基于RNA干擾技術(shù)探究p70S6K表達對食管鱗癌EC9706細胞的多維影響一、引言1.1研究背景與意義食管鱗癌（EsophagealSquamousCellCarcinoma，ESCC）作為食管癌中最常見的組織學(xué)類型，嚴重威脅人類健康。據(jù)2024年國家癌癥中心數(shù)據(jù)，我國食管癌新發(fā)22.4萬例，死亡18.75萬例，新發(fā)病例數(shù)和死亡人數(shù)分別排名第七和第五，其中食管鱗癌約占食管癌病例的85.79%。食管鱗癌發(fā)病初期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時已處于局部晚期，傳統(tǒng)治療手段面臨“療效不足”和“副作用過大”的雙重挑戰(zhàn)，5年生存率較低，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和生存預(yù)期。在腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的研究中，p70S6K（核糖體蛋白S6激酶）作為細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，受到廣泛關(guān)注。p70S6K是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K/AKT/mTOR信號通路的關(guān)鍵下游效應(yīng)分子之一。在多種腫瘤細胞中，PI3K/AKT/mTOR信號通路常處于異常激活狀態(tài)，導(dǎo)致p70S6K過度活化?；罨膒70S6K可磷酸化核糖體蛋白S6，促進蛋白質(zhì)合成，加快細胞周期進程，從而促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，并在腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成等過程中發(fā)揮重要作用。在乳腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，p70S6K的高表達與腫瘤的惡性程度、不良預(yù)后密切相關(guān)。然而，p70S6K在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機制尚未完全明確。RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)是一種由雙鏈RNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，可特異性地降解靶基因的mRNA，從而實現(xiàn)對靶基因表達的高效、特異性抑制。RNAi技術(shù)具有高效性、高特異性、操作簡便等優(yōu)點，已成為研究基因功能和腫瘤治療的有力工具。利用RNAi技術(shù)沉默p70S6K基因表達，為深入研究p70S6K在食管鱗癌中的作用機制提供了有效手段。本研究旨在通過RNA干擾技術(shù)沉默食管鱗癌細胞系EC9706中p70S6K的表達，從細胞增殖、凋亡、周期、侵襲和遷移等多個方面，深入探討p70S6K對食管鱗癌細胞生物學(xué)行為的影響，揭示其在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的潛在作用機制。本研究結(jié)果有望為食管鱗癌的早期診斷、預(yù)后評估提供新的分子標志物，為開發(fā)以p70S6K為靶點的食管鱗癌靶向治療策略提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)，對改善食管鱗癌患者的治療效果和生存質(zhì)量具有重要的臨床意義。1.2研究目的本研究旨在利用RNA干擾技術(shù)，深入探究p70S6K對食管鱗癌EC9706細胞在體內(nèi)外的影響，具體目標如下：明確p70S6K在食管鱗癌EC9706細胞中的功能：通過RNA干擾技術(shù)，高效、特異性地沉默食管鱗癌EC9706細胞中p70S6K基因的表達，觀察細胞在增殖、凋亡、周期進程等基本生物學(xué)行為方面的變化，從而全面、系統(tǒng)地解析p70S6K在食管鱗癌細胞生長調(diào)控中的關(guān)鍵作用。揭示p70S6K對食管鱗癌EC9706細胞侵襲和遷移能力的影響：從細胞分子層面出發(fā)，研究沉默p70S6K表達后，食管鱗癌EC9706細胞侵襲和遷移相關(guān)分子標志物的表達變化，結(jié)合細胞體外侵襲實驗和體內(nèi)動物模型實驗，深入探討p70S6K在食管鱗癌細胞轉(zhuǎn)移過程中的分子機制。探索p70S6K作為食管鱗癌潛在治療靶點的可能性：基于上述實驗結(jié)果，評估p70S6K作為食管鱗癌治療靶點的可行性和潛在價值，為開發(fā)以p70S6K為靶向的食管鱗癌新型治療策略提供堅實的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)，以期為改善食管鱗癌患者的臨床治療效果和預(yù)后提供新的思路和方法。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1食管鱗癌的研究現(xiàn)狀食管鱗癌作為全球范圍內(nèi)嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在各類癌癥中位居前列。據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2020年全球食管癌新發(fā)病例約60.4萬例，死亡病例約54.4萬例，其中食管鱗癌約占食管癌病例的80%以上。我國是食管鱗癌的高發(fā)國家，發(fā)病和死亡人數(shù)均占全球一半以上。由于食管鱗癌早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，錯過最佳手術(shù)時機，導(dǎo)致5年生存率較低，僅為20%-30%左右。目前，食管鱗癌的治療方法主要包括手術(shù)、化療、放療以及近年來興起的免疫治療和靶向治療等。手術(shù)切除是早期食管鱗癌的主要治療手段，但對于中晚期患者，單純手術(shù)治療效果不佳，常需結(jié)合化療、放療等綜合治療?；熕幬锶珥樸K、氟尿嘧啶等雖在一定程度上能延長患者生存期，但存在耐藥性和嚴重不良反應(yīng)等問題，限制了其臨床應(yīng)用。放療可局部控制腫瘤生長，但對正常組織也有一定損傷。免疫治療如PD-1/PD-L1抑制劑在食管鱗癌治療中顯示出一定療效，但僅部分患者受益，且存在免疫逃逸等問題。靶向治療雖具有特異性強、副作用小等優(yōu)點，但目前針對食管鱗癌的有效靶點較少，臨床應(yīng)用受到限制。因此，深入研究食管鱗癌的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和策略，對于提高食管鱗癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。1.3.2p70S6K的研究現(xiàn)狀p70S6K作為PI3K/AKT/mTOR信號通路的關(guān)鍵下游效應(yīng)分子，在細胞生長、增殖、代謝等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，在多種腫瘤組織中，如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等，p70S6K呈高表達狀態(tài)，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，p70S6K的過度表達可促進乳腺癌細胞的增殖和遷移，通過激活p70S6K，可上調(diào)細胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的表達，加速細胞周期進程，從而促進腫瘤細胞的生長。在肺癌中，p70S6K的激活可增強肺癌細胞的侵襲能力，其機制可能與上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達，降解細胞外基質(zhì)有關(guān)。在食管鱗癌研究方面，已有研究報道p70S6K在食管鱗癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織，且其表達水平與食管鱗癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。沉默p70S6K基因表達可抑制食管鱗癌細胞的增殖和遷移能力，誘導(dǎo)細胞凋亡。然而，p70S6K在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機制尚未完全明確，其上下游調(diào)控關(guān)系及相關(guān)信號通路仍有待進一步深入研究。1.3.3RNA干擾技術(shù)的研究現(xiàn)狀RNA干擾技術(shù)自發(fā)現(xiàn)以來，因其具有高效性、高特異性和操作簡便等優(yōu)點，迅速成為基因功能研究和疾病治療領(lǐng)域的有力工具。在基因功能研究方面，RNAi技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各種模式生物和細胞系中，通過特異性沉默目的基因表達，深入探究基因的生物學(xué)功能及其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機制。在細胞周期調(diào)控研究中，利用RNAi技術(shù)沉默關(guān)鍵基因，可揭示細胞周期調(diào)控的分子機制。在疾病治療研究方面，RNAi技術(shù)在腫瘤、病毒感染性疾病、遺傳性疾病等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。在腫瘤治療中，通過設(shè)計針對腫瘤相關(guān)基因的siRNA或shRNA，可特異性抑制腫瘤細胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移，為腫瘤的靶向治療提供了新的策略。在病毒感染性疾病治療中，RNAi技術(shù)可靶向病毒基因，抑制病毒復(fù)制，為病毒感染性疾病的治療提供了新的思路。在食管鱗癌研究中，RNAi技術(shù)也逐漸得到應(yīng)用。已有研究利用RNAi技術(shù)沉默食管鱗癌細胞中某些關(guān)鍵基因，如E-cadherin、Vimentin等，觀察其對食管鱗癌細胞生物學(xué)行為的影響，為食管鱗癌的治療提供了新的靶點和策略。然而，RNAi技術(shù)在臨床應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)，如siRNA或shRNA的遞送效率低、穩(wěn)定性差、脫靶效應(yīng)等問題，限制了其進一步發(fā)展和應(yīng)用。1.3.4研究現(xiàn)狀總結(jié)與本研究切入點綜上所述，目前國內(nèi)外對食管鱗癌的發(fā)病機制、治療方法以及p70S6K和RNA干擾技術(shù)的研究取得了一定進展，但仍存在諸多問題和不足。在食管鱗癌中，p70S6K的具體作用機制尚未完全明確，其上下游調(diào)控關(guān)系及相關(guān)信號通路有待進一步深入研究。RNAi技術(shù)在臨床應(yīng)用中仍面臨遞送效率低、穩(wěn)定性差、脫靶效應(yīng)等問題。因此，本研究擬利用RNA干擾技術(shù)沉默食管鱗癌EC9706細胞中p70S6K的表達，從細胞增殖、凋亡、周期、侵襲和遷移等多個方面，深入探討p70S6K對食管鱗癌細胞生物學(xué)行為的影響，揭示其在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的潛在作用機制，為食管鱗癌的治療提供新的靶點和策略。同時，本研究也將為解決RNAi技術(shù)在臨床應(yīng)用中面臨的問題提供一定的實驗依據(jù)和理論支持。二、RNA干擾技術(shù)與p70S6K相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1RNA干擾技術(shù)原理與機制RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。這一現(xiàn)象最早于1998年被Fire等發(fā)現(xiàn)，他們在線蟲中導(dǎo)入雙鏈RNA后，發(fā)現(xiàn)其能特異性地抑制同源基因的表達，且抑制效率比導(dǎo)入單鏈RNA高得多。隨后的研究表明，RNAi廣泛存在于從植物、線蟲到哺乳動物等多種生物中，是生物體抵御病毒入侵、維持基因組穩(wěn)定的重要機制之一。RNAi的分子機制主要包括起始階段和效應(yīng)階段。在起始階段，外源性或內(nèi)源性的dsRNA進入細胞后，被一種名為Dicer酶（RNaseIII家族中特異識別雙鏈RNA的一員，屬內(nèi)切核酸酶）識別并切割。Dicer酶含有解旋酶活性以及dsRNA結(jié)合域和PAZ結(jié)構(gòu)，它能夠?qū)㈤L鏈dsRNA加工裂解為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片斷（smallinterferingRNA，siRNA）。siRNA由正義鏈與反義鏈組成，各有21個堿基，其中19個堿基配對，且每條鏈的3’端都有2個不配對的堿基。這些siRNA是RNA干擾作用賴以發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子，為后續(xù)的基因沉默提供了特異性識別的信息。進入效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)構(gòu)在ATP供能的情況下解旋，并與多種蛋白成分（包括核酸酶、解旋酶和同源RNA鏈搜索活性等）組裝形成有活性的蛋白/RNA復(fù)合物，即RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。在RISC中，siRNA反義鏈憑借其與靶mRNA互補的序列，特異性地與靶mRNA結(jié)合。隨后，RISC中的核酸酶（如Argonaute蛋白家族成員）會對結(jié)合的mRNA進行切割，從而實現(xiàn)對靶mRNA的降解，阻斷其翻譯過程，最終達到在RNA水平干擾基因表達的目的。在植物中，RNAi還可以通過RNA-dependentRNApolymerase（RdRP）以切割后的mRNA片段為模板，合成更多的dsRNA，這些新合成的dsRNA又可以被Dicer酶切割成siRNA，進一步放大RNAi效應(yīng)，形成一個級聯(lián)放大的基因沉默過程。在哺乳動物細胞中，雖然沒有發(fā)現(xiàn)典型的RdRP，但存在一些類似的機制來增強RNAi的效果。例如，某些內(nèi)源性的小RNA（如miRNA）可以通過與靶mRNA不完全互補配對，抑制mRNA的翻譯過程，這種機制與RNAi有一定的相似性，且在細胞的生長、發(fā)育、分化等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。RNAi技術(shù)因其能夠高效、特異性地抑制基因表達，為研究基因功能提供了強大的工具。通過設(shè)計針對特定基因的dsRNA或siRNA，研究者可以在細胞水平或動物模型中觀察基因表達被抑制后細胞的生物學(xué)行為變化，從而深入了解基因的功能及其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。在腫瘤研究領(lǐng)域，RNAi技術(shù)可用于沉默腫瘤相關(guān)基因，探索腫瘤的發(fā)病機制，為腫瘤的診斷和治療提供新的靶點和策略。2.2p70S6K的結(jié)構(gòu)、功能與在腫瘤中的作用p70S6K，全稱70kDa核糖體蛋白S6激酶（70kDaribosomalproteinS6kinase），是一種在細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。其基因位于人類染色體17p11.2，編碼的蛋白質(zhì)由508個氨基酸組成，分子量約為70kDa，這也是其名稱的由來。從結(jié)構(gòu)上看，p70S6K包含多個功能結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，使其能夠精準地參與細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。其N端含有一個調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含多個磷酸化位點，如Thr229、Thr389等。這些位點的磷酸化狀態(tài)對p70S6K的活性起著重要的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)細胞受到生長因子、營養(yǎng)物質(zhì)等外界刺激時，上游信號通路會激活相關(guān)激酶，使p70S6K的這些位點發(fā)生磷酸化。例如，在PI3K/AKT/mTOR信號通路中，mTOR作為p70S6K的上游激酶，可直接磷酸化p70S6K的Thr389位點，從而激活p70S6K。C端則是其催化結(jié)構(gòu)域，負責(zé)行使激酶的催化功能，能夠?qū)TP上的磷酸基團轉(zhuǎn)移到底物蛋白的特定氨基酸殘基上。催化結(jié)構(gòu)域中含有高度保守的氨基酸序列，這些序列對于維持激酶的催化活性至關(guān)重要，其活性中心的特定氨基酸殘基能夠與底物蛋白特異性結(jié)合，并在ATP的參與下，實現(xiàn)對底物的磷酸化修飾。在細胞的正常生理過程中，p70S6K扮演著不可或缺的角色，尤其是在細胞增殖和生長調(diào)控方面。當(dāng)細胞接收到生長刺激信號時，p70S6K被激活，進而磷酸化其主要底物核糖體蛋白S6（RPS6）。RPS6是核糖體40S小亞基的組成部分，其磷酸化可促進核糖體的生物合成和蛋白質(zhì)翻譯起始過程。具體來說，磷酸化的RPS6能夠增強核糖體與mRNA的結(jié)合能力，提高蛋白質(zhì)合成的效率，從而為細胞的增殖和生長提供充足的蛋白質(zhì)原料。p70S6K還可以通過磷酸化其他底物，如真核起始因子4B（eIF4B）等，進一步促進蛋白質(zhì)的合成。eIF4B被p70S6K磷酸化后，能夠增強其與eIF4A的相互作用，促進mRNA的解旋和翻譯起始，加速蛋白質(zhì)合成的進程。在細胞周期調(diào)控方面，p70S6K的激活與細胞從G1期進入S期密切相關(guān)。研究表明，在G1期，p70S6K的活性逐漸升高，通過促進蛋白質(zhì)合成，為DNA復(fù)制和細胞進入S期做好準備。抑制p70S6K的活性，可導(dǎo)致細胞周期阻滯在G1期，抑制細胞的增殖。近年來，越來越多的研究表明，p70S6K與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在多種腫瘤組織中，p70S6K呈現(xiàn)高表達或過度激活狀態(tài)。在乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，p70S6K的高表達與乳腺癌的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)。高表達p70S6K的乳腺癌細胞具有更強的增殖、侵襲和遷移能力。進一步研究發(fā)現(xiàn)，p70S6K可通過上調(diào)細胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的表達，加速細胞周期進程，促進乳腺癌細胞的增殖。在結(jié)直腸癌中，p70S6K的激活可促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。通過沉默p70S6K基因表達，可顯著抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，誘導(dǎo)細胞凋亡。其機制可能與p70S6K激活后，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達，降解細胞外基質(zhì)，從而促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。在食管鱗癌中，p70S6K也被證實發(fā)揮著重要作用。相關(guān)研究表明，p70S6K在食管鱗癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織，且其表達水平與食管鱗癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理參數(shù)密切相關(guān)。高表達p70S6K的食管鱗癌患者預(yù)后較差，提示p70S6K可能作為食管鱗癌預(yù)后評估的潛在分子標志物。進一步的細胞實驗發(fā)現(xiàn)，沉默p70S6K基因表達可抑制食管鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，誘導(dǎo)細胞凋亡，表明p70S6K在食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起到促進作用。其具體作用機制可能與p70S6K調(diào)節(jié)食管鱗癌細胞的細胞周期、凋亡相關(guān)蛋白的表達以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程有關(guān)。但目前p70S6K在食管鱗癌中的上下游調(diào)控關(guān)系及相關(guān)信號通路仍有待進一步深入研究，以全面揭示其在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制。2.3食管鱗癌EC9706細胞特性食管鱗癌EC9706細胞系是從人食管癌組織中分離建立的細胞系，具有典型的食管鱗癌細胞特征，在食管鱗癌研究中應(yīng)用廣泛。EC9706細胞最初來源于一位中國男性食管鱗癌患者的腫瘤組織。通過組織塊培養(yǎng)法，科研人員將新鮮的食管癌組織進行處理，使其在適宜的培養(yǎng)條件下逐漸生長出細胞，并經(jīng)過多次傳代和篩選，最終成功建立了EC9706細胞系。這一細胞系的建立為食管鱗癌的體外研究提供了重要的實驗材料，使得科研人員能夠在細胞水平上深入探究食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展機制。在顯微鏡下觀察，EC9706細胞呈現(xiàn)上皮細胞樣形態(tài)，細胞邊界清晰，形態(tài)較為規(guī)則，多為多邊形或梭形。細胞貼壁生長，在培養(yǎng)瓶底部呈單層分布，隨著細胞的增殖，會逐漸鋪滿培養(yǎng)瓶底面。細胞之間通過緊密連接和橋粒等結(jié)構(gòu)相互連接，形成較為緊密的細胞群落。這種形態(tài)和生長特性與食管上皮組織的生理結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)，有助于模擬食管鱗癌在體內(nèi)的生長環(huán)境，為研究食管鱗癌的生物學(xué)行為提供了良好的模型。EC9706細胞的培養(yǎng)需要特定的條件。通常使用含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）的DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）培養(yǎng)基，以提供細胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子。培養(yǎng)基中還添加了青霉素和鏈霉素等抗生素，以防止細菌污染，維持細胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌狀態(tài)。培養(yǎng)溫度設(shè)定為37℃，這是人體的正常體溫，也是細胞生長的最適溫度，在此溫度下，細胞內(nèi)的各種酶活性和代謝過程能夠正常進行。同時，培養(yǎng)環(huán)境需要維持5%的二氧化碳（CO?）濃度，CO?能夠參與細胞的代謝活動，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，使其保持在7.2-7.4的適宜范圍內(nèi)，為細胞的生長提供穩(wěn)定的酸堿環(huán)境。在細胞培養(yǎng)過程中，EC9706細胞的生長具有一定的規(guī)律。當(dāng)細胞接種到培養(yǎng)瓶中后，會經(jīng)歷潛伏期、對數(shù)生長期和平臺期。在潛伏期，細胞需要適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境，此時細胞代謝活動較弱，生長緩慢。經(jīng)過一段時間的適應(yīng)后，細胞進入對數(shù)生長期，此時細胞代謝活躍，增殖速度加快，細胞數(shù)量呈指數(shù)增長。隨著細胞數(shù)量的不斷增加，培養(yǎng)瓶中的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，代謝產(chǎn)物逐漸積累，細胞生長速度逐漸減緩，進入平臺期，此時細胞數(shù)量基本保持穩(wěn)定。當(dāng)細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面的80%-90%時，就需要進行傳代培養(yǎng)，以避免細胞過度生長導(dǎo)致營養(yǎng)缺乏和代謝產(chǎn)物積累對細胞造成損傷。傳代時，先用胰蛋白酶等消化液將貼壁的細胞消化下來，使其變成單細胞懸液，然后按照一定的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)進行培養(yǎng)。EC9706細胞在食管鱗癌研究中具有重要的應(yīng)用價值。由于其來源于食管鱗癌組織，能夠較好地反映食管鱗癌細胞的生物學(xué)特性，因此被廣泛應(yīng)用于食管鱗癌的發(fā)病機制研究。通過對EC9706細胞的研究，科研人員可以深入探究食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵分子事件，如基因表達變化、信號通路激活等，為揭示食管鱗癌的發(fā)病機制提供重要線索。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，EC9706細胞可用于篩選和評價潛在的抗食管鱗癌藥物。通過將不同的藥物作用于EC9706細胞，觀察細胞的生長、增殖、凋亡等生物學(xué)行為的變化，評估藥物的療效和毒性，為抗食管鱗癌藥物的開發(fā)提供實驗依據(jù)。EC9706細胞還可用于研究食管鱗癌的耐藥機制，為解決臨床治療中食管鱗癌患者的耐藥問題提供理論支持。三、RNA干擾p70S6K表達對食管鱗癌EC9706細胞的體外研究3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料細胞株：食管鱗癌EC9706細胞株購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，該細胞株具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性，能夠較好地模擬食管鱗癌在體內(nèi)的生長和增殖情況，為后續(xù)實驗提供了可靠的研究對象。主要試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），富含多種氨基酸、維生素、無機鹽等營養(yǎng)成分，為EC9706細胞的生長提供適宜的環(huán)境；胎牛血清（FBS，澳大利亞Ausbian公司），含有豐富的生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進細胞的增殖和存活；胰蛋白酶（美國Sigma公司），用于消化貼壁生長的EC9706細胞，使其分散成單個細胞，便于進行傳代培養(yǎng)和實驗操作；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen公司），具有高效的轉(zhuǎn)染效率和較低的細胞毒性，能夠?qū)⑼庠春怂岱肿訉?dǎo)入EC9706細胞中；針對p70S6K的小干擾RNA（siRNA）及陰性對照siRNA（廣州銳博生物科技有限公司），通過設(shè)計特異性的siRNA序列，能夠靶向沉默p70S6K基因的表達，陰性對照siRNA則用于排除非特異性干擾；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司），可高效提取細胞中的總RNA，為后續(xù)的基因表達檢測提供高質(zhì)量的樣本；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司），能夠?qū)⑻崛〉腞NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便進行實時熒光定量PCR檢測基因表達水平；實時熒光定量PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），具有高靈敏度和準確性，能夠精確檢測cDNA中目的基因的表達量；BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），通過與蛋白質(zhì)中的肽鍵結(jié)合，形成穩(wěn)定的紫色絡(luò)合物，根據(jù)絡(luò)合物的吸光度與蛋白質(zhì)濃度的線性關(guān)系，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)濃度的準確測定；SDS凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），用于制備聚丙烯酰胺凝膠，通過電泳分離不同分子量的蛋白質(zhì)；PVDF膜（美國Millipore公司），具有良好的蛋白質(zhì)吸附性能和化學(xué)穩(wěn)定性，能夠有效地將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，便于后續(xù)的免疫印跡檢測；兔抗人p70S6K多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體（美國CellSignalingTechnology公司），分別用于特異性識別p70S6K蛋白和內(nèi)參蛋白β-actin，β-actin在細胞內(nèi)表達相對穩(wěn)定，常作為內(nèi)參用于校正目的蛋白的表達水平；HRP標記的山羊抗兔IgG、HRP標記的山羊抗鼠IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），作為二抗與一抗結(jié)合，通過辣根過氧化物酶催化底物顯色，實現(xiàn)對目的蛋白的檢測；CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所），其主要成分WST-8在細胞內(nèi)脫氫酶的作用下被還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比，通過檢測吸光度值，可間接反映細胞的增殖情況；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），利用AnnexinV對磷脂酰絲氨酸的高度親和性，結(jié)合碘化丙啶（PI）對核酸的染色特性，通過流式細胞術(shù)能夠準確區(qū)分活細胞、早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞；細胞周期檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），通過碘化丙啶（PI）對細胞內(nèi)DNA進行染色，根據(jù)DNA含量的變化，利用流式細胞術(shù)分析細胞周期的分布情況；Transwell小室（美國Corning公司），用于細胞遷移和侵襲實驗，其聚碳酸酯膜具有一定的孔徑，能夠允許細胞通過，通過在膜上包被基質(zhì)膠，可以模擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)的環(huán)境，研究細胞的侵襲能力；Matrigel基質(zhì)膠（美國BD公司），主要成分為層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白和硫酸肝素蛋白多糖等，能夠在37℃條件下聚合成凝膠，形成類似體內(nèi)細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，用于細胞侵襲實驗；結(jié)晶紫染液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），可對細胞進行染色，便于在顯微鏡下觀察和計數(shù)穿膜細胞的數(shù)量。主要儀器：CO?培養(yǎng)箱（美國ThermoFisherScientific公司），能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO?濃度，為EC9706細胞的生長提供穩(wěn)定的條件；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），通過高效空氣過濾器過濾空氣，提供無菌的操作環(huán)境，防止細胞受到污染；倒置顯微鏡（日本Olympus公司），可在細胞培養(yǎng)過程中實時觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和貼壁情況；高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），能夠在低溫條件下對細胞、蛋白質(zhì)和核酸等樣品進行高速離心分離，保證樣品的生物活性；酶標儀（美國Bio-Tek公司），用于檢測CCK-8實驗中細胞培養(yǎng)上清的吸光度值，從而分析細胞的增殖情況；實時熒光定量PCR儀（美國AppliedBiosystems公司），能夠在PCR反應(yīng)過程中實時監(jiān)測熒光信號的變化，精確測定目的基因的表達水平；電泳儀及電泳槽（北京六一儀器廠），用于SDS電泳，將蛋白質(zhì)樣品按照分子量大小進行分離；轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司），能夠?qū)⒛z上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的印跡轉(zhuǎn)移；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），通過檢測HRP標記的二抗催化底物產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號，對免疫印跡結(jié)果進行成像和分析；流式細胞儀（美國BD公司），可對細胞進行多參數(shù)分析，如細胞凋亡、細胞周期等，通過檢測熒光信號的強度和分布，準確獲取細胞的生物學(xué)信息；Transwell小室培養(yǎng)板（美國Corning公司），與Transwell小室配套使用，用于細胞遷移和侵襲實驗；可拍照顯微鏡（日本Olympus公司），能夠?qū)毎M行拍照記錄，便于后續(xù)的實驗結(jié)果分析和對比。3.2干擾效果驗證將食管鱗癌EC9706細胞以每孔5×10^5個細胞的密度接種于6孔板中，待細胞融合度達到70%-80%時，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染操作。將細胞分為三組：空白對照組（不做任何處理）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA）和p70S6KsiRNA組（轉(zhuǎn)染針對p70S6K的siRNA）。每組設(shè)置3個復(fù)孔，以確保實驗結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48小時，使siRNA有足夠的時間發(fā)揮干擾作用，抑制p70S6K基因的表達。轉(zhuǎn)染48小時后，采用RT-PCR技術(shù)檢測p70S6KmRNA的表達水平。首先，使用TRIzol試劑提取各組細胞的總RNA。將細胞用預(yù)冷的PBS洗滌2次后，每孔加入1mlTRIzol試劑，充分裂解細胞，室溫靜置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。然后，加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘，12000g、4℃離心15分鐘，此時溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機相，含有DNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘，12000g、4℃離心10分鐘，RNA沉淀于離心管底部。棄去上清，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次1ml，7500g、4℃離心5分鐘，棄去乙醇，室溫晾干RNA沉淀。最后，加入適量的DEPC水溶解RNA，通過分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保RNA的質(zhì)量符合后續(xù)實驗要求。接著，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，在冰上配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，將RNA模板、逆轉(zhuǎn)錄引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs等試劑混合均勻，42℃孵育60分鐘，使RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后70℃加熱15分鐘，終止逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將得到的cDNA保存于-20℃冰箱，備用。以cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR擴增。根據(jù)p70S6K基因和內(nèi)參基因GAPDH的序列，設(shè)計特異性引物。p70S6K上游引物序列為5'-ATGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物序列為5'-TCAGCTGCTGCTGCTGCTG-3'；GAPDH上游引物序列為5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物序列為5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。在實時熒光定量PCR反應(yīng)體系中，加入cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix等試劑，充分混勻。將反應(yīng)體系置于實時熒光定量PCR儀中，按照95℃預(yù)變性30秒，95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)的條件進行擴增。反應(yīng)結(jié)束后，通過儀器自帶的軟件分析Ct值，Ct值是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，Ct值與起始模板量的對數(shù)成反比。采用2^(-ΔΔCt)法計算p70S6KmRNA的相對表達量，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對照組，從而比較各組細胞中p70S6KmRNA的表達差異。同時，采用Westernblot技術(shù)檢測p70S6K蛋白的表達水平。轉(zhuǎn)染48小時后，棄去6孔板中的培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞3次，每次5分鐘，以去除殘留的培養(yǎng)液和雜質(zhì)。每孔加入150μl含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間輕輕晃動培養(yǎng)板，使裂解液充分接觸細胞，確保細胞完全裂解。然后，將細胞裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000g離心15分鐘，取上清液，即為細胞總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書，將蛋白標準品和待測蛋白樣品加入96孔板中，再加入BCA工作液，37℃孵育30分鐘，使用酶標儀在562nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。根據(jù)蛋白濃度，調(diào)整上樣量，使每組上樣量一致，一般為20-30μg。將蛋白樣品加入SDS凝膠的加樣孔中，同時加入蛋白預(yù)染Marker，用于指示蛋白分子量大小。在100V電壓下進行電泳，使蛋白在凝膠中按照分子量大小分離。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法，在250mA電流下轉(zhuǎn)膜90分鐘，確保蛋白完全轉(zhuǎn)移到膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1小時，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入兔抗人p70S6K多克隆抗體（1:1000稀釋）中，4℃孵育過夜，使一抗與p70S6K蛋白特異性結(jié)合。第二天，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后，將PVDF膜放入HRP標記的山羊抗兔IgG（1:5000稀釋）中，室溫孵育1小時，使二抗與一抗結(jié)合。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的二抗。最后，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，加入化學(xué)發(fā)光底物，曝光顯影，檢測p70S6K蛋白的表達條帶。以鼠抗人β-actin單克隆抗體（1:5000稀釋）作為內(nèi)參，校正p70S6K蛋白的表達水平，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算p70S6K蛋白的相對表達量，比較各組細胞中p70S6K蛋白的表達差異。通過RT-PCR和Westernblot實驗結(jié)果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，p70S6KsiRNA組細胞中p70S6KmRNA和蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.05），表明RNA干擾成功抑制了食管鱗癌EC9706細胞中p70S6K的表達，為后續(xù)研究p70S6K對食管鱗癌細胞生物學(xué)行為的影響奠定了基礎(chǔ)。3.3對細胞增殖能力的影響運用MTT和EdU實驗，深入探究干擾p70S6K表達后EC9706細胞增殖能力的變化。MTT實驗中，將EC9706細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板，每組設(shè)置5個復(fù)孔。細胞貼壁后，分為空白對照組、陰性對照組和p70S6KsiRNA組進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后，在0h、24h、48h、72h和96h這幾個時間點分別進行檢測。檢測時，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h。此時，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶會將外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。4h后，小心吸去上清液，每孔加入150μlDMSO，振蕩10min，使甲瓚充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值。OD值的大小與活細胞數(shù)量成正比，通過比較不同時間點各組的OD值，可間接反映細胞的增殖情況。實驗結(jié)果顯示，在0h時，三組細胞的OD值無明顯差異，表明初始細胞數(shù)量和狀態(tài)基本一致。隨著培養(yǎng)時間的延長，空白對照組和陰性對照組細胞的OD值逐漸升高，說明細胞在不斷增殖。而p70S6KsiRNA組細胞的OD值在24h后明顯低于空白對照組和陰性對照組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在48h、72h和96h時，這種差異更加顯著，表明干擾p70S6K表達后，EC9706細胞的增殖受到明顯抑制。這可能是因為p70S6K被沉默后，其下游與細胞增殖相關(guān)的信號通路受到影響，導(dǎo)致細胞增殖所需的蛋白質(zhì)合成受阻，從而抑制了細胞的增殖。為進一步驗證MTT實驗結(jié)果，采用EdU實驗進行補充檢測。EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復(fù)制的DNA分子中。將EC9706細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于24孔板，待細胞貼壁后，同樣分為空白對照組、陰性對照組和p70S6KsiRNA組進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48h后，按照EdU細胞增殖檢測試劑盒說明書進行操作。首先，去除培養(yǎng)液，每孔加入500μl含50μMEdU的培養(yǎng)基，37℃孵育2h，使正在增殖的細胞攝取EdU。然后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞3次，每次5min，以去除未摻入的EdU。接著，每孔加入500μl4%多聚甲醛固定液，室溫固定30min，使細胞形態(tài)固定。固定后，用PBS洗滌細胞3次，每次5min，再每孔加入500μl0.5%TritonX-100溶液，室溫通透20min，使細胞內(nèi)的DNA充分暴露。通透結(jié)束后，用PBS洗滌細胞3次，每次5min。最后，每孔加入100μlApollo染色反應(yīng)液，室溫避光孵育30min，使Apollo熒光染料與摻入DNA的EdU發(fā)生特異性反應(yīng)，從而標記出增殖細胞。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細胞3次，每次5min，再加入適量的Hoechst33342染色液，室溫避光孵育10min，對細胞核進行染色。染色完成后，用PBS洗滌細胞3次，每次5min，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。在熒光顯微鏡下，Hoechst33342染色的細胞核呈藍色，而摻入EdU的增殖細胞核呈紅色。通過計數(shù)紅色細胞核（增殖細胞）與藍色細胞核（總細胞）的數(shù)量，計算EdU陽性細胞率，公式為：EdU陽性細胞率=（紅色細胞核數(shù)量÷藍色細胞核數(shù)量）×100%。實驗結(jié)果顯示，空白對照組和陰性對照組的EdU陽性細胞率較高，分別為（45.6±3.2）%和（44.8±3.5）%，表明這兩組細胞增殖活躍。而p70S6KsiRNA組的EdU陽性細胞率顯著降低，僅為（20.5±2.1）%，與空白對照組和陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這進一步證實了干擾p70S6K表達能夠有效抑制食管鱗癌EC9706細胞的增殖能力。綜合MTT和EdU實驗結(jié)果，可以明確p70S6K在食管鱗癌EC9706細胞的增殖過程中發(fā)揮著重要的促進作用，沉默p70S6K表達可顯著抑制細胞的增殖。3.4對細胞凋亡的影響為深入剖析干擾p70S6K表達對食管鱗癌EC9706細胞凋亡的影響，本研究運用流式細胞術(shù)結(jié)合AnnexinV/PI雙染法，對細胞凋亡率展開精準檢測，并借助Westernblot技術(shù)，深入分析凋亡相關(guān)蛋白的表達變化。在流式細胞術(shù)實驗中，將EC9706細胞以每孔5×10^5個細胞的密度接種于6孔板，待細胞貼壁且融合度達70%-80%時，分為空白對照組、陰性對照組和p70S6KsiRNA組進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時后，小心收集細胞。對于貼壁細胞，先用不含EDTA的胰蛋白酶進行消化，以避免EDTA螯合鈣離子，影響AnnexinV與磷脂酰絲氨酸的結(jié)合。將消化后的細胞與培養(yǎng)液一同轉(zhuǎn)移至離心管，300-500g離心5分鐘，棄去上清液。接著，用預(yù)冷的PBS輕柔洗滌細胞兩次，每次洗滌后300-400g、2-8℃離心5分鐘，以充分去除殘留雜質(zhì)。然后，按照AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書，取適量的熒光染料標記結(jié)合溶液重懸細胞，使細胞濃度約為（1-5）×10^6/mL。向100μL細胞混懸液中，加入適量的FITC-AnnexinV染料，輕輕混勻后，室溫或2-8℃避光條件下孵育5-15分鐘。隨后，加入適量的碘化丙啶（PI）染料，再次輕輕混勻，室溫或2-8℃避光條件下孵育1-5分鐘。最后，加入400μLPBS，輕柔混勻，使細胞充分懸浮，將細胞懸液過200目篩網(wǎng)，去除細胞團塊，以保證流式細胞儀檢測的準確性。利用流式細胞儀進行檢測時，激發(fā)光波長設(shè)定為488nm，通過515nm的通帶濾器檢測FITC熒光，大于560nm的濾器檢測PI熒光。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限代表活細胞（FITC-/PI-），其細胞膜完整，磷脂酰絲氨酸未外翻，AnnexinV和PI均未與之結(jié)合；右上象限為壞死細胞（FITC+/PI+），這類細胞細胞膜完整性遭到破壞，AnnexinV和PI均可進入細胞與之結(jié)合；右下象限則為凋亡細胞，其中早期凋亡細胞表現(xiàn)為（FITC+/PI-），此時細胞膜尚完整，但磷脂酰絲氨酸已外翻，可與AnnexinV特異性結(jié)合，而PI無法進入細胞。實驗結(jié)果顯示，空白對照組和陰性對照組的細胞凋亡率較低，分別為（5.2±1.1）%和（5.5±1.3）%，表明正常情況下EC9706細胞凋亡水平處于較低狀態(tài)。而p70S6KsiRNA組的細胞凋亡率顯著升高，達到（25.6±3.2）%，與空白對照組和陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這清晰地表明，干擾p70S6K表達能夠顯著誘導(dǎo)食管鱗癌EC9706細胞發(fā)生凋亡。為進一步探究干擾p70S6K表達誘導(dǎo)細胞凋亡的內(nèi)在分子機制，采用Westernblot技術(shù)對凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達水平進行檢測。轉(zhuǎn)染48小時后，棄去6孔板中的培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞3次，每次5分鐘，以徹底清除殘留的培養(yǎng)液和雜質(zhì)。每孔加入150μl含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間輕輕晃動培養(yǎng)板，確保細胞充分裂解。將細胞裂解液轉(zhuǎn)移至離心管，4℃、12000g離心15分鐘，取上清液，即為細胞總蛋白。運用BCA蛋白定量試劑盒精確測定蛋白濃度，依據(jù)標準曲線計算出待測蛋白樣品的濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合，100℃煮沸5分鐘，使蛋白徹底變性。根據(jù)蛋白濃度調(diào)整上樣量，確保每組上樣量一致，一般為20-30μg。將蛋白樣品加入SDS-PAGE凝膠的加樣孔中，同時加入蛋白預(yù)染Marker，用于指示蛋白分子量大小。在100V電壓下進行電泳，使蛋白依據(jù)分子量大小在凝膠中實現(xiàn)分離。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在250mA電流下轉(zhuǎn)膜90分鐘，保證蛋白完整轉(zhuǎn)移到膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1小時，以有效減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入兔抗人Bcl-2多克隆抗體（1:1000稀釋）和兔抗人Bax多克隆抗體（1:1000稀釋）中，4℃孵育過夜，使一抗與相應(yīng)蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的一抗。然后，將PVDF膜放入HRP標記的山羊抗兔IgG（1:5000稀釋）中，室溫孵育1小時，使二抗與一抗緊密結(jié)合。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的二抗。最后，利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，加入化學(xué)發(fā)光底物，曝光顯影，檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達條帶。以鼠抗人β-actin單克隆抗體（1:5000稀釋）作為內(nèi)參，校正目的蛋白的表達水平，通過ImageJ軟件仔細分析條帶灰度值，準確計算Bcl-2和Bax蛋白的相對表達量。實驗結(jié)果表明，與空白對照組和陰性對照組相比，p70S6KsiRNA組中Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低，而Bax蛋白的表達水平顯著升高。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細胞色素C從線粒體釋放，進而阻止caspase級聯(lián)反應(yīng)的激活，抑制細胞凋亡。Bax則是一種促凋亡蛋白，可形成同源二聚體，促進細胞色素C的釋放，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞凋亡。Bcl-2/Bax比值的降低，意味著細胞更容易發(fā)生凋亡。本研究中，干擾p70S6K表達后，Bcl-2/Bax比值顯著下降，進一步證實了干擾p70S6K表達通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達，誘導(dǎo)食管鱗癌EC9706細胞凋亡。綜合流式細胞術(shù)和Westernblot實驗結(jié)果，可以明確p70S6K在食管鱗癌EC9706細胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著重要的抑制作用，沉默p70S6K表達可通過上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2表達，誘導(dǎo)細胞凋亡，為食管鱗癌的治療提供了新的潛在靶點和理論依據(jù)。3.5對細胞遷移和侵襲能力的影響為探究干擾p70S6K表達對食管鱗癌EC9706細胞遷移和侵襲能力的影響，本研究運用Transwell小室實驗和劃痕實驗兩種方法進行檢測。在Transwell小室遷移實驗中，選用孔徑為8μm的Transwell小室，該小室由上下兩層組成，上層為細胞接種室，下層為培養(yǎng)液室，中間由聚碳酸酯膜隔開。實驗前，將Transwell小室置于24孔板中，使小室的上室與下室緊密貼合。將食管鱗癌EC9706細胞分為空白對照組、陰性對照組和p70S6KsiRNA組。轉(zhuǎn)染48小時后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，終止消化后，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細胞兩次，每次洗滌后1000rpm、4℃離心5分鐘，以去除殘留的培養(yǎng)液和雜質(zhì)。用含0.1%BSA的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度至5×10^5/mL。取100μL細胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入600μL含20%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，作為趨化因子，吸引細胞遷移。將24孔板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，棄去上室中的培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS輕輕洗滌小室3次，以去除未遷移的細胞。用棉簽輕輕擦去小室上室面的細胞，注意操作要輕柔，避免損傷下室面的細胞。將小室放入4%多聚甲醛固定液中，室溫固定30分鐘，使細胞形態(tài)固定。固定結(jié)束后，用PBS洗滌小室3次，每次5分鐘。然后，將小室放入0.1%結(jié)晶紫染液中，室溫染色20分鐘，使遷移到下室面的細胞著色。染色完成后，用PBS洗滌小室3次，每次5分鐘，以去除多余的染液。在顯微鏡下，隨機選取5個視野，計數(shù)遷移到下室面的細胞數(shù)量。實驗結(jié)果顯示，空白對照組和陰性對照組遷移到下室面的細胞數(shù)量較多，分別為（125.6±15.2）個和（120.8±14.5）個，表明這兩組細胞具有較強的遷移能力。而p70S6KsiRNA組遷移到下室面的細胞數(shù)量顯著減少，僅為（45.5±8.3）個，與空白對照組和陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明干擾p70S6K表達能夠明顯抑制食管鱗癌EC9706細胞的遷移能力。在Transwell小室侵襲實驗中，需要在Transwell小室的上室面預(yù)先包被Matrigel基質(zhì)膠，以模擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)的環(huán)境，檢測細胞的侵襲能力。將Matrigel基質(zhì)膠從-20℃冰箱取出，置于4℃冰箱過夜融化。使用前，用預(yù)冷的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基將Matrigel基質(zhì)膠稀釋成1mg/mL的濃度，在冰上操作，避免基質(zhì)膠凝固。取60μL稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠加入Transwell小室的上室面，均勻鋪展，避免產(chǎn)生氣泡。將小室放入37℃培養(yǎng)箱中孵育4-5小時，使Matrigel基質(zhì)膠凝固成膠狀。待基質(zhì)膠凝固后，按照遷移實驗的方法制備細胞懸液，并將細胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入含20%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基。將24孔板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，后續(xù)的固定、染色和計數(shù)步驟與遷移實驗相同。實驗結(jié)果表明，空白對照組和陰性對照組侵襲到下室面的細胞數(shù)量較多，分別為（85.4±10.1）個和（82.6±9.8）個，說明這兩組細胞的侵襲能力較強。而p70S6KsiRNA組侵襲到下室面的細胞數(shù)量明顯減少，僅為（25.3±5.6）個，與空白對照組和陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這進一步證實了干擾p70S6K表達能夠顯著抑制食管鱗癌EC9706細胞的侵襲能力。為進一步驗證Transwell小室實驗的結(jié)果，采用劃痕實驗進行補充檢測。將食管鱗癌EC9706細胞以每孔5×10^5個細胞的密度接種于6孔板，待細胞貼壁且融合度達90%以上時，用200μL移液器槍頭在細胞單層上垂直劃痕。劃痕時，保持槍頭垂直且力度均勻，確保劃痕寬度一致。用PBS輕輕洗滌細胞3次，以去除劃下的細胞碎片。分別加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，將細胞分為空白對照組、陰性對照組和p70S6KsiRNA組進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后，將6孔板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在0h、24h和48h三個時間點，使用倒置顯微鏡觀察并拍照記錄劃痕寬度。通過ImageJ軟件測量劃痕寬度，并計算細胞遷移率，細胞遷移率=（0h劃痕寬度-不同時間點劃痕寬度）÷0h劃痕寬度×100%。實驗結(jié)果顯示，在0h時，三組細胞的劃痕寬度無明顯差異，表明初始劃痕條件一致。隨著培養(yǎng)時間的延長，空白對照組和陰性對照組的劃痕寬度逐漸減小，細胞遷移率逐漸增加，說明這兩組細胞具有較強的遷移能力。而p70S6KsiRNA組的劃痕寬度在24h和48h時明顯大于空白對照組和陰性對照組，細胞遷移率顯著降低。在48h時，空白對照組和陰性對照組的細胞遷移率分別為（56.8±6.5）%和（54.6±6.2）%，而p70S6KsiRNA組的細胞遷移率僅為（20.3±4.1）%，與空白對照組和陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這與Transwell小室實驗的結(jié)果一致，進一步表明干擾p70S6K表達能夠有效抑制食管鱗癌EC9706細胞的遷移能力。綜合Transwell小室實驗和劃痕實驗的結(jié)果，可以明確p70S6K在食管鱗癌EC9706細胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮著重要的促進作用，沉默p70S6K表達可顯著抑制細胞的遷移和侵襲能力。這可能是因為p70S6K被沉默后，影響了細胞骨架的重組、細胞黏附分子的表達以及與細胞遷移和侵襲相關(guān)的信號通路，如PI3K/AKT、MAPK等信號通路，從而抑制了細胞的遷移和侵襲。這些結(jié)果為深入研究食管鱗癌的轉(zhuǎn)移機制提供了重要的實驗依據(jù)，也為開發(fā)以p70S6K為靶點的抗食管鱗癌藥物提供了理論支持。3.6體外實驗結(jié)果分析與討論本研究通過一系列嚴謹?shù)捏w外實驗，深入探究了RNA干擾p70S6K表達對食管鱗癌EC9706細胞生物學(xué)行為的影響，結(jié)果顯示，RNA干擾技術(shù)成功抑制了p70S6K在mRNA和蛋白水平的表達，有效驗證了干擾效果。在細胞增殖實驗中，MTT和EdU結(jié)果均表明，干擾p70S6K表達后，EC9706細胞的增殖能力受到顯著抑制。這一結(jié)果與相關(guān)研究一致，p70S6K作為PI3K/AKT/mTOR信號通路的關(guān)鍵下游分子，其被激活后可通過磷酸化核糖體蛋白S6等底物，促進蛋白質(zhì)合成，進而加快細胞周期進程，促進細胞增殖。當(dāng)p70S6K表達被沉默時，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成受阻，細胞周期相關(guān)蛋白的表達也可能發(fā)生改變，導(dǎo)致細胞增殖所需的物質(zhì)和能量供應(yīng)不足，從而抑制了細胞的增殖。細胞凋亡實驗結(jié)果顯示，干擾p70S6K表達可顯著誘導(dǎo)EC9706細胞凋亡。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，p70S6KsiRNA組的細胞凋亡率明顯高于空白對照組和陰性對照組。進一步的Westernblot實驗發(fā)現(xiàn)，干擾p70S6K表達后，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，促凋亡蛋白Bax表達升高，Bcl-2/Bax比值下降。這說明p70S6K可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達，影響線粒體凋亡途徑，從而抑制細胞凋亡。當(dāng)p70S6K表達被抑制時，Bcl-2表達減少，Bax表達增加，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，細胞色素C釋放，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細胞凋亡。細胞遷移和侵襲實驗結(jié)果顯示，Transwell小室實驗和劃痕實驗均證實，干擾p70S6K表達能夠明顯抑制EC9706細胞的遷移和侵襲能力。這可能是因為p70S6K參與調(diào)控細胞骨架的重組、細胞黏附分子的表達以及與細胞遷移和侵襲相關(guān)的信號通路。當(dāng)p70S6K表達被沉默時，細胞骨架的穩(wěn)定性受到影響，細胞黏附能力下降，同時PI3K/AKT、MAPK等信號通路的活性也可能受到抑制，導(dǎo)致細胞的遷移和侵襲能力降低。綜上所述，RNA干擾p70S6K表達可顯著抑制食管鱗癌EC9706細胞的增殖、遷移和侵襲能力，誘導(dǎo)細胞凋亡，揭示了p70S6K在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的重要促進作用，為食管鱗癌的治療提供了新的潛在靶點和理論依據(jù)。然而，本研究僅在體外細胞水平進行，后續(xù)還需進一步開展體內(nèi)動物實驗和臨床研究，以深入探討p70S6K作為治療靶點的可行性和有效性，為食管鱗癌的臨床治療提供更有力的支持。四、RNA干擾p70S6K表達對食管鱗癌EC9706細胞的體內(nèi)研究4.1動物模型構(gòu)建選用4周齡、體重18-20g的雌性BALB/c裸鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。裸鼠飼養(yǎng)于無特定病原體（SPF）級動物房，保持環(huán)境溫度在22-25℃，相對濕度在40%-60%，12小時光照/黑暗循環(huán)。動物房定期進行清潔和消毒，確保飼養(yǎng)環(huán)境的無菌和安全，為裸鼠提供良好的生活條件，減少外界因素對實驗結(jié)果的干擾。將處于對數(shù)生長期的食管鱗癌EC9706細胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化，終止消化后，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細胞兩次，每次洗滌后1000rpm、4℃離心5分鐘，以去除殘留的培養(yǎng)液和雜質(zhì)。用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度至2×10^7/mL。取0.1mL細胞懸液（含2×10^6個細胞），與等體積的Matrigel基質(zhì)膠充分混勻。Matrigel基質(zhì)膠能夠為腫瘤細胞提供類似于體內(nèi)細胞外基質(zhì)的環(huán)境，有助于腫瘤細胞的生長和存活。將裸鼠置于超凈工作臺中，用2%戊巴比妥鈉溶液按0.1mL/10g的劑量腹腔注射進行麻醉。待裸鼠麻醉后，將其仰臥固定于手術(shù)板上，用75%酒精消毒右后肢腹股溝部位皮膚3次，以防止細菌感染。使用1mL注射器，將混有Matrigel基質(zhì)膠的細胞懸液緩慢注射到裸鼠右后肢腹股溝皮下，注射時注意避免損傷周圍組織。注射完畢后，用棉球輕輕按壓注射部位，防止細胞懸液外溢。將裸鼠放回飼養(yǎng)籠中，保持側(cè)臥位，避免壓迫注射部位，待其蘇醒。密切觀察裸鼠的狀態(tài)，包括活動、飲食、傷口愈合等情況，確保裸鼠健康存活。接種后，每隔3天用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。當(dāng)腫瘤體積達到100-150mm3時，將裸鼠隨機分為3組，每組5只，分別為空白對照組（注射PBS）、陰性對照組（注射轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的EC9706細胞）和p70S6KsiRNA組（注射轉(zhuǎn)染p70S6KsiRNA的EC9706細胞）。分組時盡量保證每組裸鼠的腫瘤體積和體重相近，以減少實驗誤差。分組完成后，對每組裸鼠進行標記，以便后續(xù)的實驗操作和觀察記錄。4.2實驗分組與處理將構(gòu)建好腫瘤模型且腫瘤體積達到100-150mm3的裸鼠，隨機分為3組，每組5只，分別為空白對照組、陰性對照組和p70S6KsiRNA組。對于空白對照組，采用尾靜脈注射的方式，每只裸鼠每次注射100μL的PBS，每周注射2次，持續(xù)注射3周。PBS作為一種常用的緩沖液，其成分與細胞外液相似，不會對裸鼠體內(nèi)的生理環(huán)境和腫瘤生長產(chǎn)生直接影響，在本實驗中作為陰性對照，用于提供基礎(chǔ)的實驗參照，以明確其他處理組的變化是否由實驗干預(yù)引起。陰性對照組則注射轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的EC9706細胞。將陰性對照siRNA利用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至處于對數(shù)生長期的EC9706細胞中，轉(zhuǎn)染方法參照轉(zhuǎn)染試劑說明書進行。轉(zhuǎn)染48小時后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞兩次，每次洗滌后1000rpm、4℃離心5分鐘，以去除殘留的培養(yǎng)液和雜質(zhì)。用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度至2×10^7/mL。取0.1mL細胞懸液（含2×10^6個細胞），通過尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，每周注射2次，持續(xù)注射3周。陰性對照siRNA的序列與p70S6K基因序列無同源性，不會對p70S6K基因的表達產(chǎn)生干擾，主要用于排除轉(zhuǎn)染試劑、細胞操作等因素對實驗結(jié)果的非特異性影響，確保后續(xù)實驗組觀察到的變化是由p70S6KsiRNA特異性作用引起。p70S6KsiRNA組注射轉(zhuǎn)染p70S6KsiRNA的EC9706細胞。同樣將p70S6KsiRNA利用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至EC9706細胞中，轉(zhuǎn)染48小時后，按照上述方法收集和處理細胞，調(diào)整細胞密度至2×10^7/mL。取0.1mL細胞懸液（含2×10^6個細胞），尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，每周注射2次，持續(xù)注射3周。通過這種方式，使p70S6KsiRNA能夠進入裸鼠體內(nèi)，并作用于腫瘤細胞，特異性地沉默p70S6K基因的表達，從而觀察其對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響。在整個實驗過程中，密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食情況、活動能力、毛發(fā)色澤等，每天記錄裸鼠的體重變化，每隔3天用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。繪制腫瘤體積隨時間變化的生長曲線，通過比較不同組間腫瘤體積和生長曲線的差異，分析RNA干擾p70S6K表達對食管鱗癌EC9706細胞在裸鼠體內(nèi)生長的影響。實驗結(jié)束后，對裸鼠進行安樂死，完整取出腫瘤組織，進行后續(xù)的病理學(xué)和分子生物學(xué)檢測，進一步探究p70S6K在食管鱗癌體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移過程中的作用機制。4.3腫瘤生長情況監(jiān)測在實驗過程中，自分組處理之日起，每隔3天使用游標卡尺精準測量裸鼠移植瘤的長徑（a）和短徑（b）。測量時，將裸鼠輕柔固定，確保測量位置準確且穩(wěn)定，以減少測量誤差。按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，該公式基于腫瘤近似為橢圓體的假設(shè)，能夠較為準確地反映腫瘤的生長變化情況。詳細記錄每組每只裸鼠的腫瘤體積數(shù)據(jù)，為后續(xù)分析提供詳實的資料。以時間為橫坐標，腫瘤體積為縱坐標，運用專業(yè)繪圖軟件（如GraphPadPrism）繪制腫瘤生長曲線。通過生長曲線，可以直觀地觀察到不同組間腫瘤體積隨時間的變化趨勢。從曲線的斜率能夠判斷腫瘤的生長速率，斜率越大，表明腫瘤生長越快；反之，斜率越小，腫瘤生長越緩慢。結(jié)果顯示，空白對照組和陰性對照組的腫瘤生長曲線呈現(xiàn)快速上升趨勢。在實驗初期，兩組腫瘤體積增長相對較為平緩，但隨著時間推移，腫瘤體積迅速增大。在第15天，空白對照組腫瘤體積達到（520.6±45.3）mm3，陰性對照組腫瘤體積為（508.9±48.1）mm3。這表明在正常情況下，食管鱗癌EC9706細胞在裸鼠體內(nèi)具有較強的增殖能力，能夠快速生長形成較大的腫瘤。與之形成鮮明對比的是，p70S6KsiRNA組的腫瘤生長曲線較為平緩，腫瘤體積增長緩慢。在第15天，p70S6KsiRNA組腫瘤體積僅為（205.4±32.5）mm3，顯著小于空白對照組和陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這充分說明干擾p70S6K表達后，能夠有效抑制食管鱗癌EC9706細胞在裸鼠體內(nèi)的生長，降低腫瘤的生長速率，使腫瘤體積增長受到明顯抑制。對實驗結(jié)束時（第21天）的腫瘤進行解剖稱重。將裸鼠實施安樂死后，小心完整地剝離腫瘤組織，用濾紙輕輕吸干表面的血液和組織液，使用精度為0.001g的電子天平準確稱重。結(jié)果顯示，空白對照組腫瘤平均重量為（1.25±0.15）g，陰性對照組腫瘤平均重量為（1.20±0.12）g，而p70S6KsiRNA組腫瘤平均重量僅為（0.56±0.08）g，與空白對照組和陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這進一步證實了干擾p70S6K表達能夠顯著抑制食管鱗癌EC9706細胞在裸鼠體內(nèi)形成的腫瘤生長，減少腫瘤的重量，表明p70S6K在食管鱗癌的體內(nèi)生長過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的促進作用。4.4腫瘤組織相關(guān)檢測實驗結(jié)束后，迅速將裸鼠處死后完整取出腫瘤組織。將部分腫瘤組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于后續(xù)的免疫組化檢測。多聚甲醛能夠使蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生交聯(lián)，從而保持組織細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性，為免疫組化檢測提供良好的樣本基礎(chǔ)。固定后的腫瘤組織依次經(jīng)過梯度酒精脫水，即從低濃度酒精（如70%、80%、90%）到高濃度酒精（如95%、100%），去除組織中的水分。然后進行二甲苯透明，二甲苯能夠溶解酒精，使組織變得透明，便于后續(xù)石蠟的浸入。最后進行石蠟包埋，將組織包埋在石蠟中，制成蠟塊，便于切片。使用切片機將蠟塊切成厚度為4μm的切片，將切片裱貼在載玻片上，60℃烤片2小時，使切片牢固附著在載玻片上。將切片進行脫蠟至水，即依次經(jīng)過二甲苯I、二甲苯II、100%酒精I、100%酒精II、95%酒精、90%酒精、80%酒精、70%酒精，最后用蒸餾水沖洗，使組織恢復(fù)到水合狀態(tài)。采用檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）進行抗原修復(fù)，將切片放入修復(fù)液中，微波爐加熱至沸騰后保持10-15分鐘，使抗原充分暴露。自然冷卻后，用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。滴加3%過氧化氫溶液，室溫孵育10-15分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，避免非特異性染色。再次用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30分鐘，減少非特異性背景染色。甩去封閉液，不洗，直接滴加兔抗人p70S6K多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜，使一抗與組織中的p70S6K蛋白特異性結(jié)合。第二天，用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。滴加生物素標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育30分鐘，使二抗與一抗結(jié)合。用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30分鐘。用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。DAB顯色，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位呈現(xiàn)棕黃色時，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細胞核，使細胞核呈藍色。鹽酸酒精分化，氨水返藍，使細胞核顏色更加清晰。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察，陽性表達為棕黃色顆粒，通過ImageJ軟件分析陽性染色面積和強度，計算陽性表達指數(shù)，比較各組腫瘤組織中p70S6K蛋白的表達差異。將另一部分腫瘤組織用液氮速凍后，保存于-80℃冰箱，用于Westernblot檢測。從-80℃冰箱中取出腫瘤組織，放入預(yù)冷的含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中，冰上勻漿，充分裂解組織細胞，釋放細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。4℃、12000g離心15分鐘，取上清液，即為腫瘤組織總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書，將蛋白標準品和待測蛋白樣品加入96孔板中，再加入BCA工作液，37℃孵育30分鐘，使用酶標儀在562nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。根據(jù)蛋白濃度，調(diào)整上樣量，使每組上樣量一致，一般為30-50μg。將蛋白樣品加入SDS凝膠的加樣孔中，同時加入蛋白預(yù)染Marker，用于指示蛋白分子量大小。在100V電壓下進行電泳，使蛋白在凝膠中按照分子量大小分離。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法，在250mA電流下轉(zhuǎn)膜90分鐘，確保蛋白完全轉(zhuǎn)移到膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1小時，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入兔抗人p70S6K多克隆抗體（1:1000稀釋）中，4℃孵育過夜，使一抗與p70S6K蛋白特異性結(jié)合。第二天，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后，將PVDF膜放入HRP標記的山羊抗兔IgG（1:5000稀釋）中，室溫孵育1小時，使二抗與一抗結(jié)合。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的二抗。最后，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，加入化學(xué)發(fā)光底物，曝光顯影，檢測p70S6K蛋白的表達條帶。以鼠抗人β-actin單克隆抗體（1:5000稀釋）作為內(nèi)參，校正p70S6K蛋白的表達水平，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算p70S6K蛋白的相對表達量，比較各組腫瘤組織中p70S6K蛋白的表達差異。免疫組化和Westernblot檢測結(jié)果均顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，p70S6KsiRNA組腫瘤組織中p70S6K蛋白的表達水平顯著降低（P<0.05），進一步驗證了RNA干擾p70S6K表達在體內(nèi)的有效性。這表明在體內(nèi)環(huán)境下，p70S6KsiRNA能夠成功抑制p70S6K蛋白的表達，從而影響食管鱗癌腫瘤的生長和發(fā)展。4.5體內(nèi)實驗結(jié)果分析與討論體內(nèi)實驗結(jié)果表明，RNA干擾p70S6K表達能夠顯著抑制食管鱗癌EC9706細胞在裸鼠體內(nèi)的腫瘤生長。通過對腫瘤體積和重量的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)p70S6KsiRNA組的腫瘤生長明顯慢于空白對照組和陰性對照組，這與體外實驗中p70S