(10)申請公布號CN120204412A(21)申請?zhí)?02510155021.9(22)申請日2018.11.16(30)優(yōu)先權(quán)數(shù)據(jù)62/587,7672017.11.17US62/634,7502018.02.23US(62)分案原申請數(shù)據(jù)201880072250.22018.(71)申請人隆薩銷售股份公司道格拉斯·E·威廉姆斯A61K47/42(2017.01)(54)發(fā)明名稱工程化外來體的組合物和負(fù)載腔外來體有效負(fù)載物的方法(57)摘要本發(fā)明涉及使用新鑒定為在外來體腔中富集的蛋白質(zhì)制備治療性外來體的方法。具體地，本發(fā)明提供將治療性肽或蛋白質(zhì)定位在外來體中的方法。所述方法涉及產(chǎn)生腔工程化外來體，所述腔工程化外來體包含濃度較高的外來體蛋21.一種包含靶蛋白的外來體，其中所述靶蛋白的至少一部分由外源序列表達(dá)，并且所2.如權(quán)利要求1所述的外來體，其中所述靶蛋白以比不同外來體中的不同靶蛋白更高的密度存在于所述外來體中，其中所述不同靶蛋白包括常規(guī)外來體蛋白或其變體。3.如權(quán)利要求2所述的外來體，其中所述常規(guī)外來體蛋白選自由以下組成的組：CD9、4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的外來體，其中所述外來體由被遺傳修飾成包含所述外源序列的細(xì)胞產(chǎn)生。5.如權(quán)利要求4所述的外來體，其中所述細(xì)胞包含含所述外源序列的質(zhì)粒。6.如權(quán)利要求4所述的外來體，其中所述細(xì)胞包含插入到所述細(xì)胞的基因組中的所述外源序列。7.如權(quán)利要求6所述的外來體，其中所述外源序列被插入到位于相對于編碼MARCKS、BASP1或其片段和治療性化合物的融合蛋白。10.如權(quán)利要求9所述的外來體，其中所述治療性化合物選自由以下組成的組：核苷酸、11.如權(quán)利要求1-10中任一項所述的外來體，其進(jìn)一步包含第二靶蛋白，其中所述第二12.如權(quán)利要求1-10中任一項所述的外來體，其進(jìn)一步包含第二靶蛋白，其中所述第二13.如權(quán)利要求1-10中任一項所述的外來體，其中所述靶蛋白包含(M)(G)(G/A/S)(K/14.如權(quán)利要求13所述的外來體，其中所述靶蛋白包含SEQIDNO:4-110中的任一種的16.一種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1-15中任一項所述的外來體和賦形劑。17.如權(quán)利要求16所述的藥物組合物，其基本上不含大分子，其中所述大分子選自核18.一種細(xì)胞群，其用于產(chǎn)生如權(quán)利要求1-15中任一項所述的外來體。19.一種用于修飾外來體的多肽，其包含以下的序列：(i)(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQIDNO:118);(ii)(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+),其中每個括號內(nèi)位自由(Lys、Arg、His)組成的組的任何氨基酸，并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是3(+)也不是(Asp或Glu);或(ii)(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+),其中每個括號內(nèi)位的任何氨基酸，并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu);或(iii)的組的任何氨基酸，并且(+)是選自由(Lys、Arg、His)組成的組的任何氨基酸，并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。20.如權(quán)利要求19所述的多肽，其包含SEQIDNO:4-110中的任一種的序列。NO:116)。22.如權(quán)利要求19-21中任一項所述的多肽，其中所述多肽與貨物肽融合。23.一種多肽構(gòu)建體，其包含編碼如權(quán)利要求19-22中任一項所述的多肽的編碼序列。24.如權(quán)利要求23所述的多肽構(gòu)建體，其中所述編碼序列是經(jīng)密碼子優(yōu)化的。25.一種制備工程化外來體的方法，其包括以下步驟：a.向細(xì)胞中引入編碼融合多肽的核酸構(gòu)建體，所述融合多肽包含(i)編碼MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修飾物的第一序列，和(ii)編碼貨物肽的第二序列；b.將所述細(xì)胞維持在允許所述細(xì)胞表達(dá)所述融合多肽的條件下；以及c.從所述細(xì)胞獲得包含所述融合多肽的所述工程化外來體。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述第一序列包含以下的序列：(i)(M)(G)(G/A/S)并且(+)是選自由(Lys、Arg、His)組成的組的任何氨基酸，并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu);或(ii)(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+),其中每個括號內(nèi)位置表示氨基酸，并且其中π是選自由(Pro、Gly、Ala、Ser)組成的組的任何氨基Arg、His)組成的組的任何氨基酸，并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu);或(iii)(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+),其中每個括號內(nèi)位置表示氨何氨基酸，并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。27.如權(quán)利要求25或26所述的方法，其中所述第一序列包含SEQIDNO:4-110中的任一種。429.如權(quán)利要求25-28中任一項所述的方法，其中所述融合多肽以比不同外來體中的不同靶蛋白更高的密度存在于所述工程化外來體的腔中，其中所述不同靶蛋白包括常規(guī)外來體蛋白或其變體。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述融合多肽以比所述不同外來體中的所述不同靶蛋白高超過2倍的密度存在。5[0003]本申請要求2017年11月17日提交的美國臨時專利申請62/587,767和2018年2月23[0005]本申請包括按ASCII格式以電子方式提交并特此通過引用以其全文并入的序列表。2018年11月15日創(chuàng)建的所述ASC含丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS);豆蔻?；母缓彼岬牡鞍准っ窩底物樣1短序列已顯示足以將熒光蛋白貨物分子的高效負(fù)載引導(dǎo)至與全長BASP1蛋白相同的程度。實施方案涉及通過使外來體蛋白或蛋白質(zhì)片段與治療相關(guān)蛋白質(zhì)綴合來產(chǎn)生融合蛋白并6且在外來體腔中產(chǎn)生含有融合蛋白的外來體。治療相關(guān)蛋白的天然全長蛋白或生物活性片段可以通過與富集外來體的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段綴合而被運輸?shù)酵鈦眢w腔中。[0010]本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生或使用腔工程化外來體，該腔工程化外來體被設(shè)計成用于在外來體腔中更有效地負(fù)載、或用于負(fù)載治療相關(guān)蛋白。例如，外來體腔可以經(jīng)修飾以在腔中含有更高濃度的天然全長外來體蛋白和/或天然外來體蛋白的片段或修飾物的蛋白質(zhì)。[0011]本發(fā)明的一些實施方案涉及一種用于生產(chǎn)這種腔工程化外來體的生產(chǎn)細(xì)胞或一種產(chǎn)生所述生產(chǎn)細(xì)胞的方法。外源多核苷酸可以被暫時或穩(wěn)定地引入生產(chǎn)細(xì)胞中，以由生產(chǎn)細(xì)胞產(chǎn)生表面工程化外來體。[0012]因此，在一個方面，本發(fā)明提供一種包含靶蛋白的外來體，其中所述靶蛋白的至少[0013]在一些實施方案中，所述靶蛋白以比不同外來體中的不同靶蛋白更高的密度存在于所述外來體中，其中所述不同靶蛋白包括常規(guī)外來體蛋白或其變體。在一些實施方案中，[0014]在一些實施方案中，外來體由被遺傳修飾以包含所述外源序列的細(xì)胞產(chǎn)生，任選地其中所述細(xì)胞是HEK293細(xì)胞。[0015]在一些實施方案中，所述細(xì)胞包含含有外源序列的質(zhì)粒。BASP1的基因組序列的3'或5'的基因組位點中。在一些實施方案中，所述外源序列被插入到性肽的融合蛋白。[0018]在一些實施方案中，治療性肽選自由以下組成的組：天然肽、重組肽、合成肽或至治療性化合物的接頭。在一些實施方案中，所述治療性化合物選自由以下組成的組：核苷實施方案中，治療性肽是抗微生物肽或其片段或修飾物。[0019]在一些實施方案中，外來體進(jìn)一步包含第二靶蛋白，其中所述第二靶蛋白包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段。在一些實施方案中，外來體進(jìn)一步包含第二靶蛋白，其白或其片段。[0020]在一些實施方案中，所述靶蛋白包含(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQIDNO:118)的肽。在一些實施方案中，所述靶蛋白包含(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)的任何氨基酸，并且(+)是選自由(Lys、Arg、His)組成的組的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。在一些實施方案中，所述靶蛋白包含(M)7的組的任何氨基酸，并且(+)是選自由(Lys、Arg、His)組成的組的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。[0021]在一些實施方案中，靶蛋白包含SEQIDNO:4-110中的任一種的肽。在一些實施方案中，所述靶蛋白包含MGXKLSKKK的肽，其中X是任何氨基酸(SEQIDNO:116)。在一些實施方案中，靶蛋白包含SEQIDNO:110的肽。在一些實施方案中，靶蛋白包含SEQIDNO:13的[0022]在一些實施方案中，靶蛋白進(jìn)一步包含貨物肽。[0023]在另一個方面，本發(fā)明提供一種包含外來體和賦形劑的藥物組合物。[0024]在一些實施方案中，藥物組合物基本上不含大分子，其中所述大分子選自核酸、外源蛋白、脂質(zhì)、碳水化合物、代謝物及其組合。[0025]在又一個方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生本文提供的外來體的細(xì)胞群。[0026]在一些實施方案中，細(xì)胞群包含編碼靶蛋白的外源序列，所述靶蛋白包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修飾物。在一些實施方案中，細(xì)胞群進(jìn)一步包含編碼第二靶蛋白的第二外源序列，其中所述第二靶蛋白包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修飾物。在一些實施方案中，細(xì)胞群進(jìn)一步包含編碼第二靶蛋白的第二外源序列，其中所述第二靶序列中，其中所述外源序列和所述基因組序列編碼所述靶蛋白。在一些實施方案中，外源序列是在質(zhì)粒中。[0028]在一些實施方式中，外源序列編碼治療性肽。在一些實施方案中，治療性肽選自由以下組成的組：天然肽、重組肽、合成肽或至治療性化合物的接頭。在一些實施方案中，所述治療性化合物選自由以下組成的組：核苷酸、氨基酸、脂質(zhì)、碳水化合物和小分子。在一些實施方案中，治療性肽是抗體或其片段或修飾物。在一些實施方案中，治療性肽是酶、配體、受體、轉(zhuǎn)錄因子或其片段或修飾物。在一些實施方案中，治療性肽是抗微生物肽或其片段或修飾物。[0029]在一些實施方案中，外源序列編碼靶向部分。在一些實施方案中，靶向部分對器官、組織或細(xì)胞具有特異性。[0030]在一些實施方案中，第二靶蛋白進(jìn)一步包含靶向部分。在一些實施方案中，靶向部分對器官、組織或細(xì)胞具有特異性。[0031]在一個方面，本發(fā)明提供一種用于修飾外來體的多肽，其包含以下的序列：(i)(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQIDNO:118);(ii)(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+),其中每個括號內(nèi)位置表示氨基酸，并且其中π是選自由(Pro、Gly、Ala、Ser)組成的組的任何氨基酸，X是任何氨基酸，①是選自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)組成的組的任何氨基酸，并且(+)是選自由(Lys、Arg、His)組成的組的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu);或(iii)(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+),其中每個括號內(nèi)位置表示氨基酸，并且其中π是選自由(Pro、Gly、Ala、Ser)組成的基酸，①是選自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)組成的組的任何氨基酸，并且(+)是選8自由(Lys、Arg、His)組成的組的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是[0032]在一些實施方案中，多肽包含SEQIDNO:4-110中的任一種的序列。在一些實施方[0033]在一些實施方案中，多肽與貨物肽融合。在一些實施方案中，多肽與所述貨物肽的N末端融合。[0034]在一個方面，本發(fā)明提供一種多核苷酸構(gòu)建體，該多核苷酸構(gòu)建體包含編碼本文提供的多肽的編碼序列。在一些實施方案中，編碼序列經(jīng)密碼子優(yōu)化。[0035]在另一個方面中，本發(fā)明提供一種制備工程化外來體的方法，其包括以下步驟：a.BASP1或其片段或修飾物的第一序列，和(ii)編碼貨物肽的第二序列；b.將所述細(xì)胞維持在允許所述細(xì)胞表達(dá)所述融合多肽的條件下；和c.從所述細(xì)胞獲得包含所述融合多肽的工程化外來體。[0036]在一些實施方案中，第一序列包含以下的序列：(i)(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQIDNO:118);(ii)M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+),其中每個括號內(nèi)位自由(Lys、Arg、His)組成的組的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu);或(iii)(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+),其中每個括號內(nèi)位的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。[0037]在一些實施方案中，多核苷酸包含SEQIDNO:4-110中的任一種的序列。在一些實施方案中，多核苷酸包含SEQIDNO:13的序列。在一些實施方案中，多核苷酸包含SEQID[0038]在一些實施方案中，融合多肽以比不同外來體中的不同靶蛋白更高的密度存在于所述工程化外來體的腔中，其中所述不同靶蛋白包括常規(guī)外來體蛋白或其變體。在一些實施方案中，融合多肽以比不同外來體中的不同靶蛋白高超過2倍的密度存在。在一些實施方案中，融合多肽以比不同外來體中的不同靶蛋白高超過4倍、16倍、100倍、或10,000倍的密度存在。附圖說明[0039]附圖僅出于說明的目的描繪了本發(fā)明的各種實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員將從以下討論中容易地認(rèn)識到，在不脫離本文所述的本發(fā)明的原理的情況下，可以采用本文示出的結(jié)構(gòu)和方法的可替代實施方案。[0040]圖1提供了超速離心后含樣品的Optiprep密度梯度的圖像。標(biāo)有括號的是含有外9[0041]圖2是示出從Optiprep超速離心的頂部級分鑒定的蛋白質(zhì)(Y軸)和從底部級分鑒定的蛋白質(zhì)(X軸)的點圖。虛線上方繪制的蛋白質(zhì)代表外來體富集的蛋白質(zhì)(包括MARCKS、MARCHSL1和BASP1),而虛線下方的蛋白質(zhì)代表非特異于外來體的蛋白質(zhì)。[0045]圖6A示出了從HEK293細(xì)胞收集的總細(xì)胞裂解物(左側(cè))和純化外來體群體(右側(cè))的蛋白質(zhì)印跡圖片。圖6A中提供的凝膠的蛋白質(zhì)印跡顯示，MARCK和BASP1(圖6D)位于純化外來體中，并且在總細(xì)胞裂解物中未檢測到，或者與外來體相比以顯著較低的水平在細(xì)胞裂解物中檢測到。[0046]圖7示出了純化外來體的熒光強度，所述純化外來體含有與含有氨基酸1-30、CD81或pDisplay的MARCKS片段融合的GFP。[0048]圖9示出了純化外來體的熒光強度，所述純化外來體含有與全長BASP1、含有氨基酸1-30、CD81或pDisplay的BASP1片段融合的GFP。[0049]圖10示出了用于確定足以負(fù)載外來體的最小BASP1N末端序列的融合蛋白的示意[0050]圖11示出了來自納米流式細(xì)胞術(shù)的圖，該納米流式細(xì)胞術(shù)測量經(jīng)工程化以表達(dá)與GFP融合的BASP1片段的外來體的熒光信號。x軸根據(jù)分配給如圖10中提供的各種融合蛋白的數(shù)字編號。[0051]圖12示出了經(jīng)染色蛋白凝膠的圖片，其指示負(fù)載有與GFP融合的BASP1片段的外來體的相等負(fù)載。虛線箭頭指示BASP1融合蛋白的遷移位置。泳道根據(jù)分配給如圖10中提供的各種融合蛋白的數(shù)字編號。[0052]圖13示出了用考馬斯藍(lán)染色以標(biāo)記總蛋白的蛋白凝膠的圖片。虛線箭頭指示BASP1融合蛋白的遷移位置。泳道用分配給如圖10中提供的各種融合蛋白的數(shù)字標(biāo)記。[0053]圖14示出了來自純化外來體的抗FLAG蛋白印跡的圖片，所述純化外來體含有與[0054]圖15示出了來自純化外來體的抗Alix蛋白印跡的圖片，所述純化外來體含有與FLAG和GFP融合的BASP1片段，從而證實相等的蛋白質(zhì)負(fù)載。泳道根據(jù)圖10中所示的蛋白質(zhì)序列編號。[0055]圖16A示出了包含與FLAG標(biāo)簽和GFP融合的BASP1片段的融合蛋白的序列(按出現(xiàn)順序分別為SEQIDNO135-142)。圖16B示出了從穩(wěn)定表達(dá)圖16A中的融合蛋白之一的細(xì)胞[0056]圖17A示出了來自與FLAG標(biāo)簽和GFP融修飾物(1-30-S6D、1-30-S6A和1-30-L5Q)的序列(按出現(xiàn)順序分別為SEQIDNO143-145)。圖17B示出了從穩(wěn)定表達(dá)圖17A中的融合蛋白之一的細(xì)胞中純化外來體的抗FLAG蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。[0057]圖18示出了考馬斯染色的蛋白凝膠的圖像，其中外來體樣品從穩(wěn)定表達(dá)均與中純化。圖像上的黑色箭頭指示對應(yīng)于融合蛋白的帶。[0058]圖19示出了BASP1的前28個氨基酸(保守區(qū)1)、MARCKS的氨基酸1-7和152-173(保守區(qū)2)以及MARCKSL1的氨基酸1-7和87-110(保守區(qū)3)之間的蛋白質(zhì)序列比對。[0059]圖20A示出了BASP1的氨基酸1-30(“BASP1-30”)(SEQIDNO或其修飾物的PSD結(jié)構(gòu)域融合的MARCKS或其修飾物的氨基酸1-3的融合蛋白("MARCKS-MG-穩(wěn)定表達(dá)包含圖20A的氨基酸序列和FLAG的融合蛋白的細(xì)胞的純化外來體的抗FLAG蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。用于將貨物負(fù)載到外來體腔中的每個序列的氨基酸需求(SEQIDNO:118)。[0061]圖22A示出了天然外來體或從穩(wěn)定表達(dá)與BASP1的氨基酸1-10或1-30融合的Cas9的細(xì)胞中純化外來體的總蛋白(頂部)和抗Cas9蛋白質(zhì)印跡(底部),以及減少量的重組Cas9。圖22B(頂部)示出了源自圖22A的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果的Cas9光密度測定法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖22B(底部)進(jìn)一步提供了基于標(biāo)準(zhǔn)曲線估算的，每個純化外來體負(fù)載的作為與BASP1的1-30氨基酸或1-10氨基酸片段綴合的融合蛋白的Cas9量。[0062]圖23A示出了從用表達(dá)BASP1N末端(氨基酸1-10)與卵清蛋白的融合體("“BASP1(1-10)-OVA”)的構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或用兩種構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中純化外來體的蛋白凝膠圖像，所述兩種構(gòu)建體一種表達(dá)BASP1N末端(氨基酸1-10)與卵清蛋白的融合體，并且另一種表達(dá)與跨膜蛋白PTGFRN融合的CD40L(“BASP1(1-10)-0VA;3XCD40L-PTGFRN”)。圖23A進(jìn)一步示出了負(fù)載減少量的重組0VA的蛋白凝膠的圖像。圖23B示出了來自圖23A的樣品的抗卵清蛋白蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。[0063]圖24A示出了針對與BASP1的氨基酸1-10和FLAG標(biāo)簽融合的GFP的駱駝納米抗體的序列(SEQIDNO:150)。圖24B示出了來自穩(wěn)定表達(dá)圖24A的融合蛋白("BASP1(1-10)-納米蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。[0064]圖25示出了外來體mRNA負(fù)載體系的示意圖，該負(fù)載體系包含(i)與FLAG和單體或NO:112)、2XMCP(V29I)(“819”;SEQIDNO:113)或2XMCP(V29I/N55K))(“821”;SEQIDNO:[0065]圖26A示出了外來體的蛋白凝膠，所述外來體含有圖25中所述的mRNA負(fù)載構(gòu)建體、[0066]圖27A示出了含有圖25中所示的mRNA負(fù)載構(gòu)建體的細(xì)胞(頂部)或外來體(底部)中螢光素酶mRNA的量的RT-qPCR結(jié)果。圖27B示出了定量來自圖27A中的樣品的純化外來體中11中的跨膜蛋白的外表面展示的CD40L三聚體的示意圖。[0068]圖29A示出了在與CD40L表面表達(dá)外來體一起孵育的培養(yǎng)物中小鼠B細(xì)胞活化的結(jié)表達(dá)外來體一起孵育的培養(yǎng)物中人B細(xì)胞活化的結(jié)果，所述外來體與MARCKS、MARCKSL1和BASP1的N末端片段融合。圖29C示出了當(dāng)與MARCKS、MARCKSL1、BASP1或全長PTGFRN的N末端序列融合時，不同CD40L表面展示外來體的相對效力的圖表。231,乳腺；Raji,淋巴母細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC),骨髓)的各種細(xì)胞系純化外來體中的腔[0070]圖31示出了單獨的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞來源的外來體，或來自過表達(dá)與FLAG-GFP融合的BASP1或BASP1N末端片段(1-30或1-8)的細(xì)胞的外來體的蛋白凝膠(左側(cè))和抗FLAG蛋白質(zhì)印跡(右側(cè))。具體實施方式[0072]除非另外定義，否則本文所使用的所有技術(shù)性和科學(xué)性術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常所理解的含義。如本文所用，以下術(shù)語具有以下賦予其的含義。間的膜。細(xì)胞外囊泡包括所有膜結(jié)合囊泡，其直徑小于其來源細(xì)胞的直徑。通常，細(xì)胞外囊泡的直徑范圍為20nm至1000nm,并且可以包含在內(nèi)部空間內(nèi)、顯示在細(xì)胞外囊泡的外表面上和/或跨越膜的各種大分子有效負(fù)載物。所述有效負(fù)載物可以包括核酸、蛋白質(zhì)、碳水化過直接或間接操作(例如，通過連續(xù)擠壓或用堿性溶液處理)從細(xì)胞衍生的囊泡、囊泡細(xì)胞器和活細(xì)胞產(chǎn)生的囊泡(例如，通過直接質(zhì)膜出芽或晚期內(nèi)體與質(zhì)膜融合)。細(xì)胞外囊泡可以源自活的或死的生物體、移植的組織或器官和/或培養(yǎng)的細(xì)胞。[0074]如本文所用，術(shù)語“外來體”是指細(xì)胞衍生的小(直徑在40-200nm之間)囊泡，其包括封閉內(nèi)部空間的膜，并且由所述細(xì)胞通過直接質(zhì)膜出芽或通過晚期內(nèi)體與質(zhì)膜融合而產(chǎn)生。外來體是細(xì)胞外囊泡的一種。外來體包含脂質(zhì)或脂肪酸和多肽，并且任選地包含有效負(fù)載物(例如治療劑)、接收器(例如靶向部分)、多核苷酸(例如基于其大小、密度、生化參數(shù)或其組合從生產(chǎn)細(xì)胞中分離。[0075]如本文所用，術(shù)語“納米囊泡”是指細(xì)胞衍生的小(直徑在20-250nm徑在30-150nm之間)囊泡，其包括封閉內(nèi)部空間的膜，并且通過直接或間接操作由所述細(xì)胞產(chǎn)生，使得在沒有所述操作的情況下所述生產(chǎn)細(xì)胞將不產(chǎn)生所述納米囊泡。所述生產(chǎn)細(xì)胞的適當(dāng)操作包括但不限于連續(xù)擠壓、用堿性溶液處理、超聲波處理或其組合。在一些情況下，納米囊泡的產(chǎn)生可能導(dǎo)致所述生產(chǎn)細(xì)胞的破壞。優(yōu)選地，納米囊泡的群體基本上不含通過從質(zhì)膜直接出芽或晚期內(nèi)體與質(zhì)膜融合從生產(chǎn)細(xì)胞衍生的囊泡。納米囊泡包含脂質(zhì)或脂肪酸和多肽，并且任選地包含有效負(fù)載物(例如治療劑)、接收器(例如靶向部分)、多核苷酸細(xì)胞衍生出納米囊泡，就可以基于其大小、密度、生化參數(shù)或其組合從生產(chǎn)細(xì)胞中分離出納米囊泡。[0076]如本文所用，術(shù)語“腔工程化外來體”是指內(nèi)部腔空間的組成被修飾的外來體。例生物方法改變，或者通過由先前通過化學(xué)、物理或生物方法修飾的細(xì)胞產(chǎn)生來改變。具體地，所述組成可以通過基因工程改變，或者通過由先前通過基因工程修飾的細(xì)胞產(chǎn)生來改[0077]如本文所用，術(shù)語蛋白質(zhì)的“修飾物”是指對蛋白質(zhì)的非突變氨基酸序列具有至少15%同一性的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的修飾物包括蛋白質(zhì)的片段或變體。蛋白質(zhì)的修飾進(jìn)一步可以包括對蛋白質(zhì)的片段或變體的化學(xué)或物理修飾。[0078]如本文所用，術(shù)語蛋白質(zhì)的“片段”是指與天然存在的蛋白質(zhì)相比在N和/或C末端缺失的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，MARCKS、MARCKSL1或BASP1的片段保留特異性靶向外來體腔的能力。這種片段也被稱為“功能片段”。片段是否是所述意義上的功能片段可以通過任何本領(lǐng)域已知的方法來評估，以確定外來體的蛋白質(zhì)含量，所述方法包括蛋白質(zhì)印跡、FACS分析和片段與自體熒光蛋白質(zhì)例如像GFP的融合。在一個特定的實施方案中，MARCKS、MARCKSL1、或BASP1的片段保留了天然存在的MARCKS、MARCKSL1、或BASP1特異性地靶向外來體的能力的至少50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一個特定的實施方案中，MARCKS、MARCKSL1、特異性地靶向外來體腔的能力的至少70%、80%、85%、90%、95%或99%。這種能力可以例如通過熒光標(biāo)記的變體，在實驗部分中所述的測定中評估。[0079]如本文所用，術(shù)語蛋白質(zhì)的“變體”是指通過本領(lǐng)域已知的方法比對后與另一蛋白質(zhì)共享特定氨基酸序列同一性的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的變體可以包括另一種蛋白質(zhì)中的取代、MARCKS、MARCKSL1或BASP1的片段具有至少70%同一性的變體。在一些實施方案中，MARCKS的變體或片段變體與根據(jù)SEQIDNO:1的MARCKS或與其功能片段共享至少70%、80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性。在一些實施方案中，MARCKSL1的變體或片段變體與根據(jù)SEQIDNO:2的MARCKSL1或與其功能片段共享至少70%、80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性。在一些實施方案中，BASP1的變體或片段變體與根據(jù)SEQIDNO:3的BASP1或與其功能片段共享至少70%、80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性。在上述每種情況下，優(yōu)選變體或片段變體保留特異性地靶向外來體腔的能力。[0080]用于比較的序列比對方法是本領(lǐng)域熟知的。各種程序和比對算法描述于：Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981);Needleman和Wunsch,J.Mol.Bio.48:443(1970);Meth.Mol.Biol.24:307-31人，J.Mol.Biol.215:403-10(1990)J可來自若干來源，包括國家生物信息中心(NBC1,Bethesda,Md.)和在因特網(wǎng)上獲得以與序列分析程序blastp、blasm、blastx、tblastn和tblastx關(guān)聯(lián)使用。BLAST和如何使用所述程序確定序列同一性的描述可以在NIH(國家衛(wèi)生研究院)下屬的NCBI(國家生物技術(shù)信息中心)官方網(wǎng)站上訪問。[0081]本文提供的任何蛋白質(zhì)的敘述涵蓋蛋白質(zhì)的功能變體。術(shù)語蛋白質(zhì)的“功能變體”是指蛋白質(zhì)的變體，其保留了特異性地靶向外來體腔的能力。在一個特定的實施方案中，特異性地靶向外來體腔的能力的至少70%、80%、85%、90%、95%或99%。[0082]如本文所用，術(shù)語“生產(chǎn)細(xì)胞”是指用于產(chǎn)生外來體的細(xì)胞。生產(chǎn)細(xì)胞可以是體外培養(yǎng)的細(xì)胞，或者體內(nèi)的細(xì)胞。生產(chǎn)細(xì)胞包括但不限于已知能有效產(chǎn)生外來體的細(xì)胞，例如HEK293細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。白或肽可以是天然地靶向外來體腔的非突變蛋白，或者所述非突變蛋白的片段或修飾物。靶蛋白可以是融合蛋白，其含有flag標(biāo)簽、治療性肽、靶向部分、或附著到所述非突變蛋白的其他肽，或所述非突變蛋白的修飾物或片段。靶蛋白可以包含修飾，如肉豆蔻酰化、異戊二烯化或棕櫚?；?，或通過接頭附著到膜內(nèi)部小葉的可溶性蛋白。體中的任何蛋白質(zhì)或肽，或其片段或修飾物。貨物蛋白或肽可以包括作用于與外來體接觸的靶標(biāo)(例如靶細(xì)胞)的治療性肽或蛋白。貨物蛋白可以是融合蛋白，其包含如上所述的靶蛋白或肽或其片段或修飾物，使得貨物融合蛋白可以靶向外來體腔。括未被封閉在外來體中且未附著或結(jié)合到外來體膜中的蛋白質(zhì)。取(extracting)”可互換使用，并且是指已經(jīng)經(jīng)歷一個或多個純化過程(例如選擇或富集期望的外來體制劑)的期望EV的制劑狀態(tài)(例如，多個已知或未知的量和/或濃度)。在一些實施方案中，如本文所用的分離或純化是從含有生產(chǎn)細(xì)胞的樣品中除去、部分除去(例如，一部分)外來體的過程。在一些實施方案中，分離的外來體組合物沒有可檢測的不期望活性，或者可替代地，不期望活性的水平或量等于或低于可接受的水平或量。在其他實施方案中，分離的外來體組合物具有的所期望外來體的量和/或濃度等于或高于可接受的量和/或濃度。在其他實施方案中，與獲得所述組合物的起始材料(例如，生產(chǎn)細(xì)胞制劑)相比，分離的外來體組合物富集。與起始材料相比，這種富集可以是10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%、99.999%、或大于99.9999%。在一些實施方案中，分離的外來體制劑基本上不含殘留的生物產(chǎn)品。在一些實施方案中，分離的外來體制劑100%不含、99%不含、98%不含、97%不含、96%不含、95%不含、94%不含、93%不含、92%不含、91%不含或90%不含任何污染性生物物質(zhì)。殘留的生物產(chǎn)品可能包括非生物物質(zhì)(包括化學(xué)物質(zhì))或不需要的核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或代謝物。基本上不含殘留生物產(chǎn)物還意指外來體組合物不含可檢測的生產(chǎn)細(xì)胞，并且僅外來體是可檢測[0087]術(shù)語“賦形劑”或“載體”是指添加到藥物組合物中以進(jìn)一步促進(jìn)化合物施用的惰構(gòu)批準(zhǔn)的或美國藥典中列出的用于動物(包括人)的任何藥劑，以及不會對受試者造成顯著刺激且不會消除所施用化合物的生物活性和特性的任何載體或稀釋劑。包括賦形劑和載[0088]如本文所用，術(shù)語“有效負(fù)載物”是指作用于與EV接觸的靶標(biāo)(例如靶細(xì)胞)的治療劑?？梢员灰胪鈦眢w和/或生產(chǎn)細(xì)胞中的有效負(fù)載物包括治療劑，如核苷酸(例如，包含可檢測部分或毒素或破壞轉(zhuǎn)錄的核苷酸)、核酸(例如，編碼多肽如酶的DNA或mRNA分子，或具有調(diào)節(jié)功能的RNA分子如miRNA、dsDNA、lncRNA和siRNA)、氨基酸(例如，包含可檢測部分或相關(guān)病毒和病毒顆粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒等)和小分子(例如，小分子藥物和毒素，包括小等)。治療或療法的任何哺乳動物受試者，具體是人。本文所述的方法適用于人療法和獸醫(yī)學(xué)應(yīng)[0091]如本文所用，術(shù)語“基本上不含”意指包含外來體的樣品包含質(zhì)量/體積(m/v)百分比濃度小于10%的大分子。一些級分可能含有小于0.001%、小于0.01%、小于0.05%、小于于9%或小于10%(m/v)的大分子。合。[0093]如本文所用，術(shù)語“常規(guī)外來體蛋白”意指先前已知在外來體中富集的蛋白質(zhì)，包白或其片段或變體不是常規(guī)的外來體蛋白。[0094]其他解釋慣例[0095]本文列舉的范圍應(yīng)理解為所述范圍內(nèi)的所有值(包括所列舉的端點值)的速記法。[0096]除非另外指明，否則提及具有一個或多個立構(gòu)中心的化合物是指每種立體異構(gòu)體及其立體異構(gòu)體的所有組合。[0097]外來體蛋白[0098]本發(fā)明的一些實施方案涉及外來體蛋白的鑒定、使用和修飾，所述外來體蛋白在外來體腔中高度富集。此類外來體蛋白可以通過用質(zhì)譜或本領(lǐng)域已知的其他方法分析高度純化外來體來鑒定。[0099]所述蛋白質(zhì)包括富集在外來體膜上的各種腔蛋白或膜蛋白，如跨膜蛋白、整合蛋白和外周蛋白。具體地，所述蛋白質(zhì)包括但不限于(1)豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS);(2)豆蔻?；母缓彼岬牡鞍准っ窩底物樣1(MARCKSL1);和(3)腦酸溶性蛋白1(BASP1)。[0100]根據(jù)生產(chǎn)細(xì)胞、生產(chǎn)條件、純化方法或外來體的預(yù)期應(yīng)用，可以選擇性地使用本文鑒定的一種或多種外來體蛋白?？梢澡b定富集在具有特定大小范圍、靶向部分、電荷密度、有效負(fù)載物等的某些外來體腔中的外來體蛋白，并且將其用于本發(fā)明的一些實施方案中。在一些實施方案中，可以同時或隨后使用多于一種的外來體蛋白來產(chǎn)生和分離治療性外來[0101]腔工程化外來體[0102]本發(fā)明的另一方面涉及腔工程化外來體的產(chǎn)生和使用。腔工程化外來體具有其組成被修飾的內(nèi)部空間。例如，可以通過改變腔的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或聚糖含量來修飾腔的組成。[0103]在一些實施方案中，腔工程化外來體通過化學(xué)和/或物理方法(如PEG誘導(dǎo)的融合和/或超聲波融合)產(chǎn)生。[0104]在其他實施方案中，腔工程化外來體由基因工程產(chǎn)生。由遺傳修飾的生產(chǎn)細(xì)胞或遺傳修飾細(xì)胞的后代產(chǎn)生的外來體可以含有修飾的腔組合物。在一些實施方案中，腔工程化外來體具有較高或較低密度的外來體蛋白，或者包括外來體蛋白的修飾物或片段。[0105]例如，腔工程化外來體可以由用編碼外來體蛋白或外來體蛋白修飾物或片段的外源序列轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生。包括由外源序列表達(dá)的蛋白質(zhì)的外來體可以包括修飾的腔蛋白組[0106]外來體蛋白的各種修飾物或片段可以用于本發(fā)明的實施方案。例如，可以使用被修飾以更有效地靶向外來體腔的蛋白質(zhì)。還可以使用被修飾以包含特異性且有效靶向外來體腔所需的最小片段的蛋白質(zhì)。[0107]還可以使用具有治療活性的融合蛋白。例如，融合蛋白可以包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其修飾物，特別是其片段或變體，以及治療性肽或貨物蛋白或肽。在一些[0108]治療性肽選自由天然肽、重組肽、合成肽或至治療性化合物的接頭組成的組。治療微生物肽、轉(zhuǎn)錄因子或其片段或修飾物。融合蛋白可以在外來體腔中呈現(xiàn)，并為外來體提供治療活性。[0109]在一些實施方案中，治療性肽是基因組編輯復(fù)合物的組分。在一些實施方案中，所述基因組編輯復(fù)合物是轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(TAL-效應(yīng)子核酸酶或TALEN);鋅指復(fù)合物、CRISPR/CasY或CasX復(fù)合物、或本領(lǐng)域已知的任領(lǐng)域已知的任何其他適當(dāng)?shù)幕蚪M編輯復(fù)合物或其任何組合。[0110]在一些實施方案中，治療性肽是跨膜肽。本文所述的跨膜肽可以表達(dá)為與本文所述的任何序列或其任何片段或變體的融合蛋白。在一些實施方案中，跨膜蛋白具有與外來體腔中的腔序列融合的第一末端，和在外來體表面上表達(dá)的第二末端。在一些實施方案中，段或變體。[0111]在一些實施方案中，治療性肽是核酸結(jié)合蛋白。在一些實施方案中，核酸結(jié)合蛋白白另外地包含一種或多種RNA或DNA分子。在一些實施方案中，所述一種或多種RNA是miRNA、[0112]在一些實施方案中，治療性肽是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)的一部分。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)包括FRB-FKBP相互作用系統(tǒng)，例如，如Banaszynski等人，JAmChemSoc.2005年4月6日；127(13):4715-21中所述的FRB-FKBP相互作用系統(tǒng)。[0113]融合蛋白可以靶向外來體腔，并且為外來體提供治療活性。[0114]在一些實施方案中，使用了具有靶向部分的融合蛋白。例如，融合蛋白可以包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1、或其片段或修飾物、以及靶向部分。靶向部分可以用于將外來體靶向特定器官、組織或細(xì)胞，以使用外來體進(jìn)行治療。在一些實施方案中，靶向部分是抗體或其抗原結(jié)合片段。抗體及其抗原結(jié)合片段包括全抗體、多克隆抗體、單克隆抗體和重組抗體、其片段，并且進(jìn)一步包括單鏈抗體、人源化抗體、鼠抗體、嵌合抗體、鼠-人抗體、鼠-靈長類動物抗體、靈長類動物-人單克隆抗體、抗獨特型抗體、抗體片段，例如像scFv、(scFv)?、Fab、Fab'和F(ab’)?、F(ab1)?、Fv、dAb和Fd片段、雙抗體和抗體相關(guān)多肽?？贵w及其抗原結(jié)合片段也包括雙特異性抗體和多特異性抗體，只要它們表現(xiàn)出所期望的生物活性或功能。[0115]在一些實施方案中，使用了包含病毒蛋白的融合蛋白。在一些實施方案中，融合蛋白包含病毒衣殼或包膜蛋白。在一些實施方案中，融合蛋白允許組裝保留在外來體腔中的完整病毒。種、或其修飾物，特別是其片段或變體的融合蛋白相比，或與包含常規(guī)外來體蛋白的融合蛋片段或變體的融合蛋白，導(dǎo)致融合蛋白在外來體中富集。在一些實施方案中，包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1、SEQIDNO:4-109中的任一種或其片段或修飾物的融合蛋白包含具有序列MGXKLSKKK的肽，其中X是丙氨酸或任何其他氨基酸(SEQIDNO:117);或具有序列(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)的肽，其中每個括號內(nèi)位置表示氨基酸，并且其中π是選自由(Pro、Gly、Ala、Ser)組成的組的任何氨基酸，是選自由(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、的組的任何氨基酸，并且(+)是選自由(Lys、Arg、His)組成的組的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。在一些實施方案中，所述融合蛋白包含具有序列(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)的肽，其中每個括號內(nèi)位置表示氨基酸，并且其中π是選自由(Pro、Gly、Ala、Ser)組成的組的任何氨基酸，X是任何氨基酸，①是選自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)組成的組的任何氨基酸，并且(+)是選自由(Lys、Arg、His)組成的組的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。在一些實施方案中，常規(guī)外來體蛋白選自由CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI錨蛋白、IDNO:4-109中的任一種或其片段或修飾物的融合蛋白在外來體中的富集比缺少MARCKS、MARCKSL1、BASP1、SEQIDNO:4-109中的任一種或其片段或修飾物的融合蛋白，或比包含常規(guī)外來體蛋白的融合蛋白高>2倍、>4倍、>8倍、>16倍、>25倍、>50倍、>100倍、>200倍、>500倍、>750倍、>1,000倍、>2,000倍、>5,000倍、>7,500倍、>10,000倍。在一些實施方IDNO:1-109中任一種的蛋白質(zhì)序列足以用融合蛋白負(fù)載外來體。[0117]在一些實施方案中，包含含有外源序列和本文新鑒定的外來體腔蛋白的融合蛋白的腔工程化外來體比包含與本領(lǐng)域已知的常規(guī)外來體蛋白(例如CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI錨蛋白、乳凝集素LAMP2和LAMP2B、其片段或與其結(jié)合的肽)綴合的外源序列的相似工程化外來體具有更高的融合蛋白密度。在一些實施方案中，與使用常規(guī)外來體蛋白類似修飾的其他外來體腔中的融合蛋白相比，所述含有本文新鑒定的外來體蛋白的融合蛋白在外來中，與使用常規(guī)外來體蛋白類似修飾的其他外來體腔中的融合蛋白相比，所述含有本文新鑒定的外來體蛋白的融合蛋白在外來體腔中以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。[0118]在一些實施方案中，與使用CD9類似修飾的外來體相比，包含MARCKS、其變體、片的密度存在。在一些實施方案中，與使用CD63類似修飾的外來體相比，包含MARCKS、其變體、高的密度存在。在一些實施方案中，與使用CD81類似修飾的外來體相比，包含MARCKS、其變或更高的密度存在。在一些實施方案中，與使用GPI錨蛋白類似修飾的外來體相比，包含800、1,000倍或更高的密度存在。在一些實施方案中，與使用乳凝集素類似修飾的外來體相200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些實施方案中，與使用LAMP2類似修飾的外64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些實施方案中，與使用常規(guī)蛋白類似修飾的外來體相比，包含MARCKS、其變體、片段、片段變體、或修飾物的融合蛋白以2、4、8、外來體蛋白的變體類似修飾的外來體相比，包含MARCKS、其變體、片段、片段變體、或修飾物的密度存在。在一些實施方案中，與使用CD63類似修飾的外來體相比，包含MARCKSL1、其變更高的密度存在。在一些實施方案中，與使用CD81類似修飾的外來體相比，包含MARCKSL1、倍或更高的密度存在。在一些實施方案中，與使用PDGFR類似修飾的外來體相比，包含800、1,000倍或更高的密度存在。在一些實施方案中，與使用GPI錨蛋白類似修飾的外來體100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些實施方案中，與使用乳凝集素類似修飾的外來體相比，包含MARCKSL1、其變體類似修飾的外來體相比，包含MARCKSL1、其變體、片段、片段變體、或修飾物的融合蛋白以2、LAMP2B類似修飾的外來體相比，包含MARCKSL1、其變體、片段、片段變體、或修飾物的融合蛋與使用常規(guī)蛋白類似修飾的外來體相比，包含M方案中，與使用常規(guī)外來體蛋白的變體類似修飾的外來體相比，包含MARCKSL1、其變體、片的密度存在。[0120]在一些實施方案中，與使用CD9類似修飾的外來體相比，包含BASP1、其變體、片段、度存在。在一些實施方案中，與使用CD63類似修飾的外來體相比，包含BASP1、其變體、片段、度存在。在一些實施方案中，與使用CD81類似修飾的外來體相比，包含BASP1、其變體、片段、度存在。在一些實施方案中，與使用PDGFR類似修飾的外來體相比，包含BASP1、其變體、片的密度存在。在一些實施方案中，與使用GPI錨蛋白類似修飾的外來體相比，包含BASP1、其或更高的密度存在。在一些實施方案中，與使用乳凝集素類似修飾的外來體相比，包含800、1,000倍或更高的密度存在。在一些實施方案中，與使用LAMP2類似修飾的外來體相比，400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些實施方案中，與使用LAMP2B類似修飾的外來體200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些實施方案中，與使用常規(guī)蛋白類似修飾的100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些實施方案中，與使用常規(guī)外來體蛋白的變體類似修飾的外來體相比，包含BASP1、其變體、片段、片段變體、或修飾物的融合蛋白[0121]在一些實施方案中，與使用CD9類似修飾的外來體相比，包含SEQIDNO:1-109中800、1,000倍或更高的密度存在。在一些實施方案中，與使用CD63類似修飾的外來體相比，類似修飾的外來體相比，包含SEQIDNO:1-109中的任一種、其變體、片段、片段變體、或修實施方案中，與使用PDGFR類似修飾的外來體相比，包含SEQIDNO:1-109中的任一種、其變更高的密度存在。在一些實施方案中，與使用GPI錨蛋白類似修飾的外來體相比，包含SEQIDNO:1-109中的任一種、其變體、片段、片段變體、或修飾物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些實施方案中，與使用乳凝集素類似修飾的外來體相比，包含SEQIDNO:1-109中的任一種、其變體、片段、片段變體、或修飾施方案中，與使用LAMP2類似修飾的外來體相比，包含SEQIDNO:1-109中的任一種、其變更高的密度存在。在一些實施方案中，與使用LAMP2B類似修飾的外來體相比，包含SEQID100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些實施方案中，與使用常規(guī)蛋白類似修飾的外來體相比，包含SEQIDNO:1-109中的任一種、其變體、片段、片段變體、或修飾物的案中，與使用常規(guī)外來體蛋白的變體類似修飾的外來體相比，包含SEQIDNO:1-109中的任1,000倍或更高的密度存在。[0122]在一些實施方案中，與本領(lǐng)域已知的腔工程化外來體相比，本文所述的腔工程化外來體展現(xiàn)出優(yōu)異的特征。例如，通過使用本文提供的新鑒定的外來體蛋白產(chǎn)生的腔工程化外來體與現(xiàn)有技術(shù)中的外來體(例如使用常規(guī)外來體蛋白產(chǎn)生的那些外來體)相比，在其腔中含有更高度富集的修飾蛋白質(zhì)。此外，與本領(lǐng)域已知的腔工程化外來體相比，本發(fā)明的腔工程化外來體可以具有更大、更特異或更可控的生物活性。例如，包含與本文所述外來體蛋白或其片段(例如BASP1或其片段)融合的治療性或生物學(xué)相關(guān)外源序列的腔工程化外來體可以比與本領(lǐng)域已知的支架融合具有更多期望的工程化特征。本領(lǐng)域已知的支架蛋白包板衍生生長因子受體(PDGFR)、GPI錨蛋白、乳凝集素及其片段，以及對這些蛋白質(zhì)或其片段ITGA4、SLC3A2、ATP轉(zhuǎn)運蛋白或其片段或變體不是常規(guī)的外來體蛋白。先前，外源蛋白的過表達(dá)依賴于外源蛋白在外來體中的隨機或隨意分布來產(chǎn)生腔工程化外來體。這導(dǎo)致外來體中外源蛋白的低水平、不可預(yù)測的密度。因此，本文所述的外來體蛋白及其片段在新的外來體組合物及其制備方法方面提供了重要的進(jìn)展。肽。附加肽可以附著到外來體蛋白或其片段或變體的N末端或C末端。或變體以及兩個附加肽。這兩個附加肽可以附著到外來體蛋白或其片段或變體的N末端或C末端。在一些實施方案中，兩個附加肽中的一個附著到外來體蛋白或其片段或變體的N末端，并且兩個附加肽中的另一個附著到C末端。[0125]在一些實施方案中，本文所述的產(chǎn)生腔工程化細(xì)胞外囊泡的組合物和方法包含納米囊泡。[0126]用于生產(chǎn)腔工程化外來體的生產(chǎn)細(xì)胞[0127]本發(fā)明的外來體可以由體外生長的細(xì)胞或受試者的體液產(chǎn)生。當(dāng)外來體由體外細(xì)的腔工程化外來體的其他細(xì)胞類型包括但不限于間充質(zhì)干細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)[0128]可以對生產(chǎn)細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，使其包含一個或多個外源序列，以產(chǎn)生腔工程化外來體。遺傳修飾的生產(chǎn)細(xì)胞可以含有通過瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的外源序列。外源序列可以作為質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。外源序列可以在靶位點或隨機位點處，穩(wěn)定地整合到生產(chǎn)細(xì)胞的基因組序列中。在一些實施方案中，產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系用于生產(chǎn)腔工程化外來體。[0129]外源序列可以插入到生產(chǎn)細(xì)胞的基因組序列中，位于編碼外來體蛋白的內(nèi)源序列的上游(5'末端)或下游(3'末端)。本領(lǐng)域已知的各種方法可以用于將外源序列引入生產(chǎn)細(xì)CRISPR/Cas9或TALEN的方法)修飾的細(xì)胞在本發(fā)明的范圍內(nèi)。[0130]外源序列可以包括編碼外來體蛋白或所述外來體蛋白的修飾物或片段的序列?？梢砸刖幋a外來體蛋白的序列的額外拷貝，以產(chǎn)生具有更高密度外來體蛋白的腔工程化外來體?？梢砸刖幋a外來體蛋白的修飾物或片段的外源序列，以產(chǎn)生含有外來體蛋白的修飾物或片段的腔工程化外來體。可以引入編碼親和標(biāo)簽的外源序列，以產(chǎn)生含有融合蛋白的腔工程化外來體，所述融合蛋白包含附著到外來體蛋白的親和標(biāo)簽。[0131]在一些實施方案中，與從相同或相似生產(chǎn)細(xì)胞類型分離的天然外來體相比，腔工程化外來體具有更高的外來體蛋白密度。在一些實施方案中，與所述天然外來體相比，所述高的密度存在。在一些實施方案中，與所述天然外來體相比，所述外來體蛋白在所述腔工程至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。在一些實施方案中，與所述天然外來體上的未修飾外來體蛋白相比，包含外來體蛋白的融合蛋白在所述腔工程化外來體上以800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。在一些實施方案中，與所述天然外來體上的未修飾外來體蛋白相比，外來體蛋白的片段或變體在所述腔工程化外來體上以2至4倍、4至8倍、000倍或更高的密度存在。的片段或變體或其修飾物在所述腔工程化外來體上以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。在一些實施方案中，與所述天然外來體上的未修飾MARCKSL1相比，MARCKSL1、MARCKSL1的片段或變體或其修飾物在所述腔工程化外來體上以2至4倍、4至8倍、8至16倍、的片段或變體或其修飾物在所述腔工程化外來體上以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。[0133]在一些實施方案中，生產(chǎn)細(xì)胞被進(jìn)一步修飾以包含額外的外源序列。例如，可以包括額外的外源序列來調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達(dá)，或者產(chǎn)生包含特定多肽作為有效負(fù)載物的外來體。在一些實施方案中，生產(chǎn)細(xì)胞被修飾以包含兩個外源序列，一個編碼外來體蛋白或所述外來體蛋白的修飾物或片段，并且另一個編碼有效負(fù)載物。[0134]更具體地，腔工程化外來體可以由用編碼一種或多種外來體腔蛋白的序列轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生，所述外來體腔蛋白包括但不限于(1)豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS);(2)豆蔻?；母缓彼岬牡鞍准っ窩底物樣1(MARCKSL1);和(3)腦酸溶性蛋白1(BASP1)。本文所述的一種或多種外來體腔蛋白中的任一種都可以從質(zhì)粒、插入到基因組中的外源序列或其他外源核酸如合成信使RNA(mRNA)表達(dá)。[0135]在一些實施方案中，所述一種或多種外來體腔蛋白在用編碼其全長內(nèi)源形式的外[0136]腔工程化外來體可以由用編碼一種或多種外來體腔蛋白片段的序列轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生，所述外來體腔蛋白包括但不限于(1)豆蔻?；母缓彼岬牡鞍准っ窩底物(MARCKS);(2)豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物樣1(MARCKSL1);和(3)腦酸溶性蛋白1(BASP1)。在一些實施方案中，所述序列編碼從天然蛋白質(zhì)的N末端缺失至少5、10、50、100、200、或300個氨基酸的外來體腔蛋白片段。在一些氨基酸的外來體腔蛋白片段。在一些實施方案中，所述序列編碼缺少天然蛋白質(zhì)的一個或多個功能或結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域的外來體腔蛋白片段。在一些實施方案中，融合蛋白包含SEQIDNO:4-109的肽。在一些實施方案中，融合蛋白包含S融合蛋白包含具有序列MGXKLSKKK的肽，其中X是丙氨酸或任何其他氨基酸(SEQIDNO:117)。在一些實施方案中，融合蛋白包含具有序列(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)的由(Lys、Arg、His)組成的組的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。在一些實施方案中，所述融合蛋白包含具有序列(M)(G)(π)(X)(Φ/π)相同或相似的序列的多肽的序列轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生，所述天然外來體腔蛋白包括但不限于(1)豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS);(2)豆蔻?；母缓彼岬牡鞍滋烊煌鈦眢w腔蛋白的全長或片段50%相同，例如與SEQIDNO:1-350%相同。在一些實施方案中，所述多肽與天然外來體腔蛋白的全長或片段60%相同，例如與SEQIDNO:1-3一些實施方案中，所述多肽與天然外來體腔蛋白的全長或片段99%相同，例如與SEQID與BASP1的全長或片段80%相同，例如與SEQIDNO:4-10999.9%相同。在一些實施方案中，所述多肽與BASP1的片段100%相同，例如與SEQID案中，外來體是分離的，并且通過包括但不限于大小、形狀、形態(tài)或分子組成如核酸、蛋白[0142]外來體含量的測量取。然后，可以在回收含有小RNA的總RNA的條件下，或者在將長度小于200個核苷酸的小RNA[0144]外顯子組合物可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行評估，所述方法包括但不限于轉(zhuǎn)錄[0145]可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種技術(shù)(例如定量或半定量RT-PCR、Northern個特定的實施方案中，通過以下測量至少一種RNA的水平：逆轉(zhuǎn)錄來自外來體組合物的RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸，將所述靶寡脫氧核苷酸與一種或多種RNA特異性探針寡核苷酸(例如，包含RNA特異性探針寡核苷酸的微陣列)雜交以提供外來體組合物的雜交譜，并將外來體組合物雜交譜與對照樣品產(chǎn)生的雜交譜進(jìn)行比較。測試樣品中至少一種RNA的信號[0146]另外，可以由已知RNA序列產(chǎn)生的基因特異性寡核苷酸探針制備微陣列。所述陣列可以為每種RNA含有兩種不同的寡核苷酸探針，一種含有活性的成熟序列，并且另一種對人直系同源物僅相差幾個堿基的小鼠序列，其可以用作雜交嚴(yán)格性條件的對照。來自兩種部的、相對穩(wěn)定的陽性對照。微芯片上還可以包括一種或多種用于非特異性雜交的適當(dāng)對[0147]微陣列可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)制造。例如，適當(dāng)長度(例如40個核苷酸)的探針寡核苷酸在C6位置處被5'-胺修飾，并使用可商購獲得的微陣列系統(tǒng)(例如GeneMachineOmniGrid.TM·100微陣列和AmershamCodeLink.TM)印刷在活化的載玻片上。通過用標(biāo)記引物芯片雜交。SSPE/30%甲酰胺在25℃下持續(xù)18小時，隨后以0.75.倍洗滌。TNT在37℃下持續(xù)標(biāo)記陣列上發(fā)生結(jié)合的確切位置，從而允許自動檢測和定量。輸出由一系列雜交事件組成，一個實施方案，標(biāo)記的cDNA寡聚體是生物素標(biāo)記的cDNA,由生物素標(biāo)記的引物制備。然后通過使用例如鏈霉親和素-Alexa647綴合物直接檢測含有生物素的轉(zhuǎn)錄物來處理微陣列，并利用常規(guī)掃描方法掃描。陣列上每個點的圖像強度與外來體中對應(yīng)RNA的豐度成正比。計處理和數(shù)據(jù)比較以及路徑分析。因此，微陣列可以以高通量性能同時分析成百上千個多核苷酸。mRNA表達(dá)的微陣列譜分析成功地為基礎(chǔ)研究中的基因表達(dá)研究提供了有價值的數(shù)據(jù)。并且所述技術(shù)已在制藥工業(yè)和臨床診斷中得到進(jìn)一步應(yīng)用。隨著越來越多的miRNA數(shù)據(jù)[0150]在一些實施方案中，本文所述的方法包括測量純化級分中包含的外來體和/或外[0152]可以使用動態(tài)光散射(DLS)和/或多角度光散射(MALS)測量外來體大小。使用DLS和/或MALS測量外來體大小的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且包括納米粒子跟蹤測定所述的外來體群體包括群體，其中90%的所述外來體具有如由NTA(例如，使用Malvern群體包括群體，其中95%的所述外來體具有如由NTA(例如，使用MalvernNanosight的外來體群體包括群體，其中99%的所述外來體具有如由TRPS(例如，使用iZONqNano體，其中90%的所述外來體具有如由TRPS(例如，使用iZONqNanoGold)測量的約40-由掃描電子顯微鏡(例如，TecnaiTMG2SpiritBioTWIN掃描電子顯微鏡)測量的約40-的約20-1000nm的最長尺寸。在其他實施方案中，本文所述的外來體群體包括群體，其中體包括群體，其中90%的所述外來體具有如由掃描電子顯微鏡(例如，TecnaiTG2Spirit文所述的外來體群體包括群體，其中99%的所述外來體具有如由掃描電子顯微鏡(例如，[0155]個體外來體大小可以通過納米流式細(xì)胞術(shù)基于逐個顆粒確定。在一些實施方案本文所述的外來體具有如由納米流式細(xì)胞術(shù)(例如，使用流式納米分析儀)測量的約20-1000nm的最長尺寸。在一些實施方案中，本文所述的外來體具有如由納米流式細(xì)胞術(shù)(例括群體，其中95%的所述外來體具有如由納米流式細(xì)胞術(shù)(例如，使用流式納米分析儀)測99%的所述外來體具有如由納米流式細(xì)胞術(shù)(例如，使用流式納米分析儀)測量的約20-外來體具有如由納米流式細(xì)胞術(shù)(例如，使用流式納米分析儀)測量的約40-1000nm的最長施方案中，本文所述的外來體群體包括群體，其中99%的所述外來體具有如由納米流式細(xì)胞術(shù)(例如，使用流式納米分析儀)測量的約40-1000nm的最長尺寸。[0156]外來體電荷密度的測量[0157]在一些實施方案中，本文所述的方法包括測量純化級分中包含的外來體和/或外來體群體的電荷密度。在一些實施方案中，電荷密度通過電位滴定、陰離子交換、陽離子交[0158]外來體蛋白密度的測量[0159]在一些實施方案中，本文所述的方法包括測量外來體表面上的外來體蛋白密度。表面密度可以計算或表示為每單位面積的質(zhì)量、每單位面積的蛋白質(zhì)數(shù)量、每個外來體的分子數(shù)量或分子信號強度、蛋白質(zhì)的摩爾量等。表面密度可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行融合蛋白)檢測法、納米流式細(xì)胞術(shù)、ELISA、aLISA和/或通過測量蛋白凝膠上的帶進(jìn)行測密術(shù)。[0161]提出以下實施例以便向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何制備和使用本發(fā)明的完全公開和說明，并且不意圖限制本發(fā)明人看待其發(fā)明的范圍，也不意圖表示以下實驗是進(jìn)行的全部或僅有的實驗。雖然已盡力確保所用數(shù)字(例如量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但仍應(yīng)考慮一些實驗誤差和偏差。除非另外指明，否則份數(shù)是重量份，分子量是重均分子量，溫度以攝氏[0162]除非另外指明，否則本發(fā)明的實施將采用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)常規(guī)的蛋白質(zhì)化學(xué)、生物Proteins:StructuresaAL.Lehninger,Biochemistry(WorthPublishers,Inc.,當(dāng)前版本);Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版，1989);MethodsInEnzymologySciences,第21版(Easton,Pennsylvania:MackPublishingCompany,2005);CareyandSundbergAdvancedOrganicChemistry第3版(PlenumPress)第A[0163]實施例1:新外來體蛋白的鑒定[0164]外來體的集合[0165]在9天后，從HEK293SF細(xì)胞的高密度懸浮培養(yǎng)物的上清液中收集外來體。過濾上清液，并用陰離子交換色譜進(jìn)行分級分離，并且在氯化鈉的步長梯度中洗脫。蛋白質(zhì)濃度最高的峰級分含有外來體和污染細(xì)胞組分。分離峰級分，并且在Optiprep密度梯度上通過超速離心進(jìn)一步分級分離。[0166]對于Optiprep梯度，在SW41Ti轉(zhuǎn)子的12mLUltra-Clear(344059)管中，用4mL45%OptiprepT、3mL30%OptiprepT1mLPBS制備4層無菌梯度。將外來體級分添加到Optiprep梯度中并且在4℃下以200,000xg超速離心16小時，以分離外來體級分。超速離心產(chǎn)生已知含有外來體的頂部級分、含有中等密度細(xì)胞碎片的中間級分以及含有高密度聚集體和細(xì)胞碎片的底部級分(圖1)。然后從管頂部約3mL處輕輕收集外來體層。[0167]將外來體級分在38.5mLUltra-Clear(344058)管中的約32mLPBS內(nèi)稀釋，并且在4℃下以133,900xg超速離心3小時，以沉淀經(jīng)純化的外來體。然后將沉淀的外來體重新懸[0169]為了測定對外來體具有特異性的蛋白質(zhì)，通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析OptiprepT梯度的頂部級分和底部級分。在分析之前，通過二辛可寧酸(BCA)測定法測定兩個樣品的總品添加到含有等體積外來體裂解緩沖液(60mMTris、400mMGdmC1、100mMEDTA、20mM100溶液。然后將所有樣品在55℃下孵育60分鐘。[0170]通過在-20℃下添加1250μL乙醇進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀并且然后在水浴中超聲處理5分鐘。通過在室溫下以15,000g離心5分鐘來沉淀沉淀的物質(zhì)。傾析上清液，并使用氮氣徹底干燥沉淀的物質(zhì)。將沉淀重懸于30.0μL消化緩沖液(30mM烷基化溶液(375mM碘乙酰胺，50mMTris,pH8.5)并且在室溫下在黑暗中孵育所得溶液至少30分鐘來烷基化游離半胱氨酸殘基。蛋白酶開始蛋白水解消化。將所有樣品混合，并且然后在37℃下孵育過夜。在孵育后，通過加入5.0μL10%甲酸停止胰蛋白酶活性。在通柱對每個樣品進(jìn)行脫鹽。在該過程結(jié)束時，將每個樣品干燥并且在75.0μL的95:5水：乙腈中用0.1%甲酸復(fù)原，并且轉(zhuǎn)移到HPLC小瓶進(jìn)行分析。[0173]將樣品注入UltiMate3000RSCLnano(ThermoFisherScientific)低流量色譜系統(tǒng)中，并且將胰蛋白酶肽以2.500μL/min的流速使用負(fù)載流動相(MPL:95%水，5%乙腈，0.1%甲酸)裝載到AcclaimPepMap100C18捕集柱(75μ