ICSCCSBDB32/T5099—甘藍(lán)類(lèi)蔬菜黑斑病菌分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程TechnicalcodeofpracticeformoleculardetectionAlternariabrassicicolaoncole2025-03-25發(fā) 2025-04-25實(shí)江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理 發(fā)中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版 出DBDB32/T5099—DBDB32/T5099— 前 范 規(guī)范性引用文 術(shù)語(yǔ)和定 縮略 原 試劑和材 儀器設(shè) 試驗(yàn)步 結(jié)果判 附錄A（資料性）甘藍(lán)類(lèi)蔬菜黑斑 附錄B（規(guī)范性）RPA產(chǎn)物電泳 本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由江蘇省園藝標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)提出、歸口并組織實(shí)施。DBDB32/T5099—DBDB32/T5099—甘藍(lán)類(lèi)蔬菜黑斑病菌分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了甘藍(lán)類(lèi)蔬菜黑斑病菌分子檢測(cè)的原理本文件適用于甘藍(lán)類(lèi)蔬菜葉片規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文包括所有的修改單適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法SN/T2965植物病原真菌分子生物學(xué)檢測(cè)規(guī)范術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。蕓薹生鏈格孢Alternaria引起甘藍(lán)類(lèi)蔬菜黑斑病的主要病原注：甘藍(lán)類(lèi)蔬菜黑斑病癥狀及病原菌形態(tài)特征見(jiàn)附錄A縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）PCR（Polymerasechainreaction）RPA（Recombinasepolymeraseamplification）Tris：三羥甲基氨基甲烷[Tris（hydroxymethyl）aminomethane]TAE三羥甲基氨基甲烷/乙酸/乙二胺四乙酸（Tris/aceticacid/ethylenediaminetetraacetic原理重組酶聚合酶擴(kuò)增是一種快速分子檢測(cè)技術(shù)，主要依靠重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和鏈置換DNA聚合酶，在特定恒溫條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)甘藍(lán)類(lèi)蔬菜黑斑病菌靶標(biāo)序列的高效擴(kuò)增。RPA反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，重組酶在三磷酸腺苷的參與下結(jié)合引物，形成重組酶?引物復(fù)合體。這些復(fù)合體能夠掃描與引物序列互補(bǔ)的目標(biāo)雙鏈DNA5′端位點(diǎn)，隨后單鏈結(jié)合蛋白與被置換單鏈結(jié)合使其穩(wěn)定。最后鏈置換DNA聚合酶結(jié)合在核酸蛋白復(fù)合體的游離3′端，進(jìn)行鏈延伸。以上步驟循環(huán)進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)甘藍(lán)類(lèi)蔬菜黑斑病菌靶標(biāo)序列的指數(shù)式擴(kuò)增。試劑和材料水：實(shí)驗(yàn)室用水符合GB/T6682的規(guī)定。RPA所用的引物序列見(jiàn)表1表 引物序引物正向引物CAGACATGAACACGCCAACATGACTAGACC反向引物GTGAGGCTTAGCGTAGAGTGTCAACGGTTC液氮。基因組DNA提取試劑盒。RPAAB緩沖液和含有凍干粉劑的反應(yīng)管。DNA抽提液Tris25∶24∶1混合。50×TAE（pH8.5）瓊脂糖。核酸染料。DL2000DNAmarker微量移液器配套的帶濾芯吸頭。離心管：1.5mL儀器設(shè)備電子天平：分度值為0.001g臺(tái)式低溫高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥13000r/min溫度4℃可控。微量移液器：量程分別為2.5μL10μL20μL100μL和1000μLPCR儀或恒溫水浴鍋。4℃冰箱和-20℃冰箱。水平電泳儀。凝膠成像儀。試驗(yàn)步驟樣品采集樣品保存于4℃48h樣品處理SN/T2965100mg1.5mL離DNA提取試劑盒提取基因組DNA保存于-20℃冰箱備用。RPA反應(yīng)以提取的樣品基因組DNADNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行RPA反應(yīng)。同時(shí)設(shè)置以下對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照中添加蕓薹生鏈格孢基因組DNA作為模板；陰性對(duì)照中添加健康甘藍(lán)類(lèi)蔬菜葉片來(lái)源的基因組DNA作為模板；空白對(duì)照中添加滅菌超純水作為模板。檢測(cè)體系見(jiàn)表2。表 蕓薹生鏈格孢RPA檢測(cè)反應(yīng)體組分體積A緩沖液模板滅菌超純水B緩沖液總體積依次向含有凍干粉劑的反應(yīng)管中加入上述組分，充分混勻后置于PCR儀或恒溫水浴鍋中，38℃孵育30min。反應(yīng)結(jié)束后加入等體積DNA抽提液，4℃條件下以不低于13000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中。配制1×TAE緩沖液和1%瓊脂糖凝膠（50mL瓊脂糖溶液中加入5μL10000×核酸染料，用微量移液器各吸取5μLDL2000DNAmarker10μL上清點(diǎn)樣，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果判定試驗(yàn)成立條件試驗(yàn)成立應(yīng)符合附錄B的要求，即陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)目的條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)目的條帶；如陽(yáng)試驗(yàn)結(jié)果判定被檢樣品出現(xiàn)目的條帶附 （資料性甘藍(lán)類(lèi)蔬菜黑斑病甘藍(lán)類(lèi)蔬菜黑斑病癥狀甘藍(lán)類(lèi)蔬菜的葉片、花莖和角果均能發(fā)病。該病多發(fā)生在外葉上，發(fā)病初期在葉面上產(chǎn)生黑色小斑3mm~7mm，同心輪紋不顯著。溫度高時(shí)，病斑迅速擴(kuò)大為灰褐色圓形病斑，直徑5mm~30mm，具明顯的同心輪紋，并伴有黃色暈環(huán)，濕度大時(shí)病斑上產(chǎn)生黑色霉層。后期葉片上多個(gè)病斑匯病菌生物學(xué)特性蕓薹生鏈格孢的菌落（見(jiàn)圖A.1）1個(gè)~11（20μm~70μm）×（8μm~20μm）。標(biāo)引序號(hào)說(shuō)明：A——蕓薹生鏈格孢的菌落形態(tài)；B——蕓薹生鏈格孢的孢