連續(xù)相與分散相的流速以制備形態(tài)規(guī)則、均勻分散的微球是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段。示例性地，所述分散相微球前體溶液的泵入流速為5-30μL/min,所述連續(xù)相無菌礦物油的泵入流速為50-300μL/[0063]可選地，步驟S2中，所述雜交生長培養(yǎng)基包括以下組分：DMEM高糖培養(yǎng)基(購自9001-1ACS)和1%雙抗，所述雙抗包括青霉素和鏈霉素(購自Gibco品牌青霉素-鏈霉素，貨[0064]可選地，步驟S3中，將甲基丙烯?；髂z溶液和纖維蛋白溶液在37℃恒溫條件下攪拌混合均勻，再加入引發(fā)劑避光攪拌混合，之后1000r/min離心5min,得到水凝膠前聚體[0065]可選地，步驟S4中，將所述膠原蛋白微球溶液和所述水凝膠前聚體溶液按體積比4:1混合，得到所述生物墨水，將所述生物墨水置于10-18℃下預(yù)冷15-20min,使其從液態(tài)變?yōu)槟z態(tài)。[0066]可選地，步驟S5中，3D打印技術(shù)采用直寫打印技術(shù)，將凝膠態(tài)生物墨水注入裝有點膠針頭的生物3D打印機供料裝置中，利用直寫打印工藝，打印成型為纖維絲，所述纖維絲橫截面每平方毫米含有3-12個所述膠原蛋白微球，之后紫外光下固化，即為本發(fā)明的組織工程水凝膠支架。點膠針頭的內(nèi)徑根據(jù)所需打印纖維絲的直徑確定，如需制備直徑為1000μm[0067]本發(fā)明又一實施例提供了如上所述的組織工程水凝膠支架或如上所述的組織工程水凝膠支架的制備方法制備得到的組織工程水凝膠支架在制備組織工程支架尤其是骨組織工程支架中的應(yīng)用。[0068]所述組織工程水凝膠支架在制備組織工程支架的應(yīng)用優(yōu)勢與如上所述的組織工程水凝膠支架相對于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)勢相同，在此不再贅述。[0069]組織工程支架的外形、結(jié)構(gòu)根據(jù)實際需求如依據(jù)不同的待修復區(qū)的骨缺損形態(tài)進行3D打印個性化制造，或通過3D打印制造為固定外形的支架。本發(fā)明示例性提供了一種結(jié)構(gòu)，參見圖3,首先將凝膠態(tài)生物墨水利用直寫打印工藝打印成纖維絲，然后通過纖維絲不同層次與角度的拼接架構(gòu)制成，具體而言，所述組織工程支架包括多層，上層的所述纖維絲與下層的所述纖維絲相互垂直設(shè)置，形成井字形網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。[0070]直寫打印參數(shù)：15℃、0.5-0.7MPa氣壓強度條件下，以2-5mm/s的打印速度擠出生物墨水，打印成纖維絲，通過生物3D打印機不連續(xù)擠出打印八層，形成組織工程支架，每打印一層進行紫外燈照射15-20s,紫外燈源為365nm紫外輻射燈，光固化功率為30%-50%。[0071]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照制造廠商所建議的條件。[0073]一種組織工程水凝膠支架，包括含有細胞濃度比為3:1的骨髓間充質(zhì)干細胞和內(nèi)皮細胞的膠原蛋白微球和由甲基丙烯?；髂z交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)和纖維蛋白形成的水凝膠，膠原蛋白微球分散在水凝膠中，其中，甲基丙烯?；髂z交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)由甲基丙烯?；髂z在光引發(fā)劑LAP的作用下交聯(lián)聚合而成，甲基丙烯?；髂z和纖維蛋白的質(zhì)量比為5:1。其制備方法，包括以下步驟：[0074]S1、制備膠原蛋白微球：將8mL含有骨髓間充質(zhì)干細胞和內(nèi)皮細胞的細胞懸液C加入到2mL濃度為9mg/mL的I型膠原蛋白溶液中，在4℃條件下攪拌混合均勻，得到微球前體溶液，在4℃條件下，將微球前體溶液作為分散相溶液泵入微流控裝置的一級入口，并以無菌礦物油作為連續(xù)相以正交方向泵入二級入口，分散相流速為15μL/min,連續(xù)相流速為75μL/得到含平均直徑為350μm的膠原蛋白微球懸液，將懸液輕輕搖動，并沉淀5min以與油相分離，然后在1×PBS中洗滌3次以除去殘留的礦物油，得到膠[0075]其中含有骨髓間充質(zhì)干細胞和內(nèi)皮細胞的細胞懸液C的制備方法包括以下步驟：[0076]BMSCs細胞懸液制備：用0.25%胰蛋白酶收獲培養(yǎng)的BMSCs,以1000r/min離心5min,然后加入BMSCs培養(yǎng)基，得到濃度為6×10?個/mL的含BMSCs的懸液A;[0077]HUVECs細胞懸液制備：用0.25%胰蛋白酶收獲培養(yǎng)的HUVECs,以1000r/min離心5min,然后加入HUVECs培養(yǎng)基，得到濃度為6×10?個/mL的含HUVECs的懸液B;細胞群體組成的含兩種細胞的細胞懸液C;[0079]S2、培養(yǎng)膠原蛋白微球：將膠原蛋白微球置于雜交生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2周，得到001-1ACS)和1%雙抗，所述雙抗包括青霉素和鏈霉素(購自Gibco品牌青霉素-鏈霉素，貨[0080]S3、制備水凝膠前聚體溶液：將50mg/mL甲基丙烯?；髂z溶液和20mg/mL纖維蛋白溶液按體積比2:1混合，得到10mL混合溶液，再加入0.025g光引發(fā)劑LAP,在37℃恒溫條件下避光攪拌混合均勻，得到水凝膠前聚體溶液；[0081]S4、制備打印用生物墨水：將40mL膠原蛋白微球溶液和10mL水凝膠前聚體溶液混合，得到生物墨水，將生物墨水注入裝有0.9mm螺紋針的聚丙烯注射器中，將注射器裝入生物3D打印機的控溫光固化噴頭裝置中，在15℃下預(yù)冷15min,得到易于打印的凝膠態(tài)生物墨生物墨水擠出成纖維絲，纖維絲為圓柱狀結(jié)構(gòu)，擠出成形的供料壓力(氣壓強度)為0.7MPa,控溫光固化噴頭裝置運動速度為5mm/s,打印平臺控溫為10℃,365nm紫外輻射燈光固化功率為50%,紫外燈照射時長為16s,得到由本發(fā)明組織工程水凝膠支架，纖維絲直徑950μm,橫截面膠原蛋白微球為3個，即纖維絲橫截面每平方毫米(mm2)含4個微球。[0083]實施例2[0084]本實施例與實施例1基本相同，區(qū)別在于：步驟S1中制備膠原蛋白微球時，分散相橫截面膠原蛋白微球為6個。[0085]實施例3[0086]本實施例與實施例2基本相同，區(qū)別在于：步驟S3中，將30mg/mL甲基丙烯?；髂z溶液和20mg/mL纖維蛋白溶液按體積比2:1混合，得到10mL混合溶液，10mL混合溶液中甲基丙烯酰基明膠和纖維蛋白質(zhì)量比為3:1。[0087]實施例4[0088]本實施例與實施例2基本相同，區(qū)別在于：溶液和20mg/mL纖維蛋白溶液按體積比2:1混合，得到10mL混合溶液，10mL混合溶液中甲基丙烯?；髂z和纖維蛋白質(zhì)量比為7:1。11[0090]本對比例與實施例2基本相同，區(qū)別在于：分別制備含載BMSCs的膠原蛋白微球和載HUVECs的膠原蛋白微球，再將兩種載細胞的膠原蛋白微球溶液與聚合物前體溶液混合，獲得生物墨水。[0091]BMSCs細胞懸液制備：用0.25%胰蛋白酶收獲培養(yǎng)的BMSCs,以1000r/min離心5min,然后加入BMSCs培養(yǎng)基，得到6mL濃度為6×10?個/mL的含BMSCs的懸液A;[0092]HUVECs細胞懸液制備：用0.25%胰蛋白酶收獲培養(yǎng)的HUVECs,以1000r/min離心5min,然后加入HUVECs培養(yǎng)基，得到2mL濃度為6×10?個/mL的含HUVECs的懸液B;[0093]將1.5mL濃度為9mg/mL的I型膠原蛋[0094]將0.5mL濃度為9mg/mL的I型膠原蛋白溶液加入含HUVECs的懸液B中，并在4℃條件下攪拌混合均勻，得到2.5mL含HUVECs的I型膠原蛋白溶液C2;[0095]分別以I型膠原蛋白溶液C1和C2作為分散相，按照實施例2的方法制備載BMSCs的膠原蛋白微球和載HUVECs的膠原蛋白微球。[0096]對比例2[0098]對本發(fā)明實施例1-4、對比例1-2制備得到的纖維絲的細胞成活率、血管化情況、成骨分化情況、制備的微球形態(tài)及分散效果、纖維絲橫截面的微球個數(shù)和力學性能進行檢測，結(jié)果見表1。[0099]細胞成活率和活力分析實驗：使用活細胞/死細胞雙染試劑(活死染試劑，上海集奇生物科技有限公司)分析細胞活力。首先，在染色前用PBS洗滌纖維絲三次。接下來，在纖維絲上滴加100μL配制好的活死染測定試劑(活死染試劑配方：1.5ml10×AssayBuffer+3μLPISolution+1μLCalceinAM)進行染色。然后將它們在黑暗中孵育40min,并用PBS洗滌三次以除去殘留試劑。最后，在共聚焦熒光顯微鏡下，通過獲取每幀中的兩張圖像(分別為活細胞和死細胞的紅色和綠色)來觀察和成像。[0100]血管化情況分析實驗：使用免疫組化法測定血小板內(nèi)皮細胞粘附分子(PECAM-1,內(nèi)皮標志物)表達水平以反映支架中的血管化情況。第一步，取本發(fā)明制備好的纖維絲切片抗原修復液中最大火力加熱至沸騰后關(guān)火，將切片自然冷卻至室溫，1×PBS洗3次；第五步，滴加5%BSA封閉液，37℃下靜置30min,再甩去多余液體；第六步，滴加1:150稀釋的兔抗鼠顯色劑，靜置90s,再用自來水沖洗；第八步，蘇木素復染20s后，自來水沖洗，再用1%鹽酸酒精中浸泡1s,然后用自來水沖洗；第八步，脫水處理，95%乙醇洗3次，無水乙醇洗3次，二甲苯洗3次；第九步，將得到的每張切片隨機選20個不重疊視野來進行觀察，用Image-J圖像分析軟件進行自動測量分析，計算每個視野的光密度值并計算平均值。[0101]成骨分化情況分析實驗：使用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)測量成骨特異性基因I型膠原蛋白(COL-1)、堿性磷酸酯酶(ALP)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)基因的表達水平以評估骨支架的成骨分化情況。根據(jù)制造商的方案用細胞/組織總RNA提取試劑盒(MolPureRCell/TissueTotalRNAKit)提取總RNA,并使用微量紫外分光光度計在260nm處測定其含量。使用EasyQuickRTMasterMix制備cDNA第一鏈。而后，在PCR儀上使用SYBRGreen2xqPCRMasterMix、正向和反向引物進行RT-qPCR。不同樣品的表達水平通過甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)進行標準化。[0102]微球形態(tài)及分散效果、纖維絲橫截面的微球個數(shù)觀察：通過倒置顯微鏡(NIKONECLIPSETS100)