(19)國家知識產(chǎn)權(quán)局(12)發(fā)明專利(10)授權(quán)公告號CN115894277B(65)同一申請的已公布的文獻(xiàn)號東路156號陶思琦(74)專利代理機構(gòu)鄭州天陽專利事務(wù)所(普通合伙)41113專利代理師李松蓮synthesisofoxazolesundermicrconditions.Synlett.2019,(第10期),第1642-1644頁.0VA-InducedAllergicAsthMaturation.InternationalJournalof審查員王少華一種從木賊麻黃中提取得到的酰胺類生物堿EB-A的制備方法及應(yīng)用一種從木賊麻黃中提取得到的酰胺類生物堿EB-A的制備方法，包括：木賊麻黃的干燥草質(zhì)莖，回流提取，減壓濃縮；將濃縮浸膏分散溶解，萃??；將二氯甲烷部位層析，依次梯度洗脫，將Fr.7的濃縮液經(jīng)過硅膠柱層析，洗脫，F(xiàn)r.7-3濃胺類生物堿；首次從木賊麻黃中提取分離得到了21.一種從木賊麻黃中提取得到的酰胺類生物堿EB-A的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)取木賊麻黃的干燥草質(zhì)莖進(jìn)行粉碎，以木賊麻黃10倍重量體積、質(zhì)量濃度70%的乙(2)將濃縮浸膏用純水分散溶解，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯以及正丁醇進(jìn)行(3)將二氯甲烷部位經(jīng)硅膠柱層析，依次用石油醚：丙酮的體積比為50:1、30:1、20:1、4個洗脫部位Fr.7-1~Fr.7-4;然后將Fr.7-3的濃縮液經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱層析，用質(zhì)量濃度80%的甲醇洗脫，得3個洗脫部位Fr.7-3-1~Fr.7-3-3;將Fr.7-3-2的濃縮液經(jīng)硅膠柱層析，用CH?Cl?:MeOH=50:1、20:1、10:1、5:1進(jìn)行洗脫，得到5個洗脫部位Fr.7-3-2-1~Fr.7-3-2-5;將Fr.7-3-2-2的濃縮液經(jīng)硅膠柱層析，用CH?Cl?:MeOH=30:1個洗脫部位Fr.7-3-2-2-1~Fr.7-3-2-2-2;將Fr.7-3-2-2-2的濃縮液經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱層析，用質(zhì)量濃度70%的甲醇洗脫，得到3個洗脫部位Fr.7-3-2-2-2-1~Fr.7-3-2-2-2-3;將Fr.7-3-2-2-2-1的濃縮液經(jīng)硅膠柱層析，用CH?Cl?:MeOH=25:1進(jìn)行洗脫，得到2個洗脫部位Fr.7-3-2-2-2-1-1~Fr.7-3-2-2-2-1-2;將Fr.7-3-2-離純化，濃縮干燥，得到酰胺類生物堿EB-A,保留時間為tR=26.42.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從木賊麻黃中提取得到的酰胺類生物堿EB-A的制備方法，其(1)取35.0kg木賊麻黃的干燥草質(zhì)莖進(jìn)行粉碎，以木賊麻黃10倍重量體積、質(zhì)量濃度70%的乙醇溶劑回流提取4次，每次1.5h,合并提取液，過濾，減壓濃縮，得濃縮浸膏8.84(2)將濃縮浸膏用純水分散溶解，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯以及正丁醇進(jìn)行1.31Kg以及純水部位5.04Kg;所述石油醚萃取條件為：5L石油醚萃取10次，每次4h,二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取條件與石油醚相同；(3)將二氯甲烷部位經(jīng)硅膠柱層析，依次用石油醚：丙酮的體積比為50:1、30:1、20:1、(4)將Fr.7的濃縮液經(jīng)過硅膠柱層析，依次用CH?Cl?:MeOH=20:1、10:1、5:14個洗脫部位Fr.7-1~Fr.7-4;然后將Fr.7-3的濃縮液經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱層析，用質(zhì)量濃度80%的甲醇洗脫，得3個洗脫部位Fr.7-3-1~Fr.7-3-3;將Fr.7-3-2的濃縮液經(jīng)硅膠柱層析，用CH?Cl?:MeOH=50:洗脫部位Fr.7-3-2-2-1~Fr.7-3-2-2-2;將Fr.7-3-2-2-2的濃縮液經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱層析，用質(zhì)量濃度70%的甲醇洗脫，得3個洗脫部位Fr.7-3-2-2-2-1~Fr.7-3-2-2-2-3;將Fr.7-3-2-2-2-1的濃縮液經(jīng)硅膠柱層析，用CH?Cl?:MeOH=25:1進(jìn)行洗脫，得2個洗脫部位Fr.7-3-2-2-2-1-1~Fr.7-3-2-2-2-1-2;將Fr.7-3-2-2-2-1-2用C18ODSRP-HPLC分離純33.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的從木賊麻黃中提取得到的酰胺類生物堿EB-A的制備方4一種從木賊麻黃中提取得到的酰胺類生物堿EB-A的制備方法及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明涉及生物堿提取方法，特別是一種從木賊麻黃中提取得到的酰胺類生物堿EB-A的制備方法及應(yīng)用。背景技術(shù)[0002]過敏性哮喘是一種常見的下呼吸道慢性、異質(zhì)性疾病，其特征是伴有氣道炎癥和高反應(yīng)性的可逆性氣流阻塞，以及哮喘發(fā)作時的咳嗽、喘息、呼吸困難和胸悶等癥狀。哮喘影響著全球超3億人，并且還在快速增長，在國內(nèi)，哮喘也影響著過千萬人；其中，近70%未被診斷，95%未接受標(biāo)準(zhǔn)治療，從而造成巨大的健康和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。吸入性皮質(zhì)類固醇(ICS)是哮喘治療的基礎(chǔ)。然而，吸入或全身性皮質(zhì)類固醇對許多哮喘患者無效，使得類固醇抵抗型哮喘患者的治療選擇很少。因此，迫切需要新的療法和治療靶點，以更好地控制重癥哮喘患者的癥狀和惡化，并避免口服皮質(zhì)類固醇(OCS)引起的不良反應(yīng)。[0003]哮喘的病理生理學(xué)涉及多種免疫和結(jié)構(gòu)細(xì)胞的變化。上皮屏障損傷在許多過敏性和自身免疫性疾病(如哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎和炎癥性腸病等)的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。氣道上皮細(xì)胞表達(dá)模式識別受體，如Toll樣受體(TLRs)和蛋白酶激活受體(PARs),它們可以感知各種環(huán)境刺激，包括過敏原、微生物和顆粒污染物等。當(dāng)吸入刺激時，上皮細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子并激活樹突狀細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)Th2型免疫反應(yīng)的發(fā)展并驅(qū)動先天免疫細(xì)胞的激活。樹突狀細(xì)胞作為功能最強的抗原提呈細(xì)胞(APC),在啟動和指導(dǎo)免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。在免疫反應(yīng)開始后，多種免疫細(xì)胞如2型天然淋巴細(xì)胞(ILC2)、B細(xì)關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，其釋放的顆?？梢鹌交∈湛s和粘膜水腫，從而導(dǎo)致細(xì)支氣管狹窄。目前，許多治療藥物的藥理就是針對這一關(guān)鍵的脫粒過程。[0004]全球疾病負(fù)擔(dān)研究已將哮喘確定為全球最普遍的慢性呼吸道疾病。在針對哮喘的治療中，中醫(yī)藥長久以來有著顯著的療效。在用于哮喘和過敏性疾病的多種治療方劑中均其治療哮喘的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制并開發(fā)出有效的治療藥物是非常重要和必要的。藥，且作為“肺經(jīng)專藥”,在肺系疾病的治療中有著較高的使用麻杏石甘湯、小青龍湯、射干麻黃湯等，已被廣泛用于哮喘的治療當(dāng)中。經(jīng)典名方中麻黃的本草考證結(jié)果顯示，古時所用麻黃的基原雖主要為草麻黃，但也有不少木賊麻黃混用的情況。且麻黃的化學(xué)成分分析表明，三種麻黃中木賊麻黃的生物堿含量最高，而生物堿組分是麻黃發(fā)揮平喘作用的主要有效組分。除此之外，木賊麻黃還具有較好的免疫調(diào)節(jié)作用，這為5木賊麻黃干預(yù)哮喘的研究提供了依據(jù)。本發(fā)明在對木賊麻黃的化學(xué)成分挖掘中，首次發(fā)現(xiàn)了一個酰胺類生物堿(EB-A),其對小鼠過敏性哮喘具有明顯的改善作用。為麻黃的藥理研究和抗哮喘藥物的開發(fā)提供實驗依據(jù)，迄今為止未見有公開報道。發(fā)明內(nèi)容[0006]針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種從木賊麻黃中提取得到的酰胺類生物堿EB-A的制備方法及應(yīng)用，可有效改善過敏性哮喘。[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，一種從木賊麻黃中提取得到的酰胺[0008](1)取木賊麻黃的干燥草質(zhì)莖進(jìn)行粉碎，以木賊麻黃10倍重量體積、質(zhì)量濃度70%[0009](2)將濃縮浸膏用純水分散溶解，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯以及正丁醇[0010](3)將二氯甲烷部位經(jīng)硅膠柱層析，依次用石油醚：丙酮的體積比為50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:100及質(zhì)量濃度100%甲醇梯度洗脫，得9個洗脫部位Fr.1~[0011](4)將Fr.7的濃縮液經(jīng)過硅膠柱層析，依次用CH?Cl?:MeOH得4個洗脫部位Fr.7-1～Fr.7-4;然后將Fr.7-3的濃縮液經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱層析，用質(zhì)量濃度80%的甲醇洗脫，得3個洗脫部位Fr.7-3-1～Fr.7-3-3;將Fr.7-3-2的濃縮液經(jīng)硅Fr.7-3-2-5;將Fr.7-3-2-2的濃縮液經(jīng)硅膠柱層析，用C個洗脫部位Fr.7-3-2-2-1～Fr.7-3-2-2-2;將Fr.7-3-2-2-2的濃縮液經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱層析，用質(zhì)量濃度70%的甲醇洗脫，得到3個洗脫部位Fr.7-3-2-2-2-1～Fr.7-3-2-2-2-3;將Fr.7-3-2-2-2-1的濃縮液經(jīng)硅膠柱層析，用CH?Cl?:MeOH=25:1進(jìn)行洗脫，脫部位Fr.7-3-2-2-2-1-1～Fr.7-3-2-2-2-1-2;將Fr.7-3-2-2-2-1-2用C18ODSRP-HPLC分離純化，濃縮干燥，得到酰胺類生物堿EB-A,保留時[0012]所述方法提取的酰胺類生物堿EB-A在抗過敏性哮喘藥物中的應(yīng)用。[0013]本發(fā)明首次從木賊麻黃中提取分離得到了一種具有抗哮喘活性的酰胺類生物堿(EB-A),并通過體內(nèi)外實驗證明了其對過敏性哮喘小鼠肺部損傷和炎癥的改善，以及對樹突狀細(xì)胞成熟和肥大細(xì)胞活化的抑制。為闡明木賊麻黃的活性成分提供了有力的實驗證據(jù)，也有助于麻黃藥效成分的完整解析，是提取酰胺類生物堿EB-A上的一大創(chuàng)新，社會和經(jīng)濟效益巨大。附圖說明[0014]圖1是本發(fā)明EB-A的質(zhì)譜圖。[0018]圖5是本發(fā)明EB-A對OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘小鼠肺組織損傷和炎癥的影響圖。6[0019]圖6是本發(fā)明EB-A對過敏性哮喘小鼠肺組織中PAR2活化的影響圖。[0020]圖7是本發(fā)明EB-A對過敏性哮喘小鼠體內(nèi)樹突狀細(xì)胞成熟的影響圖。[0021]圖8是本發(fā)明EB-A對肥大細(xì)胞活化脫顆粒的影響圖。[0022]圖9是本發(fā)明體外驗證EB-A抑制樹突狀細(xì)胞成熟的機制結(jié)果圖。具體實施方式[0023]以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的具體實施方式作詳細(xì)說明。[0025]本發(fā)明一種從木賊麻黃中提取得到的酰胺類生物堿EB-A的制備方法，包括以下步[0026](1)取35.0kg木賊麻黃的干燥草質(zhì)莖進(jìn)行粉碎，以木賊麻黃10倍重量體積、質(zhì)量濃度70%的乙醇溶劑回流提取4次，每次1.5h,合并提取液，過濾，減壓濃縮，得濃縮浸膏[0027](2)將濃縮浸膏用純水分散溶解，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯以及正丁醇1.31Kg以及純水部位5.04Kg;萃取條件與石油醚相同(即石油醚(5L×10次×4h)、二氯甲烷(5L×10×4h)、乙酸乙酯(5L×10×4h)以及正丁醇(5L×10×4h));[0029](3)將二氯甲烷部位經(jīng)硅膠柱層析，依次用石油醚：丙酮的體積比為50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:100及質(zhì)量濃度100%甲醇梯度洗脫，得9個洗脫部位Fr.1~[0030](4)將Fr.7(石油醚：丙酮=1:1)的濃縮液經(jīng)過硅膠柱層析，依次用CH?Cl?(二氯甲烷):MeOH(甲醇)=20:1、10:1、5:1洗脫，得4個洗脫部位Fr.7-1～Fr.7-4;然后將Fr.7-3的濃縮液經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱層析，用質(zhì)量濃度80%的甲醇洗脫，得3個洗脫部位Fr.7-進(jìn)行洗脫，得5個洗脫部位Fr.7-3-2-1～Fr.7-3-2-5;將Fr.7-3-2-2的濃縮液經(jīng)硅膠柱層3-2-2-2的濃縮液經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱層析，用質(zhì)量濃度70%的甲醇洗脫，得3個洗脫部位Fr.7-3-2-2-2-1～Fr.7-3-2-2-2-3;將Fr.7-3-2-2-2-1的濃縮液經(jīng)硅膠柱層析，用CH?Cl?:MeOH=25:1進(jìn)行洗脫，得2個洗脫部位Fr.7-3-2-2-2-1-1～Fr.7-3-2-2-2-1-2;將Fr.7-3-2-2-2-1-2用C18ODSRP-HPLC分離純化，濃縮干燥，得到酰胺類生物堿EB-A47.0mg,保留時間為tR=26.4min。其中C18ODSRP-HPLC制備的條件為5μm,250×10mm,55%甲醇，3mL/min。[0031]上述所用儀器與試藥：BrukerAVANCEIII500核磁共振儀(Bruker),BrukermaxisHDQ-TOF高分辨質(zhì)譜儀(ThermoScientific,USA),YMCAA12S05-2510WT型C18反相色譜柱(德國Dr.MaischGmbH),OSB-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司),N-1111型冷凍水循環(huán)裝置(上海愛朗儀器有限公司),NVP-1000型隔膜真空泵(上海愛朗儀器有限公司),暗箱式紫外透射儀(上海寶山顧村電光儀器廠)。7200-300目)、薄層層析硅膠(10-40μm)(青島海洋化工廠)。甲醇(色譜純，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司),所用分析純試劑(甲醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇)均為天津市富宇精細(xì)化工有限公司及天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。[0033]顯色劑：茴香醛-濃硫酸-乙醇(體積比為4:8:400)。[0034]藥材：木賊麻黃購自新疆西域漠草中藥材開發(fā)有限公司。經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠明鑒定為中藥木賊麻黃(EphedraequisetinaBge.)的干燥草質(zhì)莖。[0035]本發(fā)明提取得到的酰胺類生物堿化合物EB-A,具有治療過敏性哮喘的作用，有效用于治療過敏性哮喘藥物中，并經(jīng)過多次反復(fù)試驗均取得了相同或近似的結(jié)果，有關(guān)資料如下：[0037]本發(fā)明提取的酰胺類生物堿化合物EB-A為黃色無定形粉末，茴香醛-濃硫酸105℃加熱顯橙紅色。HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z216[M+Na]*,(calcd.ForC11H15NO2Na),確定其分子式為C??H??NO?。如圖2、3所示，由H-NMR譜低場區(qū)δ:7.41(2H,d,J=7.3Hz),7.30127.4四個碳信號，確定該化合物中存在單取代類型的苯環(huán)；此外，在低場區(qū)δ:4.67(1H,d,J=4.8Hz)以及4.10(1H,m)提示該結(jié)構(gòu)中應(yīng)含有連有吸電子基團的氫質(zhì)子信號，高場區(qū)δ:1.87(3H,s)以及1.03(3H,d,J=6.8Hz)為兩個甲基氫質(zhì)子信號；見圖3所示，3C-NMR譜中有一個δ:172.5,提示該結(jié)構(gòu)中含有酰胺鍵。根據(jù)以上信息，鑒定該化合物為N-(2-hydroxy-1-methy1-2-phenylethyl)acetamide(EB-A),該化合物首次從木賊麻黃(植物)中提取得到，分子結(jié)構(gòu)式為：所示?；衔顴B-A的H-NMR(500MHz,CD30D)和13c-NMR(125MHZ,CD30D)數(shù)據(jù)歸屬見下表1表1數(shù)據(jù)歸屬表1-89-47[0043]2.1實驗動物[0044]SPF級BALB/c小鼠50只，雌性，體重18-22g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(許可證號：SCXK(京)2021-0006)。實驗小鼠安置于河南中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)動物房，相對濕度40%～60%,溫度(23±2)℃,12h光照/12h黑暗周期中自由進(jìn)食和飲水。動物8實驗經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號DWLL2018080003)。[0045]2.2實驗細(xì)胞[0046]大鼠嗜堿性細(xì)胞白血病細(xì)胞株(RBL-2H3)和人支氣管上皮細(xì)胞系(16HBE)均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(BMDCs)的體外分離培養(yǎng)見下述實驗方法3.10免疫印跡分析。[0047]2.3實驗藥物與試劑[0048]醋酸地塞米松，購自浙江仙琚制藥股份有限公司(陽性對照藥，批號：180102);卵清白蛋白Ⅱ級(批號：A5253)、卵清白蛋白V級(批號：A5503)、Compound48/80(批號：C2313)、脂多糖(LPS)(批號：L2880)、4-硝基苯基-N-乙?；?β-D-氨基葡萄糖(批號：N9376),購自美國Sigma公司；InjectT明礬佐劑(批號：77161),購自美國ThermoFisherMedChemExpress公司；胎牛血清(批號：1011-881),購自四季青浙江天杭生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基(批號：2082064)、RPMI-1640培養(yǎng)基(批號：31800022),購自GibcoInvitrogen公司；氨芐青霉素鈉(批號：A8180)、硫酸鏈霉素315-03),購自美國Peprotech公司。[0049]PEAnnexinVApoptosisDetectionKitI凋亡檢測試劑盒(批號：559763)購買BC3710)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：PC0020),購自北京索萊寶科技有限公司；小鼠免[0051]2.4實驗儀器[0052]402A1型超聲霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司);YLS-8A型多功能誘咳引喘儀(濟南益延科技發(fā)展有限公司);BDFACSAriaIII流式細(xì)胞儀(美國BDBiosciences公司);SORVALLST16RCentrifuge5810R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司);BioTek多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司);二氧化碳3111型培養(yǎng)箱(美國ThermoFisherScientific公司);ECLPSETS100倒置顯微鏡(日本Nikon公司);微量移液器(德國Eppendorf公司);;轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司);電泳儀(美國Bio-Rad公司);Odyssey雙色紅外熒光成像儀(美國9[0054]3.1動物實驗[0055]將6-7周齡的BALB/c雌鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，隨機分為5組，即正常對照組(NC)、模型組(OVA)、陽性藥地塞米松組(Y)、EB-A低劑量組(L[0056]如圖4A所示，采用OVA和氫氧化鋁凝膠腹腔注射及OVA霧化激發(fā)方法建立過敏性哮喘小鼠模型。除正常對照組外，在第0、7、14天分別給予其余實驗小鼠腹腔注射雞卵白蛋白(OVA)與氫氧化鋁(Al?(OH)?)混懸液0.2mL致敏(OVA50μg,Al?(OH)?2mg溶于0.2mL無菌生理鹽水),第21天至27天分別給予溶于生理鹽水的1%OVA進(jìn)行霧化激發(fā)(100mgOVA溶于10mL生理鹽水),30min/次/d.模型組、陽性藥地塞米松組、EB-A低劑量組及EB-A高劑量組在激發(fā)前30min分別給予等體積生理鹽水、醋酸地塞米松(0.5mg/kg)、EB-A(10mg/kg)及EB-A(20mg/kg)。正常對照組在第0、7、14天分別給予每只小鼠腹腔注射液0.2mL致敏(Al?(OH)?2mg溶于0.2mL無菌生理鹽水),第21天至27天分別給予生理鹽水霧化激發(fā)30min,激發(fā)前30min給予等體積生理鹽水。末次霧化激發(fā)24h后，檢測各組小鼠肺功能并收集樣本。[0057]3.2咳喘指標(biāo)檢測[0058]末次激發(fā)24h后，將小鼠放置于多功能誘咳引喘儀的氣霧箱中，用25%氨水噴霧誘咳15s取出，以小鼠腹肌收縮，同時張嘴為標(biāo)準(zhǔn)，觀察小鼠從噴霧開始至第一次張口咳嗽的時間，即小鼠的咳嗽潛伏期，記錄小鼠的咳嗽潛伏期及2min內(nèi)咳嗽次數(shù)。[0059]類似地，以0.1%的磷酸組胺和2%的氯化乙酰膽堿等量混合液噴霧致喘，觀察小鼠從噴霧開始到出現(xiàn)氣短喘促的時間，即小鼠的引喘潛伏期。記錄小鼠的引喘潛伏期及2min內(nèi)喘息次數(shù)。[0060]3.3氣道反應(yīng)性檢測[0061]末次激發(fā)24h后，將小鼠依次放入FinePointeWBP體積描記腔中，用PBS調(diào)整基線值，記錄基礎(chǔ)值約2min。隨后每只小鼠給予倍數(shù)遞增濃度(0、3.125mg/mL、6.25mg/mL、5min。測量不同濃度下的肺功能變化及氣道反應(yīng)性(Penh)。[0062]3.4血清及肺泡灌洗液樣本的收集[0063]氣道反應(yīng)性檢測完成后，采取摘眼球法取血，4000rpm離心10min,獲得血清樣本，-80℃保存?zhèn)溆?。采血后行氣管插管取支氣管肺泡灌洗?BALF),用無菌生理鹽水灌洗全肺3[0064]3.5肺組織病理學(xué)評估[0065]每組隨機選擇3只小鼠，取未經(jīng)灌洗的左肺及氣管，浸泡于4%多聚甲醛中固定[0066]3.6原代肺細(xì)胞ROS及凋亡水平檢測[0067]每組隨機挑選3只小鼠，迅速解剖小鼠取出肺臟，將臟器上血跡漂洗干凈拭干，取適量肺組織于1.5mL離心管中剪碎，加入1mL胰酶消化20～30min至細(xì)胞呈黏液狀，加入血清肺細(xì)胞。制備單細(xì)胞懸液，之后按照活性氧檢測試劑盒和PEAnnexinVApoptosis7/13頁DetectionKitI凋亡檢測試劑盒要求處理細(xì)胞，并用流式細(xì)胞檢測儀進(jìn)行檢測分析。[0068]3.7相關(guān)細(xì)胞因子水平的檢測[0069]參照試劑盒說明書，ELISA法檢測血清中的IgE、PGD2、HIS和LTC4,以及血清和[0070]3.8流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血及肺組織中樹突狀細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的水平[0071]采用摘眼球法取小鼠外周血，分取血漿各100μL于流式管中，標(biāo)記為DCs和Tregs。Tregs細(xì)胞。每管加入對應(yīng)外標(biāo)抗體避光孵育30min,之后加入1×紅細(xì)胞裂解液，裂解約1mL破膜固定工作液重懸細(xì)胞，室溫避光孵育45min;每管加入2mL1×破膜緩沖液，500×g離心5min,棄上清；用100μL1×破膜緩沖液重懸細(xì)胞，加入對應(yīng)內(nèi)標(biāo)抗體(APC-避光孵育30min,之后每管加入300μLPBS重懸細(xì)胞并上機檢測。[0072]小鼠原代肺細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備參照方法3.5,檢測步驟同上。[0073]3.9肺組織免疫熒光染色[0074]取肝組織石蠟切片，脫蠟至水，抗原修復(fù)。將切片用無血清蛋白封閉液處理后，加入一抗[TPSAB1(1:200),PAR2(1:200),GMCSF(1:200),IL-33(1:200),TSLP(1:200),4℃孵育過夜；次日，加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗[山羊抗兔IgG(1:300,GB21303,Servicebio)或山羊抗小鼠IgG(1:300,GB21301,Servicebio)],室溫孵育1h;隨后用含DAPI的VECTASHIELD固定液染細(xì)胞核。在激光共聚焦顯微鏡(NikonEclipseC1)下觀察，并利用NikonDS-U3系統(tǒng)獲得熒光圖像。[0075]3.10免疫印跡分析[0076]進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析以檢測TPSAB1(1:1500)、PAR2(1:1000)、GM-CSF(1:1000)、IL-33(1:1000)和TSLP(1:1000)的表達(dá)水平。使用全蛋白質(zhì)提取試劑盒從肺組織中提取蛋白質(zhì)，并使用BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行定量。將每組40μg蛋白質(zhì)樣品加載到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS)凝膠中進(jìn)行電泳分離，之后將目的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，室溫下封閉1.5h,加入待測一抗，4℃孵育過夜；次日，加入相應(yīng)的熒光二抗(1:30000),室溫孵育1h。采用0dyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描成像，并用ImageStudio軟件對蛋白質(zhì)密度進(jìn)行定量分析。[0077]3.11小鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)[0078](1)將BALB/c小鼠采用頸椎脫臼法處死后，浸泡在75%酒精中約3-5min,取出小鼠，于無菌條件下用鑷子夾起小鼠腹部皮膚，用剪刀剪開皮膚并分離。剝離下肢皮膚，游離出小鼠的兩條下肢，小心剝離下肢的肌肉，獲取雙側(cè)股骨及脛骨，放入直徑10cm無菌培養(yǎng)皿[0079](2)仔細(xì)剔除骨周圍軟組織，并將骨放入新的無菌培養(yǎng)皿中，用剪刀剪去兩端骨骺，使用1mL注射器吸取RPMI-1640培養(yǎng)基，針頭分別從骨兩端插入骨髓腔，反復(fù)沖洗出骨[0080](3)骨髓細(xì)胞懸液經(jīng)200目(70μm)濾網(wǎng)過濾，除去組織碎片，收集骨髓細(xì)胞懸液至[0081](4)1200rpm離心5min,棄上清，加入3-4mL37℃預(yù)溫的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混11勻，室溫靜置2-4min,去除紅細(xì)胞。按[0082](5)1200rpm離心5min,棄上清，[0084](7)使用含20ng/mLGM-CSF、10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2的第0天。[0085](8)第3天時首次換液，向每皿細(xì)胞中再加入10mL含有20ng/mLGM-CSF的RPMI-[0086](9)第6天時半量換液，緩慢吸取上層細(xì)胞懸液10mL,再加入10mL含有20ng/mLGM-CSF的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，輕輕晃動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基適當(dāng)混合均勻，置于37℃、5%C02培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。驗研究。[0088]3.12RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒實驗[0089]3.12.1脫顆粒水平檢測[0090]將處于對數(shù)生長期的RBL-2H3細(xì)胞以5×104cells/mL接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。物溶液，37℃孵育1h,加入150μLNa?CO?/NaHCO?終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀405nm下檢測吸光酶孔上清OD值-空白孔上清OD值)×100%)[0092]HIS釋放率的測定：嚴(yán)格按照試劑盒說明書，ELISA法檢測RBL-2H3細(xì)胞的HIS釋放[0093]3.12.2中性紅染色[0094]對3.12.1中取過上清的細(xì)胞，用4%甲醛固定，400μL/孔，隨后用0.5%的中性紅染察并拍照。[0095]3.1316HBE-BMDCs細(xì)胞共培養(yǎng)實驗[0096]3.13.1PAR2激活條件篩選細(xì)胞貼壁生長后，用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。實驗分組：(1)正常對照組(NC):不予任何細(xì)胞貼壁生長后，用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。實驗分組：(1)正常對照組(NC):不予任何[0100]3.13.316HBE-BMDCs細(xì)胞共培養(yǎng)[0101]利用Transwell小室與24孔培養(yǎng)板構(gòu)建共培養(yǎng)體系。首先，將處于對數(shù)生長期的貼壁生長后，用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h.PAR2-AP處理12h激活16HBE細(xì)胞中PAR2,AZ3451[0102]3.13.4流式細(xì)胞術(shù)檢測BMDCs表面共刺激分子的表達(dá)情況板孔2遍，并收集至對應(yīng)的流式管中。[0104](2)1200rpm離心5min,棄上清。[0105](3)每管加入200μL含有2%FBS的PBS封閉液，4℃避光反應(yīng)30min(封閉非特異性抗體的Fc段)。[0106](4)反應(yīng)完畢后，按下列表2方案分別加入抗體進(jìn)行染色。[0107]表2染色方案體積aAnti-MouseCD11cPEbAnti-MouseCD11cPECAnti-MouseCD40PEdAnti-MouseCD11cPE[0109](5)室溫避光孵育30min,期間每10min輕彈流式管底部，防止細(xì)胞聚集導(dǎo)致染色不充分。[0112]3.14分子對接[0113]EB-A的2D/3D結(jié)構(gòu)由Chemoffice軟件制備。從數(shù)據(jù)庫(/)中獲得受體蛋白PAR2(PDBID:5NDD)的晶體結(jié)構(gòu)。使用AutoDockVina軟件進(jìn)行分子對接，并使用DiscoveryStudioVisualizer軟件將對接結(jié)果進(jìn)行可視化處理。[0114]3.15統(tǒng)計方法[0115]實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，SPSS20.0進(jìn)行單因素方差使用GraphPadPrism8.0(GraphPadSoftwareInc.,美國)呈現(xiàn)所有統(tǒng)計分析結(jié)果。[0117]4.1EB-A對OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘典型表型的改善顯著增加(P<0.01),咳喘潛伏期明顯縮短(P<0.001,或P<0.05);與模型組相比，EB-A干預(yù)顯著阻止了這種變化(P<0.001,P<0.01或P<0.05)(見圖4B-E)。此外，OVA組小鼠的血清總IgE<0.01)(見圖4F)。此外，肺組織病理學(xué)分析顯示過敏性哮喘小鼠的肺組織出現(xiàn)了明顯的炎性細(xì)胞浸潤和膠原沉積(P<0.001);而EB-A干預(yù)后以上情況明顯改善(P<0.001)(見圖4G),提示EB-A顯著改善了OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘的典型特征。[0119]圖4中，A.0VA誘導(dǎo)的過敏性哮喘小鼠模型構(gòu)建的示意圖；B.氣道高反應(yīng)性(n=3);C.血清中PGD2水平(n=6);D-E.小鼠咳喘次數(shù)及潛伏期(n=6)。F.血清中IgE水平(n=6)。[0120]4.2EB-A對OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘小鼠肺組織損傷和炎癥的影響[0121]為了進(jìn)一步評估EB-A對哮喘小鼠肺組織損傷和炎癥的影響，本發(fā)明檢測了原代小組相比，過敏性哮喘小鼠原代肺組織細(xì)胞的凋亡和ROS水平均顯著增加(P<0.001),而EB-A平下調(diào)之外，IL-4、IL-5、IL-13和TNF-α的水平均顯著上調(diào)(P<0.001、P<0.01或P<0.05);與IL-10水平顯著升高(P<0.001、P<0.01或P<0.05)(見圖5C-H),提示EB-A能夠減輕OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘小鼠的肺組織損傷和炎癥。[0122]圖5中，A.原代肺細(xì)胞凋亡流式圖及量化結(jié)果(n=3);B.原代肺細(xì)胞ROS流式圖及量化結(jié)果(n=3);C-H.依次為血清及BALF中[0123]4.3EB-A對過敏性哮喘小鼠肺組織中PAR2活化的影響[0124]PAR2是氣道上皮細(xì)胞表達(dá)的參與過敏性氣道炎癥反應(yīng)的一種模式識別受體。在本CSF,IL-33和TSLP的表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，與NC組相比，OVA組小鼠肺組織中PAR2被激活，且GM-CSF,IL-33和TSLP的水平明顯增加(P<0.001,或P<0.01);而EB-A干預(yù)使小鼠肺組行了分子對接，結(jié)果如圖6C所示，EB-A以氫鍵、靜電和疏水相互作用等與PAR2中的拮抗劑結(jié)合口袋相互結(jié)合。提示EB-A干預(yù)抑制了肺組織中PAR2的活化，且EB-A可能是一種潛在的[0126]4.4EB-A對過敏性哮喘小鼠體內(nèi)樹突狀細(xì)胞成熟的影響[0127]樹突狀細(xì)胞在適應(yīng)性免疫反應(yīng)和免疫病理學(xué)的啟動和指導(dǎo)中起著核心作用，并最終決定了慢性疾病的嚴(yán)重程度。在炎癥環(huán)境中，樹突狀細(xì)胞(DC)趨于成熟，成熟的樹突狀細(xì)本發(fā)明利用流式細(xì)胞術(shù)檢測了小鼠外周血(PB)和肺組織中樹突狀細(xì)胞的水平，還檢測了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的水平以評估抑制DC成熟對免疫耐受的后續(xù)影響。如圖7所示，0VA致敏[0128]圖7中，A.小鼠肺組織中DCs和Tregs的流式圖及量化結(jié)果；B.小鼠外周血中DCs和<0.05,**P<0.01,***P<[0129]4.5EB-A對肥大細(xì)胞活化脫顆粒的影響[0130]研究表明，肥大細(xì)胞及其介質(zhì)與哮喘和過敏的發(fā)病機制有關(guān)。在本發(fā)明中，研究了EB-A對小鼠肺組織中MCs活化的影響。甲苯胺藍(lán)染色顯示，在正常小鼠肺組織中幾乎看不到MCs,而在OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘小鼠肺組織中觀察到MCs和肺間質(zhì)中分散的染色顆粒(P<0.001)(見圖8A)。此外，如圖8B-G所示，血清和BALF中肥大細(xì)胞蛋白酶1(mMCP-1)和β-胰蛋白酶(β-MCT)水平、血清中組胺和LTC4水平以及哮喘小鼠肺組織中TPSAB1的表達(dá)均顯著增加；而EB-A干預(yù)明顯抑制了MCs的活化(P<0.001,P<0.01,或P<0.05)。此外，通過體外構(gòu)建Compound48/80(C48/80)誘導(dǎo)RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒模型模擬體外肥大細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象，進(jìn)一步驗證EB-A對肥大細(xì)胞活化的影響。結(jié)果如圖8H-J所示，與NC組相比，C48/80刺激后，細(xì)胞的脫顆?，F(xiàn)象(P<0.001,P<0.01,或P<0.05),提示EB-A在體內(nèi)外均可抑制肥大細(xì)胞的活化和脫顆粒。[0131]圖8中，A.肺組織甲苯胺藍(lán)染色圖及肥大細(xì)胞計數(shù)結(jié)果；BC.血清和BALF中mMCP-1[0132]4.6體外驗證EB-A抑制樹突狀細(xì)胞成熟的機制[0133]為了探討肺上皮細(xì)胞PAR2活化對DC成熟的影響以及EB-A的干預(yù)作用，本發(fā)明建立AP)顯著促進(jìn)16HBE細(xì)胞中PAR2的表達(dá)(P<0.001),而在該濃度下，給予EB-A干預(yù)能夠明顯抑制PAR2的表達(dá)(P<0.01)。在共培養(yǎng)體系中，PAR2的激活顯著刺激了樹突狀細(xì)胞表面標(biāo)志物ClassII、CD40、CD80和CD86的表達(dá)(P<0.001,P<0.01,或P<0.05)(見圖9C[0135]本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)并證實了從木賊麻黃中提取的一個酰胺類生物堿化合物N-(2-hydroxy-1-methyl-2-phenylethyl)acetamide(EB-A)的平喘活性，并對其平喘機制進(jìn)行了研究。通過建立OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘小鼠模型，研究EB-A對過敏性哮喘的干預(yù)作用。地塞米松主要用于過敏性和自身免疫性炎癥疾病，因此在本發(fā)明中被用作陽性對照藥物。體內(nèi)實驗結(jié)果表明，EB-A干預(yù)改善了過敏性哮喘小鼠所表現(xiàn)出的典型特征，如血清總IgE水平的地看出，EB-A可以顯著抑制小鼠氣道重塑和氣管平滑肌的增殖。[0136]在哮喘發(fā)作期間，氣道上皮在結(jié)構(gòu)和功能上出現(xiàn)異常，并且更容易受到吸入性刺激的影響。在針對特定過敏原的致敏過程中，先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的幾種細(xì)胞類型以及各種配體-受體相互作用被觸發(fā)。已經(jīng)有研究證明了PAR2活化與過敏性氣道炎癥的發(fā)展有關(guān)。同樣，在本發(fā)明中也觀察到了PAR2的激活和下游炎癥信號的產(chǎn)生，而EB-A干預(yù)顯著抑制了PAR2的激活，改善了肺組織的損傷和炎癥，進(jìn)而保護了肺上皮屏障。當(dāng)上皮屏障受損時，過敏原易穿過受損的上皮屏障并被位于氣道中的樹突狀細(xì)胞(DC內(nèi)化。樹突狀細(xì)胞在炎癥環(huán)境中具有很強的識別和捕獲抗原的能力，是唯一能夠刺激幼稚T細(xì)胞活化和增殖的專職現(xiàn)的，這對于抑制自身免疫和慢性炎癥至關(guān)重要。已有大量實驗證據(jù)表明，未成熟的樹突狀細(xì)胞(iDC)本身可以將傳統(tǒng)的幼稚T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg表型或促進(jìn)現(xiàn)有Treg的功能。在本發(fā)明中同時測量了小鼠外周血和肺組織中DC和Treg的水平，發(fā)現(xiàn)EB-A處理抑制了DC成熟，同時增加了Treg分化，表明EB-A能夠抑制過敏性哮喘小鼠體內(nèi)樹突狀細(xì)胞的成熟，并促進(jìn)機體免疫耐受的形成。[0137]肥大細(xì)胞(MC)起源于造血干細(xì)胞，在血液和淋巴系統(tǒng)中循環(huán)，并遷移到粘膜組織(如上皮細(xì)胞、腺體、平滑肌細(xì)胞等),然后在組織特異性微環(huán)境的作用下發(fā)育成熟。肥大細(xì)胞被認(rèn)為是與哮喘慢性過敏性炎癥相關(guān)的長期病理生理變化和組織重塑的關(guān)鍵驅(qū)動因素。當(dāng)身體二次暴露于相同的過敏原時，MC表面的高親和力IgE受體(FcRI)與多價抗原相互交聯(lián)，并迅速導(dǎo)致肥大細(xì)胞活化和大量過敏介質(zhì)的釋放。本發(fā)明考察了EB-A在體內(nèi)和體外對[0138]過敏原可以通過病原體相關(guān)的分子模式直接激活樹突狀細(xì)胞，也可以通過作用于氣道上皮細(xì)胞間接激活樹突狀細(xì)胞。在本發(fā)明實驗中觀察到PAR2活化和DC成熟的變化方向止樹突狀細(xì)胞的成熟。[0139]綜上所述，本發(fā)明首次從木賊麻黃中提取分離得到了一種具有抗哮喘活性的酰胺類生物堿(EB-A),并通過體內(nèi)外實驗證明了其對過敏性哮喘小鼠肺部損傷和炎癥的改善，以及對樹突狀細(xì)胞成熟和肥