2025年高二（下）生物微生物工程題一、微生物培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)（一）培養(yǎng)基的配制與類型微生物的營養(yǎng)需求是培養(yǎng)技術(shù)的核心，培養(yǎng)基需包含碳源、氮源、水、無機鹽及生長因子五大基本成分。以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為例，牛肉膏提供碳源和維生素，蛋白胨提供氮源和生長因子，NaCl維持滲透壓平衡。按物理性質(zhì)可分為固體培養(yǎng)基（添加瓊脂）和液體培養(yǎng)基，前者用于菌落觀察和純化，后者適用于大規(guī)模發(fā)酵。按功能可分為選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基，如以纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基可篩選纖維素分解菌，伊紅美藍培養(yǎng)基可鑒別大腸桿菌。培養(yǎng)基配制需嚴(yán)格遵循滅菌流程：稱量→溶解→調(diào)節(jié)pH→分裝→滅菌（高壓蒸汽滅菌121℃、15-30分鐘）→倒平板。pH調(diào)節(jié)需根據(jù)微生物特性，如霉菌適宜pH5.0-6.0，細(xì)菌適宜pH7.0-7.2，放線菌適宜pH7.5-8.5。滅菌后的培養(yǎng)基需進行無菌檢測，37℃培養(yǎng)24小時無雜菌生長方可使用。（二）無菌技術(shù)與接種操作無菌操作是防止雜菌污染的關(guān)鍵，核心原則是避免已滅菌物品與未滅菌物品接觸。常用滅菌方法包括：干熱滅菌：玻璃器皿（如培養(yǎng)皿）在160-170℃烘箱中滅菌2小時灼燒滅菌：接種環(huán)、涂布器通過酒精燈火焰灼燒（需冷卻后使用，避免燙死菌種）過濾滅菌：不耐高溫的試劑（如維生素、抗生素）用0.22μm濾膜過濾接種方法主要有平板劃線法和稀釋涂布平板法。平板劃線法通過連續(xù)劃線將菌種逐步稀釋，最終獲得單菌落，操作時需注意劃線區(qū)域不重疊，每次劃線前需灼燒接種環(huán)；稀釋涂布平板法需先將菌液進行梯度稀釋（通常10?1至10??），再取0.1mL涂布于平板，適用于活菌計數(shù)，計數(shù)公式為：菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/接種體積。（三）微生物數(shù)量測定稀釋涂布平板法：統(tǒng)計菌落數(shù)在30-300之間的平板，結(jié)果更接近實際活菌數(shù)，但操作復(fù)雜、耗時較長。顯微鏡直接計數(shù)法：使用血細(xì)胞計數(shù)板（規(guī)格1mm×1mm×0.1mm），計算公式為：每毫升菌液數(shù)量=（中方格平均菌落數(shù)×16或25）×10?×稀釋倍數(shù)。該方法包括死菌和活菌，計數(shù)結(jié)果偏高。比濁法：通過分光光度計測定OD值（600nm波長），利用標(biāo)準(zhǔn)曲線換算菌液濃度，適用于快速檢測。二、微生物工程應(yīng)用實例分析（一）食品發(fā)酵技術(shù)醬油釀造以大豆和小麥為原料，黑曲霉、酵母菌和乳酸菌協(xié)同作用：制曲階段：黑曲霉分泌蛋白酶和淀粉酶，將蛋白質(zhì)水解為氨基酸，淀粉水解為葡萄糖發(fā)酵階段：酵母菌進行酒精發(fā)酵（C?H??O?→2C?H?OH+2CO?），乳酸菌產(chǎn)生乳酸，形成風(fēng)味物質(zhì)關(guān)鍵控制：發(fā)酵溫度28-30℃，pH5.5-6.0，發(fā)酵周期15-20天酸奶制作保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合發(fā)酵：乳糖在乳酸菌作用下分解為乳酸（C??H??O??+H?O→4C?H?O?）當(dāng)pH降至4.6時，牛奶中酪蛋白凝固形成凝膠狀工業(yè)生產(chǎn)采用90-95℃巴氏殺菌15-30分鐘，接種量3%-5%，42℃發(fā)酵4-6小時（二）環(huán)境保護應(yīng)用污水處理活性污泥法利用微生物群落降解有機物：好氧處理：曝氣池中，好氧菌（如假單胞菌）將有機物分解為CO?和H?O，BOD去除率達90%以上厭氧處理：產(chǎn)甲烷菌（如甲烷桿菌）在無氧條件下將有機酸轉(zhuǎn)化為CH?和CO?，可回收能源關(guān)鍵參數(shù)：DO（溶解氧）2-4mg/L，污泥濃度2-4g/L，停留時間8-12小時重金屬生物修復(fù)某些微生物可通過吸附、轉(zhuǎn)化作用去除重金屬：假單胞菌能分泌有機酸溶解Pb2?、Cd2?酵母菌細(xì)胞壁多糖可吸附Hg2?、Cr??，吸附率達80%-90%基因工程菌（如轉(zhuǎn)入MT基因的大腸桿菌）可提高重金屬富集能力（三）醫(yī)藥生產(chǎn)案例青霉素生產(chǎn)采用產(chǎn)黃青霉液體深層發(fā)酵：菌種選育：通過誘變育種獲得高產(chǎn)菌株，當(dāng)前生產(chǎn)菌株青霉素產(chǎn)量達60000U/mL（原始菌株僅20U/mL）發(fā)酵條件：碳源：玉米漿（提供葡萄糖和氨基酸）氮源：硫酸銨（控制NH??濃度，避免分解產(chǎn)物阻遏）溫度：25-28℃，pH6.5-7.0，通氣量1:0.8（v/v·min）提取純化：通過乙酸丁酯萃取，真空干燥獲得青霉素G鉀鹽，純度達99.5%三、典型例題解析（一）選擇題（單選）培養(yǎng)基配方分析某培養(yǎng)基配方如下：甘露醇10g、KH?PO?0.2g、MgSO?0.2g、NaCl0.2g、CaCO?5g、蒸餾水1000mL。該培養(yǎng)基可用于篩選（）A.大腸桿菌B.自生固氮菌C.酵母菌D.纖維素分解菌答案：B解析：培養(yǎng)基中無氮源（CaCO?不提供氮），可篩選能利用空氣中N?的自生固氮菌。大腸桿菌需有機氮源，酵母菌需生長因子，纖維素分解菌需以纖維素為碳源。無菌操作判斷下列操作違反無菌技術(shù)的是（）A.倒平板時培養(yǎng)基溫度降至50℃左右再倒B.接種前用70%酒精擦拭雙手C.培養(yǎng)皿打開后將皿蓋朝上放置D.涂布器使用前在酒精中浸泡后灼燒答案：C解析：培養(yǎng)皿打開后皿蓋應(yīng)倒置或斜放，避免空氣中雜菌落入。（二）實驗題題目：某研究小組從土壤中分離能降解石油的微生物，流程如下：土壤取樣→富集培養(yǎng)→梯度稀釋→涂布平板→純化培養(yǎng)→性能鑒定（1）富集培養(yǎng)時應(yīng)選用以_______為唯一碳源的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程需持續(xù)通入空氣，目的是_________。（2）純化培養(yǎng)時，若采用平板劃線法，第二次劃線應(yīng)從第一次劃線的_______開始，劃線結(jié)束后需將平板_______（正放/倒置）培養(yǎng)。（3）性能鑒定時，將單菌落接種于含石油的固體培養(yǎng)基，若觀察到_______，說明該菌株具有降解能力。（4）若要測定培養(yǎng)液中活菌數(shù)量，將10mL菌液梯度稀釋至10??，取0.1mL涂布平板，三個重復(fù)平板的菌落數(shù)分別為246、258、252，則原菌液中活菌數(shù)為_______個/mL。答案：（1）石油；提供氧氣，促進好氧微生物生長（2）末端；倒置（防止冷凝水滴落污染菌落）（3）菌落周圍出現(xiàn)透明圈（石油被降解）（4）2.52×10?（計算：(246+258+252)/3×10?/0.1=252×10?=2.52×10?）（三）綜合分析題題目：檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)采用黑曲霉在密閉發(fā)酵罐中進行，回答下列問題：（1）黑曲霉的代謝類型是_______，發(fā)酵過程中需控制pH在3.0-4.0，目的是________。（2）培養(yǎng)基中添加葡萄糖作為碳源，當(dāng)葡萄糖濃度過高時會導(dǎo)致_______（現(xiàn)象），可通過_______（措施）避免。（3）發(fā)酵后期檸檬酸產(chǎn)量下降，原因可能是________（答出2點）。答案：（1）異養(yǎng)需氧型；抑制雜菌生長（黑曲霉耐酸性強）（2）葡萄糖效應(yīng)（分解產(chǎn)物阻遏）；流加補料（分批添加葡萄糖）（3）①營養(yǎng)物質(zhì)耗盡；②代謝產(chǎn)物積累抑制酶活性；③pH值異常；④菌體衰老自溶四、實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)分析（一）微生物分離實驗設(shè)計案例：從泡菜壇中分離產(chǎn)酸菌取樣：取泡菜汁10mL，加入90mL無菌水制成10?1稀釋液選擇培養(yǎng)基：酸性麥芽汁培養(yǎng)基（pH4.0，添加0.02%溴甲酚綠指示劑）接種方法：稀釋涂布平板法（10?3、10??、10??三個稀釋度）培養(yǎng)條件：30℃厭氧培養(yǎng)48小時（用厭氧袋或厭氧培養(yǎng)箱）篩選指標(biāo)：菌落周圍出現(xiàn)黃色暈圈（產(chǎn)酸使指示劑變色）（二）數(shù)據(jù)處理與誤差分析某同學(xué)用稀釋涂布平板法計數(shù)大腸桿菌，結(jié)果如下：稀釋倍數(shù)接種體積(mL)菌落數(shù)(個)10??0.132010??0.13510??0.14計算：應(yīng)選擇10??稀釋度的菌落數(shù)（35在30-300范圍內(nèi)），活菌數(shù)=35×10?/0.1=3.5×10?個/mL誤差來源：涂布器未冷卻導(dǎo)致部分菌種死亡（結(jié)果偏低）菌落重疊（結(jié)果偏低）稀釋操作時未充分混勻（結(jié)果波動大）（三）實驗改進方案針對傳統(tǒng)平板劃線法單菌落分離效率低的問題，可采用三區(qū)劃線法：第一區(qū)（A區(qū)）劃3條平行線，灼燒接種環(huán)第二區(qū)（B區(qū)）從A區(qū)末端劃4條平行線，灼燒接種環(huán)第三區(qū)（C區(qū)）從B區(qū)末端劃5條放射線該方法可在一個平板上獲得更多單菌落，提高分離效率30%以上。五、拓展應(yīng)用與前沿技術(shù)（一）合成生物學(xué)改造通過基因工程優(yōu)化微生物代謝途徑：乙醇生產(chǎn)：將丙酮酸脫羧酶基因?qū)氪竽c桿菌，實現(xiàn)葡萄糖到乙醇的高效轉(zhuǎn)化，產(chǎn)量提高40%PHA（聚羥基脂肪酸酯）合成：改造假單胞菌的碳代謝途徑，使PHA占細(xì)胞干重的80%，可用于生物可降解塑料生產(chǎn)（二）自動化發(fā)酵控制現(xiàn)代發(fā)酵罐配備在線監(jiān)測系統(tǒng)，實時調(diào)控參數(shù)：溶氧電極：控制通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速pH電極：通過添加氨水或硫酸自動調(diào)節(jié)pH濁度計：監(jiān)測菌體濃度，實現(xiàn)流加培養(yǎng)某制藥廠采用50m3發(fā)酵罐生產(chǎn)紅霉素，通過PID控制系統(tǒng)（比例-積分-微分），發(fā)酵周期縮短20%，產(chǎn)量提升15%。（三）極端微生物應(yīng)用極端環(huán)境微生物具有特殊代謝能力：嗜熱菌（如水生棲熱菌）：產(chǎn)生耐高溫DNA聚合酶（Taq酶），用于PCR技術(shù)嗜鹽菌（如鹽沼鹽桿菌）：合成類胡蘿卜素，用于食品添加劑嗜酸菌（如氧化亞鐵硫桿菌）：用于低品位銅礦的生物浸出，銅回收率達90%六、易錯知識點辨析消毒與滅菌的區(qū)別消毒僅殺死部分微生物（如75%酒精消毒），滅菌殺死所有微生物（包括芽孢和孢子）。菌落與菌苔的差異菌落是單個菌體繁殖形成的純培養(yǎng)物，菌苔是多個菌落融合形成的片狀群體。選擇培養(yǎng)基與鑒別培養(yǎng)基的作用選擇培養(yǎng)基抑制不需要的微生物（如添加青霉素篩選真菌），鑒別培養(yǎng)基區(qū)分不同微生物（如伊紅美藍鑒別大腸桿菌）