ICS01.120

CCSA00

34

安徽省地方標準

DB34/T3861—2021

畜禽血清中黃曲霉毒素B1生物標志物的測

定高效液相色譜法

DeterminationofAFB1biomarkerinserumhighperformanceliquid

chromatographicmethod

2021-01-25發(fā)布2021-02-25實施

安徽省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB34/T3861—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。

本文件由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。

本文件由安徽省農(nóng)業(yè)標準化技術(shù)委員會歸口。

本文件起草單位：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)、安徽浩翔農(nóng)牧有限公司（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部豬肉質(zhì)量安全控制重點實驗

室）、望江縣小月山農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司、和縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局、望江縣畜牧獸醫(yī)局、安徽省動物疫病預(yù)防與

控制中心、安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、宿松縣春潤食品有限公司。

本文件主要起草人：王希春、楊長根、陳祥國、趙家喜、沈艷、高亞飛、王軍、湯繼順、趙杰、吳

金節(jié)、李玉、馮士彬、孫裴、涂健、馮江華。

I

DB34/T3861—2021

畜禽血清中黃曲霉毒素B1生物標志物的測定高效液相色譜法

1范圍

本文件確立了畜禽血清中黃曲霉毒素B1生物標志物含量的高效液相色譜法測定方法，并規(guī)定了測定

原理、試劑和設(shè)備、測定步驟、測定結(jié)果的表述、重復(fù)性、檢出限與定量限、回收率。

本文件適用于畜禽血清中AFB1生物標志物的測定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

黃曲霉毒素B1AflatoxinB1，AFB1

主要由黃曲霉與寄生曲霉代謝產(chǎn)生的一種真菌毒素，進入體內(nèi)以后會與血液白蛋白中的賴氨酸

（Lysine）結(jié)合形成穩(wěn)定的生物標志物AFB1-Lysine。

4原理

通過蛋白酶的消化，從血清白蛋白中釋放出AFB1生物標志物，采用固相萃取柱濃縮。濃縮的AFB1

生物標志物經(jīng)高效液相色譜儀分離，用熒光檢測器檢測。

5試劑和設(shè)備

5.1試劑與材料

5.1.1甲醇（CH3OH）：色譜純。

5.1.2蛋白酶。

5.1.3磷酸二氫銨（NH4H2PO4），分析純。

5.1.4疊氮化鈉（NaN3），分析純。

5.1.5白蛋白試劑（DMA）：生物試劑。

5.1.6蛋白檢測染料試劑濃縮液（考馬斯亮藍G-250）

5.1.7氯化鈉（NaCl），分析純。

5.1.8磷酸氫二鈉（Na2HPO4），分析純。

5.1.9磷酸二氫鉀（KH2PO4），分析純。

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DB34/T3861—2021

5.1.10氫氧化銨（NH4OH），分析純。

5.1.11甲酸（HCOOH），分析純。

5.1.12AFB1生物標志物標準品AFB1-Lysine（純度≥99％）。

5.1.13除另外說明外，本標準所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682的一級水。

5.2儀器與設(shè)備

5.2.1高效液相色譜儀（含熒光檢測器、柱溫箱）。

5.2.2水浴恒溫搖床。

5.2.3固相萃取柱（1cc/30mg）。

5.2.4粒徑5μmC18高效液相色譜柱（?250×4.6mm）。

5.2.5渦旋振蕩器。

5.2.6微量進樣器。

5.2.7天平（感量0.0001g）。

5.2.8pH計。

5.2.9-80℃超低溫冰箱。

5.2.10冷凍離心機：轉(zhuǎn)速≥3500g。

5.2.11紫外分光光度計。

6測定步驟

6.1樣品制備

無菌采集新鮮血液5mL，室溫靜置2h，2000g離心15min，取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中。

6.2總蛋白及白蛋白含量測定

6.2.1血清總蛋白濃度測定

6.2.1.14℃下精密稱取1mg/mL蛋白標準品置于玻璃管中用于制備標準曲線，各管添加量見表1。

表1血清總蛋白標準曲線繪制

標準溶液水標準

序號

(μL)(μL)(μg)

108000

227982

347964

467946

587928

61079010

71578515

6.2.1.2取待測血清5μL至離心管中，加入95μL水稀釋樣品，渦旋混合均勻，然后將4μL稀

釋樣品轉(zhuǎn)移到預(yù)先添加796μL水的玻璃試管中；向所有管中加入200μL考馬斯亮藍G-250，室溫

下渦旋，混合均勻轉(zhuǎn)移至待測試管中；以試管1作為空白，在595nm的波長下，使用紫外分光光度

2

DB34/T3861—2021

計進行測量；記錄標準品和樣品的吸光度讀數(shù)，根據(jù)標準吸光度制作標準曲線，由公式計算可得總蛋白

濃度。

6.2.1.3血清總蛋白含量計算公式見公式（1）、公式（2）、公式（3）：

標準曲線：

y