唐古特白刺果實多糖：從分離表征到免疫調(diào)節(jié)活性的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義唐古特白刺（NitrariatangutorumBobr.）為蒺藜科白刺屬灌木，廣泛分布于中國西北干旱和半干旱地區(qū)，如青海柴達木盆地、內(nèi)蒙古西部、寧夏等地。其具有極強的抗逆性，耐鹽堿、干旱、風沙，是荒漠地區(qū)重要的生態(tài)保護植物，在保持水土、防風固沙、改良土壤等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。唐古特白刺果實作為其重要的生物產(chǎn)物，不僅是當?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)中動物的食物來源之一，也因其獨特的營養(yǎng)價值和潛在藥用價值，逐漸成為研究和開發(fā)的熱點。從資源利用角度來看，唐古特白刺果實資源豐富，但長期以來，除少量用于傳統(tǒng)食用和簡單加工外，大部分果實未得到充分利用，造成資源浪費。對唐古特白刺果實多糖的研究，有助于開拓其新的應(yīng)用領(lǐng)域，提高資源利用率，推動相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展。以柴達木盆地為例，該地區(qū)擁有大量唐古特白刺資源，若能有效開發(fā)利用其果實多糖，不僅能減少資源閑置，還能帶動當?shù)亟?jīng)濟發(fā)展，促進生態(tài)保護與經(jīng)濟發(fā)展的良性循環(huán)。在醫(yī)藥保健領(lǐng)域，多糖類物質(zhì)因其具有多種生物活性而備受關(guān)注。植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、降血糖等功效，在藥物研發(fā)、保健品開發(fā)等方面展現(xiàn)出巨大潛力。唐古特白刺果實多糖作為一種潛在的生物活性多糖，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對于開發(fā)新型天然藥物和功能性食品具有重要意義。一方面，深入了解唐古特白刺果實多糖的免疫調(diào)節(jié)活性，可為開發(fā)免疫增強劑提供理論依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)，有助于提高人體免疫力，預(yù)防和治療免疫相關(guān)疾病。另一方面，隨著人們健康意識的提高，對天然、安全、有效的保健品需求日益增加，唐古特白刺果實多糖有望成為保健品的優(yōu)質(zhì)原料，滿足市場需求。綜上所述，開展唐古特白刺果實多糖的分離、表征及免疫調(diào)節(jié)活性研究，既有助于實現(xiàn)唐古特白刺資源的高效利用，又能為醫(yī)藥保健領(lǐng)域提供新的物質(zhì)資源和研究思路，具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。1.2唐古特白刺概述唐古特白刺（NitrariatangutorumBobr.），屬蒺藜科白刺屬落葉小灌木，在我國主要分布于青海柴達木盆地、內(nèi)蒙古西部、寧夏、甘肅河西走廊以及新疆等地。這些地區(qū)氣候干旱，年降水量少，蒸發(fā)量大，土壤鹽堿化程度較高，唐古特白刺能夠在這樣惡劣的環(huán)境中生長繁衍，展現(xiàn)出其獨特的適應(yīng)性。從形態(tài)特征來看，唐古特白刺植株一般高1-2米，分枝眾多，常呈彎曲、平臥或開展狀，這種形態(tài)有助于其在風沙環(huán)境中減少風蝕的影響，同時增加與地面的接觸面積，更好地吸收水分和養(yǎng)分。其不孕枝先端刺針狀，這不僅是一種防御機制，減少動物的啃食，還能在一定程度上減少水分的散失。嫩枝呈現(xiàn)白色，這可能與它反射陽光、降低體溫，從而減少水分蒸發(fā)有關(guān)。葉通常2-3枚簇生于嫩枝之上，寬倒披針形，長18-30毫米，寬6-8毫米，先端鈍圓，基部漸狹呈楔形，全緣，稀具先端齒裂，肉質(zhì)的葉片能夠儲存更多的水分，以適應(yīng)干旱環(huán)境?；ㄅ帕休^為密集，花期在5-6月，此時荒漠地區(qū)氣溫逐漸升高，昆蟲活動頻繁，有利于其傳粉。核果卵形或有時橢圓形，熟時深紅色，果汁呈玫瑰色，果期為7-8月，鮮艷的果實顏色能夠吸引動物采食，有助于種子的傳播。唐古特白刺具有極強的生態(tài)適應(yīng)性。它是多漿旱生型陽性植物，對光照需求較高，在充足的陽光下能進行旺盛的光合作用。其耐旱能力出眾，根系極為發(fā)達，根長可達地上部分的數(shù)倍甚至數(shù)十倍，能深入地下尋找水源，如在柴達木盆地，其根系可深達十幾米，以獲取深層地下水。同時，唐古特白刺耐鹽堿能力也很強，能夠通過自身的生理調(diào)節(jié)機制，適應(yīng)高鹽堿土壤環(huán)境，例如其細胞內(nèi)積累大量的可溶性物質(zhì)，以平衡外界高濃度的鹽分，維持細胞的正常生理功能。此外，它還耐寒、抗風、耐高溫、耐瘠薄，在極端低溫和高溫環(huán)境下都能生存，在狂風肆虐的沙漠地區(qū)，能有效抵御風沙侵蝕，在土壤貧瘠的荒漠中也能頑強生長。唐古特白刺在生態(tài)系統(tǒng)中具有不可替代的重要作用。在保持水土方面，其龐大的根系能夠固定土壤顆粒，防止水土流失，特別是在沙漠邊緣和河流階地等區(qū)域，有效減少了土壤的侵蝕和沙漠化的擴展。在防風固沙上，唐古特白刺常形成密集的灌叢，降低風速，阻擋風沙，是沙漠地區(qū)重要的防風固沙屏障。而且，它還能改良土壤，通過自身的生長代謝，增加土壤中的有機質(zhì)含量，改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力，為其他植物的生長創(chuàng)造條件。唐古特白刺還是荒漠生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的基礎(chǔ)，其枝葉和果實為眾多荒漠動物提供食物來源，如駱駝、羊等家畜會食用其枝葉，一些小型哺乳動物和鳥類也以其果實為食，對維持荒漠生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性意義重大。除了重要的生態(tài)價值，唐古特白刺還具有一定的經(jīng)濟價值和藥用價值。其果實酸甜可口，富含多種營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、維生素以及多種微量元素等，可直接食用，也可用于釀酒、制醋、制作果汁飲料等，開發(fā)出一系列具有地方特色的食品。唐古特白刺果實還具有藥用功效，在傳統(tǒng)醫(yī)學中，常被用于治療脾虛食少、消化不良、產(chǎn)婦乳少、神經(jīng)衰弱等癥狀，現(xiàn)代研究也表明，其果實提取物具有抗氧化、抗疲勞、抗應(yīng)激、保肝等多種藥理活性，為開發(fā)天然藥物和保健品提供了潛在的資源。1.3植物多糖研究現(xiàn)狀植物多糖作為一類重要的生物大分子，廣泛存在于植物的根、莖、葉、果實等組織中，近年來在提取、表征及生物活性研究方面取得了顯著進展。在提取技術(shù)上，傳統(tǒng)的熱水浸提法仍然是常用的基礎(chǔ)方法，其原理是利用多糖易溶于熱水的特性，將植物材料在一定溫度下與水共熱，使多糖從植物細胞中溶出。該方法操作簡單、成本較低，但存在提取時間長、能耗高、多糖得率和純度相對較低等缺點。為了克服這些問題，新興的提取技術(shù)不斷涌現(xiàn)。超聲波輔助提取法利用超聲波的空化效應(yīng)、機械效應(yīng)和熱效應(yīng)，能夠破壞植物細胞壁，加速多糖的溶出，縮短提取時間，提高提取效率，如在枸杞多糖的提取中，超聲波輔助提取可使多糖得率比傳統(tǒng)熱水浸提法提高[X]%。微波輔助提取則借助微波的熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)，使植物細胞內(nèi)的極性分子快速振動，導(dǎo)致細胞破裂，多糖釋放，具有提取時間短、能耗低、選擇性好等優(yōu)點，在紅棗多糖提取中，微波輔助提取能在較短時間內(nèi)獲得較高純度的多糖。酶解法是利用纖維素酶、果膠酶等酶類，特異性地降解植物細胞壁的組成成分，從而使多糖更易溶出，該方法條件溫和，對多糖結(jié)構(gòu)破壞小，有利于保持多糖的生物活性，在香菇多糖提取中，酶解法可有效提高多糖的提取率和純度。此外，超臨界流體萃取技術(shù)利用超臨界流體在臨界點附近對溶質(zhì)具有特殊溶解能力的特性，實現(xiàn)多糖的高效提取，具有提取效率高、無污染、易于分離等優(yōu)勢，不過設(shè)備成本較高，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。植物多糖的表征是深入了解其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的關(guān)鍵?；瘜W分析方法可對多糖的單糖組成、糖苷鍵連接方式、糖基序列等進行分析。通過酸水解將多糖降解為單糖，再利用高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）等技術(shù)對單糖進行分離和鑒定，確定其組成。甲基化分析結(jié)合GC-MS可用于確定糖苷鍵的連接方式。儀器分析技術(shù)在多糖表征中發(fā)揮著重要作用。紅外光譜（IR）能夠提供多糖中官能團的信息，如羥基、羰基、糖苷鍵等，通過特征吸收峰判斷多糖的類型和結(jié)構(gòu)特征。核磁共振（NMR）技術(shù)，特別是1H-NMR和13C-NMR，可準確測定多糖的化學結(jié)構(gòu)、糖環(huán)的構(gòu)型、連接位置等。原子力顯微鏡（AFM）可以直觀地觀察多糖分子的形貌、大小和聚集狀態(tài)，為多糖的微觀結(jié)構(gòu)研究提供直接證據(jù)。多角度激光光散射（MALLS）結(jié)合凝膠滲透色譜（GPC）能夠精確測定多糖的分子量和分子量分布。植物多糖的生物活性研究是其應(yīng)用開發(fā)的基礎(chǔ)。免疫調(diào)節(jié)是植物多糖重要的生物活性之一，許多植物多糖能夠激活免疫細胞，如巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞等，促進免疫細胞的增殖、分化和活性因子的分泌，從而增強機體的免疫功能。例如，黃芪多糖可通過調(diào)節(jié)巨噬細胞的吞噬功能和細胞因子的分泌，增強機體的非特異性免疫和特異性免疫。抗腫瘤活性方面，植物多糖可通過多種機制發(fā)揮作用，包括誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖、調(diào)節(jié)腫瘤細胞周期、抑制腫瘤血管生成等。香菇多糖能誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，同時增強機體的免疫監(jiān)視功能，協(xié)同免疫系統(tǒng)清除腫瘤細胞。在抗氧化方面，植物多糖可以清除體內(nèi)過多的自由基，如超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基等，抑制脂質(zhì)過氧化，保護細胞免受氧化損傷。藍莓多糖具有較強的抗氧化能力，能有效清除自由基，減輕氧化應(yīng)激對細胞的損傷。此外，植物多糖還具有降血脂、降血糖、抗菌、抗病毒等多種生物活性，在醫(yī)藥、保健品、食品等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。1.4唐古特白刺果實多糖研究現(xiàn)狀近年來，唐古特白刺果實多糖作為一種具有潛在生物活性的天然產(chǎn)物，逐漸受到研究人員的關(guān)注，在提取、分離、結(jié)構(gòu)鑒定以及生物活性等方面取得了一定的研究成果。在提取工藝研究上，傳統(tǒng)熱水浸提法是較早用于唐古特白刺果實多糖提取的方法，王凌云等人通過正交試驗探討了白刺多糖的最佳提取工藝，在多糖提取之前先將白刺果肉、果皮粉末除脂，去除單糖等干擾因素，得出白刺多糖的最佳提取工藝是料液比為1：5，94℃下回流提取3次，每次2h，在此條件下得到的白刺多糖含量為34.562mg/g。但該方法存在提取時間長、能耗大、多糖得率相對較低等問題。為了提高多糖提取效率，新興技術(shù)不斷被應(yīng)用。微波輔助超聲波提取法結(jié)合了微波和超聲波的優(yōu)勢，能夠快速破壞植物細胞結(jié)構(gòu)，促進多糖溶出。有研究采用該方法，通過考察料液比、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)4個影響因素，確定了最佳工藝條件為微波輔助提取功率1000W，提取時間5min；超聲提取時料液比1:5，提取溫度95℃，提取時間1h，超聲提取3次，經(jīng)驗證試驗，所得唐古特白刺果實多糖平均含量為33.875mg?g-1，該方法顯著縮短了提取時間，提高了多糖得率?？焖偃軇┹腿》ɡ蒙邷囟群蛪毫碓黾游镔|(zhì)溶解度和擴散效率，金建華等人運用該方法，通過單因素試驗及響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，確定溫度102℃、時間10min、壓力10MPa、循環(huán)提取2次為優(yōu)化提取工藝，該工藝下提取的多糖對DPPH?和?OH的清除力強，展現(xiàn)出良好的抗氧化活性。在結(jié)構(gòu)鑒定方面，目前對唐古特白刺果實多糖結(jié)構(gòu)的研究還相對較少。已有的研究主要借助一些常規(guī)的分析技術(shù)，如通過酸水解將多糖降解為單糖，再利用高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）等技術(shù)對單糖組成進行分析，但對于多糖的糖苷鍵連接方式、糖基序列、空間構(gòu)象等深層次結(jié)構(gòu)信息的研究還不夠深入，缺乏如核磁共振（NMR）、原子力顯微鏡（AFM）等先進技術(shù)的系統(tǒng)應(yīng)用，這限制了對唐古特白刺果實多糖結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的全面認識。在生物活性研究領(lǐng)域，唐古特白刺果實多糖已被證實具有多種生物活性?？寡趸钚苑矫妫囗椦芯勘砻髌淠軌蛱岣咝∈笱宄趸锲缁福⊿OD）活力，降低血清丙二醛（MDA）含量，還對DPPH?和?OH等自由基具有較強的清除能力，具有較好的還原力，可作為潛在的抗氧化劑應(yīng)用于食品、保健品等行業(yè)。在抗疲勞方面，通過小鼠負重游泳實驗和自由游泳后相關(guān)生化指標測定發(fā)現(xiàn)，唐古特白刺果實多糖能顯著延長小鼠力竭游泳時間，降低血清乳酸（LD）和血清尿素氮（BUN）濃度，增加肝糖原含量?？箲?yīng)激作用研究顯示，在抗高溫、耐低溫和抗缺氧實驗中，唐古特白刺果實多糖高、低劑量組均能延長小鼠在相應(yīng)惡劣環(huán)境中的存活時間。此外，唐古特白刺果實多糖在保肝方面也有積極作用，對小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）具有顯著的抑制作用，能有效保護化學性肝損傷。然而，目前對于唐古特白刺果實多糖生物活性的作用機制研究還不夠透徹，多數(shù)僅停留在現(xiàn)象觀察和指標測定層面，缺乏從細胞和分子水平深入探究其作用的信號通路和調(diào)控機制。總體而言，唐古特白刺果實多糖的研究雖然取得了一定進展，但仍存在諸多不足。在提取工藝上，雖然新方法不斷涌現(xiàn)，但仍需進一步優(yōu)化，以實現(xiàn)高效、低耗、綠色的提取目標。結(jié)構(gòu)鑒定方面，需要引入更多先進技術(shù)，深入解析其精細結(jié)構(gòu)。生物活性研究則需在現(xiàn)有基礎(chǔ)上，從分子生物學、細胞生物學等多學科角度，深入探究其作用機制，為唐古特白刺果實多糖的開發(fā)利用提供更堅實的理論基礎(chǔ)。二、唐古特白刺果實多糖的分離2.1材料與儀器實驗選用新鮮的唐古特白刺果實，采摘于[具體產(chǎn)地]，采摘后立即進行處理，以保證果實的新鮮度和多糖的活性。將果實洗凈、晾干后，去除果核，得到果肉部分備用。本實驗所使用的試劑均為分析純，包括無水乙醇、石油醚、、正丁醇、葡萄糖、濃硫酸、蒽、苯酚、考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白、DEAE-纖維素、SephadexG-100等。其中，無水乙醇用于多糖的沉淀和洗滌；石油醚用于去除果實中的脂溶性雜質(zhì)；和正丁醇用于Sevage法脫蛋白；葡萄糖作為標準品用于多糖含量的測定；濃硫酸和蒽用于多糖的顯色反應(yīng)；苯酚用于多糖的純度鑒定；考馬斯亮藍G-250和牛血清白蛋白用于蛋白質(zhì)含量的測定；DEAE-纖維素和SephadexG-100用于多糖的分離純化。儀器設(shè)備方面，主要有電子天平（精度為0.0001g），用于準確稱量原料和試劑的質(zhì)量；高速離心機，最大轉(zhuǎn)速可達15000r/min，用于分離提取液中的固液成分；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，可在減壓條件下對提取液進行濃縮，提高濃縮效率，減少多糖的損失；超聲波清洗器，功率為200W，頻率為40kHz，利用超聲波的空化效應(yīng)和機械效應(yīng)，加速多糖的提??；紫外可見分光光度計，可在200-800nm波長范圍內(nèi)進行掃描，用于多糖含量和純度的測定；冷凍干燥機，能夠在低溫下將多糖溶液中的水分升華除去，得到干燥的多糖粉末，最大程度地保留多糖的生物活性；恒溫水浴鍋，控溫精度為±0.1℃，用于多糖提取和反應(yīng)過程中的溫度控制；層析柱，規(guī)格為2.6cm×100cm，填充DEAE-纖維素和SephadexG-100等填料，用于多糖的分離純化；自動部分收集器，可按設(shè)定的時間間隔收集洗脫液，方便后續(xù)的分析檢測。2.2提取方法比較2.2.1熱水浸提法熱水浸提法是提取唐古特白刺果實多糖的傳統(tǒng)方法，其原理基于多糖的水溶性。多糖是極性大分子化合物，在熱水中，分子熱運動加劇，多糖分子與水分子之間的相互作用增強，使得多糖能夠克服分子間的作用力，從植物細胞中溶出進入水溶液。這種方法操作相對簡單，將粉碎后的唐古特白刺果實與水按一定料液比混合，在加熱條件下，保持一定溫度和時間進行浸提。具體操作步驟為：首先將唐古特白刺果實洗凈、烘干，粉碎過篩后，稱取一定質(zhì)量的粉末置于圓底燒瓶中，按設(shè)定的料液比加入蒸餾水。將圓底燒瓶置于恒溫水浴鍋中，加熱至預(yù)定溫度，如王凌云等人的研究中，將料液比設(shè)為1：5，在94℃下回流提取，此溫度既能保證多糖的充分溶解，又能避免溫度過高導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)的破壞。在提取過程中，為使提取更充分，需不斷攪拌，使果實粉末與熱水充分接觸?；亓魈崛?次，每次2h，這樣可保證盡可能多的多糖被提取出來。提取結(jié)束后，將提取液趁熱過濾，去除未溶的殘渣。然后將濾液進行減壓濃縮，以減少后續(xù)醇沉時乙醇的用量。最后，向濃縮液中加入95%乙醇，使乙醇的最終濃度達到70%左右，多糖會因在高濃度乙醇中溶解度降低而沉淀析出。將沉淀離心收集，并用無水乙醇、***等洗滌，去除雜質(zhì)，最后冷凍干燥得到粗多糖。熱水浸提法對多糖提取率有顯著影響。料液比是關(guān)鍵因素之一，當料液比過低，即水的用量不足時，果實中的多糖無法充分溶解，導(dǎo)致提取率降低；而料液比過高，不僅會增加后續(xù)濃縮和分離的工作量，還可能使多糖在大量水中分散過度，不利于沉淀析出，也會影響提取率。提取溫度對提取率也有重要作用，適當提高溫度能加快多糖的溶解速度，但過高的溫度會使多糖發(fā)生降解，影響其結(jié)構(gòu)和活性，從而降低提取率。提取時間同樣不可忽視，時間過短，多糖溶解不完全；時間過長，可能導(dǎo)致多糖的分解或雜質(zhì)的溶出增加，也不利于提取率的提高。在王凌云等人的研究中，通過正交試驗優(yōu)化得到的料液比1：5、94℃下回流提取3次每次2h的工藝條件下，得到的白刺多糖含量為34.562mg/g。然而，熱水浸提法也存在明顯的局限性，如提取時間長，能耗大，且在提取過程中可能會引入較多雜質(zhì)，后續(xù)分離純化難度較大，這些問題限制了其在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用。2.2.2微波輔助超聲波提取法微波輔助超聲波提取法是一種新興的唐古特白刺果實多糖提取技術(shù)，它巧妙地結(jié)合了微波和超聲波的協(xié)同作用，展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。微波是一種頻率介于300MHz至300GHz的電磁波，在微波輔助提取過程中，微波的熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)共同發(fā)揮作用。熱效應(yīng)使得植物細胞內(nèi)的水分子迅速振動，產(chǎn)生大量熱能，導(dǎo)致細胞內(nèi)溫度急劇升高，細胞內(nèi)壓力增大，當壓力超過細胞壁的承受力時，細胞破裂，多糖等物質(zhì)釋放出來。非熱效應(yīng)則通過改變分子的排列和運動方式，促進多糖分子與溶劑的相互作用，加速多糖的溶解。超聲波的作用原理主要基于其空化效應(yīng)、機械效應(yīng)和熱效應(yīng)?？栈?yīng)是指超聲波在液體中傳播時，會產(chǎn)生許多微小的氣泡，這些氣泡在超聲波的作用下迅速膨脹和破裂，產(chǎn)生瞬間的高溫、高壓和強烈的沖擊波，能夠有效地破壞植物細胞壁，增加細胞的通透性，使多糖更容易溶出。機械效應(yīng)表現(xiàn)為超聲波在介質(zhì)中傳播時引起的機械振動，這種振動可以促進物質(zhì)的擴散和傳質(zhì)，加快多糖從細胞內(nèi)擴散到提取溶劑中。熱效應(yīng)則是由于超聲波的能量轉(zhuǎn)化為熱能，使提取體系的溫度升高，進一步加速多糖的提取。在實際操作中，首先將唐古特白刺果實進行預(yù)處理，洗凈、烘干、粉碎后備用。將一定量的果實粉末置于提取容器中，加入適量的提取溶劑，如蒸餾水。設(shè)定微波輔助提取功率為1000W，提取時間5min。在微波作用下，果實細胞迅速破裂，多糖初步釋放。隨后進行超聲提取，控制料液比為1:5，提取溫度95℃，提取時間1h，超聲提取3次。在超聲過程中，進一步利用超聲波的各種效應(yīng)，使多糖充分溶出并擴散到溶劑中。提取結(jié)束后，經(jīng)過過濾、濃縮、醇沉等后續(xù)處理步驟，得到粗多糖。微波輔助超聲波提取法具有諸多優(yōu)勢。從提取效率來看，該方法能夠在較短的時間內(nèi)獲得較高的多糖提取率。以唐古特白刺果實多糖提取為例，相關(guān)研究確定的最佳工藝條件下，所得唐古特白刺果實多糖平均含量為33.875mg?g-1，與傳統(tǒng)熱水浸提法相比，提取時間大幅縮短，從熱水浸提法的數(shù)小時縮短至微波輔助提取的幾分鐘和超聲提取的1小時左右，同時多糖得率也能保持在較高水平。這是因為微波和超聲波的協(xié)同作用，能夠更有效地破壞植物細胞結(jié)構(gòu)，加速多糖的釋放和擴散。在能耗方面，由于提取時間的縮短，整體能耗降低，符合綠色化學和可持續(xù)發(fā)展的理念。而且，該方法對多糖結(jié)構(gòu)的破壞較小，有利于保持多糖的生物活性。在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，多糖的生物活性是其應(yīng)用的關(guān)鍵，微波輔助超聲波提取法在這方面具有明顯的優(yōu)勢，為唐古特白刺果實多糖的開發(fā)利用提供了更有利的條件。2.2.3酶輔助提取法酶輔助提取法是利用酶的特異性催化作用來提高唐古特白刺果實多糖提取效率的一種方法。其原理基于植物細胞壁的組成成分和酶的作用機制。植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素、果膠等物質(zhì)組成，這些物質(zhì)形成了緊密的結(jié)構(gòu)，阻礙了多糖從細胞內(nèi)釋放出來。酶輔助提取法通過選擇合適的酶，如纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶等，特異性地降解細胞壁的組成成分，破壞細胞壁的結(jié)構(gòu)，增加細胞的通透性，從而使多糖更容易從細胞內(nèi)溶出到提取溶劑中。纖維素酶能夠水解纖維素分子中的β-1,4-糖苷鍵，將纖維素分解為小分子的糖類，破壞細胞壁的纖維素骨架；果膠酶則作用于果膠，水解果膠分子中的糖苷鍵，使果膠降解，破壞細胞壁的粘性和完整性；半纖維素酶可以降解半纖維素，進一步削弱細胞壁的結(jié)構(gòu)。在唐古特白刺果實多糖的提取中，酶的選擇至關(guān)重要。不同的酶對多糖提取效果有著不同的影響。纖維素酶可以有效破壞細胞壁的纖維素部分，使多糖釋放，但單獨使用纖維素酶時，可能由于細胞壁其他成分的存在，多糖釋放并不完全。果膠酶對于富含果膠的唐古特白刺果實來說，能夠分解果膠，打開細胞壁的部分結(jié)構(gòu)，促進多糖的溶出。在實際應(yīng)用中，常采用復(fù)合酶的方式，將纖維素酶、果膠酶等按一定比例混合使用，發(fā)揮各酶的協(xié)同作用，以達到更好的提取效果。例如，在某些研究中，將纖維素酶和果膠酶按1:1的比例混合，用于唐古特白刺果實多糖的提取，結(jié)果顯示多糖提取率明顯提高。酶輔助提取法的操作過程如下：首先將唐古特白刺果實洗凈、烘干、粉碎。稱取一定質(zhì)量的果實粉末，加入適量的緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH值至酶的最適pH值，一般纖維素酶和果膠酶的最適pH值在4-6之間。加入一定量的復(fù)合酶，在適宜的溫度下進行酶解反應(yīng)，通常酶解溫度為40-50℃，這是酶活性較高的溫度范圍。酶解時間根據(jù)具體情況而定，一般為1-3h。在酶解過程中，需不斷攪拌，使酶與果實粉末充分接觸，保證酶解反應(yīng)的均勻進行。酶解結(jié)束后，通過加熱或調(diào)節(jié)pH值等方式使酶失活，然后進行過濾、濃縮、醇沉等后續(xù)處理步驟，得到粗多糖。酶輔助提取法具有顯著的優(yōu)點。其條件溫和，在較低的溫度和較溫和的pH值條件下進行，能夠有效避免多糖在高溫、強酸強堿等條件下可能發(fā)生的降解和結(jié)構(gòu)破壞，有利于保持多糖的生物活性。與傳統(tǒng)提取方法相比，酶輔助提取法可以提高多糖的提取率和純度。通過特異性地降解細胞壁成分，減少了雜質(zhì)的溶出，使得提取得到的多糖純度更高。而且，該方法對環(huán)境友好，酶是生物催化劑，在反應(yīng)結(jié)束后不會產(chǎn)生有害的殘留物質(zhì)，符合綠色化學的要求。然而，酶輔助提取法也存在一些不足之處，如酶的成本較高，不同批次的酶活性可能存在差異，需要嚴格控制酶解條件，這些因素在一定程度上限制了其大規(guī)模應(yīng)用。2.3提取工藝優(yōu)化2.3.1單因素實驗以微波輔助超聲波提取法為例，深入探討各因素對唐古特白刺果實多糖提取率的影響。在單因素實驗中，固定其他條件，逐一改變一個因素的水平，以明確該因素對多糖提取率的具體影響規(guī)律。首先考察料液比對多糖提取率的影響。保持微波輔助提取功率為1000W，提取時間5min；超聲提取溫度95℃，提取時間1h，超聲提取3次，分別設(shè)置料液比為1:3、1:4、1:5、1:6、1:7。當料液比為1:3時，由于水的用量相對較少，果實中的多糖無法充分溶解，導(dǎo)致提取率較低；隨著料液比增加到1:5，多糖溶解更加充分，提取率顯著提高；然而，當料液比繼續(xù)增大至1:7時，過多的水分可能會使多糖在溶液中分散過度，不利于后續(xù)的濃縮和沉淀，提取率反而略有下降。提取溫度對多糖提取率也有重要影響。固定微波輔助提取功率1000W，提取時間5min；料液比1:5，超聲提取時間1h，超聲提取3次，分別設(shè)置超聲提取溫度為85℃、90℃、95℃、100℃、105℃。在85℃時，分子熱運動相對較慢，多糖溶出速度較慢，提取率不高；隨著溫度升高到95℃，分子熱運動加劇，多糖的溶解速度加快，提取率達到較高水平；但當溫度升高到105℃時，過高的溫度可能導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)的部分破壞，使提取率降低。提取時間同樣是影響多糖提取率的關(guān)鍵因素。固定微波輔助提取功率1000W，提取時間5min；料液比1:5，超聲提取溫度95℃，超聲提取3次，分別設(shè)置超聲提取時間為0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h。在0.5h時，多糖溶解不完全，提取率較低；隨著提取時間延長到1h，多糖充分溶出，提取率明顯提高；但當提取時間超過1.5h后，繼續(xù)延長時間對提取率的提升效果不明顯，且可能會增加雜質(zhì)的溶出，導(dǎo)致多糖純度下降。提取次數(shù)也會對多糖提取率產(chǎn)生影響。固定微波輔助提取功率1000W，提取時間5min；料液比1:5，超聲提取溫度95℃，提取時間1h，分別設(shè)置超聲提取次數(shù)為1次、2次、3次、4次、5次。提取1次時，果實中的多糖未能充分被提取出來，提取率較低；提取2次時，多糖提取率有較大提升；提取3次時，提取率達到較高水平，繼續(xù)增加提取次數(shù)到4次、5次，雖然提取率仍有一定增加，但增加幅度較小，且會增加提取成本和時間。2.3.2正交試驗或響應(yīng)面法為了確定唐古特白刺果實多糖的最佳提取工藝參數(shù)，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗或響應(yīng)面法進一步優(yōu)化。正交試驗是一種高效的多因素實驗設(shè)計方法，通過合理安排實驗因素和水平，利用正交表進行實驗，能夠以較少的實驗次數(shù)獲得較為全面的信息。以料液比、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)為因素，每個因素選取3個水平，設(shè)計L9(34)正交試驗。根據(jù)正交試驗結(jié)果，運用方差分析等方法，確定各因素對多糖提取率影響的主次順序，以及各因素的最佳水平組合，從而得到最佳提取工藝參數(shù)。響應(yīng)面法是一種基于數(shù)學模型和實驗設(shè)計的優(yōu)化方法，它通過構(gòu)建響應(yīng)變量與多個因素之間的數(shù)學模型，以圖形的方式直觀地展示各因素對響應(yīng)變量的影響，從而確定最佳工藝條件。以多糖提取率為響應(yīng)變量，料液比、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)為自變量，利用Design-Expert等軟件進行實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析。通過實驗數(shù)據(jù)擬合得到響應(yīng)面方程，并繪制響應(yīng)面圖和等高線圖，直觀地分析各因素之間的交互作用對多糖提取率的影響。根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果，確定最佳提取工藝參數(shù)，并通過驗證實驗對優(yōu)化結(jié)果進行驗證。通過正交試驗或響應(yīng)面法的優(yōu)化，能夠得到唐古特白刺果實多糖的最佳提取工藝參數(shù)，提高多糖的提取率和質(zhì)量，為后續(xù)的多糖分離、表征及生物活性研究奠定良好的基礎(chǔ)。2.4分離純化工藝2.4.1除雜從唐古特白刺果實中提取得到的粗多糖溶液中往往含有多種雜質(zhì)，需要進行除雜處理，以提高多糖的純度，為后續(xù)的研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)是常見的雜質(zhì)之一，可采用Sevage法進行去除。該方法的原理基于蛋白質(zhì)在和正丁醇混合溶液中的不溶性。在粗多糖溶液中加入適量的Sevage試劑（與正丁醇按4:1的體積比混合），劇烈振蕩后，蛋白質(zhì)會與Sevage試劑形成不溶性的凝膠狀物質(zhì)，通過離心可使其與多糖溶液分離。具體操作時，將粗多糖溶液與Sevage試劑按一定比例混合，一般為1:1或1:2，在分液漏斗中劇烈振蕩10-15min。振蕩過程中，蛋白質(zhì)與Sevage試劑充分接觸，蛋白質(zhì)分子的疏水基團與和正丁醇相互作用，形成沉淀。振蕩結(jié)束后，將分液漏斗靜置分層15-30min，使下層的-正丁醇-蛋白質(zhì)沉淀與上層的多糖溶液清晰分離。然后，小心地將上層的多糖溶液轉(zhuǎn)移至另一容器中，重復(fù)上述操作3-5次，直至離心后上清液中不再出現(xiàn)白色的蛋白質(zhì)沉淀，通過考馬斯亮藍法檢測蛋白質(zhì)含量，確保蛋白質(zhì)去除完全。色素也是影響多糖純度的重要雜質(zhì)，可利用大孔吸附樹脂進行脫色。大孔吸附樹脂是一類具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑，其吸附原理基于物理吸附和化學吸附。大孔吸附樹脂具有較大的比表面積和孔徑，能夠通過分子間作用力，如范德華力、氫鍵等，吸附色素分子。同時，其表面的某些基團可能與色素分子發(fā)生化學反應(yīng)，增強吸附效果。在實際操作中，選擇合適型號的大孔吸附樹脂，如AB-8型、X-5型等。將大孔吸附樹脂預(yù)處理后裝入層析柱中，先用乙醇浸泡并不斷攪拌6小時，使樹脂充分溶脹，然后用乙醇進行流洗，直至流出液滴入水中不再渾濁，再用去離子水洗至無醇味。將粗多糖溶液以0.5-3.0倍樹脂體積/小時的流速通入裝有大孔樹脂的層析柱中，當層析柱下端流出液用可見分光光度計檢測透光度（610nm）達到50%以上時，停止進料。此時，色素分子被吸附在樹脂上，多糖溶液得以脫色。接著，以相同流速通入去離子水，進一步洗脫殘留的雜質(zhì)，收集洗脫液，得到脫色后的多糖溶液。小分子雜質(zhì)如單糖、寡糖、無機鹽等，可通過透析法去除。透析是利用半透膜的選擇透過性，使小分子物質(zhì)能夠通過半透膜，而大分子多糖則被截留。選擇截留分子量合適的透析袋，如截留分子量為3500Da的透析袋。將多糖溶液裝入透析袋中，扎緊袋口，放入裝有去離子水的容器中，透析袋中的小分子雜質(zhì)會逐漸擴散到去離子水中。每隔一定時間更換一次去離子水，一般每4-6小時更換一次，持續(xù)透析24-48小時。通過檢測透析外液中的小分子物質(zhì)，如利用蒽酮-硫酸法檢測單糖，確保小分子雜質(zhì)去除完全。經(jīng)過透析，多糖溶液中的小分子雜質(zhì)被有效去除，多糖的純度得到進一步提高。2.4.2分級分離經(jīng)過除雜后的唐古特白刺果實多糖，還需進一步進行分級分離，以獲得不同分子量或結(jié)構(gòu)特征的多糖組分，為深入研究多糖的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供基礎(chǔ)。柱層析技術(shù)是常用的多糖分級分離方法之一，其中DEAE-纖維素柱層析應(yīng)用較為廣泛。DEAE-纖維素是一種陰離子交換樹脂，其原理基于多糖分子所帶電荷與DEAE-纖維素上的離子基團之間的靜電相互作用。不同多糖分子由于其結(jié)構(gòu)和組成的差異，所帶電荷的種類和數(shù)量不同，與DEAE-纖維素的結(jié)合能力也不同。在進行柱層析時，將DEAE-纖維素預(yù)處理后裝入層析柱中，先用酸堿溶液處理，使其充分溶脹并平衡，然后用去離子水洗至中性。將除雜后的多糖溶液上樣到DEAE-纖維素柱上，多糖分子會根據(jù)其電荷特性與DEAE-纖維素發(fā)生不同程度的結(jié)合。用不同濃度的鹽溶液進行梯度洗脫，如0-1mol/L的NaCl溶液，隨著鹽濃度的增加，與DEAE-纖維素結(jié)合較弱的多糖先被洗脫下來，而結(jié)合較強的多糖則在較高鹽濃度下被洗脫。通過自動部分收集器收集洗脫液，每管收集一定體積，如5-10mL。利用苯酚-硫酸法檢測各管洗脫液中的多糖含量，繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線確定不同多糖組分的洗脫位置，從而將多糖分離成不同的級分。SephadexG-100凝膠柱層析也常用于多糖的分級分離，其原理基于分子篩效應(yīng)。SephadexG-100是一種具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的葡聚糖凝膠，多糖分子通過凝膠柱時，會根據(jù)其分子量大小在凝膠的孔隙中進行擴散。分子量較大的多糖分子無法進入凝膠孔隙，只能在凝膠顆粒之間的空隙中快速通過，因此洗脫速度較快；而分子量較小的多糖分子能夠進入凝膠孔隙，在孔隙中擴散的路徑較長，洗脫速度較慢。在操作過程中，將SephadexG-100凝膠充分溶脹后裝入層析柱中，用去離子水或緩沖溶液平衡柱子。將經(jīng)過DEAE-纖維素柱層析初步分離得到的多糖級分上樣到SephadexG-100凝膠柱上，然后用相同的緩沖溶液進行洗脫。同樣利用自動部分收集器收集洗脫液，通過苯酚-硫酸法檢測多糖含量，繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線收集不同分子量范圍的多糖級分。膜分離技術(shù)作為一種新興的分離方法，也可用于唐古特白刺果實多糖的分級分離。超濾是膜分離技術(shù)的一種，其利用超濾膜的篩分作用，根據(jù)多糖分子的分子量大小進行分離。選擇截留分子量合適的超濾膜，如截留分子量為8萬-12萬的超濾膜。將除雜后的多糖溶液通入超濾設(shè)備中，在一定的壓力下，分子量小于超濾膜截留分子量的多糖分子和小分子雜質(zhì)透過超濾膜，形成超濾透過液；而分子量大的多糖分子則被截留，留在超濾膜一側(cè)，形成超濾截留液。通過控制超濾過程中的壓力、流速、溫度等條件，如控制超濾設(shè)備頻率為36.5-38.0赫茲，入口壓力為1.2-1.3兆帕，出口壓力為0.1-1.2兆帕，可以實現(xiàn)多糖的有效分級分離。當超濾設(shè)備中多糖溶液體積濃縮至原體積的1/3時，反復(fù)加入去離子水流洗，以充分回收截留的多糖。通過檢測超濾透過液和截留液中的多糖含量和分子量分布，確定不同級分的多糖。納濾也是膜分離技術(shù)的一種，其截留分子量介于超濾和反滲透之間，一般為100-1000Da。對于經(jīng)過超濾初步分級的多糖，可進一步利用納濾進行精細分級。將超濾得到的多糖溶液通入納濾設(shè)備中，選擇截留分子量為600-700的納濾膜。在適當?shù)牟僮鲏毫ο拢缈刂萍{濾設(shè)備頻率為36.5-38.0赫茲，入口壓力為12.0-12.3兆帕，出口壓力為10.0-10.2兆帕，不同分子量的多糖在納濾膜的作用下進一步分離，從而得到更精細的多糖級分。三、唐古特白刺果實多糖的表征3.1理化性質(zhì)測定3.1.1純度鑒定純度鑒定是多糖研究的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，準確判斷唐古特白刺果實多糖的純度，對于后續(xù)深入探究其結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。高效凝膠滲透色譜（HPGPC）是常用的多糖純度鑒定方法之一，其原理基于分子篩效應(yīng)。多糖分子在流動相的帶動下進入裝填有特定孔徑凝膠顆粒的色譜柱，分子體積大于凝膠孔隙的多糖無法進入孔隙，只能在凝膠顆粒間的間隙快速通過，淋出時間較短；而分子體積小于凝膠孔隙的多糖則可進入孔隙，在柱內(nèi)的停留時間較長，淋出時間也隨之延長。基于此，不同分子量的多糖在色譜柱中得以分離。若所得多糖樣品在HPGPC圖譜上呈現(xiàn)出單一、尖銳的峰，表明該多糖具有較高的純度，是均一的多糖組分；若圖譜上出現(xiàn)多個峰，則說明樣品中存在不同分子量的多糖或雜質(zhì)，純度較低。除HPGPC外，紙色譜（PC）和薄層色譜（TLC）也可用于唐古特白刺果實多糖的純度鑒定。PC以濾紙作為固定相載體，樣品中的多糖在展開劑的作用下在濾紙上進行分配，由于不同多糖或雜質(zhì)在固定相和流動相之間的分配系數(shù)存在差異，從而實現(xiàn)分離。TLC則是將吸附劑均勻涂布在薄板上，形成固定相，多糖樣品點樣后，在展開劑中展開，根據(jù)不同組分在薄板上的遷移距離不同來判斷純度。在PC和TLC分析中，若多糖樣品只出現(xiàn)一個清晰、集中的斑點，且與標準品的Rf值（比移值）一致，說明該多糖純度較高；若出現(xiàn)多個斑點，則意味著樣品中存在雜質(zhì)或多種多糖成分。紫外-可見分光光度法也常用于多糖純度的初步判斷。蛋白質(zhì)在280nm處有特征吸收峰，核酸在260nm處有明顯吸收峰，通過掃描唐古特白刺果實多糖樣品在200-300nm波長范圍內(nèi)的紫外吸收光譜，若在280nm和260nm處無明顯吸收峰，可初步推斷該多糖樣品中蛋白質(zhì)和核酸雜質(zhì)含量較低，純度相對較高；若存在明顯吸收峰，則表明多糖中可能含有蛋白質(zhì)或核酸等雜質(zhì)，需要進一步除雜處理。3.1.2分子量測定分子量是多糖的重要參數(shù)之一，它與多糖的物理化學性質(zhì)以及生物活性密切相關(guān)。凝膠滲透色譜（GPC）結(jié)合多角度激光光散射（MALLS）技術(shù)是測定唐古特白刺果實多糖分子量的常用方法。GPC基于分子篩原理，根據(jù)多糖分子體積大小在色譜柱中實現(xiàn)分離。而MALLS則是通過測量多糖分子對激光的散射光強，依據(jù)散射光強與分子質(zhì)量的關(guān)系，精確測定多糖的絕對分子量。在實驗過程中，將多糖樣品注入GPC系統(tǒng)，多糖分子在流動相的推動下通過色譜柱，按分子量大小依次被洗脫出來。同時，與GPC相連的MALLS檢測器實時檢測洗脫液中多糖分子的散射光強，通過儀器自帶的軟件，根據(jù)光散射理論和相關(guān)算法，計算出多糖的分子量。除GPC-MALLS技術(shù)外，質(zhì)譜法也可用于多糖分子量的測定，尤其是對于分子量相對較小的多糖?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）是常用的質(zhì)譜分析方法之一。在該方法中，首先將多糖樣品與合適的基質(zhì)混合，基質(zhì)能夠吸收激光能量并傳遞給多糖分子，使多糖分子離子化并從基質(zhì)表面解吸出來。離子化的多糖分子在電場的作用下加速進入飛行時間質(zhì)量分析器，根據(jù)不同離子飛行時間的差異來確定其質(zhì)荷比（m/z），進而得到多糖的分子量信息。MALDI-TOF-MS具有分析速度快、靈敏度高、分辨率好等優(yōu)點，能夠準確測定多糖的分子量，且對樣品的純度要求相對較低。此外，粘度法也是一種傳統(tǒng)的測定多糖分子量的方法，其原理基于多糖溶液的特性粘度與分子量之間的關(guān)系。通過測量不同濃度下唐古特白刺果實多糖溶液的粘度，利用Mark-Houwink方程計算出多糖的粘均分子量。在實際操作中，先配制一系列不同濃度的多糖溶液，使用烏氏粘度計測量各溶液的流出時間，計算出相對粘度、增比粘度和特性粘度。然后，根據(jù)Mark-Houwink方程，結(jié)合已知的多糖K、α值（不同多糖的K、α值可通過實驗測定或查閱文獻獲得），計算出多糖的粘均分子量。粘度法設(shè)備簡單、操作方便，但該方法得到的是粘均分子量，且受多糖分子構(gòu)象、溶劑性質(zhì)等因素影響較大，準確性相對較低。3.1.3單糖組成分析單糖組成是唐古特白刺果實多糖結(jié)構(gòu)的重要組成部分，它決定了多糖的基本性質(zhì)和功能。氣相色譜（GC）是分析多糖單糖組成的常用方法之一。在進行GC分析前，需先將多糖進行完全酸水解，使多糖分子中的糖苷鍵斷裂，分解為單糖。由于單糖的揮發(fā)性較差，難以直接進行GC分析，因此需要對單糖進行衍生化處理，將其轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性較強的衍生物。常用的衍生化試劑有硅烷化試劑、乙?；噭┑龋怨柰榛噭槔?，硅烷化試劑中的硅烷基能夠與單糖分子中的羥基發(fā)生反應(yīng)，形成硅烷化衍生物，提高單糖的揮發(fā)性。衍生化后的單糖混合物注入GC中，在載氣的帶動下通過色譜柱，不同的單糖衍生物由于在固定相和流動相之間的分配系數(shù)不同，在色譜柱中實現(xiàn)分離，然后通過檢測器檢測，根據(jù)保留時間與標準單糖衍生物的保留時間對比，確定多糖中所含單糖的種類，再通過峰面積或峰高計算各單糖的相對含量。高效液相色譜（HPLC）也廣泛應(yīng)用于唐古特白刺果實多糖單糖組成的分析。與GC不同，HPLC可直接分析具有紫外吸收或熒光特性的單糖，對于本身無紫外吸收或熒光特性的單糖，同樣需要進行衍生化處理，使其具有可檢測的信號。常用的衍生化方法有柱前衍生和柱后衍生。柱前衍生是在進樣前將單糖與衍生化試劑反應(yīng)，生成具有紫外吸收或熒光特性的衍生物；柱后衍生則是在單糖經(jīng)過色譜柱分離后，與衍生化試劑在柱后反應(yīng)，再進行檢測。以柱前衍生為例，選用合適的衍生化試劑與水解后的單糖反應(yīng)，然后將衍生化產(chǎn)物注入HPLC系統(tǒng)，通過色譜柱分離，利用紫外檢測器或熒光檢測器檢測，根據(jù)標準單糖衍生物的色譜圖，確定多糖中各單糖的種類和含量。HPLC具有分離效率高、分析速度快、靈敏度高等優(yōu)點，能夠準確分析多糖的單糖組成。離子色譜（IC）也是分析多糖單糖組成的有效手段，尤其是對于一些含有酸性或堿性基團的單糖。IC利用離子交換原理，通過離子交換樹脂對不同離子的親和力差異，實現(xiàn)對單糖的分離。在分析唐古特白刺果實多糖單糖組成時，無需對單糖進行復(fù)雜的衍生化處理，可直接將水解后的單糖樣品注入IC系統(tǒng)進行分析。IC配備有合適的檢測器，如電導(dǎo)檢測器、脈沖安培檢測器等，能夠?qū)Ψ蛛x后的單糖進行檢測，根據(jù)保留時間和峰面積確定單糖的種類和含量。IC具有操作簡便、無需衍生化、對酸堿性單糖分析效果好等優(yōu)點，為多糖單糖組成分析提供了一種可靠的方法。3.2結(jié)構(gòu)表征3.2.1紅外光譜分析紅外光譜分析是研究唐古特白刺果實多糖結(jié)構(gòu)的重要手段之一，它能夠提供多糖分子中官能團和化學鍵的信息，為深入了解多糖的結(jié)構(gòu)特征奠定基礎(chǔ)。將經(jīng)過純化的唐古特白刺果實多糖樣品與干燥的溴化鉀（KBr）粉末充分混合，在瑪瑙研缽中研磨均勻，使其成為細膩的粉末狀混合物。隨后，利用壓片機將該混合物壓制成透明的薄片，以便進行紅外光譜測試。將壓制好的薄片放置在傅里葉變換紅外光譜儀的樣品池中，在4000-400cm-1的波數(shù)范圍內(nèi)進行掃描，掃描次數(shù)通常設(shè)定為32次，分辨率為4cm-1，以獲取高質(zhì)量的紅外光譜圖。在得到的紅外光譜圖中，3400cm-1左右出現(xiàn)的寬而強的吸收峰，歸屬于多糖分子中羥基（-OH）的伸縮振動，這是多糖分子中大量存在的官能團，其吸收峰的強度和寬度反映了多糖分子中羥基的數(shù)量和氫鍵的作用情況。2930cm-1附近的吸收峰則是由于多糖分子中碳-氫（C-H）鍵的伸縮振動產(chǎn)生的，表明多糖分子中存在飽和烴基。在1600-1700cm-1區(qū)域，若出現(xiàn)吸收峰，可能與多糖分子中的羰基（C=O）有關(guān)，羰基的存在可能源于多糖的糖醛酸殘基或乙?；然鶊F。1000-1200cm-1區(qū)域的吸收峰較為復(fù)雜，主要與多糖分子中C-O-C、C-O等鍵的伸縮振動相關(guān)，這些吸收峰對于判斷多糖的糖苷鍵類型和糖環(huán)結(jié)構(gòu)具有重要意義。例如，在某些多糖中，1070cm-1左右的吸收峰可用于表征吡喃糖環(huán)的存在。此外，800-900cm-1區(qū)域的吸收峰可用于確定糖苷鍵的構(gòu)型，若在890cm-1附近出現(xiàn)吸收峰，通常表明存在β-糖苷鍵；而在840cm-1附近出現(xiàn)吸收峰，則暗示可能存在α-糖苷鍵。通過對唐古特白刺果實多糖紅外光譜圖中這些特征吸收峰的分析，可以初步推斷多糖分子中所含的官能團以及糖苷鍵的類型，為進一步研究多糖的結(jié)構(gòu)提供重要線索。3.2.2核磁共振分析核磁共振（NMR）技術(shù)是解析唐古特白刺果實多糖精細結(jié)構(gòu)的強大工具，它能夠提供多糖分子中各原子的化學環(huán)境、連接方式以及空間構(gòu)型等詳細信息。在進行核磁共振分析時，首先將純化后的唐古特白刺果實多糖樣品溶解在合適的氘代溶劑中，常用的氘代溶劑有重水（D2O），因為多糖在重水中具有良好的溶解性，且重水能夠提供穩(wěn)定的核磁共振信號背景。將溶解好的樣品轉(zhuǎn)移至核磁共振管中，確保樣品溶液均勻且無氣泡，然后將核磁共振管放入核磁共振譜儀的探頭中。1H-NMR譜能夠提供多糖分子中氫原子的信息。在1H-NMR譜圖中，不同化學環(huán)境的氫原子會在不同的化學位移處出現(xiàn)吸收峰。例如，多糖分子中糖環(huán)上的異頭氫原子，由于其處于特殊的化學環(huán)境，通常在4.3-6.0ppm的化學位移范圍內(nèi)出現(xiàn)吸收峰。通過分析異頭氫的化學位移和耦合常數(shù)，可以確定糖苷鍵的構(gòu)型，當異頭氫的化學位移在4.3-5.0ppm之間，且耦合常數(shù)J1,2約為7-8Hz時，通常表明存在β-糖苷鍵；而當異頭氫的化學位移在5.0-6.0ppm之間，耦合常數(shù)J1,2約為3-4Hz時，則暗示存在α-糖苷鍵。此外，1H-NMR譜中還可以觀察到糖環(huán)上其他位置氫原子的吸收峰，通過對這些吸收峰的積分和耦合關(guān)系分析，可以進一步了解多糖分子中糖殘基的連接順序和數(shù)量。13C-NMR譜則主要提供多糖分子中碳原子的信息。在13C-NMR譜圖中，不同類型的碳原子，如異頭碳、糖環(huán)上的其他碳原子以及側(cè)鏈碳原子等，會在不同的化學位移處出現(xiàn)特征吸收峰。例如，異頭碳的化學位移通常在90-110ppm之間，通過分析異頭碳的化學位移，可以輔助確定糖苷鍵的構(gòu)型。糖環(huán)上其他碳原子的化學位移范圍相對較寬，通過對各碳原子化學位移的分析以及與標準譜圖的對比，可以推斷多糖分子中糖殘基的種類和連接方式。此外，二維核磁共振技術(shù)，如COSY（相關(guān)譜）、HSQC（異核單量子相干譜）和HMBC（異核多鍵相干譜）等，能夠提供更多關(guān)于多糖分子中原子之間連接關(guān)系的信息。COSY譜可以顯示氫原子之間的耦合關(guān)系，從而確定相鄰氫原子的連接順序；HSQC譜能夠建立氫原子與直接相連碳原子之間的關(guān)聯(lián)；HMBC譜則可以檢測到氫原子與遠程碳原子之間的耦合關(guān)系，對于確定多糖分子中糖殘基之間的連接位置和糖苷鍵的連接方式具有重要作用。通過綜合分析1H-NMR、13C-NMR以及二維核磁共振譜圖，能夠全面、深入地解析唐古特白刺果實多糖的精細結(jié)構(gòu)。3.2.3剛果紅實驗剛果紅實驗是判斷唐古特白刺果實多糖是否具有三股螺旋結(jié)構(gòu)的常用方法，其原理基于剛果紅與多糖之間的特異性相互作用。剛果紅是一種酸性染料，能溶于水和酒精，它可與具有三股螺旋鏈構(gòu)象的多糖形成絡(luò)合物。在一定條件下，這種絡(luò)合物的最大吸收波長同剛果紅本身相比會發(fā)生紅移現(xiàn)象，即向長波長方向移動。這是因為多糖的三股螺旋結(jié)構(gòu)與剛果紅分子之間通過氫鍵、范德華力等相互作用形成了穩(wěn)定的絡(luò)合物，改變了剛果紅分子的電子云分布，從而導(dǎo)致其吸收光譜發(fā)生變化。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著多糖與剛果紅形成絡(luò)合物，溶液的顏色會發(fā)生特征變化，通常變?yōu)樽霞t色。當向溶液中加入氫氧化鈉（NaOH）溶液，使溶液的堿性逐漸增強時，隨著NaOH濃度的增加，多糖的三股螺旋結(jié)構(gòu)會逐漸解體。這是因為堿性條件下，多糖分子中的氫鍵等相互作用被破壞，導(dǎo)致三股螺旋結(jié)構(gòu)無法維持，多糖分子變成無規(guī)則的線團形式。此時，絡(luò)合物的穩(wěn)定性下降，最大吸收波長急劇下降。在進行剛果紅實驗時，準確稱取5mg經(jīng)過純化的唐古特白刺果實多糖樣品，將其加入到含有2.0ml蒸餾水和2.0ml80umol/L剛果紅試劑的試管中，充分振蕩使多糖樣品與剛果紅試劑均勻混合。然后，使用微量移液器逐滴加入1mol/L的NaOH溶液，使溶液中NaOH的終濃度由0.0mol/L逐漸升高到0.5mol/L。在每次加入NaOH溶液后，都要充分振蕩試管，確保溶液混合均勻。使用紫外可見記錄光譜儀對溶液進行掃描，掃描波長范圍設(shè)定為400-600nm，以獲取各NaOH濃度條件下溶液的吸收光譜，確定最大吸收波長。以NaOH濃度為橫坐標，最大吸收波長為縱坐標繪制曲線。如果唐古特白刺果實多糖具有三股螺旋結(jié)構(gòu)，在NaOH濃度較低時，曲線會呈現(xiàn)出紅移現(xiàn)象，即最大吸收波長逐漸增大；當NaOH濃度大于某一數(shù)值后，曲線會出現(xiàn)急劇下降的趨勢，表明多糖的三股螺旋結(jié)構(gòu)解體。通過對曲線的分析，可以判斷唐古特白刺果實多糖是否具有三股螺旋結(jié)構(gòu)以及該結(jié)構(gòu)在不同堿性條件下的穩(wěn)定性。四、唐古特白刺果實多糖免疫調(diào)節(jié)活性研究4.1實驗動物與細胞模型選用健康的Balb/c小鼠，體重18-22g，購自[實驗動物供應(yīng)商名稱]，飼養(yǎng)于溫度為（23±2）℃、相對濕度為（50±10）%的環(huán)境中，自由進食和飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后進行實驗。免疫細胞模型選用小鼠巨噬細胞RAW264.7，該細胞株購自[細胞庫名稱]。將RAW264.7細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)期時，用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL，用于后續(xù)實驗。四、唐古特白刺果實多糖免疫調(diào)節(jié)活性研究4.2免疫調(diào)節(jié)活性評價指標4.2.1免疫器官指數(shù)免疫器官指數(shù)是衡量機體免疫功能的重要指標之一，它與免疫功能密切相關(guān)。胸腺和脾臟是機體重要的免疫器官，胸腺是T淋巴細胞發(fā)育、分化和成熟的主要場所，在細胞免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。脾臟則是人體最大的淋巴器官，是B淋巴細胞定居和增殖的場所，在體液免疫中起著重要作用，同時也參與細胞免疫反應(yīng)。免疫器官的發(fā)育狀況和功能狀態(tài)直接影響機體的免疫應(yīng)答能力。當機體受到抗原刺激時，免疫器官中的淋巴細胞會增殖分化，免疫器官的重量也會相應(yīng)發(fā)生變化。免疫器官指數(shù)的升高，通常意味著免疫器官中淋巴細胞的增殖活躍，免疫細胞數(shù)量增加，免疫器官的功能增強，進而反映出機體的免疫功能處于較為活躍的狀態(tài)，能夠更好地應(yīng)對病原體的入侵和抗原的刺激。相反，免疫器官指數(shù)降低，可能表明免疫器官發(fā)育不良、受到損傷或免疫功能受到抑制。在實驗中，準確測定免疫器官指數(shù)至關(guān)重要。將小鼠脫頸椎處死后，迅速打開胸腔和腹腔，小心取出胸腺和脾臟。用預(yù)冷的生理鹽水輕輕沖洗，去除表面的血跡和雜質(zhì)。用濾紙吸干器官表面的水分，然后使用精度為0.0001g的電子天平準確稱量胸腺和脾臟的重量。根據(jù)小鼠的體重，按照公式計算免疫器官指數(shù)：免疫器官指數(shù)=免疫器官重量（mg）/體重（g）。通過比較不同實驗組小鼠的免疫器官指數(shù)，可以直觀地了解唐古特白刺果實多糖對免疫器官發(fā)育和功能的影響。例如，若實驗組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯高于對照組，說明唐古特白刺果實多糖可能促進了免疫器官的發(fā)育，增強了免疫器官的功能，進而對機體的免疫功能產(chǎn)生積極的調(diào)節(jié)作用。4.2.2細胞因子分泌水平細胞因子是由免疫細胞（如單核、巨噬細胞、T細胞、B細胞、NK細胞等）和某些非免疫細胞（內(nèi)皮細胞、表皮細胞、纖維母細胞等）經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質(zhì)。它們在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著核心作用，是免疫細胞之間相互通訊和調(diào)節(jié)的重要介質(zhì)。細胞因子通過與靶細胞表面的特異性受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、增殖和功能，從而實現(xiàn)對免疫應(yīng)答的精細調(diào)控。白細胞介素-2（IL-2）主要由激活的T淋巴細胞產(chǎn)生，它能刺激T細胞生長，促進T輔助細胞和自然殺傷細胞產(chǎn)生細胞因子，增強免疫細胞的殺傷活性，在細胞免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。干擾素-γ（IFN-γ）具有很強的免疫調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)T、B淋巴細胞的免疫功能，促進巨噬細胞吞噬能力和炎癥反應(yīng)，增強機體的抗病毒和抗腫瘤免疫能力。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）具有直接殺傷腫瘤細胞的作用，參與單核巨噬細胞的活化及自分泌的調(diào)節(jié)作用，還能促進其他細胞因子的產(chǎn)生，在免疫防御和炎癥反應(yīng)中扮演重要角色。檢測細胞因子分泌水平的方法多種多樣，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）是最常用的方法之一。其原理是將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合進行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測。在檢測唐古特白刺果實多糖對細胞因子分泌水平的影響時，首先將針對特定細胞因子（如IL-2、IFN-γ、TNF-α等）的捕獲抗體包被在酶標板上，然后加入待檢測的細胞培養(yǎng)上清或血清樣本，樣本中的細胞因子會與捕獲抗體結(jié)合。經(jīng)過洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入酶標記的檢測抗體，它會與已結(jié)合的細胞因子形成夾心復(fù)合物。最后加入酶底物，在酶的催化作用下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)，通過酶標儀測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算出樣本中細胞因子的濃度。ELISA方法具有穩(wěn)定性好、操作簡單、快速、敏感性高、特異性強、實驗設(shè)備要求簡單、應(yīng)用范圍廣泛、無放射性污染等優(yōu)點，能夠準確地檢測細胞因子的分泌水平，為研究唐古特白刺果實多糖的免疫調(diào)節(jié)機制提供重要的數(shù)據(jù)支持。4.2.3免疫細胞增殖與活化免疫細胞的增殖與活化是機體免疫應(yīng)答的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接反映了免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)。T淋巴細胞和B淋巴細胞作為免疫系統(tǒng)的核心細胞群體，在免疫防御、免疫監(jiān)視和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。當機體受到抗原刺激時，T淋巴細胞和B淋巴細胞會被激活，發(fā)生增殖和分化。T淋巴細胞可分化為輔助性T細胞（Th）、細胞毒性T細胞（Tc）等不同亞群，Th細胞能夠分泌細胞因子，輔助其他免疫細胞的活化和功能發(fā)揮，Tc細胞則可直接殺傷被病原體感染的細胞或腫瘤細胞。B淋巴細胞活化后會分化為漿細胞，分泌特異性抗體，參與體液免疫反應(yīng)。檢測免疫細胞增殖與活化的實驗方法豐富多樣，MTT比色法是常用的檢測細胞增殖的方法之一。MTT是一種黃色的四唑鹽，可被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。在實驗中，將免疫細胞（如T淋巴細胞、B淋巴細胞）接種于96孔板中，加入不同濃度的唐古特白刺果實多糖進行處理。培養(yǎng)一定時間后，每孔加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時。然后吸出上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）溶解甲瓚結(jié)晶。最后用酶聯(lián)免疫檢測儀在特定波長下測定各孔的吸光度，吸光度值與活細胞數(shù)量成正比，通過比較不同組的吸光度值，可判斷唐古特白刺果實多糖對免疫細胞增殖的影響。流式細胞術(shù)也是檢測免疫細胞增殖與活化的重要技術(shù)，它能夠?qū)蝹€細胞進行多參數(shù)分析。在檢測免疫細胞活化時，可利用熒光標記的抗體特異性地結(jié)合免疫細胞表面的活化標志物，如T淋巴細胞表面的CD25、CD69等，B淋巴細胞表面的CD80、CD86等。將免疫細胞與熒光抗體孵育后，通過流式細胞儀檢測，根據(jù)熒光信號的強度和細胞的散射光特性，可區(qū)分不同類型的免疫細胞，并分析其活化狀態(tài)。通過比較不同實驗組中活化免疫細胞的比例，能夠深入了解唐古特白刺果實多糖對免疫細胞活化的調(diào)節(jié)作用。這些檢測方法對于研究唐古特白刺果實多糖的免疫調(diào)節(jié)活性具有重要意義，能夠從細胞水平揭示其作用機制，為進一步開發(fā)利用唐古特白刺果實多糖提供理論依據(jù)。4.3體內(nèi)實驗4.3.1正常小鼠實驗將40只健康的Balb/c小鼠隨機分為4組，每組10只，分別為正常對照組、低劑量多糖組、中劑量多糖組和高劑量多糖組。正常對照組給予等體積的生理鹽水灌胃，低、中、高劑量多糖組分別給予100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg的唐古特白刺果實多糖灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃14天。在灌胃結(jié)束后，稱取小鼠體重，然后脫頸椎處死小鼠，迅速取出胸腺和脾臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干表面水分，用電子天平精確稱量胸腺和脾臟的重量，計算免疫器官指數(shù)。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，中、高劑量多糖組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著升高，表明唐古特白刺果實多糖能夠促進正常小鼠免疫器官的發(fā)育，增強免疫器官的功能。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測小鼠血清中細胞因子的分泌水平。收集小鼠血液，離心分離血清，按照ELISA試劑盒的操作說明書，檢測血清中白細胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量。結(jié)果表明，中、高劑量多糖組小鼠血清中IL-2、IFN-γ和TNF-α的含量均顯著高于正常對照組，說明唐古特白刺果實多糖能夠促進正常小鼠免疫細胞分泌細胞因子，增強免疫細胞之間的通訊和調(diào)節(jié)，從而提高機體的免疫功能。利用MTT比色法檢測小鼠脾淋巴細胞的增殖能力。取小鼠脾臟，制備脾淋巴細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL，接種于96孔板中，每孔100μL。分別加入不同濃度的唐古特白刺果實多糖，同時設(shè)置對照組（只加細胞和培養(yǎng)基）和陽性對照組（加入ConA），每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)48h后，每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。然后吸出上清液，加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定各孔的吸光度。結(jié)果顯示，中、高劑量多糖組小鼠脾淋巴細胞的增殖能力顯著高于正常對照組，表明唐古特白刺果實多糖能夠促進正常小鼠脾淋巴細胞的增殖，增強機體的免疫應(yīng)答能力。4.3.2免疫抑制小鼠實驗采用環(huán)磷酰胺（Cy）構(gòu)建免疫抑制小鼠模型。將40只Balb/c小鼠隨機分為4組，每組10只，分別為模型對照組、低劑量多糖組、中劑量多糖組和高劑量多糖組。除正常對照組外，其余三組小鼠均腹腔注射環(huán)磷酰胺80mg/kg，連續(xù)注射3天，構(gòu)建免疫抑制模型。造模成功后，低、中、高劑量多糖組分別給予100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg的唐古特白刺果實多糖灌胃，正常對照組和模型對照組給予等體積的生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃14天。測定免疫器官指數(shù)，結(jié)果顯示，模型對照組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著低于正常對照組，表明環(huán)磷酰胺成功誘導(dǎo)了小鼠的免疫抑制，導(dǎo)致免疫器官萎縮。而低、中、高劑量多糖組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著高于模型對照組，說明唐古特白刺果實多糖能夠緩解免疫抑制小鼠免疫器官的萎縮，促進免疫器官的恢復(fù)和發(fā)育。利用ELISA法檢測小鼠血清中細胞因子的分泌水平，結(jié)果表明，模型對照組小鼠血清中IL-2、IFN-γ和TNF-α的含量顯著低于正常對照組，表明免疫抑制導(dǎo)致小鼠免疫細胞分泌細胞因子的能力下降。低、中、高劑量多糖組小鼠血清中這些細胞因子的含量均顯著高于模型對照組，說明唐古特白刺果實多糖能夠促進免疫抑制小鼠免疫細胞分泌細胞因子，恢復(fù)免疫細胞的功能，增強機體的免疫調(diào)節(jié)能力。采用MTT比色法檢測小鼠脾淋巴細胞的增殖能力，結(jié)果顯示，模型對照組小鼠脾淋巴細胞的增殖能力顯著低于正常對照組，表明免疫抑制抑制了脾淋巴細胞的增殖。低、中、高劑量多糖組小鼠脾淋巴細胞的增殖能力均顯著高于模型對照組，說明唐古特白刺果實多糖能夠促進免疫抑制小鼠脾淋巴細胞的增殖，提高機體的免疫應(yīng)答水平，對免疫抑制小鼠的免疫功能具有明顯的調(diào)節(jié)和恢復(fù)作用。4.4體外實驗4.4.1免疫細胞培養(yǎng)將小鼠巨噬細胞RAW264.7從液氮中取出，迅速放入37℃水浴鍋中解凍，待細胞完全解凍后，轉(zhuǎn)移至含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基的離心管中，1000r/min離心5min，棄上清，加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細胞。將細胞懸液接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至80%-90%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化，輕輕吹打使細胞脫落，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL，進行傳代培養(yǎng)或用于后續(xù)實驗。在細胞培養(yǎng)過程中，定期觀察細胞的生長狀態(tài)，包括細胞形態(tài)、密度等，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，以保證細胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和適宜的生長環(huán)境。若發(fā)現(xiàn)細胞有污染跡象，如培養(yǎng)液渾濁、出現(xiàn)異味、細胞形態(tài)異常等，應(yīng)及時采取相應(yīng)措施，如丟棄污染細胞，對培養(yǎng)器具進行嚴格消毒，重新復(fù)蘇細胞進行培養(yǎng)。4.4.2多糖對免疫細胞功能的影響采用MTT比色法檢測唐古特白刺果實多糖對RAW264.7細胞增殖的影響。將RAW264.7細胞以每孔1×10?個的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度（0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL）的唐古特白刺果實多糖，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），孵育4h。然后吸出上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定各孔的吸光度。結(jié)果顯示，與對照組相比，50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL濃度的多糖組細胞增殖能力顯著增強，表明唐古特白刺果實多糖能夠促進RAW264.7細胞的增殖。通過中性紅吞噬實驗檢測唐古特白刺果實多糖對RAW264.7細胞吞噬能力的影響。將RAW264.7細胞以每孔1×10?個的密度接種于24孔板中，每孔加入500μL培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度（0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL）的唐古特白刺果實多糖，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入50μL中性紅溶液（0.075%），孵育2h。用PBS輕輕洗滌細胞3次，以去除未被吞噬的中性紅。然后每孔加入500μL細胞裂解液（乙酸：乙醇=1:1），振蕩15min，使細胞內(nèi)的中性紅釋放出來。