棉花品種純度檢測(cè)SNP分子標(biāo)記法PuritytestingofcottonvarietybySNPmarkers2021-02-01實(shí)施2021-02-01實(shí)施新疆維吾爾自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提出。本標(biāo)準(zhǔn)由新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口并組織實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所、新疆維吾爾自治區(qū)植物保護(hù)站、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心、新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院、新疆維吾爾自治區(qū)種業(yè)發(fā)展中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：匡猛、溫少輝、黃龍雨、周大云、魏守軍、吳玉珍、王延琴、艾先濤、聶新輝、梁亞軍、宋羽、高翔、辜立新。本標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施應(yīng)用中的疑問(wèn)，請(qǐng)咨詢(xún)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所。對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)的修改意見(jiàn)建議，請(qǐng)反饋至新疆維吾爾自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局(烏魯木齊市新華南路167號(hào))、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所(河南省安陽(yáng)市開(kāi)發(fā)區(qū)黃河大道38號(hào))。新疆維吾爾自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局聯(lián)系電話(huà)傳真郵編：830004新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳聯(lián)系電話(huà)郵編：830049新疆維吾爾中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所聯(lián)系電話(huà)郵編：455000工1本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotidepolymorphisms,SNP)標(biāo)記進(jìn)行棉花(Gos凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T3543.1農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程總則GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)品種純度檢測(cè)中優(yōu)先選用的一套SNP位點(diǎn)，具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、具備數(shù)據(jù)自動(dòng)分型效果等2見(jiàn)附錄B。送驗(yàn)樣品為種子，對(duì)于雜交種重量應(yīng)不低于70g或不少于500粒；對(duì)于常規(guī)種重量應(yīng)不低于140g或7.2.1DNA提取方法應(yīng)保證提取的DNA數(shù)量和質(zhì)量符合PCR擴(kuò)增的要求，DNA無(wú)降解，溶液的紫輕顛倒混勻至絮狀DNA成團(tuán)析出。用剪口槍頭吸取DNA,轉(zhuǎn)移至盛有70%乙醇的離心管中洗滌一次，三氯甲烷/異戊醇(24:1)混合液，充分混合后12,000rpm離心10min。吸取上清液，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻至絮狀DNA成團(tuán)析出。用剪口槍頭吸取DNA,轉(zhuǎn)移至盛有70%乙醇的離心管中 常表現(xiàn)為雙親互補(bǔ)型)的SNP位點(diǎn)； 37.3.2對(duì)于常規(guī)種純度測(cè)定，鑒定異交個(gè)體、混雜個(gè)體的，各需篩選3個(gè)以上的SNP位點(diǎn)。7.3.3本標(biāo)準(zhǔn)推薦了26個(gè)品種純度檢測(cè)核心SNP位點(diǎn)(參見(jiàn)附錄C)作為優(yōu)先篩選的候選SNP位點(diǎn)。篩選時(shí)，可用至少含20粒的小樣品進(jìn)行試驗(yàn)，依據(jù)7.3.1和7.3.2的要求，確定適宜的SNP位點(diǎn)或SNP和7.4.2所列的一種方法?；跍y(cè)序的基因分型測(cè)試樣品中要包含2個(gè)參照樣品和2個(gè)空白對(duì)照。引物：按照附錄C所提供的SNP位點(diǎn)信息設(shè)計(jì)合成7.4.1.2PCR體系94℃15min;94℃20s,61℃~55℃60s,10個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)降低0.6℃);94℃20s,55℃測(cè)試樣品中要包含2個(gè)參照樣品和2個(gè)空白對(duì)照。按照附錄C所提供的SNP位點(diǎn)信息設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的7.4.2.2PCR體系每個(gè)PCR反應(yīng)體系所使用的DNA總量為40ng,2×KASPMasterMix預(yù)混液5μL,KASP引物0.1494℃15min;94℃20s,61℃~55℃60s,10個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)降低0.6℃);94℃20s,55℃604單獨(dú)運(yùn)行程序37℃,60sec,1循環(huán)后，利用realtimePCR儀自帶軟件，對(duì)樣品基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行讀數(shù)據(jù)記錄方式為具體基因型，如某個(gè)位點(diǎn)為A/G變異，則有AA、AG、GG三種基因型，缺失數(shù)據(jù)記錄為“--”。按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則，采用公式(1)計(jì)算品種純度：5(規(guī)范性)A.3.2十二烷基苯磺酸鈉(SDS)。A.3.6乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-NaA.3.8鹽酸：37%。A.4SNP基因分型核心試劑A.4.1引物探針：基于附錄C提供的78個(gè)核心位點(diǎn)6(規(guī)范性)186.1gNa?EDTA.2H?O溶于800mL水中，用固體NaOH調(diào)pH值至8.0,定容至1000mL,高壓滅菌。60.55gTris堿溶于適量水中，加HCI調(diào)pH至8.0,定容至500mL,高壓滅菌。25mL濃鹽酸(36%～38%),加水定容至500mL。81.7g氯化鈉和20gCTAB溶于適量水中，然后加入1mol/LTris-HCl100mL,0.5mol/LEDTA40mL,加水定容至1000mL。使用前加入10mLβ-巰基乙醇。1mol/LTris-HCl5mL,0.5mol/LEDTA1mL,加HCI調(diào)pH至8.0,定容至500mL。注：試驗(yàn)中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。7(資料性)核心位點(diǎn)名單及側(cè)翼序列等位基因及側(cè)翼序列TATGAGCATCCTATGAACTATTCGAATGTGTTTCTIG/ATTTTTCTATTACATGTATGTTTATATGTCAGTTAATTTTGATGCCACTGTTAATGGGACAAAAA[T/C]GTGTTACGATCTCGTAGCCAGAGATCACGATGGTATTACTCGACCTGTTACTCGACCTAGTATTACT[C/T]GACCTGTTACTGAGACATTGGGACAAGCAAATTGTACAACTTAACCTAATGAATTTAACAATTA[CIA]CATTTGAAGTTTTGAATTGAATGGAGGGACAGCTAGCACTATTTCGAACAACCATCTCTATGCTTGC[A/C]GcCCCCAGATCACTATAAAAGCCAACATATAGATTTCAGCCACCGAGGACAGCAGACCATGTC[A/G]CCGACAACCAATGGCCGTCGTAGAGGCTCGTCGTCCAACTAATTACAATTTGGCCACTAAAACTTTT[A/G]AATTTGCTGTGGAGTCTGGCCATTTGCTAAAGTGTCCAAGAGTTCAAAAACAACAAAAAAGATT[T/G]TTCGATTGAAAGCACGAAGGATTTGGATTCCATTCTCATTTTGAATATGGCGCAATTAGAAGGTTAG[C/T]CTTTGAGTTTGTGATGTGAACGTGTGTGTTAAAGCTCAGGCTACCTCTGTGGCTAGTGTTGACA[G/A]CGTGAAGAACAATAAACTGGAATGTCCGTACTATCCAGTCTGTACTGCCAGATTGGGTTAAGGC[T/C]TAACTCTGATCCGTCAACTGCATCTGCTACTCGAGTTTTAATTCGATTTTTTTCATGTTTTCCATTC[A/G]TTTGTGTTATAATAATTTAATTCTAGTTGTTCTCGTACCACCATGAAAAACATTTAAAAAAAAC[T/G]AAACATAAATACGTATGTCGGACATATACAGTGTATTTTATGTAGTCAACACTTATACCGTAAG[A/C]ATTCATATTGAGTTAAGAAGTTGATTCGAAAGTTGGATGGGGGTATTACTTGCAATTTTATGCAAAC[T/CJCGAGTCGCAAACTTGTTACCAAGGAATGAAGTGTTTCTCAACCACGAAAAGGGTTTCCCAAACT[T/C]TACAAAAAATGGGGGAAGTCAATATGGCAAACGTCGAAGTAAACAATAAATAAAAAAAGTAGCGTGG[T/G]TAGATTATACTTGTACTAGTATTTGGATTCGGAAAAGGCAATGTTGTGGTAGATGCTCTATGTC[G/A]GAGATCAATGACTGATTTACGGGCGATGGCGACACTGTCTTCAAATCCTGGATACTTTGACTT[T/C]GAAGTCTAGTATTGCAATGCCATTCCTCAACAAAAGGCTCCCTATTTCTTCTTATAACTGAAAT[C/A]AAAAAAATGAAATCCccCCGAATCTTTTTTTCATACGTCTCTAAAGAGAAACCGCTGTGAGTTTGTG[G/A]GGCATTTCGTCAATTGGTCCTATACGTCTCGGATACATCTCCCTATTTGTTTCTAAAATAGATTACT[C/T]ACCAACTGTCGATAGGTAGCTCTTGTATTCTTGATCGGAGAGACCATCGATGCCAAAGGCCTTACGG[A/G]GGTCCATTTGAGCGAAAGCATCCAAA