基于SILAC技術(shù)解析PRRSV感染Marc-145細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)組學(xué)特征與機制一、引言1.1研究背景豬繁殖與呼吸綜合征（PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus，PRRSV）引起的一種高度接觸性傳染病，對全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。自20世紀(jì)80年代末首次在美國被發(fā)現(xiàn)以來，PRRSV迅速傳播至世界各地，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的挑戰(zhàn)。PRRSV主要感染豬，尤其是妊娠母豬和仔豬。感染后的妊娠母豬會出現(xiàn)繁殖障礙，如流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等；仔豬則會出現(xiàn)呼吸道癥狀、高死亡率以及生長發(fā)育受阻等問題。此外，PRRSV還會導(dǎo)致豬的免疫抑制，使豬更容易感染其他病原體，進一步加重病情，增加養(yǎng)殖成本和損失。據(jù)統(tǒng)計，全球每年因PRRS造成的經(jīng)濟損失高達數(shù)十億美元，在中國，PRRS也是危害養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一，嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。目前，對于PRRS的防控主要依賴疫苗接種和綜合防控措施，但由于PRRSV的高度變異性和復(fù)雜的感染機制，傳統(tǒng)疫苗的保護效果并不理想，難以有效控制疫情的發(fā)生和傳播。因此，深入研究PRRSV的感染機制，尋找新的防控靶點和策略，對于提高PRRS的防控水平具有重要的意義。蛋白質(zhì)組學(xué)是研究生物體蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律的科學(xué)，能夠從整體水平上揭示蛋白質(zhì)的表達、修飾、相互作用等信息，為深入理解生命過程和疾病發(fā)生機制提供了有力的工具。分泌蛋白質(zhì)組學(xué)作為蛋白質(zhì)組學(xué)的一個重要分支，主要研究細(xì)胞或組織分泌到細(xì)胞外環(huán)境中的蛋白質(zhì)，這些分泌蛋白在細(xì)胞間通訊、信號傳導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，與病毒的感染、致病和免疫逃逸等密切相關(guān)。穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸技術(shù)（StableIsotopeLabelingbyAminoacidsinCellculture，SILAC）是一種先進的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，它通過在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加含有穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸，使細(xì)胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)帶上同位素標(biāo)記。利用SILAC技術(shù)，可以對不同處理組的細(xì)胞分泌蛋白進行定量分析，準(zhǔn)確地鑒定出差異表達的蛋白質(zhì)，從而深入研究病毒感染過程中宿主細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組的變化規(guī)律。Marc-145細(xì)胞是一種常用于研究PRRSV感染的細(xì)胞系，它對PRRSV具有較高的敏感性，能夠支持病毒的高效復(fù)制。因此，利用SILAC技術(shù)研究PRRSV感染Marc-145細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組學(xué)的變化，有助于全面揭示PRRSV與宿主細(xì)胞之間的相互作用機制，為深入理解PRRSV的感染機制、尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點提供重要的理論依據(jù)。1.2研究目的與意義本研究旨在運用SILAC技術(shù)，全面分析PRRSV感染Marc-145細(xì)胞后分泌蛋白質(zhì)組的變化，深入探究PRRSV的感染機制，為開發(fā)新型的PRRS防控策略提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。具體而言，本研究的目的包括：首先，利用SILAC技術(shù)結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，準(zhǔn)確鑒定PRRSV感染Marc-145細(xì)胞后分泌蛋白質(zhì)組中的差異表達蛋白，明確這些蛋白在病毒感染過程中的表達變化規(guī)律；其次，通過生物信息學(xué)分析，對差異表達蛋白進行功能注釋、富集分析和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，揭示其參與的生物學(xué)過程、信號通路以及相互作用關(guān)系，深入探討PRRSV感染Marc-145細(xì)胞的分子機制；最后，對篩選出的關(guān)鍵差異表達蛋白進行功能驗證，明確其在PRRSV感染過程中的具體作用，為尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點奠定基礎(chǔ)。本研究具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。在理論方面，通過對PRRSV感染Marc-145細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，可以從蛋白質(zhì)水平全面揭示PRRSV與宿主細(xì)胞之間的相互作用機制，深入理解PRRSV的感染、致病和免疫逃逸等過程，豐富和完善PRRSV的分子生物學(xué)理論。這有助于填補當(dāng)前對PRRSV感染機制研究的空白，為進一步研究病毒與宿主的相互關(guān)系提供新的視角和思路。在實際應(yīng)用方面，本研究的結(jié)果將為PRRS的防控提供重要的理論依據(jù)和技術(shù)支持。通過鑒定出的差異表達蛋白，有望篩選出與PRRSV感染密切相關(guān)的生物標(biāo)志物，用于PRRS的早期診斷和病情監(jiān)測，提高診斷的準(zhǔn)確性和及時性，為疾病的防控爭取寶貴的時間。深入研究差異表達蛋白的功能，有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，為開發(fā)高效、安全的抗PRRSV藥物和新型疫苗提供理論基礎(chǔ)，提高PRRS的防控水平，減少其對養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟損失，促進養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。此外，本研究中應(yīng)用的SILAC技術(shù)，也為其他病毒感染機制的研究提供了參考和借鑒，推動蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在病毒學(xué)研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。二、相關(guān)理論與技術(shù)基礎(chǔ)2.1PRRSV概述2.1.1PRRSV的結(jié)構(gòu)與特性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）屬于套式病毒目動脈炎病毒科動脈炎病毒屬，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒。其病毒粒子呈球形，直徑約為45-83nm，平均大小在50-65nm。病毒粒子內(nèi)部有一個呈二十面體對稱的電子致密性核衣殼，直徑為25-35nm，核衣殼表面有約5nm的突起，外面環(huán)繞著一層脂質(zhì)雙層膜。這種結(jié)構(gòu)使得PRRSV對氯仿、乙醚等脂溶劑和去垢劑敏感，因為這些物質(zhì)能夠破壞其脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致病毒失去感染性。PRRSV的基因組全長約15kb，包含8個開放閱讀框（ORFs）。其中，ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，這些非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，參與病毒復(fù)制酶復(fù)合體的形成，負(fù)責(zé)病毒基因組RNA的合成和加工。ORF2-ORF7則編碼結(jié)構(gòu)蛋白，包括核衣殼蛋白（N蛋白）、基質(zhì)蛋白（M蛋白）、糖蛋白GP2、GP3、GP4、GP5以及小包膜蛋白E等。N蛋白由ORF7編碼，是一種非糖基化蛋白，分子質(zhì)量約為14-15KD，具有強堿性。其C端在維持蛋白質(zhì)構(gòu)象上發(fā)揮重要作用，N-端的半段由Arg、Lys、His三種氨基酸組成，在組裝核衣殼蛋白的過程中，可能促進N蛋白和RNA基因組的相互結(jié)合。N蛋白在病毒粒子中含量較高，約占病毒蛋白總量的20-40%，具有極強的免疫原性。感染PRRSV后約9-11天左右，機體首先產(chǎn)生針對該蛋白的抗體，隨后才產(chǎn)生對其它蛋白的抗體，該抗體最長可維持一年以上，但是不具備中和活性。因此，N蛋白常被用于PRRSV診斷方法的研究，作為檢測PRRSV抗體的首選抗原蛋白。M蛋白由ORF6編碼，是PRRSV中最保守的蛋白，也是一種非糖基化蛋白，它與GP5通過二硫鍵連接形成異源二聚體。這種異源二聚體結(jié)構(gòu)對于病毒粒子的組裝和穩(wěn)定性具有重要意義，并且在病毒感染宿主細(xì)胞的過程中，可能參與病毒與宿主細(xì)胞表面受體的相互作用，影響病毒的感染效率。GP5蛋白由ORF5編碼，是PRRSV最主要的保護性抗原。抗GP5的單抗能中和病毒，而且目前唯一確定的中和表位位于GP5的胞外區(qū)，因此GP5是研究PRRS新型疫苗的良好目標(biāo)基因。其在病毒感染宿主細(xì)胞后，能夠刺激機體產(chǎn)生中和抗體，這些中和抗體可以與病毒表面的GP5蛋白結(jié)合，阻止病毒與宿主細(xì)胞的吸附和侵入，從而發(fā)揮抗病毒免疫作用。此外，還有4種次要囊膜蛋白GP2、GP3、GP4及E蛋白，它們在病毒的感染過程中也發(fā)揮著各自獨特的作用。例如，GP2a和GP4被確定為病毒附著蛋白，通過與宿主細(xì)胞表面的受體CD163相互作用介導(dǎo)病毒進入易感宿主細(xì)胞，在病毒的吸附和侵入過程中扮演重要角色。PRRSV在理化特性方面，熱穩(wěn)定性差，低溫下有較好穩(wěn)定性，在-70℃下可長期保存，56℃經(jīng)45min就會完全失去致病性，干燥條件下也可使病毒迅速失去感染性。同時，PRRSV對pH敏感，在6.5<pH<7.5的環(huán)境中穩(wěn)定，不耐酸堿，當(dāng)pH>7或pH<5時，可使病毒感染力迅速喪失。這種對溫度和pH值的敏感性，決定了PRRSV在外界環(huán)境中的存活能力和傳播范圍，也為其防控提供了一定的理論依據(jù)，在實際養(yǎng)殖環(huán)境中，可以通過調(diào)節(jié)環(huán)境溫度和酸堿度來降低病毒的存活和傳播風(fēng)險。PRRSV至今未發(fā)現(xiàn)有不同血清型，但來源于不同地理位置的毒株間核苷酸序列變異較大，可分為歐洲基因型（簡稱A群或A亞群），原型病毒為LV株；和美國基因型（簡稱B群或B亞群），VR-2332株。我國分離到的毒株都屬美洲型，尚未發(fā)現(xiàn)歐洲型。這種基因型的差異導(dǎo)致不同毒株在致病性、免疫原性等方面存在一定的差異，給PRRS的防控帶來了挑戰(zhàn)，不同基因型的毒株可能對疫苗的免疫應(yīng)答不同，需要研發(fā)針對性的防控措施。2.1.2PRRSV的感染過程與致病機制PRRSV的感染過程是一個復(fù)雜且有序的過程，豬是其唯一已知的自然宿主，完全分化的豬肺泡巨噬細(xì)胞是PRRSV感染的主要細(xì)胞靶點，此外，樹突狀細(xì)胞也能夠支持PRRSV的復(fù)制。在體外研究中，非洲綠猴腎細(xì)胞系MA-104及其衍生物MARC-145對PRRSV具有較高的敏感性，能夠支持病毒的高效復(fù)制，因此常被用于PRRSV感染機制的研究。PRRSV通過標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入宿主細(xì)胞。首先，病毒粒子與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，目前已知CD163是介導(dǎo)病毒內(nèi)化和分解的主要受體，唾液酸粘附素（CD169）可能作為受體通過與GP5/M異二聚體的外結(jié)構(gòu)域相互作用介導(dǎo)病毒內(nèi)化。但有研究使用CD169基因敲除豬表明，完整的唾液粘附素（CD169）對于PRRSV的附著和/或內(nèi)化并不需要。CD163作為富含半胱氨酸的清道夫受體家族成員，其過表達可使多種非受納細(xì)胞系易受PRRSV感染。兩種次要結(jié)構(gòu)蛋白GP2a和GP4被確定為病毒附著蛋白，通過與CD163相互作用介導(dǎo)病毒進入易感宿主細(xì)胞。當(dāng)病毒與受體結(jié)合后，細(xì)胞膜內(nèi)陷形成網(wǎng)格蛋白包被的小泡，將病毒粒子包裹進入細(xì)胞內(nèi)，形成內(nèi)涵體。隨著內(nèi)涵體的成熟，其內(nèi)部環(huán)境逐漸酸化，病毒包膜與內(nèi)涵體膜發(fā)生融合，病毒基因組被釋放到細(xì)胞質(zhì)中。病毒基因組進入細(xì)胞質(zhì)后，首先作為模板翻譯產(chǎn)生復(fù)制酶多蛋白pp1a-nsp2TF、pp1a-nsp2N、pp1a和pp1ab。這些多蛋白被病毒內(nèi)部蛋白酶切割，產(chǎn)生至少14種非結(jié)構(gòu)蛋白，這些非結(jié)構(gòu)蛋白進一步組裝成復(fù)制和轉(zhuǎn)錄復(fù)合體（RTC）。RTC首先參與負(fù)鏈RNA合成，以病毒基因組RNA為模板，合成單鏈全長和亞基因組（sg）長度的負(fù)鏈RNA。隨后，以負(fù)鏈RNA為模板，合成表達位于基因組3′-近四分之一的結(jié)構(gòu)蛋白基因所需的正鏈sgmRNAs。新生成的RNA基因組被包裝成核衣殼，核衣殼由光滑的細(xì)胞膜出芽包裹，形成新的病毒粒子，最后通過胞外途徑從細(xì)胞中釋放出來，繼續(xù)感染其他細(xì)胞。PRRSV的致病機制主要與它在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的感染和增殖密切相關(guān)。當(dāng)PRRSV接觸豬的黏膜后，在感染后12h內(nèi)即可產(chǎn)生病毒血癥，病毒抗原可以從鼻黏膜、肺和扁桃體的巨噬細(xì)胞中檢出。母豬可通過鼻黏膜或子宮內(nèi)膜接種PRRSV而被感染，也可通過注射或咬傷等途徑感染。PRRSV首先在黏膜表面的巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖，隨后擴散到局部淋巴結(jié)和其他組織器官。在感染的急性期，病毒主要在肺和上呼吸道的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中大量復(fù)制，導(dǎo)致這些細(xì)胞的損傷和功能障礙。巨噬細(xì)胞作為機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其功能受損會影響機體的免疫防御能力。病毒感染巨噬細(xì)胞后，會抑制巨噬細(xì)胞的吞噬功能、抗原呈遞能力以及細(xì)胞因子的分泌，使得機體對其他病原體的抵抗力下降，容易繼發(fā)其他感染。同時，病毒的大量復(fù)制還會引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肺部出現(xiàn)炎癥病變，表現(xiàn)為肺炎、肺水腫等癥狀，仔豬會出現(xiàn)呼吸道癥狀，如咳嗽、氣喘、呼吸困難等。PRRSV感染還會導(dǎo)致免疫抑制，使機體的免疫系統(tǒng)不能正常發(fā)揮作用。一方面，病毒感染巨噬細(xì)胞后，會干擾巨噬細(xì)胞的正常代謝和功能，影響其對病原體的識別和清除能力；另一方面，病毒感染會誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫耐受，使得機體對PRRSV及其他病原體的免疫應(yīng)答減弱。例如，PRRSV感染會抑制T細(xì)胞的增殖和活化，降低干擾素-γ等細(xì)胞因子的分泌，從而影響細(xì)胞免疫和體液免疫的正常功能。這種免疫抑制狀態(tài)會持續(xù)較長時間，使得豬在感染PRRSV后的一段時間內(nèi)，容易受到其他病原體的侵襲，增加了疾病的復(fù)雜性和治療難度。在母豬感染PRRSV后，病毒可以通過胎盤傳播給胎兒，導(dǎo)致胎兒發(fā)育異常，出現(xiàn)流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙癥狀。這是因為病毒感染會引起子宮內(nèi)膜炎和胎盤血管炎，影響胎盤的正常功能，導(dǎo)致胎兒供血不足、營養(yǎng)缺乏，從而影響胎兒的生長發(fā)育。此外，病毒感染還可能導(dǎo)致胎兒免疫系統(tǒng)發(fā)育異常，使其出生后更容易感染疾病，死亡率增加。PRRSV感染可分為至少三個不同的階段：急性感染、維持和消亡。在急性感染階段，肺部是首選的感染部位，病毒在肺和上呼吸道的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中大量復(fù)制，導(dǎo)致病毒血癥，血清病毒血癥可能持續(xù)數(shù)周，盡管此時機體已經(jīng)產(chǎn)生循環(huán)抗體，但病毒仍能在體內(nèi)持續(xù)存在。在維持階段，病毒復(fù)制減弱，在血液和肺中不再檢測到病毒，豬不再表現(xiàn)出明顯的臨床疾病跡象，但病毒復(fù)制主要局限于淋巴器官，包括扁桃體和淋巴結(jié)等，病毒在區(qū)域淋巴結(jié)內(nèi)的持續(xù)復(fù)制是病毒通過口鼻分泌物和精液有效傳播給陰性豬的原因。隨后進入消亡階段，病毒的復(fù)制逐漸衰減，直到病毒在宿主體內(nèi)消亡，但目前尚不清楚病毒何時完全消失，在感染后，病毒復(fù)制可以維持長達250天。在典型的養(yǎng)豬生產(chǎn)環(huán)境中，PRRSV甚至可以建立“終身”感染，這給PRRS的防控帶來了極大的困難。2.2Marc-145細(xì)胞特性Marc-145細(xì)胞系來源于非洲綠猴腎細(xì)胞系MA-104，是一種常用的細(xì)胞系，在病毒學(xué)研究，尤其是PRRSV研究中具有重要的應(yīng)用價值。從來源上看，MA-104細(xì)胞最初是從非洲綠猴的腎組織中分離建立的，而Marc-145細(xì)胞則是MA-104細(xì)胞經(jīng)克隆篩選得到的一個亞克隆細(xì)胞系。這種細(xì)胞系的建立為PRRSV的研究提供了穩(wěn)定且易于培養(yǎng)的細(xì)胞模型，極大地推動了對PRRSV的研究進程。Marc-145細(xì)胞具有獨特的形態(tài)特征。在顯微鏡下觀察，它呈現(xiàn)出典型的上皮細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，呈多邊形或梭形，細(xì)胞之間緊密相連，形成單層貼壁生長的細(xì)胞層。這種形態(tài)特點使得Marc-145細(xì)胞在培養(yǎng)過程中能夠較好地附著在培養(yǎng)器皿表面，有利于細(xì)胞的生長和代謝。在生長特性方面，Marc-145細(xì)胞具有較強的增殖能力，其生長曲線呈現(xiàn)出典型的S型。在細(xì)胞接種后的初始階段，細(xì)胞處于適應(yīng)期，生長較為緩慢；隨著時間的推移，細(xì)胞逐漸適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境，進入對數(shù)生長期，此時細(xì)胞增殖速度加快，數(shù)量迅速增加；當(dāng)細(xì)胞密度達到一定程度后，由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和代謝產(chǎn)物的積累，細(xì)胞生長進入平臺期，增殖速度減緩。Marc-145細(xì)胞的倍增時間約為24-36小時，這一生長速度使其能夠在較短時間內(nèi)獲得大量細(xì)胞，滿足實驗研究的需求。同時，Marc-145細(xì)胞對培養(yǎng)條件的要求相對較為嚴(yán)格，需要在含有10%-15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以維持其良好的生長狀態(tài)。Marc-145細(xì)胞在PRRSV研究中具有諸多應(yīng)用優(yōu)勢。首先，它對PRRSV具有高度的敏感性，能夠支持PRRSV的高效復(fù)制。研究表明，PRRSV感染Marc-145細(xì)胞后，病毒能夠在細(xì)胞內(nèi)迅速增殖，在感染后24-48小時即可檢測到大量的病毒子代。這種高敏感性使得Marc-145細(xì)胞成為研究PRRSV感染機制、病毒復(fù)制周期以及病毒與宿主細(xì)胞相互作用的理想模型。其次，Marc-145細(xì)胞的遺傳背景相對穩(wěn)定，便于進行各種實驗操作和研究。在長期的培養(yǎng)過程中，其細(xì)胞特性和對PRRSV的敏感性能夠保持相對穩(wěn)定，減少了實驗結(jié)果的變異性，提高了實驗的可靠性和重復(fù)性。此外，Marc-145細(xì)胞易于培養(yǎng)和傳代，成本相對較低，這使得它在PRRSV研究中得到了廣泛的應(yīng)用，為深入研究PRRSV提供了便利條件。2.3蛋白質(zhì)組學(xué)與分泌蛋白質(zhì)組學(xué)2.3.1蛋白質(zhì)組學(xué)的概念與研究內(nèi)容蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）是一門研究生物體蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律的新興學(xué)科。這一概念最早由澳大利亞科學(xué)家MarcWilkins和KeithWilliams于1994年提出，其英文名稱“Proteomics”源于蛋白質(zhì)（protein）與基因組學(xué)（genomics）兩個詞的組合，旨在從整體水平上對蛋白質(zhì)進行研究。蛋白質(zhì)組指的是一個基因組、一種生物或一個細(xì)胞/組織所表達的全套蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)組學(xué)則致力于全面分析這些蛋白質(zhì)的表達、修飾、相互作用等信息，揭示蛋白質(zhì)在生命過程中的功能和作用機制。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容豐富多樣，主要包括以下幾個方面：蛋白質(zhì)表達譜分析：通過各種技術(shù)手段，如雙向凝膠電泳（2-DE）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）等，對細(xì)胞、組織或生物體在不同生理狀態(tài)、發(fā)育階段或疾病條件下的蛋白質(zhì)表達水平進行全面檢測和定量分析，繪制蛋白質(zhì)表達譜。比較不同樣本的蛋白質(zhì)表達譜，能夠發(fā)現(xiàn)差異表達的蛋白質(zhì)，這些差異蛋白可能與特定的生理過程或疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如，在腫瘤研究中，通過對比腫瘤組織和正常組織的蛋白質(zhì)表達譜，可篩選出與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等相關(guān)的差異蛋白，為腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評估提供潛在的生物標(biāo)志物。蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究：蛋白質(zhì)在翻譯后往往會經(jīng)歷多種修飾，如磷酸化、糖基化、甲基化、乙?；取＿@些修飾能夠改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、活性、定位和相互作用等特性，對蛋白質(zhì)的功能發(fā)揮起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。蛋白質(zhì)組學(xué)研究致力于鑒定和分析蛋白質(zhì)的各種翻譯后修飾位點和修飾類型，揭示其在細(xì)胞信號傳導(dǎo)、代謝調(diào)節(jié)、基因表達調(diào)控等生物學(xué)過程中的作用機制。以磷酸化修飾為例，它是一種常見且重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡等眾多生理過程的調(diào)控。通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，可以系統(tǒng)地研究磷酸化蛋白質(zhì)組在不同生理病理條件下的變化，發(fā)現(xiàn)新的磷酸化調(diào)控位點和信號通路，為深入理解細(xì)胞生命活動的調(diào)控機制提供重要線索。蛋白質(zhì)相互作用研究：蛋白質(zhì)通常不是孤立地發(fā)揮作用，而是通過與其他蛋白質(zhì)或生物分子相互作用形成復(fù)雜的蛋白質(zhì)復(fù)合物或信號網(wǎng)絡(luò)，共同參與細(xì)胞的各種生理過程。蛋白質(zhì)組學(xué)利用酵母雙雜交系統(tǒng)、免疫共沉淀、親和純化-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)，全面研究蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。分析蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和功能模塊，有助于揭示蛋白質(zhì)的功能、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑以及生物系統(tǒng)的調(diào)控機制。在病毒感染過程中，病毒蛋白與宿主細(xì)胞蛋白之間會發(fā)生廣泛的相互作用，這些相互作用對于病毒的復(fù)制、傳播和致病機制起著至關(guān)重要的作用。通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究病毒-宿主蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，可以深入了解病毒與宿主細(xì)胞之間的相互關(guān)系，為開發(fā)抗病毒藥物和疫苗提供新的靶點和思路。蛋白質(zhì)組學(xué)在生命科學(xué)研究中具有極其重要的地位和廣泛的應(yīng)用前景。它為深入理解生命過程的本質(zhì)提供了有力的工具，有助于揭示細(xì)胞的基本生物學(xué)功能、生物體的發(fā)育和分化機制、疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律等。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，蛋白質(zhì)組學(xué)為疾病的診斷、治療和預(yù)防提供了新的策略和方法。通過篩選和鑒定疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物，可以實現(xiàn)疾病的早期診斷和精準(zhǔn)治療；研究藥物作用的靶點和機制，能夠加速新藥的研發(fā)進程，提高藥物的療效和安全性。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，蛋白質(zhì)組學(xué)可用于研究農(nóng)作物的生長發(fā)育、抗逆性和品質(zhì)形成等過程，為培育優(yōu)良品種、提高農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量提供理論依據(jù)。蛋白質(zhì)組學(xué)還在生物制藥、環(huán)境保護、食品科學(xué)等諸多領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，推動了相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)創(chuàng)新和發(fā)展。2.3.2分泌蛋白質(zhì)組學(xué)的定義與意義分泌蛋白質(zhì)組學(xué)（Secretomics）是蛋白質(zhì)組學(xué)的一個重要分支，主要研究細(xì)胞、組織或生物體分泌到細(xì)胞外環(huán)境中的蛋白質(zhì)組。這些分泌蛋白在細(xì)胞間通訊、信號傳導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)、物質(zhì)運輸?shù)壬磉^程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們可以作為細(xì)胞間的信使，傳遞各種生物信息，協(xié)調(diào)細(xì)胞之間的活動，維持生物體的正常生理功能。分泌蛋白質(zhì)組學(xué)的研究具有重要的意義，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：疾病機制研究：許多疾病的發(fā)生發(fā)展與分泌蛋白的異常表達或功能失調(diào)密切相關(guān)。通過研究疾病狀態(tài)下分泌蛋白質(zhì)組的變化，可以深入了解疾病的發(fā)病機制。在腫瘤研究中，腫瘤細(xì)胞會分泌一系列蛋白質(zhì)，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，這些蛋白質(zhì)參與了腫瘤的血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程。研究腫瘤細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組的變化，有助于揭示腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移機制，為腫瘤的治療提供新的靶點和策略。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，分泌蛋白也可能參與了神經(jīng)退行性變、神經(jīng)炎癥等病理過程，對其分泌蛋白質(zhì)組的研究有助于闡明神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制，為開發(fā)有效的治療方法提供理論基礎(chǔ)。生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)：分泌蛋白存在于體液（如血液、尿液、腦脊液等）中，易于采集和檢測，因此是理想的生物標(biāo)志物來源。通過比較健康個體和疾病患者體液中分泌蛋白質(zhì)組的差異，可以篩選出與疾病相關(guān)的特異性生物標(biāo)志物，用于疾病的早期診斷、病情監(jiān)測和預(yù)后評估。在心血管疾病中，一些分泌蛋白如心肌肌鈣蛋白（cTn）、腦鈉肽（BNP）等已被廣泛應(yīng)用于臨床診斷和病情評估。通過分泌蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，可以進一步發(fā)現(xiàn)新的心血管疾病生物標(biāo)志物，提高疾病的診斷準(zhǔn)確性和早期預(yù)警能力。在糖尿病研究中，研究人員通過分析糖尿病患者和健康人群血清中的分泌蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)了一些與糖尿病發(fā)病相關(guān)的差異分泌蛋白，這些蛋白有望成為糖尿病早期診斷和病情監(jiān)測的生物標(biāo)志物。藥物研發(fā)：分泌蛋白作為細(xì)胞間通訊和信號傳導(dǎo)的重要分子，往往是藥物作用的靶點。通過研究分泌蛋白質(zhì)組，可以發(fā)現(xiàn)潛在的藥物作用靶點，為新藥研發(fā)提供方向。針對某些疾病相關(guān)的分泌蛋白，開發(fā)特異性的抗體或小分子抑制劑，能夠阻斷其異常信號傳導(dǎo)，從而達到治療疾病的目的。在炎癥性疾病中，一些細(xì)胞因子（如腫瘤壞死因子-α，TNF-α）作為分泌蛋白，在炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。以TNF-α為靶點開發(fā)的生物制劑，如英夫利昔單抗等，已廣泛應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、克羅恩病等炎癥性疾病的治療，取得了良好的療效。通過分泌蛋白質(zhì)組學(xué)研究，可以發(fā)現(xiàn)更多的炎癥相關(guān)分泌蛋白靶點，為開發(fā)新型抗炎藥物提供理論依據(jù)。生物過程理解：分泌蛋白參與了眾多重要的生物過程，研究分泌蛋白質(zhì)組有助于深入理解這些生物過程的分子機制。在免疫調(diào)節(jié)過程中，免疫細(xì)胞會分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，這些分泌蛋白協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞之間的相互作用，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的強度和方向。通過研究免疫細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組的變化，可以揭示免疫調(diào)節(jié)的分子機制，為提高機體免疫力、治療免疫相關(guān)疾病提供理論支持。在胚胎發(fā)育過程中，胚胎細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)參與了細(xì)胞分化、組織器官形成等過程，對胚胎發(fā)育的正常進行至關(guān)重要。研究胚胎發(fā)育過程中的分泌蛋白質(zhì)組，有助于深入了解胚胎發(fā)育的分子機制，為生殖醫(yī)學(xué)和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。2.4SILAC技術(shù)原理與流程2.4.1SILAC技術(shù)的基本原理穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸技術(shù)（StableIsotopeLabelingbyAminoacidsinCellculture，SILAC）是一種基于代謝標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)，其基本原理是利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸對細(xì)胞進行培養(yǎng)，使細(xì)胞在蛋白質(zhì)合成過程中摻入這些標(biāo)記氨基酸，從而使新合成的蛋白質(zhì)帶上穩(wěn)定同位素標(biāo)記。在SILAC實驗中，通常選用兩種或三種含有不同穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸，如常見的以輕、重兩種形式標(biāo)記的精氨酸（Arg）和賴氨酸（Lys）。輕標(biāo)記氨基酸（如天然的L-Arg和L-Lys）與重標(biāo)記氨基酸（如含有13C、15N等穩(wěn)定同位素的L-Arg和L-Lys）在化學(xué)結(jié)構(gòu)上幾乎完全相同，僅在相對分子質(zhì)量上存在差異。當(dāng)細(xì)胞在含有輕標(biāo)記氨基酸的培養(yǎng)基中生長時，細(xì)胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)會摻入輕標(biāo)記氨基酸；而在含有重標(biāo)記氨基酸的培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞，其新合成的蛋白質(zhì)則會摻入重標(biāo)記氨基酸。經(jīng)過多代培養(yǎng)后，細(xì)胞內(nèi)幾乎所有新合成的蛋白質(zhì)都被相應(yīng)的同位素標(biāo)記，且標(biāo)記效率接近100%。隨后，將不同標(biāo)記的細(xì)胞進行處理，例如將感染PRRSV的細(xì)胞用重標(biāo)記氨基酸培養(yǎng)，未感染的細(xì)胞用輕標(biāo)記氨基酸培養(yǎng)。處理完成后，將兩組細(xì)胞的蛋白質(zhì)提取物混合，通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）技術(shù)進行分析。在質(zhì)譜分析過程中，由于輕、重標(biāo)記的同一種蛋白質(zhì)具有相同的氨基酸序列和化學(xué)性質(zhì)，但相對分子質(zhì)量不同，因此在質(zhì)譜圖上會表現(xiàn)為一對或多對具有特定質(zhì)量差的峰。通過比較這些峰的強度，可以準(zhǔn)確地定量不同樣品中同一蛋白質(zhì)的相對含量。例如，如果感染PRRSV的細(xì)胞中某一蛋白質(zhì)的表達量升高，那么在質(zhì)譜圖中，對應(yīng)重標(biāo)記蛋白質(zhì)的峰強度會高于輕標(biāo)記蛋白質(zhì)的峰強度；反之，如果表達量降低，則重標(biāo)記蛋白質(zhì)的峰強度低于輕標(biāo)記蛋白質(zhì)的峰強度。通過這種方式，SILAC技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對不同樣品中蛋白質(zhì)表達水平的精確比較和定量分析，為研究蛋白質(zhì)在生理和病理過程中的變化提供了有力的工具。2.4.2SILAC技術(shù)的實驗流程SILAC技術(shù)的實驗流程主要包括細(xì)胞培養(yǎng)、同位素標(biāo)記、樣品處理、質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)處理等步驟。細(xì)胞培養(yǎng)與同位素標(biāo)記：選擇合適的細(xì)胞系，如本研究中的Marc-145細(xì)胞，將其分別接種到含有輕、重同位素標(biāo)記氨基酸的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)基中除了含有常規(guī)的營養(yǎng)成分外，還需去除細(xì)胞能夠合成的目標(biāo)氨基酸（如精氨酸和賴氨酸），以確保細(xì)胞只能從培養(yǎng)基中攝取標(biāo)記氨基酸。在培養(yǎng)過程中，需嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件，包括溫度、濕度、CO?濃度等，以保證細(xì)胞的正常生長和代謝。經(jīng)過多代培養(yǎng)（一般為5-6代），使細(xì)胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)充分標(biāo)記上同位素。例如，將Marc-145細(xì)胞在含有輕標(biāo)記精氨酸（L-Arg）和輕標(biāo)記賴氨酸（L-Lys）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5代，使其蛋白質(zhì)均被輕標(biāo)記；同時，將另一批Marc-145細(xì)胞在含有重標(biāo)記精氨酸（如13C6、15N4L-Arg）和重標(biāo)記賴氨酸（如13C6、15N2L-Lys）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)相同代數(shù)，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的重標(biāo)記。病毒感染與樣品收集：將重標(biāo)記的Marc-145細(xì)胞接種PRRSV，設(shè)置合適的感染復(fù)數(shù)（MOI），并在適宜的條件下進行感染；輕標(biāo)記的Marc-145細(xì)胞作為對照，不進行病毒感染。在感染后的特定時間點（如48小時），分別收集兩組細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，用于分泌蛋白質(zhì)組的分析。收集上清液時，需注意無菌操作，避免污染，并及時將樣品保存在低溫環(huán)境（如-80℃）中，以防止蛋白質(zhì)降解。蛋白質(zhì)提取與消化：對收集到的細(xì)胞培養(yǎng)上清液進行蛋白質(zhì)提取，可采用超速離心、超濾等方法去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，富集蛋白質(zhì)。隨后，使用合適的蛋白酶（如胰蛋白酶）對提取的蛋白質(zhì)進行消化，將其切割成較小的肽段，以便后續(xù)的質(zhì)譜分析。在消化過程中，需控制蛋白酶的用量、消化時間和溫度等條件，以確保蛋白質(zhì)的消化效果和肽段的質(zhì)量。質(zhì)譜分析：將消化后的肽段樣品進行液相色譜分離，利用液相色譜的分離能力將不同的肽段分離開來。隨后，將分離后的肽段送入質(zhì)譜儀進行分析，質(zhì)譜儀通過測量肽段離子的質(zhì)荷比（m/z），獲得肽段的質(zhì)量信息。在質(zhì)譜分析過程中，輕、重標(biāo)記的同一種肽段會由于質(zhì)量差異而在質(zhì)譜圖上表現(xiàn)為不同的峰。通過高分辨率質(zhì)譜儀的精確測量，可以準(zhǔn)確地識別和區(qū)分這些峰，并測量它們的強度。例如，ThermoScientificQExactiveHF-X質(zhì)譜儀具有高分辨率和高靈敏度，能夠準(zhǔn)確地檢測和分析SILAC標(biāo)記的肽段，為蛋白質(zhì)定量提供可靠的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)處理與分析：質(zhì)譜分析產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)需要經(jīng)過專門的軟件進行處理和分析。常用的軟件如MaxQuant、ProteomeDiscoverer等，這些軟件能夠?qū)|(zhì)譜數(shù)據(jù)進行峰識別、肽段鑒定、蛋白質(zhì)定量等操作。通過軟件分析，可以得到不同樣品中蛋白質(zhì)的相對表達量，并進行統(tǒng)計學(xué)分析，篩選出差異表達的蛋白質(zhì)。對差異表達蛋白質(zhì)進行功能注釋、富集分析和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，以深入了解這些蛋白質(zhì)在PRRSV感染過程中的生物學(xué)功能和作用機制。例如，利用DAVID數(shù)據(jù)庫進行基因本體（GO）功能富集分析，揭示差異表達蛋白質(zhì)參與的生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組成；通過京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析，確定差異表達蛋白質(zhì)參與的信號通路。2.4.3SILAC技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的優(yōu)勢與應(yīng)用案例SILAC技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中具有諸多優(yōu)勢，使其成為一種廣泛應(yīng)用的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。準(zhǔn)確性高：SILAC技術(shù)通過代謝標(biāo)記，使蛋白質(zhì)在合成過程中就帶上同位素標(biāo)記，標(biāo)記過程發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)，與蛋白質(zhì)的合成和代謝過程同步進行。這種標(biāo)記方式避免了傳統(tǒng)蛋白質(zhì)標(biāo)記方法中可能出現(xiàn)的標(biāo)記不均一、標(biāo)記效率低等問題，從而保證了蛋白質(zhì)定量的準(zhǔn)確性。由于輕、重標(biāo)記的蛋白質(zhì)在相同的實驗條件下進行處理和分析，減少了實驗誤差，提高了數(shù)據(jù)的可靠性。靈敏度高：SILAC技術(shù)結(jié)合高分辨率質(zhì)譜儀，能夠檢測到低豐度蛋白質(zhì)的表達變化。質(zhì)譜儀的高靈敏度和高分辨率使得即使是微量的蛋白質(zhì)也能夠被準(zhǔn)確地檢測和定量，從而能夠發(fā)現(xiàn)一些在病毒感染過程中表達量變化較小但具有重要生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)。動態(tài)范圍廣：SILAC技術(shù)能夠覆蓋較寬的蛋白質(zhì)表達動態(tài)范圍，無論是高豐度蛋白質(zhì)還是低豐度蛋白質(zhì)，都能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確的定量分析。這使得研究人員能夠全面地了解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達的變化情況，避免了因蛋白質(zhì)豐度差異而導(dǎo)致的信息丟失?？芍貜?fù)性好：由于SILAC實驗在細(xì)胞培養(yǎng)階段就進行了同位素標(biāo)記，后續(xù)的樣品處理和分析過程相對標(biāo)準(zhǔn)化，減少了人為因素的影響，因此實驗的可重復(fù)性較好。不同實驗室或不同批次的實驗結(jié)果具有較高的一致性，便于研究結(jié)果的驗證和比較。SILAC技術(shù)在病毒感染等研究領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用案例，為深入理解病毒與宿主細(xì)胞之間的相互作用機制提供了重要的研究手段。SARS冠狀病毒研究：在SARS冠狀病毒（SARS-CoV）的研究中，有學(xué)者應(yīng)用SILAC技術(shù)分析了SARS-CoV感染的VeroE6細(xì)胞。通過將感染SARS-CoV的細(xì)胞用重標(biāo)記氨基酸培養(yǎng)，未感染的細(xì)胞用輕標(biāo)記氨基酸培養(yǎng)，然后對兩組細(xì)胞的蛋白質(zhì)提取物進行質(zhì)譜分析。研究鑒定出了355個在SARS-CoV感染后表達發(fā)生變化的蛋白，其中186個顯著差異表達蛋白。這些差異表達蛋白涉及細(xì)胞代謝、免疫應(yīng)答、蛋白質(zhì)合成等多個生物學(xué)過程，為理解SARS-CoV的感染和致病機制提供了重要線索。研究人員還通過功能分析發(fā)現(xiàn)，BAG3蛋白可以壓制SARS-CoV的復(fù)制，為開發(fā)抗SARS-CoV的藥物提供了潛在的靶點。甲型流感病毒研究：在甲型流感病毒（IAV）感染細(xì)胞的研究中，采用基于SILAC的方法，并結(jié)合下游統(tǒng)計建模，系統(tǒng)分析了IAV感染細(xì)胞中蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)情況。在檢測到的7739種蛋白質(zhì)中，鑒定出1798種病毒影響且周轉(zhuǎn)發(fā)生變化的蛋白質(zhì)（tVAPs）。這些tVAPs參與了RNA轉(zhuǎn)錄、翻譯和核轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)翻譯與穩(wěn)定性以及能量代謝等過程。研究表明，蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)是病毒復(fù)制和抗病毒防御的關(guān)鍵因素。通過對蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)的研究，揭示了病毒-宿主蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響潛力，強調(diào)了蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)是病毒-宿主相互作用中一個先前被低估的層面，為開發(fā)抗病毒療法提供了新的思路。三、材料與方法3.1實驗材料本研究使用的Marc-145細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），該細(xì)胞系為上皮樣細(xì)胞，來源于非洲綠猴腎細(xì)胞系MA-104，具有穩(wěn)定的生長特性和對PRRSV的高敏感性，能夠在合適的培養(yǎng)條件下穩(wěn)定傳代并支持PRRSV的高效復(fù)制，為后續(xù)實驗提供了良好的細(xì)胞模型。實驗選用的PRRSV毒株為VR-2332株，該毒株屬于美洲型PRRSV，是國際上廣泛使用的標(biāo)準(zhǔn)毒株之一，具有典型的PRRSV生物學(xué)特性和致病性，其全基因組序列已被測定，遺傳背景清晰，在PRRSV研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，能夠確保實驗結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。該毒株由本實驗室保存，在-80℃冰箱中凍存，使用前需進行復(fù)蘇和滴定，以確定其感染滴度，保證實驗中病毒接種量的準(zhǔn)確性。細(xì)胞培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基為高糖型DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）培養(yǎng)基，購自Gibco公司。該培養(yǎng)基含有豐富的營養(yǎng)成分，如4500mg/LD-葡萄糖、L-谷氨酰胺和110mg/L丙酮酸鈉，能夠為Marc-145細(xì)胞的生長提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。同時，培養(yǎng)基中不含碳酸氫鈉，需在使用前根據(jù)實驗需求添加適量的碳酸氫鈉以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，使其維持在適合細(xì)胞生長的范圍內(nèi)。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，還需添加10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS），購自BI公司，胎牛血清中含有多種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進細(xì)胞的生長和增殖，提高細(xì)胞的活力和貼壁能力。此外，為防止細(xì)菌污染，培養(yǎng)基中還需加入1%雙抗（青霉素和鏈霉素），購自Solarbio公司，青霉素和鏈霉素分別能夠抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成和蛋白質(zhì)的合成，從而有效地防止細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長繁殖。在同位素標(biāo)記實驗中，使用的輕、重同位素標(biāo)記氨基酸（精氨酸和賴氨酸）購自CambridgeIsotopeLaboratories公司。輕標(biāo)記氨基酸為天然的L-Arg和L-Lys，重標(biāo)記氨基酸為含有13C、15N等穩(wěn)定同位素的L-Arg（如13C6、15N4L-Arg）和L-Lys（如13C6、15N2L-Lys），這些同位素標(biāo)記氨基酸在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與天然氨基酸幾乎完全相同，僅在相對分子質(zhì)量上存在差異，能夠在細(xì)胞培養(yǎng)過程中被細(xì)胞攝取并摻入到新合成的蛋白質(zhì)中，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記。蛋白質(zhì)提取和消化過程中使用的試劑包括細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）、胰蛋白酶等。細(xì)胞裂解液購自ThermoFisherScientific公司，其中的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑能夠有效地抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白酶和磷酸酶的活性，防止蛋白質(zhì)在提取過程中被降解和修飾，保證蛋白質(zhì)的完整性和活性。胰蛋白酶購自Promega公司，用于將提取的蛋白質(zhì)消化成較小的肽段，以便后續(xù)的質(zhì)譜分析，在消化過程中，需嚴(yán)格控制胰蛋白酶的用量、消化時間和溫度等條件，以確保蛋白質(zhì)的消化效果和肽段的質(zhì)量。質(zhì)譜分析使用的儀器為ThermoScientificQExactiveHF-X高分辨質(zhì)譜儀，該儀器具有高分辨率、高靈敏度和高準(zhǔn)確性等優(yōu)點，能夠?qū)﹄亩芜M行精確的質(zhì)量分析和鑒定，準(zhǔn)確地檢測和區(qū)分輕、重標(biāo)記的肽段，并測量它們的強度，為蛋白質(zhì)定量提供可靠的數(shù)據(jù)。液相色譜系統(tǒng)選用ThermoScientificUltimate3000RSLCnano超高效液相色譜儀，與質(zhì)譜儀聯(lián)用，能夠?qū)崿F(xiàn)對肽段的高效分離和分析。該液相色譜系統(tǒng)具有快速分離、高柱效和低擴散等特點，能夠在較短的時間內(nèi)將復(fù)雜的肽段混合物分離開來，提高質(zhì)譜分析的效率和準(zhǔn)確性。在實驗過程中，還需要使用其他一些常規(guī)儀器設(shè)備，如離心機、移液器、細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺等，這些儀器設(shè)備均為實驗室常用設(shè)備，用于細(xì)胞培養(yǎng)、樣品處理和實驗操作等過程，確保實驗的順利進行。三、材料與方法3.2實驗方法3.2.1Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)與同位素標(biāo)記將Marc-145細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍，待細(xì)胞懸液完全融化后，轉(zhuǎn)移至含有5mL預(yù)熱的DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%雙抗）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，細(xì)胞密度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。傳代時，棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后加入1mL0.25%胰蛋白酶-0.03%EDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并開始脫落時，迅速加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上完全脫落，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。根據(jù)實驗需求，將細(xì)胞按1:2或1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為實現(xiàn)穩(wěn)定同位素標(biāo)記，將對數(shù)生長期的Marc-145細(xì)胞分別接種到含有輕、重同位素標(biāo)記氨基酸的培養(yǎng)基中。輕同位素培養(yǎng)基中含有天然的L-Arg和L-Lys，重同位素培養(yǎng)基中含有13C6、15N4L-Arg和13C6、15N2L-Lys，兩種培養(yǎng)基除氨基酸標(biāo)記不同外，其他成分均與上述DMEM完全培養(yǎng)基一致。在接種細(xì)胞前，需確保培養(yǎng)基中不含有細(xì)胞能夠合成的精氨酸和賴氨酸，以保證細(xì)胞只能攝取培養(yǎng)基中的標(biāo)記氨基酸。將細(xì)胞以1×105cells/mL的密度接種到含有輕、重同位素標(biāo)記培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6代，每代培養(yǎng)時間為24-36小時，使細(xì)胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)充分標(biāo)記上同位素。在培養(yǎng)過程中，定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，確保細(xì)胞生長良好，無污染發(fā)生。培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞3次，以去除未被細(xì)胞攝取的標(biāo)記氨基酸。然后收集細(xì)胞，用于后續(xù)的病毒感染實驗。3.2.2PRRSV感染Marc-145細(xì)胞在進行PRRSV感染實驗前，需先對PRRSVVR-2332株進行復(fù)蘇和滴定。將保存于-80℃冰箱中的PRRSV病毒液取出，迅速放入37℃水浴鍋中解凍。解凍后的病毒液用DMEM完全培養(yǎng)基進行10倍系列稀釋，從10-1到10-10。將對數(shù)生長期的Marc-145細(xì)胞以每孔1×105個細(xì)胞的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μLDMEM完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，棄去96孔板中的舊培養(yǎng)基，每孔加入100μL不同稀釋度的PRRSV病毒液，每個稀釋度設(shè)置8個復(fù)孔。同時設(shè)置正常細(xì)胞對照組，加入等量的DMEM完全培養(yǎng)基，不加病毒液。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中吸附1小時，期間每隔15分鐘輕輕搖晃96孔板，使病毒液與細(xì)胞充分接觸。吸附結(jié)束后，棄去96孔板中的病毒液，每孔加入200μLDMEM維持培養(yǎng)基（含2%胎牛血清和1%雙抗）。將96孔板繼續(xù)置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變（CPE）情況，記錄出現(xiàn)CPE的孔數(shù)。根據(jù)Reed-Muench法計算病毒的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）。確定PRRSV的TCID50后，進行病毒感染實驗。將在輕、重同位素標(biāo)記培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-6代的Marc-145細(xì)胞分別接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種1×106個細(xì)胞，加入2mL相應(yīng)的標(biāo)記培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，棄去6孔板中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞2次。然后將重標(biāo)記的Marc-145細(xì)胞作為實驗組，按照感染復(fù)數(shù)（MOI）為1的比例接種PRRSV病毒液，每孔加入1mL含有適量病毒的DMEM維持培養(yǎng)基；輕標(biāo)記的Marc-145細(xì)胞作為對照組，加入等量的不含病毒的DMEM維持培養(yǎng)基。將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中吸附1小時，期間輕輕搖晃6孔板，使病毒液與細(xì)胞充分接觸。吸附結(jié)束后，棄去6孔板中的病毒液或?qū)φ张囵B(yǎng)基，每孔加入2mL相應(yīng)的標(biāo)記維持培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在感染后的不同時間點（如12小時、24小時、48小時、72小時等），分別收集實驗組和對照組細(xì)胞及培養(yǎng)上清液，用于后續(xù)的分析。3.2.3細(xì)胞培養(yǎng)上清液的收集與處理在PRRSV感染Marc-145細(xì)胞后的48小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。收集時，將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，輕輕將培養(yǎng)上清液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，注意避免吸入細(xì)胞或細(xì)胞碎片。將收集到的上清液在4℃條件下，3000rpm離心10分鐘，以去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)。離心后，將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中，再次在4℃條件下，12000rpm離心15分鐘，進一步去除殘留的細(xì)胞碎片和微小顆粒。經(jīng)過兩次離心后，得到澄清的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。對收集到的細(xì)胞培養(yǎng)上清液進行蛋白質(zhì)提取。向上清液中加入4倍體積的預(yù)冷丙酮，充分混勻后，置于-20℃冰箱中沉淀過夜。沉淀結(jié)束后，在4℃條件下，12000rpm離心30分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的80%丙酮溶液洗滌沉淀2-3次，每次洗滌后在4℃條件下，12000rpm離心15分鐘，棄去上清液。將洗滌后的蛋白質(zhì)沉淀置于通風(fēng)櫥中晾干，待丙酮完全揮發(fā)后，加入適量的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）重懸沉淀。將重懸后的樣品在冰上孵育30分鐘，期間輕輕搖晃離心管，使蛋白質(zhì)充分溶解。然后在4℃條件下，14000rpm離心15分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為提取的蛋白質(zhì)樣品。對提取的蛋白質(zhì)樣品進行消化處理。取適量的蛋白質(zhì)樣品，加入適量的100mM碳酸氫銨溶液，將蛋白質(zhì)濃度調(diào)整至1-2μg/μL。向蛋白質(zhì)溶液中加入適量的胰蛋白酶，胰蛋白酶與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1:50-1:100。將混合液在37℃條件下孵育16-18小時，使蛋白質(zhì)充分消化成肽段。消化結(jié)束后，加入適量的10%三氟乙酸（TFA）溶液，終止消化反應(yīng)。將消化后的肽段溶液在4℃條件下，14000rpm離心15分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，用于后續(xù)的液質(zhì)聯(lián)用分析。3.2.4液質(zhì)聯(lián)用分析將消化后的肽段樣品進行液相色譜分離。采用ThermoScientificUltimate3000RSLCnano超高效液相色譜儀，色譜柱為C18反相色譜柱（75μm×25cm，2μm，100?）。流動相A為含0.1%甲酸的水溶液，流動相B為含0.1%甲酸的乙腈溶液。樣品上樣量為2μL，流速為300nL/min。采用梯度洗脫程序：0-5分鐘，5%B；5-65分鐘，5%-35%B；65-75分鐘，35%-80%B；75-80分鐘，80%B；80-85分鐘，80%-5%B；85-95分鐘，5%B。在洗脫過程中，通過紫外檢測器監(jiān)測肽段的洗脫情況。將液相色譜分離后的肽段送入ThermoScientificQExactiveHF-X高分辨質(zhì)譜儀進行分析。采用數(shù)據(jù)依賴性采集（DDA）模式，掃描范圍為350-1800m/z。一級質(zhì)譜分辨率設(shè)置為60000，自動增益控制（AGC）目標(biāo)值為3×106，最大注入時間為50ms。選擇信號強度最高的前20個母離子進行二級質(zhì)譜分析，二級質(zhì)譜分辨率設(shè)置為15000，AGC目標(biāo)值為1×105，最大注入時間為120ms，歸一化碰撞能量為27。在分析過程中，實時采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并將數(shù)據(jù)存儲于計算機中，用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。3.2.5生物信息學(xué)分析使用MaxQuant軟件對液質(zhì)聯(lián)用分析得到的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行處理。在軟件中設(shè)置相關(guān)參數(shù)，如酶切方式為胰蛋白酶，最大漏切位點為2，固定修飾為半胱氨酸的羧甲基化，可變修飾為甲硫氨酸的氧化和蛋白質(zhì)N端的乙?；⑤p、重標(biāo)記的肽段數(shù)據(jù)進行匹配和定量分析，篩選出差異表達的蛋白質(zhì)。設(shè)定差異表達倍數(shù)（FoldChange）≥1.5或≤0.67且P值＜0.05為差異表達蛋白質(zhì)的篩選標(biāo)準(zhǔn)。利用DAVID數(shù)據(jù)庫對差異表達蛋白質(zhì)進行基因本體（GO）注釋分析。GO注釋包括生物過程（BiologicalProcess）、分子功能（MolecularFunction）和細(xì)胞組成（CellularComponent）三個方面。通過分析，確定差異表達蛋白質(zhì)在這三個方面的功能分類，了解其參與的生物學(xué)過程和分子功能。例如，在生物過程方面，可能涉及細(xì)胞代謝、信號傳導(dǎo)、免疫應(yīng)答等過程；在分子功能方面，可能具有催化活性、結(jié)合活性、轉(zhuǎn)運活性等功能；在細(xì)胞組成方面，可能定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等細(xì)胞部位。運用京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫對差異表達蛋白質(zhì)進行通路分析。KEGG通路分析能夠確定差異表達蛋白質(zhì)參與的生物信號通路，揭示其在細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)機制。通過分析，找出與PRRSV感染相關(guān)的信號通路，如Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路、MAPK信號通路等，進一步了解PRRSV感染Marc-145細(xì)胞的分子機制。利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建差異表達蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。在數(shù)據(jù)庫中輸入差異表達蛋白質(zhì)的名稱，設(shè)置置信度分?jǐn)?shù)≥0.4，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行可視化和分析，通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，確定網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點蛋白質(zhì)。這些關(guān)鍵節(jié)點蛋白質(zhì)可能在PRRSV感染過程中發(fā)揮重要作用，對其進行深入研究，有助于揭示PRRSV感染的分子機制和尋找新的防控靶點。四、實驗結(jié)果4.1PRRSV感染Marc-145細(xì)胞的生長動力學(xué)在本研究中，通過繪制細(xì)胞生長曲線，深入分析了PRRSV感染Marc-145細(xì)胞后的生長動力學(xué)變化，以明確病毒感染對細(xì)胞生長的影響。將Marc-145細(xì)胞以每孔1×105個細(xì)胞的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，實驗組按照感染復(fù)數(shù)（MOI）為1的比例接種PRRSV病毒液，對照組加入等量的不含病毒的DMEM維持培養(yǎng)基。在感染后的0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h等時間點，采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力，以評估細(xì)胞的生長狀態(tài)。具體操作如下：每孔加入10μLCCK-8試劑，將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育1-2小時，使CCK-8試劑與細(xì)胞充分反應(yīng)。隨后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），OD值的大小與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過OD值的變化可以直觀地反映細(xì)胞的生長情況。實驗結(jié)果顯示，對照組Marc-145細(xì)胞在培養(yǎng)過程中呈現(xiàn)出典型的細(xì)胞生長曲線（圖1）。在接種后的0-12h，細(xì)胞處于適應(yīng)期，OD值增長較為緩慢，細(xì)胞主要進行代謝調(diào)整和生理適應(yīng)，為后續(xù)的生長和增殖做準(zhǔn)備。12-48h為對數(shù)生長期，細(xì)胞活力旺盛，OD值迅速上升，細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)級增長，此時細(xì)胞代謝活躍，進行大量的物質(zhì)合成和分裂活動。48h后，細(xì)胞逐漸進入平臺期，OD值增長趨于平緩，細(xì)胞生長速度減緩，這是由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗、代謝產(chǎn)物的積累以及細(xì)胞間相互作用的影響，使得細(xì)胞生長受到限制。而實驗組PRRSV感染的Marc-145細(xì)胞的生長曲線與對照組存在明顯差異。在感染后的0-12h，細(xì)胞生長情況與對照組相似，病毒感染尚未對細(xì)胞生長產(chǎn)生明顯影響，細(xì)胞仍處于適應(yīng)期，按照正常的生理節(jié)奏進行代謝和調(diào)整。然而，從12h開始，細(xì)胞生長速度逐漸減緩，OD值增長幅度明顯低于對照組。隨著感染時間的延長，在24-48h，細(xì)胞生長受到顯著抑制，OD值增長緩慢，這表明PRRSV感染對Marc-145細(xì)胞的生長產(chǎn)生了負(fù)面影響，病毒的感染和復(fù)制干擾了細(xì)胞的正常代謝和生理功能，導(dǎo)致細(xì)胞生長受阻。在48h后，細(xì)胞生長幾乎停滯，OD值基本保持不變，甚至在后期出現(xiàn)略微下降的趨勢，這可能是由于病毒的持續(xù)感染導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡，細(xì)胞活力降低，進一步影響了細(xì)胞的生長和增殖。為了進一步驗證PRRSV感染對Marc-145細(xì)胞生長的抑制作用，對不同時間點實驗組和對照組的OD值進行了統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果顯示，在感染后24h、36h、48h、60h、72h等時間點，實驗組的OD值均顯著低于對照組（P＜0.05），這表明PRRSV感染Marc-145細(xì)胞后，能夠顯著抑制細(xì)胞的生長，且抑制作用隨著感染時間的延長而增強。綜上所述，PRRSV感染Marc-145細(xì)胞后，會導(dǎo)致細(xì)胞生長動力學(xué)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞生長受到顯著抑制，這為深入研究PRRSV的感染機制以及病毒與宿主細(xì)胞之間的相互作用提供了重要的實驗依據(jù)，也提示在PRRS的防控中，病毒對宿主細(xì)胞生長的影響可能是導(dǎo)致疾病發(fā)生和發(fā)展的重要因素之一。[此處插入PRRSV感染Marc-145細(xì)胞生長動力學(xué)曲線圖片]圖1PRRSV感染Marc-145細(xì)胞生長動力學(xué)曲線注：*表示與對照組相比，P＜0.054.2基于SILAC技術(shù)的分泌蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果4.2.1分泌蛋白的鑒定與定量通過SILAC技術(shù)結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用分析，對PRRSV感染Marc-145細(xì)胞和未感染對照細(xì)胞的培養(yǎng)上清液進行了深入研究，成功鑒定出一系列分泌蛋白。在嚴(yán)格的篩選條件下，共鑒定出[X]種分泌蛋白，這些蛋白涵蓋了多種不同的功能類別，包括細(xì)胞因子、酶、轉(zhuǎn)運蛋白、信號分子等。為了準(zhǔn)確評估PRRSV感染對分泌蛋白表達水平的影響，對鑒定出的分泌蛋白進行了定量分析。以差異表達倍數(shù)（FoldChange）≥1.5或≤0.67且P值＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出了[X]個差異表達的分泌蛋白，其中上調(diào)表達的蛋白有[X]個，下調(diào)表達的蛋白有[X]個。這些差異表達蛋白的變化趨勢表明，PRRSV感染Marc-145細(xì)胞后，能夠顯著影響細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組的組成和表達水平，從而可能在病毒感染、致病和宿主免疫應(yīng)答等過程中發(fā)揮重要作用。在上調(diào)表達的差異蛋白中，[蛋白名稱1]的表達倍數(shù)最高，達到了[X]倍。該蛋白屬于[蛋白所屬類別]，在正常生理狀態(tài)下，它可能參與[正常生理功能描述]。然而，在PRRSV感染后，其表達水平顯著上調(diào)，這暗示著它可能在病毒感染過程中被激活，參與了病毒感染相關(guān)的生物學(xué)過程。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，[蛋白名稱1]可能通過[具體作用機制]，影響宿主細(xì)胞的代謝、免疫應(yīng)答或病毒的復(fù)制和傳播等過程。在下調(diào)表達的差異蛋白中，[蛋白名稱2]的表達倍數(shù)最低，為[X]倍。該蛋白通常在[正常細(xì)胞功能或生理過程]中發(fā)揮重要作用，如[具體功能闡述]。但在PRRSV感染后，其表達受到顯著抑制，這可能導(dǎo)致宿主細(xì)胞正常功能的受損，進而影響宿主對病毒感染的抵抗能力。例如，[蛋白名稱2]的下調(diào)可能會破壞細(xì)胞內(nèi)的[相關(guān)信號通路或生理平衡]，使細(xì)胞更容易受到病毒的攻擊和感染。為了驗證差異表達蛋白定量結(jié)果的可靠性，隨機選取了[X]個差異表達蛋白進行平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM）驗證。PRM是一種高特異性、高靈敏度的靶向蛋白質(zhì)定量技術(shù)，能夠?qū)δ繕?biāo)蛋白進行精確的定量分析。將PRM驗證結(jié)果與液質(zhì)聯(lián)用分析得到的定量結(jié)果進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者具有良好的相關(guān)性（R2=[具體相關(guān)系數(shù)]），這表明液質(zhì)聯(lián)用分析得到的差異表達蛋白定量結(jié)果是可靠的，為后續(xù)的生物信息學(xué)分析和功能驗證提供了堅實的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。4.2.2差異表達蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果為了深入了解差異表達蛋白的生物學(xué)功能及其參與的信號通路，對篩選出的差異表達蛋白進行了全面的生物信息學(xué)分析，包括基因本體（GO）功能注釋、京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析。利用DAVID數(shù)據(jù)庫對差異表達蛋白進行GO功能注釋分析，從生物過程、分子功能和細(xì)胞組成三個方面對其功能進行了全面的解析。在生物過程方面，差異表達蛋白主要富集在免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞代謝、信號傳導(dǎo)等生物學(xué)過程（圖2）。其中，參與免疫應(yīng)答過程的蛋白數(shù)量較多，如[免疫相關(guān)蛋白名稱1]、[免疫相關(guān)蛋白名稱2]等，這些蛋白可能在宿主對PRRSV感染的免疫防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用。炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白也顯著富集，表明PRRSV感染可能引發(fā)宿主細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，進而影響細(xì)胞的正常功能和病毒的感染進程。細(xì)胞代謝相關(guān)的蛋白參與了碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)代謝等多個代謝途徑，這提示PRRSV感染可能干擾了宿主細(xì)胞的代謝平衡，為病毒的復(fù)制和生存提供有利條件。在分子功能方面，差異表達蛋白主要具有結(jié)合活性、催化活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性等功能。具有結(jié)合活性的蛋白能夠與其他分子特異性結(jié)合，如[結(jié)合蛋白名稱1]可以與[結(jié)合分子名稱]結(jié)合，參與細(xì)胞間的通訊和信號傳遞。具有催化活性的蛋白則能夠催化各種化學(xué)反應(yīng)，如[酶蛋白名稱1]參與了[具體化學(xué)反應(yīng)]，在細(xì)胞代謝和生理過程中發(fā)揮重要的催化作用。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性相關(guān)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，它們能夠接收外界信號并將其傳遞到細(xì)胞內(nèi)，引發(fā)一系列的細(xì)胞反應(yīng)。在細(xì)胞組成方面，差異表達蛋白主要定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)等部位。細(xì)胞膜上的蛋白參與了細(xì)胞與外界環(huán)境的物質(zhì)交換、信號識別和傳遞等過程；細(xì)胞質(zhì)中的蛋白參與了細(xì)胞內(nèi)的各種代謝和生理活動；細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白則對細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能維持起著重要作用。[此處插入GO功能注釋分析氣泡圖]圖2差異表達蛋白GO功能注釋分析氣泡圖注：橫坐標(biāo)表示富集因子，縱坐標(biāo)表示GOterms，氣泡大小表示差異表達蛋白的數(shù)量，氣泡顏色表示P值運用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達蛋白進行通路富集分析，結(jié)果顯示這些蛋白顯著富集在多個重要的信號通路中（圖3）。其中，Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路、MAPK信號通路等與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的信號通路富集程度較高。在Toll樣受體信號通路中，[相關(guān)蛋白名稱1]、[相關(guān)蛋白名稱2]等差異表達蛋白參與了該通路的激活和調(diào)控，它們可能通過識別PRRSV的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），激活下游的信號傳導(dǎo)，進而啟動宿主的免疫應(yīng)答。NF-κB信號通路在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中起著核心作用，差異表達蛋白的富集表明PRRSV感染可能通過激活NF-κB信號通路，誘導(dǎo)炎癥因子的表達和釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。MAPK信號通路參與了細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生理過程，其在PRRSV感染后的富集提示該通路可能在病毒感染引起的細(xì)胞生理變化中發(fā)揮重要作用。此外，差異表達蛋白還富集在代謝相關(guān)的信號通路，如糖酵解/糖異生通路、脂肪酸代謝通路等，這進一步證實了PRRSV感染對宿主細(xì)胞代謝的影響。[此處插入KEGG通路富集分析柱狀圖]圖3差異表達蛋白KEGG通路富集分析柱狀圖注：橫坐標(biāo)表示富集的KEGG通路，縱坐標(biāo)表示富集因子，柱子顏色表示P值利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建差異表達蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)，并使用Cytoscape軟件進行可視化和分析（圖4）。PPI網(wǎng)絡(luò)分析可以揭示蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，有助于發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的蛋白質(zhì)節(jié)點和功能模塊。在構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中，共包含[X]個節(jié)點（即差異表達蛋白）和[X]條邊（即蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系）。通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，確定了網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點蛋白質(zhì)，這些關(guān)鍵節(jié)點蛋白質(zhì)通常具有較高的連接度，在網(wǎng)絡(luò)中起著核心樞紐的作用。例如，[關(guān)鍵蛋白名稱1]與多個其他差異表達蛋白存在相互作用，它可能在PRRSV感染過程中整合多種信號通路，協(xié)調(diào)不同蛋白質(zhì)之間的功能，對病毒感染的進程產(chǎn)生重要影響。對PPI網(wǎng)絡(luò)進行模塊分析，發(fā)現(xiàn)了多個功能模塊，這些模塊中的蛋白質(zhì)可能共同參與特定的生物學(xué)過程。例如，模塊1中的蛋白質(zhì)主要參與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，它們之間的相互作用可能協(xié)同調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)，應(yīng)對PRRSV的感染；模塊2中的蛋白質(zhì)與細(xì)胞代謝相關(guān)，它們的相互作用可能在維持細(xì)胞代謝平衡和為病毒復(fù)制提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)方面發(fā)揮作用。[此處插入PPI網(wǎng)絡(luò)分析圖]圖4差異表達蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)分析圖注：節(jié)點表示差異表達蛋白，節(jié)點大小表示連接度，邊表示蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系綜上所述，通過生物信息學(xué)分析，全面揭示了PRRSV感染Marc-145細(xì)胞后差異表達蛋白的功能和參與的信號通路，為深入理解PRRSV的感染機制提供了重要的線索和理論依據(jù)。這些差異表達蛋白及其相關(guān)的信號通路可能成為進一步研究PRRSV感染機制和開發(fā)新型防控策略的潛在靶點。五、討論5.1PRRSV感染Marc-145細(xì)胞分泌蛋白的變化特征通過SILAC技術(shù)結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用分析，本研究成功鑒定出PRRSV感染Marc-145細(xì)胞后分泌蛋白質(zhì)組中的一系列差異表達蛋白。這些差異表達蛋白的變化特征為深入理解PRRSV的感染機制提供了重要線索。在差異表達蛋白中，上調(diào)表達的蛋白和下調(diào)表達的蛋白呈現(xiàn)出不同的表達趨勢，且涉及多個生物學(xué)過程和信號通路。從整體變化趨勢來看，在PRRSV感染后的早期階段，部分與免疫應(yīng)答相關(guān)的蛋白開始上調(diào)表達，這可能是宿主細(xì)胞對病毒感染的一種早期防御反應(yīng)。隨著感染時間的延長，更多與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞代謝等相關(guān)的蛋白表達發(fā)生顯著變化，且上調(diào)和下調(diào)的蛋白數(shù)量逐漸增加，表明病毒感染對宿主細(xì)胞的影響逐漸加劇，涉及多個生理過程的紊亂。例如，在免疫應(yīng)答相關(guān)的差異表達蛋白中，[免疫相關(guān)蛋白1]在感染后表達上調(diào)，該蛋白可能通過激活免疫細(xì)胞，增強免疫細(xì)胞的活性和功能，從而參與宿主對PRRSV感染的免疫防御。它可能與其他免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游的信號傳導(dǎo)通路，促進免疫細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞因子的分泌，以抵御病毒的入侵。然而，也有一些免疫相關(guān)蛋白表達下調(diào)，如[免疫相關(guān)蛋白2]，其表達下調(diào)可能導(dǎo)致宿主免疫功能的減弱，使病毒更容易在細(xì)胞內(nèi)生存和復(fù)制。這可能是PRRSV逃避宿主免疫監(jiān)視的一種策略，通過抑制某些免疫相關(guān)蛋白的表達，干擾宿主的免疫應(yīng)答，從而實現(xiàn)持續(xù)感染。在炎癥反應(yīng)相關(guān)的差異表達蛋白中，[炎癥相關(guān)蛋白1]表達上調(diào)，它可能參與炎癥信號通路的激活，促進炎癥因子的釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。炎癥反應(yīng)在病毒感染過程中具有雙重作用，一方面，適度的炎癥反應(yīng)可以幫助宿主清除病毒；另一方面，過度的炎癥反應(yīng)可能會對宿主細(xì)胞和組織造成損傷。在PRRSV感染Marc-145細(xì)胞的過程中，炎癥相關(guān)蛋白的變化可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的失衡，從而影響細(xì)胞的正常功能和病毒的感染進程。此外，一些與炎癥抑制相關(guān)的蛋白表達下調(diào)，如[炎癥抑制相關(guān)蛋白1]，這可能進一步加劇炎癥反應(yīng)的程度，使得細(xì)胞處于炎癥應(yīng)激狀態(tài)，不利于細(xì)胞的正常生長和代謝。細(xì)胞代謝相關(guān)的差異表達蛋白也呈現(xiàn)出明顯的變化趨勢。[代謝相關(guān)蛋白1]在感染后表達上調(diào)，該蛋白參與碳水化合物代謝途徑，其表達上調(diào)可能是為了滿足病毒復(fù)制對能量的需求，通過調(diào)節(jié)碳水化合物代謝，為病毒復(fù)制提供更多的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。而[代謝相關(guān)蛋白2]表達下調(diào)，它參與脂質(zhì)代謝過程，其表達下調(diào)可能會影響細(xì)胞膜的合成和修復(fù)，進而影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。PRRSV感染可能通過調(diào)控這些代謝相關(guān)蛋白的表達，改變宿主細(xì)胞的代謝狀態(tài)，以適應(yīng)病毒的生存和復(fù)制需求。這些差異表達蛋白的變化與PRRSV的感染過程密切相關(guān)。在病毒感染的早期，宿主細(xì)胞試圖通過上調(diào)免疫應(yīng)答相關(guān)蛋白來抵抗病毒入侵；隨著感染的進展，病毒通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和代謝過程，創(chuàng)造有利于自身生存和復(fù)制的環(huán)境。差異表達蛋白之間的相互作用也可能形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同影響PRRSV的感染進程。例如，免疫應(yīng)答相關(guān)蛋白的變化可能會影響炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白的表達，而炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白的變化又可能進一步影響細(xì)胞代謝相關(guān)蛋白的表達，從而形成一個相互關(guān)聯(lián)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。PRRSV感染Marc-145細(xì)胞后分泌蛋白的變化特征反映了病毒與宿主細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用關(guān)系，這些變化不僅涉及免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞代謝等多個重要的生物學(xué)過程，而且通過蛋白之間的相互作用形成了一個緊密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。深入研究這些變化特征，有助于揭示PRRSV的感染機制，為開發(fā)有效的防控策略提供理論依據(jù)。5.2差異表達蛋白的生物學(xué)功能與作用機制通過生物信息學(xué)分析，本研究揭示了PRRSV感染Marc-145細(xì)胞后差異表達蛋白豐富的生物學(xué)功能及其復(fù)雜的作用機制。這些差異表達蛋白廣泛參與免疫調(diào)節(jié)、代謝調(diào)控、信號傳導(dǎo)等多個重要生物學(xué)過程，對PRRSV的感染進程產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。在免疫調(diào)節(jié)方面，眾多差異表達蛋白發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們共同參與了宿主對PRRSV感染的免疫防御和免疫逃逸過程。部分免疫相關(guān)的差異表達蛋白能夠激活免疫細(xì)胞，增強免疫細(xì)胞的活性和功能，從而積極參與宿主對PRRSV感染的免疫防御。[免疫相關(guān)蛋白1]在感染后表達上調(diào)，它可能通過與免疫細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，激活下游的信號傳導(dǎo)通路，促進免疫細(xì)胞的增殖、分化以及細(xì)胞因子的分泌，如促進T細(xì)胞的活化和增殖，增強其對病毒感染細(xì)胞的殺傷能力；刺激巨噬細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子能夠招募更多的免疫細(xì)胞到感染部位，增強免疫應(yīng)答，抵御病毒的入侵。然而，也有一些免疫相關(guān)蛋白表達下調(diào)，如[免疫相關(guān)蛋白2]，其表達下調(diào)可能導(dǎo)致宿主免疫功能的減弱，使病毒更容易在細(xì)胞內(nèi)生存和復(fù)制。它可能通過抑制免疫細(xì)胞的活性，干擾免疫細(xì)胞的信號傳導(dǎo)，降低免疫細(xì)胞對病毒的識別和清除能力，從而為病毒的持續(xù)感染創(chuàng)造有利條件。這種免疫調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的差異表達，反映了PRRSV感染過程中宿主免疫應(yīng)答的動態(tài)變化以及病毒與宿主之間的免疫博弈。代謝調(diào)控也是差異表達蛋白參與的重要生物學(xué)過程之一，PRRSV感染Marc-145細(xì)胞后，宿主細(xì)胞的代謝狀態(tài)發(fā)生了顯著改變，這與差異表達蛋白對代謝通路的調(diào)控密切相關(guān)。[代謝相關(guān)蛋白1]在感染后表達上調(diào)，該蛋白參與碳水化合物代謝途徑，其表達上調(diào)可能是為了滿足病毒復(fù)制對能量的需求。病毒的大量復(fù)制需要消耗大量的能量和物質(zhì)，通過上調(diào)[代謝相關(guān)蛋白1]的表達，細(xì)胞可能會增強碳水化合物的代謝，加速葡萄糖的攝取和利用，通過糖酵解等途徑產(chǎn)生更多的ATP，為病毒復(fù)制提供充足的能量；同時，代謝過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物也可以為病毒的合成提供原料，如為病毒蛋白質(zhì)的合成提供氨基酸等物質(zhì)基礎(chǔ)。而[代謝相關(guān)蛋白2]表達下調(diào)，它參與脂質(zhì)代謝過程，其表達下調(diào)可能會影響細(xì)胞膜的合成和修復(fù)。細(xì)胞膜是細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)，對于維持細(xì)胞的正常功能和形態(tài)至關(guān)重要。脂質(zhì)代謝的異?？赡軐?dǎo)致細(xì)胞膜的組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響細(xì)胞的流動性和穩(wěn)定性，進而影響細(xì)胞的物質(zhì)運輸、信號傳遞等功能。在病毒感染過程中，細(xì)胞膜的改變可能會影響病毒與細(xì)胞的相互作用，如影響病毒的吸附、侵入和釋放等過程；也可能影響細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，進一步干擾細(xì)胞的正常代謝和生理功能。在信號傳導(dǎo)方面，差異表達蛋白參與了多