小反芻獸疫病毒與羊傳染性膿皰病毒雙重Detectionmethodofpestedespetitsruminantsvirusandorfvirusbyduplexreal-timefluorescencequantitativ2023-07-20發(fā)布2023-09-20實施I本文件按照GB/T1.1--2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和產(chǎn)建設兵團畜牧獸醫(yī)工作總站。蘇曉慧、薛文、秦菊、努爾麥麥提阿穆提、居馬別克夏拉巴依、馬亞珍、符玉涓、艾日登才次克、李璐、張丹、沙那瓦爾塔希、任娟、美熱木古麗巴依待拉提、烏那爾汗吉斯汗、孫曉明、馮冰、陳玲、高姍姍、顏成旭、陸桂麗、茹仙古麗木明、加米拉、加伊娜古力、特列克庫拉別克。維吾爾自治區(qū)動物疾病預防控制中心(新疆烏魯木齊市高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)藍病預防控制中心(北京市大興區(qū)天貴大街17號)、北京億森寶生物科技有限公司(北京市北京經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)(通州)科創(chuàng)東五街2號)、新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所(新疆畜牧科學院疆烏魯木齊市高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)冬融街726號)、新疆生產(chǎn)建設兵團畜牧獸醫(yī)工作總站(新疆烏魯木齊市米東區(qū)米東南路2188號紅光雅居小區(qū)7號公建樓)、新疆維吾爾自治市新華南路167號)。疆維吾爾自治區(qū)動物疾病預防控制中心(新疆烏魯木齊市高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)藍疫病預防控制中心(北京市大興區(qū)天貴大街17號)、新疆維吾爾自治區(qū)市場監(jiān)督新疆維吾爾自治區(qū)畜牧獸醫(yī)局聯(lián)系電話傳真郵編：830004新疆維吾爾自治區(qū)動物疾病預防控制中心聯(lián)系電話傳真郵編：中國動物疫病預防控制中心聯(lián)系電話傳真郵編：100125北京億森寶生物科技有限公司聯(lián)系電話傳真郵編：100176新疆維吾爾自治區(qū)市場監(jiān)督管理局聯(lián)系電話傳真郵編：8300041本文件規(guī)定了小反芻獸疫病毒與羊傳染性膿2規(guī)范性引用文件僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本檢測引物探針見附錄B。6操作步驟選擇處于發(fā)熱期(體溫40℃~41℃)、排出膿性、漿液性眼分泌物、出現(xiàn)口腔潰瘍癥狀的活畜采2(0.01mol/LpH7.4,PBS)中。將含有滲出物的棉拭子在微量振蕩器上充分混合，捻動、擠壓干后棄去拭子。12000r/min離心5min,吸取上清300山于1.5mL滅菌離心管中，編號備用。選擇剛被撲殺或者死亡時間不超過24h的病畜采集組織樣品。無菌采集腸系膜和支氣管淋巴結各3個~4個，脾、胸腺、腸粘膜和肺組織各約25g~50g,分別置于50mL離心管或密封袋中。每份組織分別從三個不同位置取樣，稱取樣品約1g,用手術剪剪碎的樣品混勻后取0.1g裝入研磨管，于高通量研磨儀中研磨，加入1.5mL0.01mol/LpH7.4PBS繼續(xù)研磨，待勻漿后轉至1.5mL滅菌離心管中，12000樣品采集后，放置有冰盒的采樣箱里送至實驗室，在24h內進行檢測。6.3DNA/RNA的提取6.3.1取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入6.3.2將液體吸入吸附柱中，12000r/min離心30s。6.3.3棄去收集管中液體，加入600μ洗滌液，12000r/min離心30s。6.3.4重復上述步驟6.3.3。6.3.5棄去收集管中液體，12000r/min離心2min,以除去殘留的洗滌液。6.3.6將吸附柱移入新的1.5mL無菌離心管中，向柱中央加入洗脫液60山。6.3.7室溫靜置2min,12000r/min離心1min,離心管中液體為核酸模板。得到的核酸模板盡量在6.3.8若使用核酸提取儀提取核酸，則按DNA/RNA提取試劑盒說明書進行操作。6.4.1試驗前20min從-20℃冰箱中取出試劑盒等相應試劑，使試劑完全溶解。6.4.2每個檢測反應體系總量為15μL:14山的熒光PCR反應液，1L的酶混合物。6.4.3蓋緊PCR反應管蓋后將PCR反應管轉移至樣本準備區(qū)，剩余試劑放回-20℃冰箱冷凍保存。6.5加樣(樣本準備區(qū))6.5.1分別向上述PCR反應管中加入已提取樣本核酸模板各5μL,陽性對照和陰性對照核酸模板各加5μL,記錄加樣順序。36.5.2蓋緊管蓋，瞬時離心30s,PCR樣本管轉移至擴增區(qū)。為：45℃10min,1個循環(huán)；95℃10min,1個循環(huán)；95℃15s,60℃45s,40個循環(huán)，在每性膿皰病毒陽性質粒作為陽性對照，同時以雙蒸水代替模板作為陰性對照。分別提取樣品和對照品的6.7.2.1陰性對照：無擴增曲線且Ct值>38或無Ct值。6.7.2.2陽性：Ct值≤30,有明顯指數(shù)增長，呈典型的S型曲線。6.7.2.3以上：Ct值≤30,有明顯獸疫病毒和羊傳染性膿皰病毒核酸。若在“FAM”標記下出現(xiàn)典型的擴增曲線且Ct值≤35,則判定樣本中小反芻獸疫病毒核酸陽性。若在“HEX”標記下出現(xiàn)典型的擴增曲線且Ct值≤35,則判定樣本中羊傳染性若被檢樣本的PCR反應體系通道無典型擴增曲線，且Ct值>38或無Ct值，則判定樣本小反芻獸疫病重復檢測。如重復實驗結果Ct值仍在35～38之間，有明顯4(規(guī)范性)氯化鈉氯化鉀二水合磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀滅菌雙蒸水A.2EDTA-Na?(0.5mol/L,pH=8.0)溶液配制滅菌雙蒸水氫氧化鈉滅菌雙蒸水異硫氰酸胍氯化鈉0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液(EDTA-Na?)(pH=8滅菌雙蒸水A.4洗滌液磷酸二氫鉀氯化鈉滅菌雙蒸水磷酸二氫鉀滅菌雙蒸水5(規(guī)范性)實時熒光PCR檢測B.1引物序列根據(jù)已報道的PPRV和ORFV的基因組序列各設計1套用于特異性擴增的引物和探針，具體引物信息與基因片段大小見表B.1和B.2。表B.1小反芻獸醫(yī)病毒引物序列及目的片段長度引物引物序列(5′→3引物探針FAM-CTCGGAAATCGCCTCGCAGGC表B.2羊傳染性膿皰病毒引物序列及目的片段