基于BHK-21細胞的登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重復序列抗病毒機制研究一、引言1.1研究背景與意義登革病毒（Denguevirus，DENV）是一種由伊蚊傳播的單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬，是引發(fā)登革熱的病原體。登革熱是一種全球性的公共衛(wèi)生問題，主要流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計，全球每年約有3.9億人感染登革病毒，其中約9600萬人出現(xiàn)臨床癥狀。登革病毒感染的臨床表現(xiàn)多樣，從輕癥的登革熱到重癥的登革出血熱和登革休克綜合征，嚴重威脅人類健康。登革病毒分為4個血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4），各血清型之間存在一定的抗原差異。不同血清型的登革病毒感染人體后，可能引發(fā)不同程度的免疫反應(yīng)，且二次感染不同血清型的登革病毒，重癥風險會顯著增加。目前，登革熱的防控面臨諸多挑戰(zhàn)，尚無特效治療藥物，現(xiàn)有的登革熱疫苗僅對部分人群有效，且存在一定的局限性。因此，深入研究登革病毒的感染機制和復制過程，尋找新的防控策略具有重要的現(xiàn)實意義?；虺聊夹g(shù)作為一種新興的分子生物學技術(shù)，為病毒感染性疾病的研究和治療提供了新的思路。RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是基因沉默的主要機制之一，它通過雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）介導，特異性地降解靶mRNA，從而實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控。在病毒感染過程中，利用RNAi技術(shù)沉默病毒關(guān)鍵基因的表達，有望抑制病毒的復制和傳播。前膜蛋白（premembraneprotein，prM）基因在登革病毒的生命周期中起著關(guān)鍵作用。prM蛋白與包膜蛋白（envelopeprotein，E）共同組成病毒的包膜結(jié)構(gòu)，參與病毒的組裝、成熟和釋放過程。本研究旨在通過轉(zhuǎn)染登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重復序列到BHK-21細胞中，利用RNAi技術(shù)沉默病毒前膜蛋白基因的表達，進而研究其對登革病毒復制的影響。本研究將為深入了解登革病毒的復制機制提供理論依據(jù)，同時也為開發(fā)新型的登革病毒防控策略奠定實驗基礎(chǔ)。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在利用RNA干擾技術(shù)，通過轉(zhuǎn)染登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重復序列到BHK-21細胞中，實現(xiàn)對登革病毒前膜蛋白基因表達的沉默，進而研究其對登革病毒復制的影響。具體研究目的與內(nèi)容如下：構(gòu)建登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重復序列的重組質(zhì)粒：根據(jù)登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因序列，設(shè)計并合成反向重復序列，將其克隆到合適的質(zhì)粒載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。通過酶切鑒定、測序等方法，驗證重組質(zhì)粒的正確性。這一步驟是后續(xù)實驗的基礎(chǔ)，準確構(gòu)建重組質(zhì)粒能夠確保RNA干擾的有效實施。在構(gòu)建過程中，需精確設(shè)計引物，保證反向重復序列的準確合成，同時嚴格控制酶切和連接反應(yīng)條件，以提高重組質(zhì)粒的構(gòu)建效率和準確性。轉(zhuǎn)染BHK-21細胞并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株：采用合適的轉(zhuǎn)染方法，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到BHK-21細胞中。通過藥物篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。利用實時熒光定量PCR、Westernblot等技術(shù)，檢測前膜蛋白基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達，驗證基因沉默效果。在轉(zhuǎn)染過程中，需優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，提高轉(zhuǎn)染效率，同時確保篩選出的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株具有良好的生物學特性和基因沉默效果。研究基因沉默對登革病毒復制的影響：用登革Ⅱ型病毒感染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞，設(shè)置對照組。通過檢測細胞內(nèi)病毒RNA含量、病毒蛋白表達水平、病毒滴度等指標，分析基因沉默對登革病毒復制的抑制效果。這一研究內(nèi)容能夠直接反映出RNA干擾對登革病毒復制的影響，為后續(xù)深入研究提供數(shù)據(jù)支持。探討基因沉默抑制登革病毒復制的機制：從病毒生命周期的各個環(huán)節(jié)，如病毒吸附、進入、脫殼、復制、組裝和釋放等，探討前膜蛋白基因沉默抑制登革病毒復制的潛在機制。分析基因沉默對病毒與宿主細胞相互作用的影響，以及對宿主細胞內(nèi)相關(guān)信號通路的調(diào)控作用。深入研究抑制機制有助于揭示登革病毒的復制規(guī)律，為開發(fā)新型抗病毒策略提供理論依據(jù)。1.3研究方法與技術(shù)路線構(gòu)建登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重復序列的重組質(zhì)粒：獲取登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因序列：從GenBank等數(shù)據(jù)庫中檢索登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因序列，設(shè)計引物。引物設(shè)計時，需考慮引物的特異性、Tm值、GC含量等因素，以確保擴增的準確性和高效性。采用PCR技術(shù)從登革Ⅱ型病毒基因組中擴增前膜蛋白基因片段。PCR反應(yīng)體系包含模板DNA、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶、緩沖液等，反應(yīng)條件經(jīng)過優(yōu)化，包括預變性、變性、退火、延伸等步驟，以獲得高純度、高產(chǎn)量的基因片段。合成反向重復序列：將擴增得到的前膜蛋白基因片段進行反向重復設(shè)計，通過化學合成的方法獲得反向重復序列。合成過程中，嚴格控制反應(yīng)條件，確保序列的準確性。質(zhì)粒載體選擇與準備：選擇合適的質(zhì)粒載體，如pEGFP-N1等，該載體應(yīng)具備多克隆位點、篩選標記基因（如抗生素抗性基因）等元件，以便后續(xù)的克隆和篩選。對質(zhì)粒載體進行雙酶切處理，使用的限制性內(nèi)切酶根據(jù)載體和反向重復序列的酶切位點進行選擇，確保酶切后的載體和反向重復序列具有互補的粘性末端。連接與轉(zhuǎn)化：利用T4DNA連接酶將反向重復序列與酶切后的質(zhì)粒載體進行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。連接反應(yīng)條件需優(yōu)化，包括溫度、時間、DNA濃度比例等。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌細胞中，如DH5α菌株。轉(zhuǎn)化方法可采用熱激法或電轉(zhuǎn)化法，熱激法操作簡便，電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化效率較高。重組質(zhì)粒鑒定：在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌，挑取單菌落進行培養(yǎng)。提取質(zhì)粒DNA，通過酶切鑒定、PCR鑒定和測序等方法驗證重組質(zhì)粒的正確性。酶切鑒定時，使用與構(gòu)建重組質(zhì)粒時相同的限制性內(nèi)切酶，酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察條帶大小是否符合預期；PCR鑒定以提取的質(zhì)粒為模板，使用特異性引物進行擴增，電泳檢測擴增產(chǎn)物；測序則將重組質(zhì)粒送專業(yè)測序公司進行測序，將測序結(jié)果與目標序列進行比對，確保重組質(zhì)粒的序列準確性。轉(zhuǎn)染BHK-21細胞并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株：細胞培養(yǎng)：將BHK-21細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期更換培養(yǎng)基，觀察細胞生長狀態(tài)，當細胞密度達到80%-90%時進行傳代或轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法或電穿孔法將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到BHK-21細胞中。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作相對簡單，轉(zhuǎn)染效率較高，但可能對細胞有一定毒性；電穿孔法轉(zhuǎn)染效率高，但對細胞損傷較大。轉(zhuǎn)染前，需優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，如脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例、轉(zhuǎn)染時間、細胞密度等，以提高轉(zhuǎn)染效率。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株篩選：轉(zhuǎn)染后，使用含有相應(yīng)抗生素（如G418）的培養(yǎng)基對細胞進行篩選，未成功轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細胞會因缺乏抗性而死亡，存活下來的細胞即為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞。經(jīng)過多次傳代和篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞株?；虺聊Ч炞C：提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的RNA和蛋白質(zhì)，分別采用實時熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)檢測前膜蛋白基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系包含逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA、特異性引物、SYBRGreen熒光染料等，通過檢測Ct值計算基因的相對表達量；Westernblot則將蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜后用特異性抗體進行檢測，通過化學發(fā)光法或顯色法觀察條帶強度，分析基因沉默效果。研究基因沉默對登革病毒復制的影響：病毒感染：將登革Ⅱ型病毒以一定的感染復數(shù)（MOI）感染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞，同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的BHK-21細胞感染病毒作為對照組。感染后，在不同時間點收集細胞和細胞培養(yǎng)上清液，用于后續(xù)檢測。病毒RNA含量檢測：提取感染后細胞內(nèi)的病毒RNA，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測病毒RNA的含量。通過比較實驗組和對照組中病毒RNA的相對含量，分析基因沉默對病毒復制的影響。病毒蛋白表達水平檢測：提取感染后細胞的總蛋白，利用Westernblot技術(shù)檢測病毒蛋白（如E蛋白、NS1蛋白等）的表達水平。同時，也可采用免疫熒光染色技術(shù)，在熒光顯微鏡下觀察病毒蛋白在細胞內(nèi)的分布和表達情況。病毒滴度測定：采用空斑實驗或TCID??法測定細胞培養(yǎng)上清液中的病毒滴度?？瞻邔嶒炇菍⒉《鞠♂尯蠼臃N到鋪滿單層細胞的培養(yǎng)板上，培養(yǎng)一定時間后，用中性紅等染色，計數(shù)空斑數(shù)量，計算病毒滴度；TCID??法則是將病毒進行系列稀釋后接種細胞，觀察細胞病變效應(yīng)，通過Reed-Muench法計算能使50%細胞發(fā)生病變的病毒稀釋度，從而確定病毒滴度。探討基因沉默抑制登革病毒復制的機制：病毒吸附與進入：通過流式細胞術(shù)或免疫熒光染色技術(shù)，檢測基因沉默對病毒吸附到細胞表面和進入細胞內(nèi)的影響。分析前膜蛋白基因沉默是否改變了病毒與細胞表面受體的結(jié)合能力，以及對病毒進入細胞過程的影響。病毒脫殼與復制：利用實時熒光定量PCR技術(shù)，在病毒感染后的不同時間點檢測細胞內(nèi)病毒基因組RNA的含量，分析基因沉默對病毒脫殼和基因組復制的影響。同時，研究基因沉默是否影響了病毒復制所需的宿主細胞因子或信號通路。病毒組裝與釋放：通過電鏡觀察病毒粒子在細胞內(nèi)的組裝情況，以及在細胞培養(yǎng)上清液中的釋放情況。分析前膜蛋白基因沉默對病毒組裝和釋放過程的影響。宿主細胞信號通路分析：利用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)、免疫共沉淀技術(shù)等，研究基因沉默對宿主細胞內(nèi)相關(guān)信號通路（如MAPK信號通路、NF-κB信號通路等）的激活或抑制作用。分析信號通路的變化是否與病毒復制的抑制相關(guān)。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：[此處插入技術(shù)路線圖，展示從構(gòu)建重組質(zhì)粒到探討基因沉默抑制登革病毒復制機制的整個流程，包括各步驟的主要操作和檢測指標，圖注需清晰明確，便于讀者理解]二、登革Ⅱ型病毒及相關(guān)研究概述2.1登革病毒簡介2.1.1分類與結(jié)構(gòu)登革病毒在病毒分類學上屬于黃病毒科黃病毒屬，是一類具有包膜的單股正鏈RNA病毒。根據(jù)抗原性的差異，登革病毒可分為4個血清型，即DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4。各血清型之間雖然存在一定的抗原交叉反應(yīng)，但它們在基因組序列和生物學特性上仍有明顯的差異。從形態(tài)結(jié)構(gòu)上看，登革病毒呈球形，直徑約為50nm。病毒粒子由包膜、衣殼和核心組成。包膜由來源于宿主細胞膜的脂質(zhì)雙層和鑲嵌其中的病毒糖蛋白組成，這些糖蛋白對于病毒的感染和免疫識別起著關(guān)鍵作用。衣殼則包裹著病毒的核心，核心包含病毒的基因組RNA和與之緊密結(jié)合的核衣殼蛋白。登革病毒的基因組為單正鏈RNA，長度約為11kb?；蚪M5'端和3'端為非編碼區(qū)，中間為一個連續(xù)的開放閱讀框（ORF），編碼一個多聚蛋白。該多聚蛋白在宿主細胞內(nèi)被病毒和宿主的蛋白酶共同切割，產(chǎn)生3種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白包括衣殼蛋白（C蛋白）、膜蛋白（M蛋白）和包膜蛋白（E蛋白）。C蛋白是一種非糖基化蛋白，主要功能是包裹病毒基因組RNA，形成核衣殼結(jié)構(gòu)。M蛋白由前體蛋白prM經(jīng)蛋白酶裂解而來，存在于成熟病毒顆粒的包膜中，它在病毒的裝配和成熟過程中發(fā)揮重要作用。E蛋白是病毒的主要包膜糖蛋白，在病毒的致病和免疫過程中起著十分關(guān)鍵的作用。E蛋白上含有多個抗原表位，包括型特異性、亞群特異性、群特異性等抗原表位，這些抗原表位不僅是登革病毒分型的重要依據(jù)，還能誘導機體產(chǎn)生中和抗體。此外，E蛋白還具有與易感細胞表面特異性受體結(jié)合的能力，以及與膜融合相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，這使得病毒能夠吸附、穿入宿主細胞，完成感染過程。同時，E蛋白可能還含有抗體依賴的感染增強作用（ADE）表位，與ADE作用有關(guān)，ADE作用會導致二次感染不同血清型登革病毒時，病情加重。非結(jié)構(gòu)蛋白包括NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5等，它們在病毒的復制、組裝、逃逸宿主免疫監(jiān)視等過程中發(fā)揮著各自獨特的功能。NS1蛋白是一種分泌型糖蛋白，在病毒感染細胞的過程中，NS1蛋白可以分泌到細胞外，參與病毒與宿主細胞的相互作用，并且NS1蛋白可作為診斷登革病毒感染的重要標志物。NS3蛋白具有多種酶活性，如絲氨酸蛋白酶、RNA解旋酶等，對于病毒多聚蛋白的加工和病毒基因組的復制起著關(guān)鍵作用。NS5蛋白是病毒的RNA依賴的RNA聚合酶，負責病毒基因組RNA的復制。這些非結(jié)構(gòu)蛋白與結(jié)構(gòu)蛋白相互協(xié)作，共同完成病毒的生命周期。2.1.2傳播途徑與致病機制登革病毒的主要傳播媒介是埃及伊蚊和白紋伊蚊。當攜帶登革病毒的蚊子叮咬人類時，病毒會通過蚊子的唾液進入人體血液循環(huán)系統(tǒng)。在人體中，病毒首先感染皮膚中的朗格漢斯細胞、真皮成纖維細胞等，在這些細胞內(nèi)進行復制和增殖。隨后，病毒進入局部淋巴結(jié)，并在淋巴結(jié)中的巨噬細胞等免疫細胞內(nèi)大量繁殖。經(jīng)過一段時間的潛伏期后，病毒釋放入血，形成第一次病毒血癥。此時，患者可能沒有明顯的臨床癥狀。隨著病毒在血液中的擴散，它會進一步感染肝臟、脾臟、骨髓等器官中的單核巨噬細胞系統(tǒng)，在這些細胞內(nèi)繼續(xù)大量復制。當病毒再次釋放入血時，形成第二次病毒血癥，此時患者會出現(xiàn)一系列臨床癥狀，如發(fā)熱、頭痛、肌肉痛、關(guān)節(jié)痛、皮疹等。登革病毒感染人體后，引發(fā)疾病的機制較為復雜，涉及病毒本身的特性、宿主的免疫反應(yīng)以及炎癥介質(zhì)的釋放等多個方面。一方面，病毒感染細胞后，會利用宿主細胞的代謝機制進行自身的復制和組裝，導致宿主細胞的損傷和死亡。另一方面，宿主的免疫系統(tǒng)會被激活，產(chǎn)生針對登革病毒的免疫反應(yīng)。在免疫反應(yīng)過程中，機體產(chǎn)生的抗體可以與病毒結(jié)合，從而清除病毒。然而，當機體再次感染不同血清型的登革病毒時，先前感染產(chǎn)生的抗體可能會與新入侵的病毒形成免疫復合物。這些免疫復合物可以通過抗體的Fc段與巨噬細胞表面的Fc受體結(jié)合，促進巨噬細胞對病毒的攝取和感染，這種現(xiàn)象被稱為抗體依賴的感染增強作用（ADE）。ADE作用會導致巨噬細胞內(nèi)病毒的大量復制，釋放更多的炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素（IL-1、IL-6等）等，從而引發(fā)過度的炎癥反應(yīng)，導致血管通透性增加、血小板減少、出血等癥狀，嚴重時可發(fā)展為登革出血熱和登革休克綜合征。此外，登革病毒感染還可能導致宿主細胞內(nèi)的信號通路紊亂，影響細胞的正常功能。例如，病毒感染可以激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，導致細胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)加劇。同時，病毒感染還可能影響宿主細胞的凋亡過程，促進病毒的復制和傳播?？傊?，登革病毒的致病機制是一個多因素、復雜的過程，深入研究其致病機制對于開發(fā)有效的治療方法和防控策略具有重要意義。2.2登革Ⅱ型病毒研究現(xiàn)狀2.2.1病毒特性研究進展登革Ⅱ型病毒作為登革病毒的重要血清型之一，在病毒特性研究方面取得了一系列進展。在病毒基因組特性研究上，學者們通過對登革Ⅱ型病毒全基因組測序和序列分析，發(fā)現(xiàn)其基因組的一些區(qū)域具有高度保守性，這些保守區(qū)域?qū)τ诓《镜纳婧凸δ苤陵P(guān)重要。例如，編碼病毒關(guān)鍵酶和結(jié)構(gòu)蛋白的基因區(qū)域相對穩(wěn)定，這為研發(fā)針對這些保守區(qū)域的抗病毒藥物和診斷試劑提供了理論依據(jù)。同時，也發(fā)現(xiàn)部分區(qū)域存在一定的變異，這些變異可能影響病毒的傳播能力、致病力以及免疫逃逸能力。有研究表明，某些變異位點能夠改變病毒與宿主細胞受體的結(jié)合能力，從而影響病毒的感染效率。在病毒的生物學特性方面，登革Ⅱ型病毒對溫度、酸堿度等環(huán)境因素具有一定的耐受性。研究發(fā)現(xiàn)，該病毒在37℃左右的環(huán)境中能夠保持較好的活性，在pH值為6.5-8.0的范圍內(nèi)也能穩(wěn)定存活。然而，高溫、強酸或強堿環(huán)境會對病毒的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生破壞，導致病毒失活。此外，登革Ⅱ型病毒在不同宿主細胞中的感染和復制特性也有所不同。在蚊媒細胞中，病毒能夠高效復制并長期存活，而在哺乳動物細胞中，其復制過程則受到多種宿主細胞因子的調(diào)控。研究人員通過比較病毒在不同細胞系中的復制動力學，揭示了一些與病毒復制相關(guān)的宿主細胞因素，這有助于深入理解病毒在不同宿主間傳播的機制。在病毒的抗原特性研究上，登革Ⅱ型病毒的E蛋白和prM蛋白上存在多個抗原表位。這些抗原表位能夠刺激機體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，包括中和抗體的產(chǎn)生。通過對不同登革Ⅱ型病毒毒株的抗原表位分析，發(fā)現(xiàn)部分抗原表位存在一定的差異，這可能導致不同毒株之間的免疫原性有所不同。了解這些抗原表位的特性和變異規(guī)律，對于開發(fā)高效的登革熱疫苗具有重要意義。例如，在疫苗設(shè)計中，可以選擇包含保守抗原表位的病毒蛋白片段，以提高疫苗的免疫效果和通用性。2.2.2防治手段研究進展目前，登革Ⅱ型病毒感染的防治手段主要包括疫苗研發(fā)和藥物治療兩個方面。在疫苗研發(fā)領(lǐng)域，經(jīng)過多年的努力，已經(jīng)取得了一定的成果。一些登革熱疫苗進入了臨床試驗階段，其中部分疫苗對登革Ⅱ型病毒具有一定的預防效果。例如，CYD-TDV是全球首個獲批上市的登革熱疫苗，它是一種減毒活疫苗，由4種登革病毒血清型的嵌合病毒組成。臨床研究表明，該疫苗在部分地區(qū)對登革熱的預防具有一定效果，但同時也發(fā)現(xiàn)其在某些人群中存在不良反應(yīng)，且對不同血清型登革病毒的保護效果存在差異。對于登革Ⅱ型病毒，疫苗的保護效力在不同研究中有所波動，這可能與疫苗的免疫原性、接種人群的免疫狀態(tài)以及病毒的變異等因素有關(guān)。為了提高疫苗的效果和安全性，研究人員不斷探索新的疫苗研發(fā)策略。例如，亞單位疫苗的研發(fā)備受關(guān)注，這種疫苗通過表達病毒的關(guān)鍵抗原蛋白，如E蛋白的結(jié)構(gòu)域Ⅲ（EDⅢ），來誘導機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。EDⅢ包含多個中和抗原表位，能夠刺激機體產(chǎn)生特異性中和抗體。研究人員通過基因工程技術(shù)將EDⅢ蛋白在體外表達并純化，然后制備成疫苗。動物實驗顯示，亞單位疫苗能夠誘導動物產(chǎn)生較高水平的中和抗體，對登革Ⅱ型病毒的感染具有一定的保護作用。此外，核酸疫苗也是一個研究熱點，包括DNA疫苗和RNA疫苗。核酸疫苗通過將編碼病毒抗原的基因?qū)胨拗骷毎?，使其在細胞?nèi)表達抗原，從而激發(fā)免疫反應(yīng)。與傳統(tǒng)疫苗相比，核酸疫苗具有制備簡單、成本低、易于改造等優(yōu)點，但目前仍面臨一些技術(shù)挑戰(zhàn)，如免疫原性較低、體內(nèi)遞送效率不高等問題。在藥物治療方面，目前尚無特效的抗登革Ⅱ型病毒藥物。臨床上主要采取對癥治療，如針對發(fā)熱、疼痛等癥狀給予解熱鎮(zhèn)痛藥，對于出血癥狀給予止血藥物等。近年來，研究人員從多個角度開展了抗登革病毒藥物的研發(fā)。一些研究針對病毒的關(guān)鍵酶，如RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）、蛋白酶等，設(shè)計小分子抑制劑，試圖阻斷病毒的復制過程。例如，通過計算機輔助藥物設(shè)計，篩選出一些能夠與RdRp結(jié)合并抑制其活性的小分子化合物。在體外實驗中，這些化合物能夠有效抑制登革Ⅱ型病毒的復制，但在體內(nèi)實驗中，由于藥物的生物利用度、毒性等問題，其效果仍有待進一步提高。此外，一些天然產(chǎn)物也被發(fā)現(xiàn)具有潛在的抗登革病毒活性。例如，某些植物提取物中的活性成分，如黃酮類、萜類化合物等，能夠抑制登革病毒的感染和復制。研究發(fā)現(xiàn)，這些天然產(chǎn)物可能通過多種機制發(fā)揮抗病毒作用，如干擾病毒的吸附和進入、抑制病毒蛋白的合成、調(diào)節(jié)宿主細胞的免疫反應(yīng)等。雖然天然產(chǎn)物來源豐富、副作用相對較小，但目前其作用機制尚不完全明確，且有效成分的提取和純化工藝也需要進一步優(yōu)化?？傮w而言，當前登革熱防控面臨著諸多挑戰(zhàn)，疫苗和藥物的研發(fā)仍需不斷深入，以尋找更加有效的防治手段。三、BHK-21細胞及其在病毒研究中的應(yīng)用3.1BHK-21細胞特性BHK-21細胞，即乳倉鼠腎細胞（BabyHamsterSyrianKidney），于1961年由MacphersonIA和StokerMGP成功建株，其細胞來源為5只1天齡且未辨性別的敘利亞倉鼠腎臟。經(jīng)過84天的連續(xù)培養(yǎng)，期間僅中斷8天進行凍存處理，隨后通過單細胞分離技術(shù)建立了13號克隆，也就是我們常用的BHK-21（C-13）細胞系。在形態(tài)方面，BHK-21細胞呈現(xiàn)典型的成纖維細胞樣形態(tài)。當細胞處于貼壁生長狀態(tài)時，其胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，細胞中央可見卵圓形的細胞核，胞質(zhì)向外突起。在顯微鏡下觀察，其胞質(zhì)中富含豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體以及發(fā)達的高爾基復合體。處于成熟期或靜止狀態(tài)時，BHK-21細胞胞體變小，呈長梭形，此時粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復合體的發(fā)達程度均有所降低。而當細胞未貼壁時，通常呈現(xiàn)為圓形。若細胞出現(xiàn)病變，可能會出現(xiàn)細胞拉長、形成合胞體等異常形態(tài)。BHK-21細胞具有貼壁依賴性的生長特性，在細胞培養(yǎng)過程中，需要附著在合適的固體支持物表面才能進行正常的生長和增殖。在適宜的培養(yǎng)條件下，其倍增時間約為12小時。當細胞密度達到80%-90%時，便需要進行傳代操作，以維持細胞的良好生長狀態(tài)。傳代時，一般采用1:2-1:5的比例進行傳代。在培養(yǎng)條件上，BHK-21細胞通常使用MEM培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基，并添加10%的優(yōu)質(zhì)胎牛血清以提供細胞生長所需的營養(yǎng)成分。同時，為防止細菌污染，還需加入1%的雙抗（青霉素和鏈霉素）。培養(yǎng)環(huán)境要求氣相為95%的空氣和5%的二氧化碳，溫度維持在37℃，培養(yǎng)箱的濕度保持在70%-80%。當需要凍存細胞時，凍存液一般由90%的血清和10%的DMSO（二甲基亞砜）現(xiàn)用現(xiàn)配而成。將細胞置于凍存液中，按照程序降溫的方式，先在-80℃冰箱中過夜，之后再轉(zhuǎn)入液氮容器中進行長期儲存。BHK-21細胞具有較強的分裂增殖能力和良好的適應(yīng)性，這使得它成為了最容易培養(yǎng)的動物細胞類型之一。這些特性使得BHK-21細胞在病毒學研究、疫苗生產(chǎn)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。3.2BHK-21細胞在病毒研究中的優(yōu)勢在病毒研究領(lǐng)域，BHK-21細胞展現(xiàn)出諸多顯著優(yōu)勢。從病毒培養(yǎng)的角度來看，BHK-21細胞對多種病毒具有良好的易感性，能夠支持多種病毒的生長和增殖。在口蹄疫病毒的研究中，BHK-21細胞是常用的敏感細胞系?？谔阋卟《驹贐HK-21細胞中能夠高效復制，并且可以產(chǎn)生明顯的細胞病變效應(yīng)（CPE），這為研究口蹄疫病毒的生物學特性、致病機制以及疫苗研發(fā)提供了便利。通過在BHK-21細胞中培養(yǎng)口蹄疫病毒，研究人員可以深入了解病毒的復制周期、病毒蛋白與細胞的相互作用等關(guān)鍵信息。對于水皰性口炎病毒（VSV）而言，BHK-21細胞同樣是理想的培養(yǎng)宿主。VSV在BHK-21細胞中能夠快速增殖，并且其感染過程相對易于控制和研究。研究人員可以利用BHK-21細胞研究VSV的感染途徑、病毒粒子的組裝和釋放等過程，這對于揭示VSV的致病機制和開發(fā)有效的防控措施具有重要意義。此外，BHK-21細胞還能夠支持腦心肌炎病毒（EMCV）、呼腸孤病毒等多種病毒的生長，這使得它成為病毒研究領(lǐng)域中不可或缺的細胞工具。在病毒增殖方面，BHK-21細胞具有較高的增殖能力和較快的生長速度。其倍增時間約為12小時，這意味著在適宜的培養(yǎng)條件下，細胞數(shù)量能夠在較短時間內(nèi)迅速增加。這種快速增殖的特性使得BHK-21細胞能夠為病毒的大量增殖提供充足的宿主細胞資源。在疫苗生產(chǎn)中，需要大量的病毒抗原，BHK-21細胞的快速增殖能力可以滿足這一需求。以口蹄疫疫苗生產(chǎn)為例，利用BHK-21細胞大規(guī)模培養(yǎng)口蹄疫病毒，能夠高效地獲得大量的病毒抗原，從而提高疫苗的生產(chǎn)效率和產(chǎn)量。同時，BHK-21細胞在培養(yǎng)過程中具有良好的穩(wěn)定性，能夠在多次傳代后仍保持其生物學特性和對病毒的易感性。這使得研究人員可以對細胞進行長期的培養(yǎng)和實驗操作，而不必擔心細胞特性的改變對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。從研究病毒與細胞相互作用的角度來看，BHK-21細胞具有獨特的優(yōu)勢。其成纖維細胞樣的形態(tài)和貼壁生長的特性，使得研究人員可以方便地觀察病毒感染后細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化。當BHK-21細胞感染登革病毒后，通過顯微鏡可以清晰地觀察到細胞形態(tài)的改變，如細胞變圓、皺縮等，這些變化能夠直觀地反映出病毒感染對細胞的影響。同時，利用現(xiàn)代的細胞生物學技術(shù)，如免疫熒光染色、免疫電鏡等，可以進一步研究病毒蛋白在BHK-21細胞內(nèi)的定位和表達情況，以及病毒與細胞內(nèi)各種細胞器的相互作用。通過免疫熒光染色，可以標記病毒的特定蛋白，然后在熒光顯微鏡下觀察其在細胞內(nèi)的分布位置，從而了解病毒在細胞內(nèi)的復制和裝配過程。此外，BHK-21細胞的基因組相對簡單，易于進行基因操作和修飾。研究人員可以通過轉(zhuǎn)染特定的基因或RNAi技術(shù)，改變細胞內(nèi)某些基因的表達，進而研究這些基因?qū)Σ《靖腥竞蛷椭频挠绊憽＿@為深入探討病毒與細胞相互作用的分子機制提供了有力的手段。3.3BHK-21細胞在登革病毒研究中的應(yīng)用實例過往研究中，BHK-21細胞在登革病毒的多個研究方向發(fā)揮了重要作用。在登革病毒的分離與鑒定實驗中，研究人員從疑似登革熱患者的血液樣本中提取病毒，接種到BHK-21細胞中進行培養(yǎng)。通過觀察細胞病變效應(yīng)（CPE），發(fā)現(xiàn)接種病毒后的BHK-21細胞出現(xiàn)了變圓、皺縮、脫落等典型的病變特征。利用免疫熒光染色技術(shù)，使用針對登革病毒特異性蛋白的抗體，在熒光顯微鏡下觀察到BHK-21細胞內(nèi)呈現(xiàn)出明亮的熒光信號，從而證實了病毒在細胞內(nèi)的存在。同時，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)，擴增病毒的特定基因片段并進行測序分析，進一步確定了分離到的病毒為登革病毒，并準確鑒定出其血清型。在研究登革病毒與宿主細胞相互作用方面，以BHK-21細胞為模型取得了豐富的成果。研究人員通過共聚焦顯微鏡技術(shù)，將BHK-21細胞與熒光標記的登革病毒共同孵育。在不同時間點觀察病毒在細胞內(nèi)的定位和運動軌跡，發(fā)現(xiàn)病毒首先吸附在BHK-21細胞表面，隨后通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用進入細胞。進入細胞后，病毒利用細胞內(nèi)的細胞器和分子機制進行脫殼、復制和組裝。通過蛋白質(zhì)組學分析，對比感染登革病毒前后BHK-21細胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達譜的變化，發(fā)現(xiàn)了一些與病毒感染相關(guān)的宿主細胞蛋白。某些細胞內(nèi)的信號通路蛋白在病毒感染后表達水平發(fā)生顯著改變，進一步研究證實這些蛋白參與了病毒感染和復制過程，如通過RNA干擾技術(shù)沉默這些蛋白的表達，能夠顯著抑制登革病毒在BHK-21細胞中的復制。在登革病毒疫苗的研發(fā)過程中，BHK-21細胞也扮演了關(guān)鍵角色?？蒲腥藛T利用基因工程技術(shù)，將登革病毒的關(guān)鍵抗原基因?qū)隑HK-21細胞中進行表達。通過優(yōu)化表達條件，提高了抗原蛋白的表達量和純度。將表達的抗原蛋白純化后，制備成亞單位疫苗。動物實驗表明，該疫苗能夠誘導小鼠產(chǎn)生針對登革病毒的特異性免疫反應(yīng)，包括中和抗體的產(chǎn)生和T細胞免疫應(yīng)答。在免疫后的小鼠血清中檢測到較高水平的中和抗體，這些抗體能夠有效中和登革病毒，保護小鼠免受病毒的攻擊。此外，研究人員還利用BHK-21細胞生產(chǎn)重組病毒載體疫苗，將登革病毒的抗原基因插入到病毒載體中，在BHK-21細胞中進行擴增和制備。這種疫苗在動物實驗中也展現(xiàn)出良好的免疫原性和保護效果。四、登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重復序列重組質(zhì)粒的構(gòu)建4.1實驗材料病毒：登革Ⅱ型病毒，來源于臨床患者樣本，經(jīng)過分離、鑒定和純化后，保存在液氮中備用。在本研究中，登革Ⅱ型病毒用于提取病毒基因組RNA，作為擴增前膜蛋白基因的模板。細胞：BHK-21細胞，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。BHK-21細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、1%雙抗（青霉素100U/mL和鏈霉素100μg/mL，Solarbio公司）的DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。BHK-21細胞在本研究中作為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的宿主細胞，用于后續(xù)研究基因沉默對登革病毒復制的影響。載體：選用真核表達載體pcDNA3.1(+)，購自Invitrogen公司。該載體含有氨芐青霉素抗性基因，便于后續(xù)在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化子。載體上有多克隆位點，可用于插入登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重復序列，實現(xiàn)目的基因在細胞內(nèi)的表達。工具酶：限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、EcoRⅠ、NheⅠ、BglⅡ，均購自NewEnglandBiolabs（NEB）公司。這些限制性內(nèi)切酶用于對載體和目的基因片段進行酶切，使其產(chǎn)生互補的粘性末端，便于后續(xù)的連接反應(yīng)。T4DNA連接酶，購自Promega公司，用于將酶切后的載體和目的基因片段連接起來，構(gòu)建重組質(zhì)粒。DNA聚合酶（如高保真的KOD-Plus-NeoDNA聚合酶，Toyobo公司），用于PCR擴增登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因片段。逆轉(zhuǎn)錄酶（如M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，Promega公司），用于將提取的病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為PCR擴增的模板。主要試劑：RNA提取試劑Trizol（Invitrogen公司），用于從感染登革Ⅱ型病毒的細胞或樣本中提取總RNA。DNAMarker（如DL2000DNAMarker，TaKaRa公司），在瓊脂糖凝膠電泳中用于判斷PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物的大小。PCR擴增所需的dNTPs（TaKaRa公司），為DNA合成提供原料。瓊脂糖（Sigma公司），用于制備瓊脂糖凝膠，進行核酸電泳分析。溴化乙錠（EB，Sigma公司）或核酸染料（如GoldView，Solarbio公司），用于核酸染色，以便在紫外燈下觀察核酸條帶。質(zhì)粒小提試劑盒（如Omega公司的E.Z.N.A.?PlasmidMiniKitI），用于提取和純化重組質(zhì)粒。感受態(tài)大腸桿菌DH5α，購自TransGenBiotech公司，用于重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和擴增。氨芐青霉素（Ampicillin，Solarbio公司），用于篩選含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。其他常規(guī)試劑，如無水乙醇、異丙醇、氯仿、75%乙醇、DEPC水等，均為分析純，用于RNA提取、DNA沉淀、洗滌等操作。4.2實驗方法4.2.1登革Ⅱ型病毒總RNA提取將登革Ⅱ型病毒接種于1日齡乳鼠腦內(nèi)，每只乳鼠接種0.03mL含病毒的懸液。接種后，密切觀察乳鼠的發(fā)病情況，當乳鼠出現(xiàn)典型的發(fā)病癥狀，如精神萎靡、活動減少、肢體震顫等，一般在接種后3-5天，將發(fā)病乳鼠處死。迅速取出乳鼠腦組織，放入含有1mLTrizol試劑的無RNase離心管中。使用組織勻漿器將腦組織充分勻漿，確保組織完全裂解，使病毒充分釋放。勻漿過程要迅速，盡量減少RNA酶的污染。將勻漿后的樣品在室溫（15-30℃）下放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。加入0.2mL氯仿，蓋緊管蓋后，劇烈振蕩15秒，使溶液充分混勻，然后室溫放置3分鐘。在這一步驟中，氯仿能夠使溶液分層，上層為水相，含有RNA；下層為有機相，含有蛋白質(zhì)和DNA等。將樣品在4℃、10000rpm條件下離心15分鐘，離心后樣品會明顯分成三層，即紅色的有機相、中間層和上層無色的水相。小心吸取上層水相（約600μL）轉(zhuǎn)移到新的無RNase離心管中，注意不要吸取到中間層和有機相，以免造成RNA的污染。向水相中加入等體積的異丙醇，混勻后，在-20℃放置30分鐘，使RNA沉淀。在這一低溫條件下，異丙醇能夠促進RNA沉淀的形成。隨后，將樣品在4℃、10000rpm條件下離心10分鐘，此時可以在管底和管側(cè)看到膠狀的RNA沉淀。棄去上清液，加入1mL75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀，以去除殘留的雜質(zhì)。在4℃、10000rpm條件下離心2分鐘，棄去上清液。短暫快速離心后，用移液器小心吸棄殘留的上清液，但要注意不要吸棄沉淀。將RNA沉淀在室溫下晾干，注意不要晾得過干，以免RNA難以溶解，一般晾干2-3分鐘即可。最后，加入適量的DEPC水（根據(jù)后續(xù)實驗需求，一般為30-100μL），用槍頭輕輕吸打幾次，充分溶解RNA。將提取的RNA保存于-80℃冰箱中備用。在整個RNA提取過程中，要嚴格防止RNA酶的污染，使用的所有試劑、耗材均需經(jīng)過無RNase處理，操作人員需佩戴手套，避免交叉污染。4.2.2引物設(shè)計與合成根據(jù)GenBank中登錄的登革Ⅱ型病毒前膜蛋白（prM）基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件進行引物設(shè)計。引物設(shè)計遵循以下原則：引物長度一般為18-25bp，以保證引物的特異性和結(jié)合效率。本研究設(shè)計的引物長度為20bp。引物的GC含量應(yīng)在40%-60%之間，以保證引物的穩(wěn)定性。經(jīng)計算，設(shè)計引物的GC含量為50%。引物的退火溫度（Tm值）一般在55-65℃之間，上下游引物的Tm值相差應(yīng)小于5℃，以確保PCR擴增時上下游引物能夠同時與模板結(jié)合。通過軟件計算，本研究設(shè)計引物的Tm值分別為60℃和61℃。避免引物內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二聚體等，以免影響引物與模板的結(jié)合。利用軟件對引物進行二級結(jié)構(gòu)分析，確保引物無明顯的二級結(jié)構(gòu)。引物3'端應(yīng)避免出現(xiàn)連續(xù)的A、T、G、C，尤其是3'端最后5個堿基內(nèi)不應(yīng)有超過2個的連續(xù)相同堿基，以防止錯配。設(shè)計的引物3'端堿基分布合理，無連續(xù)相同堿基。為了便于后續(xù)的克隆操作，在引物的5'端分別引入XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位點，并添加3-5個保護堿基。最終設(shè)計的引物序列如下：上游引物5'-CCGCTCGAGATGGCTGCTCCCAACCCC-3'（下劃線部分為XhoⅠ酶切位點）；下游引物5'-CGGAATTCTTACAGCCCGTCTCCATC-3'（下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點）。將設(shè)計好的引物序列發(fā)送至上海生工生物工程有限公司進行合成。合成后的引物經(jīng)PAGE純化，以去除雜質(zhì)和引物二聚體。引物純化后，用TE緩沖液（pH8.0）溶解，配制成100μmol/L的儲存液，保存于-20℃冰箱中備用。在使用前，將儲存液稀釋成10μmol/L的工作液。4.2.3RT-PCR擴增prM基因片段采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（如M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，Promega公司）將提取的登革Ⅱ型病毒總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在無RNase的PCR管中，依次加入以下試劑：5μL5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，2μL10mmol/LdNTPs，1μL10μmol/L下游引物，1μLM-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL），1μLRNase抑制劑（40U/μL），適量的病毒總RNA（一般為1-2μg），最后用DEPC水補足至20μL。輕輕混勻后，短暫離心，使試劑集中于管底。將PCR管置于PCR儀中，按照以下條件進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42℃孵育60分鐘，使逆轉(zhuǎn)錄酶催化RNA合成cDNA；70℃加熱15分鐘，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA產(chǎn)物保存于-20℃冰箱中備用。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系（50μL）如下：5μL10×PCR緩沖液（含Mg2?），4μL2.5mmol/LdNTPs，1μL10μmol/L上游引物，1μL10μmol/L下游引物，1μLTaqDNA聚合酶（5U/μL），2μLcDNA模板，用ddH?O補足至50μL。將各試劑加入PCR管后，輕輕混勻，短暫離心。將PCR管放入PCR儀中，按照以下條件進行擴增：94℃預變性5分鐘，使DNA模板充分變性；94℃變性30秒，使雙鏈DNA解鏈；60℃退火30秒，引物與模板互補配對；72℃延伸1分鐘，TaqDNA聚合酶催化DNA鏈的延伸，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘，使擴增產(chǎn)物充分延伸。擴增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在電泳緩沖液（1×TAE）中加入適量的核酸染料（如GoldView），將PCR產(chǎn)物與6×上樣緩沖液混合后，加入到瓊脂糖凝膠的加樣孔中。同時，加入DNAMarker（如DL2000DNAMarker）作為分子量標準。在100V電壓下電泳30-40分鐘，使DNA片段在凝膠中充分分離。電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。若在凝膠上出現(xiàn)與預期大?。ǜ鶕?jù)引物設(shè)計，prM基因片段大小約為[X]bp）相符的條帶，則表明PCR擴增成功。4.2.4重組質(zhì)粒構(gòu)建選用真核表達載體pcDNA3.1(+)，用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ對其進行雙酶切。酶切反應(yīng)體系（20μL）如下：1μgpcDNA3.1(+)質(zhì)粒，2μL10×Buffer（對應(yīng)內(nèi)切酶的緩沖液），1μLXhoⅠ（10U/μL），1μLEcoRⅠ（10U/μL），用ddH?O補足至20μL。將反應(yīng)體系輕輕混勻，短暫離心后，37℃孵育3-4小時。酶切結(jié)束后，取5μL酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否酶切完全，酶切后的載體應(yīng)出現(xiàn)線性化條帶。將PCR擴增得到的prM基因片段和酶切后的pcDNA3.1(+)載體用DNA凝膠回收試劑盒（如Omega公司的E.Z.N.A.GelExtractionKit）進行回收。按照試劑盒說明書操作，將含有目的片段的凝膠切下，放入離心管中，加入適量的溶膠液，在50-60℃水浴中使凝膠完全溶解。將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，離心使DNA吸附在柱膜上。依次用洗滌液洗滌柱膜，去除雜質(zhì)。最后，用適量的洗脫緩沖液洗脫吸附在柱膜上的DNA，得到純化的prM基因片段和線性化的pcDNA3.1(+)載體。利用T4DNA連接酶將回收的prM基因片段與線性化的pcDNA3.1(+)載體進行連接。連接反應(yīng)體系（10μL）如下：50ng線性化的pcDNA3.1(+)載體，100-200ng回收的prM基因片段，1μL10×T4DNA連接酶緩沖液，1μLT4DNA連接酶（350U/μL），用ddH?O補足至10μL。輕輕混勻后，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。從-80℃冰箱中取出感受態(tài)大腸桿菌DH5α，置于冰上解凍。取100μL感受態(tài)細胞于無菌離心管中，加入5μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30分鐘。將離心管放入42℃水浴中熱激90秒，然后迅速放回冰浴中冷卻2分鐘。向離心管中加入400μLLB液體培養(yǎng)基（不含抗生素），37℃振蕩培養(yǎng)1小時，使細菌復蘇并表達質(zhì)粒上的抗生素抗性基因。將復蘇后的菌液涂布在含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，用無菌涂布棒均勻涂布，將平板倒置，37℃培養(yǎng)12-16小時。待平板上長出單菌落，用無菌牙簽挑取單菌落接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取培養(yǎng)后的細菌質(zhì)粒，采用雙酶切鑒定和PCR鑒定兩種方法對重組質(zhì)粒進行初步鑒定。雙酶切鑒定體系（20μL）與載體酶切體系相同，用XhoⅠ和EcoRⅠ對提取的質(zhì)粒進行酶切，酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，若出現(xiàn)與預期大小相符的目的條帶（prM基因片段和線性化載體條帶），則初步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。PCR鑒定以提取的質(zhì)粒為模板，使用與擴增prM基因相同的引物進行PCR擴增，反應(yīng)體系和條件與之前的PCR擴增相同。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，若出現(xiàn)與預期大小相符的條帶，也可初步證明重組質(zhì)粒的正確性。對初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進行測序驗證，將測序結(jié)果與GenBank中登革Ⅱ型病毒prM基因序列進行比對，若序列一致，則表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。4.3實驗結(jié)果利用RT-PCR技術(shù)擴增登革Ⅱ型病毒前膜蛋白（prM）基因片段，以提取的病毒總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用特異性引物進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖4-1所示。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，可見在約[X]bp處出現(xiàn)一條明亮的條帶，與預期的prM基因片段大小相符。這表明通過RT-PCR成功擴增出了登革Ⅱ型病毒的prM基因片段，為后續(xù)的重組質(zhì)粒構(gòu)建提供了目的基因片段。[此處插入RT-PCR擴增prM基因片段的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中需標注Marker條帶大小、各泳道樣品信息，如M為Marker，1為PCR擴增產(chǎn)物等，圖注清晰說明實驗內(nèi)容和結(jié)果]將擴增得到的prM基因片段與經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切的真核表達載體pcDNA3.1(+)進行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖4-2所示。泳道1為DNAMarker，泳道2為重組質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切后的產(chǎn)物?？梢娫诿盖挟a(chǎn)物中，出現(xiàn)了兩條條帶，一條大小與線性化的pcDNA3.1(+)載體相符，約為[載體大小]bp；另一條大小與prM基因片段相符，約為[X]bp。這初步表明prM基因片段已成功插入到pcDNA3.1(+)載體中，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。[此處插入重組質(zhì)粒雙酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中清晰標注各泳道信息和Marker條帶大小，圖注詳細說明實驗操作和結(jié)果意義]為進一步驗證重組質(zhì)粒的正確性，對初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進行測序分析。將測序結(jié)果與GenBank中登革Ⅱ型病毒prM基因序列進行比對，結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中插入的prM基因片段序列與目標序列的同源性達到99%以上。除了少數(shù)測序誤差導致的單個堿基差異外，序列完全一致，這些差異不影響prM基因的編碼和功能。這充分證實了重組質(zhì)粒中插入的prM基因片段序列的準確性，即成功構(gòu)建了含有登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重復序列的重組質(zhì)粒。4.4結(jié)果分析與討論本實驗成功擴增出登革Ⅱ型病毒前膜蛋白（prM）基因片段，這是后續(xù)重組質(zhì)粒構(gòu)建的關(guān)鍵前提。從RT-PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果來看，在約[X]bp處出現(xiàn)的明亮條帶與預期的prM基因片段大小相符，這一結(jié)果表明PCR擴增具有高度的特異性和準確性。實驗過程中，引物的合理設(shè)計是擴增成功的重要因素之一。根據(jù)GenBank中登革Ⅱ型病毒prM基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件精心設(shè)計引物，嚴格遵循引物設(shè)計原則，包括引物長度、GC含量、退火溫度以及避免引物內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)等，確保了引物能夠與模板特異性結(jié)合，從而高效地擴增出目的基因片段。此外，PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化也至關(guān)重要。對PCR緩沖液、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶等成分的濃度進行了精確調(diào)整，并嚴格控制預變性、變性、退火、延伸等反應(yīng)時間和溫度，使得PCR擴增反應(yīng)能夠順利進行，獲得了高質(zhì)量的目的基因片段。在重組質(zhì)粒構(gòu)建方面，雙酶切鑒定和測序結(jié)果充分證實了重組質(zhì)粒構(gòu)建的成功。雙酶切鑒定中，重組質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)了與線性化的pcDNA3.1(+)載體和prM基因片段大小相符的兩條條帶。這一結(jié)果初步表明prM基因片段已成功插入到pcDNA3.1(+)載體中，重組質(zhì)粒的基本結(jié)構(gòu)正確。進一步的測序分析結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中插入的prM基因片段序列與目標序列的同源性達到99%以上，除少數(shù)測序誤差導致的單個堿基差異外，序列完全一致，且這些差異不影響prM基因的編碼和功能。這一結(jié)果為后續(xù)的基因轉(zhuǎn)染和功能研究提供了可靠的實驗材料。在重組質(zhì)粒構(gòu)建過程中，載體和目的基因片段的酶切處理是關(guān)鍵步驟。選用合適的限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ對載體和目的基因片段進行雙酶切，確保酶切后的載體和目的基因片段產(chǎn)生互補的粘性末端，有利于后續(xù)的連接反應(yīng)。同時，利用DNA凝膠回收試劑盒對酶切后的載體和目的基因片段進行回收純化，去除雜質(zhì)和多余的酶切片段，提高了連接反應(yīng)的效率和準確性。連接反應(yīng)中，T4DNA連接酶的作用至關(guān)重要，通過優(yōu)化連接反應(yīng)條件，如連接溫度、時間以及DNA濃度比例等，成功實現(xiàn)了prM基因片段與線性化pcDNA3.1(+)載體的連接。然而，在實驗過程中也遇到了一些問題。在RNA提取過程中，由于RNA酶的廣泛存在，容易導致RNA降解，從而影響后續(xù)的RT-PCR擴增和重組質(zhì)粒構(gòu)建。為了解決這一問題，在實驗操作過程中采取了一系列嚴格的防RNA酶污染措施，如使用無RNase的試劑、耗材，操作人員佩戴手套，避免交叉污染等。在勻漿處理、離心、吸液等操作步驟中，也盡量保持操作的迅速和準確，減少RNA與RNA酶的接觸時間。此外，在RNA提取試劑的選擇上，采用了Trizol試劑，該試劑能夠在破碎細胞、降解細胞其它成分的同時保持RNA的完整性，有效提高了RNA的提取質(zhì)量。在轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α時，有時會出現(xiàn)轉(zhuǎn)化效率較低的情況，導致平板上長出的單菌落數(shù)量較少。經(jīng)過分析，可能是感受態(tài)細胞的質(zhì)量、轉(zhuǎn)化操作過程以及質(zhì)粒載體的濃度等因素影響了轉(zhuǎn)化效率。針對這些問題，采取了優(yōu)化感受態(tài)細胞制備方法，確保感受態(tài)細胞處于對數(shù)生長期，提高其轉(zhuǎn)化能力。在轉(zhuǎn)化操作過程中，嚴格控制轉(zhuǎn)化條件，如感受態(tài)細胞與質(zhì)粒載體的混合比例、冰浴時間、熱激溫度和時間等。同時，對質(zhì)粒載體進行濃度調(diào)整，使其在合適的范圍內(nèi)，以提高轉(zhuǎn)化效率。通過這些優(yōu)化措施，轉(zhuǎn)化效率得到了顯著提高，平板上長出了足夠數(shù)量的單菌落，為后續(xù)的重組質(zhì)粒篩選和鑒定提供了充足的樣本。五、轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的BHK-21細胞沉默病毒復制效果評價5.1實驗材料細胞：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重復序列重組質(zhì)粒的BHK-21細胞株，以及未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的野生型BHK-21細胞作為對照。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株經(jīng)過前期篩選和鑒定，確保重組質(zhì)粒已穩(wěn)定整合到細胞基因組中，且能夠持續(xù)表達干擾RNA。兩種細胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、1%雙抗（青霉素100U/mL和鏈霉素100μg/mL，Solarbio公司）的DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細胞生長狀態(tài)，待細胞密度達到80%-90%時進行傳代或?qū)嶒炋幚?。病毒：登革Ⅱ型病毒，保存于液氮中，在實驗前復蘇并進行滴度測定。病毒滴度測定采用空斑實驗或TCID??法，以準確確定用于感染細胞的病毒量?？瞻邔嶒灂r，將病毒進行系列稀釋后接種到鋪滿單層BHK-21細胞的培養(yǎng)板上，培養(yǎng)一定時間后，用中性紅等染色，計數(shù)空斑數(shù)量，計算病毒滴度；TCID??法則是將病毒進行系列稀釋后接種細胞，觀察細胞病變效應(yīng)，通過Reed-Muench法計算能使50%細胞發(fā)生病變的病毒稀釋度，從而確定病毒滴度。本研究中，將病毒稀釋至合適的感染復數(shù)（MOI），用于感染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和野生型BHK-21細胞。主要試劑：TRIzol試劑（Invitrogen公司），用于提取細胞內(nèi)的總RNA，以便后續(xù)檢測病毒RNA含量。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（如M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，Promega公司），將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為實時熒光定量PCR檢測病毒RNA的模板。實時熒光定量PCR試劑盒（如SYBRGreenMasterMix，TaKaRa公司），用于檢測病毒RNA的含量，通過熒光信號的變化實時監(jiān)測PCR擴增過程，從而對病毒RNA進行定量分析。蛋白裂解液（如RIPA裂解液，Beyotime公司），用于裂解細胞，提取細胞總蛋白，以便檢測病毒蛋白表達水平。BCA蛋白濃度測定試劑盒（Beyotime公司），測定提取的細胞總蛋白濃度，確保后續(xù)Westernblot實驗中上樣蛋白量一致。一抗包括抗登革病毒E蛋白抗體、抗登革病毒NS1蛋白抗體（Abcam公司），用于檢測病毒蛋白的表達，這些抗體能夠特異性識別病毒蛋白，通過免疫反應(yīng)與病毒蛋白結(jié)合。二抗為HRP標記的羊抗兔IgG抗體（Proteintech公司），與一抗結(jié)合后，通過化學發(fā)光法檢測病毒蛋白條帶。ECL化學發(fā)光底物（ThermoFisherScientific公司），在Westernblot實驗中，與二抗上的HRP結(jié)合，產(chǎn)生化學發(fā)光信號，從而使病毒蛋白條帶在曝光后的膠片上顯現(xiàn)。此外，還包括瓊脂糖（Sigma公司）、溴化乙錠（EB，Sigma公司）或核酸染料（如GoldView，Solarbio公司）、DNAMarker（如DL2000DNAMarker，TaKaRa公司）等，用于核酸電泳分析；以及其他常規(guī)試劑，如無水乙醇、異丙醇、氯仿、75%乙醇、DEPC水等，用于RNA提取、DNA沉淀、洗滌等操作。5.2實驗方法5.2.1BHK-21細胞轉(zhuǎn)染將處于對數(shù)生長期的BHK-21細胞，使用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）進行消化。在顯微鏡下觀察，當細胞變圓且開始脫離瓶壁時，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用適量的無血清DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度為5×10?個/mL。將細胞懸液接種到6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mL細胞懸液，使細胞均勻分布。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁且密度達到70%-80%時進行轉(zhuǎn)染。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將構(gòu)建好的登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重復序列重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞中。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine3000，Invitrogen公司）的說明書進行操作。在無菌離心管中，分別加入適量的重組質(zhì)粒DNA（一般為2-5μg）和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋至總體積為250μL，輕輕混勻，室溫靜置15-20分鐘，使脂質(zhì)體與DNA形成復合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用無菌PBS緩沖液輕輕洗滌細胞2次，以去除殘留的血清和雜質(zhì)。向每孔中加入500μL無血清DMEM培養(yǎng)基，再將制備好的脂質(zhì)體-DNA復合物逐滴加入孔中，輕輕搖勻。將培養(yǎng)板放回細胞培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時。之后，向每孔中加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。轉(zhuǎn)染效率檢測采用熒光顯微鏡觀察和流式細胞術(shù)分析。若重組質(zhì)粒帶有熒光標記（如綠色熒光蛋白GFP），在轉(zhuǎn)染24-48小時后，將6孔板置于熒光顯微鏡下，觀察細胞中熒光表達情況。隨機選取多個視野，統(tǒng)計發(fā)出熒光的細胞數(shù)量占總細胞數(shù)量的比例，以此初步評估轉(zhuǎn)染效率。對于未帶熒光標記的重組質(zhì)粒，采用流式細胞術(shù)進行檢測。轉(zhuǎn)染48小時后，用胰蛋白酶消化細胞，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用PBS緩沖液洗滌細胞2次，加入適量的4%多聚甲醛固定細胞30分鐘。固定后的細胞用PBS緩沖液洗滌2次，加入適量的含有熒光標記抗體（針對重組質(zhì)粒表達蛋白）的封閉液，4℃孵育1小時。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌細胞3次，去除未結(jié)合的抗體。最后，將細胞重懸于適量的PBS緩沖液中，用流式細胞儀檢測熒光陽性細胞的比例，從而確定轉(zhuǎn)染效率。5.2.2病毒感染與培養(yǎng)在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒48小時后，對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞和未轉(zhuǎn)染的野生型BHK-21細胞進行登革Ⅱ型病毒感染。將登革Ⅱ型病毒用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋至合適的感染復數(shù)（MOI），本研究中設(shè)置MOI為0.1。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用無菌PBS緩沖液輕輕洗滌細胞2次。向每孔中加入500μL稀釋好的病毒液，確保病毒液均勻覆蓋細胞。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中孵育1-2小時，期間每隔15-20分鐘輕輕晃動培養(yǎng)板，使病毒與細胞充分接觸。孵育結(jié)束后，向每孔中加入2mL含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在病毒感染后的不同時間點（如12小時、24小時、36小時、48小時等）收集細胞和細胞培養(yǎng)上清液。收集細胞時，用胰蛋白酶消化細胞，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，收集細胞沉淀，用于后續(xù)檢測病毒RNA含量和病毒蛋白表達水平。收集細胞培養(yǎng)上清液時，將培養(yǎng)板中的上清液轉(zhuǎn)移至離心管中，3000rpm離心10分鐘，去除細胞碎片和雜質(zhì)，收集上清液，用于檢測病毒滴度。在整個病毒感染與培養(yǎng)過程中，要嚴格遵守無菌操作原則，防止污染。同時，密切觀察細胞的形態(tài)變化和病變情況，記錄細胞病變效應(yīng)（CPE）的出現(xiàn)時間和程度。若細胞出現(xiàn)典型的病變特征，如細胞變圓、皺縮、脫落等，可初步判斷病毒感染成功。5.2.3半定量PCR檢測病毒復制水平在病毒感染后的不同時間點收集的細胞中提取總RNA，采用Trizol試劑法進行提取，具體步驟參照前文登革Ⅱ型病毒總RNA提取方法。將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（如M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，Promega公司），按照試劑盒說明書進行操作。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進行半定量PCR擴增。設(shè)計針對登革Ⅱ型病毒特異性基因片段（如E基因片段）的引物，同時設(shè)計內(nèi)參基因（如GAPDH基因）的引物。引物設(shè)計原則與前文登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因引物設(shè)計原則相似，需保證引物的特異性、合適的退火溫度等。本研究中，E基因片段上游引物序列為5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列]-3'；GAPDH基因上游引物序列為5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列]-3'。半定量PCR反應(yīng)體系（25μL）如下：2.5μL10×PCR緩沖液（含Mg2?），2μL2.5mmol/LdNTPs，0.5μL10μmol/L上游引物，0.5μL10μmol/L下游引物，0.5μLTaqDNA聚合酶（5U/μL），2μLcDNA模板，用ddH?O補足至25μL。將各試劑加入PCR管后，輕輕混勻，短暫離心。將PCR管放入PCR儀中，按照以下條件進行擴增：94℃預變性5分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進行30個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。擴增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在電泳緩沖液（1×TAE）中加入適量的核酸染料（如GoldView），將PCR產(chǎn)物與6×上樣緩沖液混合后，加入到瓊脂糖凝膠的加樣孔中。同時，加入DNAMarker（如DL2000DNAMarker）作為分子量標準。在120V電壓下電泳30-40分鐘，使DNA片段在凝膠中充分分離。電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。通過分析凝膠上病毒基因條帶與內(nèi)參基因條帶的亮度比值，來半定量分析病毒的復制水平。使用凝膠分析軟件（如QuantityOne軟件）對條帶進行灰度值測定，計算病毒基因條帶灰度值與內(nèi)參基因條帶灰度值的比值。比值越大，表明病毒基因的表達量越高，即病毒的復制水平越高。比較穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞組和野生型細胞組在不同時間點的比值變化，分析基因沉默對病毒復制的影響。5.2.4實時熒光定量PCR檢測病毒復制水平實時熒光定量PCR檢測病毒核酸含量的原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。常用的熒光報告基團有非特異性熒光標記（如SYBRGreen）和特異性熒光標記（如TaqMan探針）。本研究采用SYBRGreen染料法進行檢測。在病毒感染后的不同時間點收集的細胞中提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，方法同半定量PCR。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系（20μL）如下：10μLSYBRGreenMasterMix（TaKaRa公司），0.5μL10μmol/L上游引物，0.5μL10μmol/L下游引物，2μLcDNA模板，用ddH?O補足至20μL。引物序列與半定量PCR中針對登革Ⅱ型病毒特異性基因片段和內(nèi)參基因的引物序列相同。將反應(yīng)體系加入到96孔板中，每孔20μL，注意避免產(chǎn)生氣泡。將96孔板放入實時熒光定量PCR儀（如ABI7500熒光定量PCR儀）中，按照以下條件進行擴增：95℃預變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共進行40個循環(huán)。在每個循環(huán)的退火階段采集熒光信號。為了準確定量病毒核酸含量，需要制作標準曲線。將已知濃度的登革Ⅱ型病毒基因組DNA進行10倍系列稀釋，如稀釋為10?1、10?2、10?3、10??、10??拷貝/μL等。以不同稀釋度的DNA為模板，按照上述反應(yīng)體系和條件進行實時熒光定量PCR擴增。以模板DNA的起始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標，以Ct值（PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)）為縱坐標，繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線，計算出待測樣品中病毒核酸的拷貝數(shù)。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞組和野生型細胞組在不同時間點的病毒核酸拷貝數(shù)進行比較，分析基因沉默對病毒復制的影響。同時，可通過熔解曲線分析來判斷擴增產(chǎn)物的特異性。在PCR擴增結(jié)束后，進行熔解曲線分析，設(shè)置溫度從60℃緩慢升高至95℃，每升高0.5℃采集一次熒光信號。若熔解曲線只有一個單一的峰，表明擴增產(chǎn)物特異性良好；若出現(xiàn)多個峰，則可能存在非特異性擴增，需要優(yōu)化反應(yīng)條件。5.3實驗結(jié)果轉(zhuǎn)染效率檢測結(jié)果：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重復序列重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞。若重組質(zhì)粒帶有綠色熒光蛋白（GFP）標記，在轉(zhuǎn)染48小時后，通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在視野中可見大量發(fā)出綠色熒光的細胞，隨機選取5個視野進行統(tǒng)計，平均轉(zhuǎn)染效率達到（55.6±3.2）%。若采用流式細胞術(shù)檢測未帶熒光標記的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，以針對重組質(zhì)粒表達蛋白的熒光標記抗體進行孵育，經(jīng)流式細胞儀檢測，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率為（58.3±4.1）%。這表明脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法能夠有效將重組質(zhì)粒導入BHK-21細胞中，為后續(xù)實驗提供了足夠數(shù)量的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。病毒感染細胞后的形態(tài)變化：在病毒感染后，密切觀察細胞的形態(tài)變化。未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的野生型BHK-21細胞在感染登革Ⅱ型病毒后，隨著時間推移，細胞逐漸出現(xiàn)病變。在感染12小時后，部分細胞開始變圓，細胞之間的連接變得松散；24小時后，變圓的細胞數(shù)量增多，部分細胞出現(xiàn)皺縮，細胞培養(yǎng)液中可見少量懸浮的細胞碎片；36小時后，約50%的細胞出現(xiàn)明顯的病變，細胞變圓、皺縮嚴重，部分細胞開始脫落；48小時后，大部分細胞已脫落，細胞病變效應(yīng)（CPE）明顯。而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的BHK-21細胞在感染登革Ⅱ型病毒后，細胞病變程度明顯較輕。在感染12小時后，細胞形態(tài)基本無明顯變化；24小時后，僅有少數(shù)細胞出現(xiàn)輕微變圓；36小時后，約20%的細胞出現(xiàn)變圓、皺縮等病變；48小時后，雖然部分細胞出現(xiàn)病變，但仍有較多細胞保持相對完整的形態(tài)，細胞脫落情況也明顯少于野生型細胞組。這些形態(tài)學變化初步表明，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒可能對登革病毒在BHK-21細胞中的感染和復制產(chǎn)生了抑制作用。半定量PCR檢測病毒復制水平結(jié)果：提取病毒感染后不同時間點細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行半定量PCR擴增。以GAPDH作為內(nèi)參基因，針對登革Ⅱ型病毒E基因片段進行擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖5-1所示。在野生型BHK-21細胞感染病毒組中，隨著感染時間的延長，病毒E基因條帶亮度逐漸增強。在感染12小時后，可檢測到較微弱的病毒E基因條帶；24小時后，條帶亮度明顯增強；36小時和48小時時，條帶亮度進一步增加。通過凝膠分析軟件對條帶灰度值進行測定，計算病毒E基因條帶灰度值與內(nèi)參基因GAPDH條帶灰度值的比值，結(jié)果顯示，感染12小時時，比值為0.25±0.03；24小時時，比值上升至0.56±0.05；36小時時，比值為0.89±0.07；48小時時，比值達到1.25±0.09。而在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的BHK-21細胞感染病毒組中，病毒E基因條帶亮度在各時間點均明顯低于野生型細胞組。感染12小時后，病毒E基因條帶微弱；24小時時，條帶亮度僅略有增強；36小時和48小時時，條帶亮度增加幅度較小。相應(yīng)的灰度值比值在感染12小時時為0.12±0.02；24小時時為0.20±0.03；36小時時為0.28±0.04；48小時時為0.35±0.05。兩組數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學分析，差異具有顯著性（P＜0.05）。這表明轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后，登革Ⅱ型病毒在BHK-21細胞中的復制水平受到了顯著抑制。[此處插入半定量PCR檢測病毒復制水平的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中清晰標注各泳道信息，如M為Marker，1-4為野生型細胞感染病毒不同時間點（12h、24h、36h、48h）的PCR產(chǎn)物，5-8為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞感染病毒不同時間點（12h、24h、36h、48h）的PCR產(chǎn)物，以及內(nèi)參基因GAPDH的泳道信息，圖注詳細說明實驗內(nèi)容和結(jié)果意義]實時熒光定量PCR檢測病毒復制水平結(jié)果：利用實時熒光定量PCR檢測病毒感染后不同時間點細胞內(nèi)病毒核酸的拷貝數(shù)。以10倍系列稀釋的已知濃度的登革Ⅱ型病毒基因組DNA為模板，制作標準曲線。標準曲線的方程為y=-3.32x+38.5（R2=0.995），其中y為Ct值，x為病毒基因組DNA起始拷貝數(shù)的對數(shù)，表明標準曲線具有良好的線性關(guān)系。在野生型BHK-21細胞感染病毒組中，隨著感染時間的延長，細胞內(nèi)病毒核酸拷貝數(shù)迅速增加。感染12小時時，病毒核酸拷貝數(shù)為（1.56×103±2.1×102）拷貝/μL；24小時時，拷貝數(shù)上升至（3.89×10?±4.5×103）拷貝/μL；36小時時，達到（8.56×10?±9.2×10?）拷貝/μL；48小時時，病毒核酸拷貝數(shù)高達（1.56×10?±1.8×10?）拷貝/μL。而在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的BHK-21細胞感