目錄TOC\o"1-9"\h\u16983中文摘要 基于親和毛細(xì)管電泳的抗凝藥物篩選方法研究摘要目的：近年來(lái)，靜脈血栓栓塞癥嚴(yán)重危及著我國(guó)民眾生命健康。抗血栓藥物在臨床治療上發(fā)揮著重要的治療與預(yù)防的作用。但在治療靜脈血栓栓塞時(shí)，抗凝血酶藥物具有出血風(fēng)險(xiǎn)、個(gè)體療效差異大等問(wèn)題，導(dǎo)致有較高的致死率。因此，急需發(fā)現(xiàn)新的具有抗凝活性的藥物以治療靜脈血栓栓塞。因此，本研究采用親和毛細(xì)管電泳技術(shù)（AffinityCapillaryElectrophoresis，ACE），旨在建立一種高效、靈敏的抗凝藥物篩選新方法。方法：首先建立黃酮類(lèi)活性成分的區(qū)帶毛細(xì)管電泳（CapillaryZoneElectrophoresis，CZE）分析方法并進(jìn)行方法學(xué)考察，驗(yàn)證了分析方法的可靠性，能夠檢測(cè)出被分析物質(zhì)。對(duì)陽(yáng)性藥物阿加曲班進(jìn)行測(cè)定，證實(shí)了ACE方法的可行性。利用ACE法對(duì)黃酮類(lèi)藥物進(jìn)行篩選，通過(guò)淌度遷移值法，可以計(jì)算出藥物與凝血酶作用的結(jié)合常數(shù)Kb值，評(píng)估藥物與凝血酶作用的親和力大小，從而篩選出抗凝藥物。結(jié)果：對(duì)建立的CZE方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，證實(shí)了CZE方法的可靠性。在50-1000μM范圍內(nèi)，藥物線性良好。阿加曲班、槲皮素、蘆丁的定量限分別為200μM、150μM、100μM，檢測(cè)限均為50μM。藥物檢測(cè)的精密度和重復(fù)性較好，精密度均不超過(guò)2%，重復(fù)性均不超過(guò)10%。利用ACE法測(cè)定得到阿加曲班、槲皮素、蘆丁的結(jié)合常數(shù)Kb值分別為3.4×105L/mol、3.9×104L/mol、2.1×104L/mol。結(jié)論：本研究建立的基于親和毛細(xì)管電泳技術(shù)的抗凝藥物篩選方法，測(cè)定到了藥物與凝血酶作用的結(jié)合常數(shù)，成功篩選出具有抗凝活性的藥物。關(guān)鍵詞：毛細(xì)管電泳，抗凝藥物，結(jié)合常數(shù)，黃酮類(lèi)藥物，藥物篩選ResearchontheScreeningMethodofAnticoagulantDrugsBasedonAffinityCapillaryElectrophoresisABSTRACTObjective:Inrecentyears,venousthromboembolism(VTE)hasposedaseriousthreattopublichealthinChina.Antithromboticdrugsplayacrucialroleinclinicaltreatmentandprevention.However,anticoagulanttherapies,suchasantithrombindrugs,carryrisksofbleedingandexhibitsignificantvariabilityinindividualefficacy,leadingtohighmortalityratesinVTEtreatment.Therefore,thereisanurgentneedtodiscovernewanticoagulantagentsforVTEtherapy.Thisstudyemploysaffinitycapillaryelectrophoresis(ACE)toestablishanefficientandsensitivescreeningmethodforanticoagulantdrugs.Methods:

First,acapillaryzoneelectrophoresis(CZE)methodwasdevelopedforanalyzingflavonoidactivecomponents,andmethodologicalvalidationwasconductedtoconfirmthereliabilityoftheanalyticalapproach,ensuringaccuratedetectionofthetargetsubstances.ThefeasibilityoftheACEmethodwasverifiedbytestingthepositivecontroldrugargatroban.UsingACE,flavonoidswerescreened,andthebindingconstant(Kb)betweenthedrugsandthrombinwascalculatedviamobilityshiftanalysistoevaluatetheirbindingaffinity,therebyidentifyingpotentialanticoagulantcandidates.Results:MethodologicalvalidationconfirmedthereliabilityoftheestablishedCZEmethod.Thedrugsexhibitedgoodlinearitywithintherangeof50–1000μM.Thelimitsofquantification(LOQ)forargatroban,quercetin,andrutinwere200μM,150μM,and100μM,respectively,whilethelimitsofdetection(LOD)forallthreewere50μM.Theprecisionandrepeatabilityofthedrugassaysweresatisfactory,withprecisionbelow2%andrepeatabilitybelow10%.TheACEmethoddeterminedthebindingconstants(Kb)ofargatroban,quercetin,andrutintobe3.4×10?L/mol,3.9×10?L/mol,and2.1×10?L/mol,respectively.Conclusion:ThedevelopedACE-basedscreeningplatformsuccessfullyquantifieddrug-thrombinbindingconstantsandidentifiedcompoundswithanticoagulantactivity,establishingarobustmethodologyforanticoagulantdrugdiscovery.Keywords:Capillaryelectrophoresis，Anticoagulantmedications，Bindingconstants，F(xiàn)lavonoiddrugs，drugscreening基于親和毛細(xì)管電泳的抗凝藥物篩選方法研究前言靜脈血栓栓塞癥（Venousthromboembolismevent，VTE）是一類(lèi)由靜脈內(nèi)血液異常凝結(jié)引發(fā)的循環(huán)系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)形式為深靜脈血栓和肺栓塞ADDINNE.Ref.{32F170FA-49FE-45EB-B7D7-DE53C5456DB8}[1]。深靜脈血栓多發(fā)生在人體下肢深靜脈，偶爾也出現(xiàn)在上肢靜脈中。當(dāng)在這些靜脈中出現(xiàn)血栓時(shí)，可能會(huì)阻礙血液循環(huán)系統(tǒng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)，出現(xiàn)腿部疼痛、腫脹、發(fā)紅等癥狀。如果此時(shí)還不采取治療措施，深靜脈血栓中的栓子脫落，會(huì)隨著血流流向肺部堵塞肺動(dòng)脈，形成肺栓塞。血栓堵塞肺動(dòng)脈后，會(huì)阻礙氧氣與血液的正常交換，患者會(huì)出現(xiàn)呼吸困難、胸痛等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致窒息，死亡率極高ADDINNE.Ref.{6ED15F26-569D-4EC2-B093-5CB438CEB659}[2]。在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，凝血酶在血栓形成中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。凝血酶在血栓形成的凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮著多重功能：一方面將纖維蛋白原水解為纖維蛋白單體ADDINNE.Ref.{D8F52352-216B-4014-A15B-0BE78CB32676}[2]，這些單體自發(fā)聚合形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；另一方面激活因子ⅩⅢ，促使纖維蛋白交聯(lián)形成穩(wěn)定的凝塊。同時(shí)，凝血酶還通過(guò)正反饋機(jī)制激活因子Ⅴ、Ⅷ和Ⅺ，顯著放大凝血信號(hào)。從凝血機(jī)制的角度分析，凝血酶的生成是整個(gè)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，該酶一旦大量形成，便會(huì)顯著促進(jìn)后續(xù)凝血反應(yīng)的進(jìn)行，促使血栓的形成。治療靜脈血栓的藥物主要為抗凝血酶藥物ADDINNE.Ref.{07D30331-9557-42AA-AE06-4C4B8E92E51A}[3]。目前，臨床常用抗凝藥物主要有四大類(lèi)，包括：肝素類(lèi)、直接凝血酶抑制劑類(lèi)、維生素K拮抗劑類(lèi)、Xa因子抑制劑類(lèi)ADDINNE.Ref.{961E4D33-41C7-4886-871B-95328550340B}[4]。雖然抗凝藥物種類(lèi)多，但普遍存在出血風(fēng)險(xiǎn)大、個(gè)體差異大、治療窗口狹窄、特殊人群限制等不足ADDINNE.Ref.{212EA6C9-F429-43B3-A1C2-0CC1F0828C37}[4]。因此，我們還需要開(kāi)發(fā)出更多新型抗凝藥物。新型抗凝藥物具有重要意義。近年來(lái)，隨著生物技術(shù)、化學(xué)技術(shù)和分析技術(shù)的不斷進(jìn)步，凝血酶抑制劑的篩選方法取得了顯著進(jìn)展。JieDai等人ADDINNE.Ref.{14E46279-85C6-404B-AB62-33202BB0A5DE}[5]，利用熒光探針?lè)?，一種基于量子點(diǎn)和纖維蛋白原的熒光傳感器被開(kāi)發(fā)用于凝血酶的檢測(cè)和抑制劑篩選，并成功用于復(fù)雜基質(zhì)中凝血酶抑制劑的篩選。ChencunHuang等人ADDINNE.Ref.{4B61C624-3618-4A32-8EB1-F06D51D5B982}[6]，建立一種有效的親和超濾-質(zhì)譜聯(lián)用（AUF-MS）方法，以快速篩選血府逐瘀湯中抗凝血酶的活性成分。此外，分子對(duì)接技術(shù)、高通量篩選技術(shù)等也被應(yīng)用于抗凝藥物篩選。然而，現(xiàn)有抗凝藥物篩選方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、成本高等局限性。因此，仍需建立一種高效、靈敏的抗凝藥物篩選新方法。親和毛細(xì)管電泳是一種創(chuàng)新的毛細(xì)管電泳技術(shù)，它通過(guò)將毛細(xì)管電泳的高效分離能力與生物分子間的特異性識(shí)別能力有機(jī)結(jié)合，為研究分子相互作用提供了強(qiáng)大工具。將親和毛細(xì)管電泳技術(shù)應(yīng)用于抗凝藥物篩選，通過(guò)藥物與凝血酶作用前后遷移時(shí)間的變化，可以計(jì)算得到藥物與凝血酶的結(jié)合常數(shù)ADDINNE.Ref.{4A5AD0CE-4A8A-4802-AADC-4D0314E4DCE4}[7]，從而篩選出具有抗凝活性的藥物。本研究首先建立了黃酮類(lèi)活性成分的CZE分析方法，并進(jìn)行方法學(xué)考察，測(cè)定了藥物的線性范圍、檢測(cè)限與定量限、精密度、重復(fù)性等方法學(xué)參數(shù)，驗(yàn)證了分析方法的可靠性。然后對(duì)陽(yáng)性藥物阿加曲班進(jìn)行測(cè)定，證實(shí)了ACE方法的可行性。最后利用ACE法對(duì)黃酮類(lèi)藥物進(jìn)行篩選，通過(guò)淌度遷移值法，計(jì)算出藥物與凝血酶作用的結(jié)合常數(shù)Kb值，評(píng)估藥物與凝血酶作用的親和力大小，從而篩選出了槲皮素與蘆丁具有抗凝血酶活性。實(shí)驗(yàn)儀器與試劑實(shí)驗(yàn)儀器Agilent7100毛細(xì)管電泳儀安捷倫科技有限公司SQP電子天平賽多利斯科學(xué)儀器有限公司OHAUS電子天平奧豪斯儀器有限公司超聲波清洗儀寧波新芝生物科技股份有限公司實(shí)驗(yàn)試劑無(wú)水磷酸氫二鈉成都科隆化學(xué)有限公司無(wú)水磷酸二氫鈉成都科隆化學(xué)有限公司氫氧化鈉成都科隆化學(xué)有限公司甲醇成都科隆化學(xué)有限公司二甲基亞砜成都科隆化學(xué)有限公司純化水重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室蘆丁上海麥克林生化科技有限公司槲皮素上海麥克林生化科技有限公司凝血酶上海源葉生物科技有限公司方法學(xué)建立與驗(yàn)證毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）是毛細(xì)管電泳技術(shù)中最基礎(chǔ)、最常用的分離方法ADDINNE.Ref.{4F68C5B2-F278-4638-96F1-5D37ACB88448}[8]，自20世紀(jì)80年代由Jorgenson等奠定基礎(chǔ)后迅速發(fā)展，已經(jīng)成為現(xiàn)代分析化學(xué)中不可或缺的高效分離手段。其基本原理是通過(guò)電場(chǎng)作用下帶電粒子的差異化遷移行為而實(shí)現(xiàn)分離，帶電粒子荷質(zhì)比大小會(huì)影響其遷移速率，荷質(zhì)比越大的帶電粒子速度越快；同時(shí)，粒子的分子大小和形狀也會(huì)通過(guò)影響其在溶液中的摩擦阻力而改變遷移行為。該技術(shù)具有進(jìn)樣量少、分離效率高、分析速度快、成本低等優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于藥物分析、生物大分子（如蛋白質(zhì)、核酸）研究以及小分子離子檢測(cè)等領(lǐng)域。通過(guò)優(yōu)化緩沖液組成、pH值、電場(chǎng)強(qiáng)度等關(guān)鍵參數(shù)，CZE能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)復(fù)雜樣品的高分辨率分離和準(zhǔn)確定量分析。通過(guò)建立CZE方法，可以確定最佳的運(yùn)行緩沖液組成、毛細(xì)管類(lèi)型、電泳電壓、溫度和檢測(cè)波長(zhǎng)等實(shí)驗(yàn)條件，以實(shí)現(xiàn)藥物與凝血酶等目標(biāo)分子的最佳分離效果。建立CZE電泳方法和進(jìn)行方法驗(yàn)證ADDINNE.Ref.{B9339F9A-97A5-49A4-A302-D5410D437150}[9]是確保親和毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵步驟，有助于提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性，為藥物篩選提供堅(jiān)實(shí)的技術(shù)支持。分析方法的建立電泳條件選擇為20kV，100mbar，5s，裸柱。背景電解質(zhì)溶液為磷酸鹽緩沖液，模擬凝血酶人體生理?xiàng)l件，設(shè)置pH為7.4。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前先用0.1MNaOH、純化水、磷酸鹽緩沖液依次沖洗毛細(xì)管電泳柱2min。每次進(jìn)樣前用磷酸鹽緩沖液沖洗毛細(xì)管電泳柱1min。測(cè)定樣品前，先用0.01%DMF溶液跑至基線平穩(wěn)。溶液配制背景電解質(zhì)溶液稱取0.6g磷酸二氫鈉（MW119.98）加入25mL超純水，充分溶解，配制成200mM磷酸二氫鈉溶液；稱取0.71g磷酸氫二鈉(MW141.96)加入25mL超純水，充分溶解，配制成200mM磷酸氫二鈉溶液。取純化水9mL加入磷酸二氫鈉（200mM）0.5mL和磷酸氫二鈉（200mM）0.5mL,再加入49μL氫氧化鈉溶液（1M），充分混勻，配制成pH7.4的磷酸鹽緩沖液(20mM)。需注意的是磷酸鹽緩沖液容易變質(zhì)，需要現(xiàn)配現(xiàn)用。供試品溶液阿加曲班水溶性較好，準(zhǔn)確稱取阿加曲班（MW508.63）25.4mg，溶于5mL磷酸鹽緩沖液中，超聲輔助溶解，得到10mM儲(chǔ)備液。取適量10mM儲(chǔ)備液，用磷酸鹽稀釋至1mM，備用。槲皮素與蘆丁水溶性較差，需輔助有機(jī)試劑進(jìn)行溶解。準(zhǔn)確稱取槲皮素（MW302.24）24.2mg，溶于8mL甲醇，超聲處理至完全溶解，配制成10mM儲(chǔ)備液。取適量10mM儲(chǔ)備液，用磷酸鹽稀釋至1mM，備用。準(zhǔn)確稱取蘆丁（MW610.52）30.5mg，溶于5mL甲醇，超聲處理至完全溶解，配制成10mM儲(chǔ)備液。取適量10mM儲(chǔ)備液，用磷酸鹽稀釋至1mM，備用。凝血酶溶液準(zhǔn)確稱取凝血酶(MW37,000Da)1.00mg溶于27μL磷酸鹽緩沖液中，配制成1mM凝血酶溶液，再用磷酸鹽緩沖液稀釋成10μM。方法學(xué)考察標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取阿加曲班、槲皮素、蘆丁供試品溶液分別用磷酸鹽緩沖液稀釋成50、100、200、400、800、1000μM六個(gè)濃度點(diǎn)，吸取500μL裝入樣品瓶，運(yùn)行毛細(xì)管電泳儀，以供試品濃度（μM）為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，分別得到阿加曲班、槲皮素、蘆丁的線性回歸方程。檢測(cè)限與定量限評(píng)估分析方法的檢測(cè)限與定量限常用信噪比法，即S/N。取空白緩沖液溶液，用毛細(xì)管電泳方法進(jìn)樣，得到空白基質(zhì)色譜圖，得到噪音N。將阿加曲班、槲皮素、蘆丁供試品溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋?zhuān)♂屢翰捎妹?xì)管電泳方法進(jìn)行檢測(cè)，觀察供試品色譜圖峰高，得到信號(hào)S。當(dāng)信噪比為3時(shí)，對(duì)應(yīng)的供試品濃度為該化合物的檢測(cè)限；當(dāng)信噪比為10時(shí)，對(duì)應(yīng)的供試品濃度為該化合物的定量限。精密度試驗(yàn)按照2.2.2方法制備阿加曲班、槲皮素、蘆丁供試品溶液各一份，用毛細(xì)管電泳方法進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄數(shù)據(jù)，測(cè)得供試品峰面積的RSD(%)。重復(fù)性試驗(yàn)按照2.2.2方法制備阿加曲班、槲皮素、蘆丁供試品溶液各六份，用毛細(xì)管電泳方法進(jìn)樣，每份樣品進(jìn)樣1次，記錄數(shù)據(jù)，測(cè)得供試品峰面積的RSD(%)。結(jié)果與討論標(biāo)準(zhǔn)曲線按照方法2.3.1，結(jié)果如圖1.1、圖1.2、圖1.3所示，將峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，得到阿加曲班（檢查波長(zhǎng)：333nm）的線性回歸方程為y=0.08166x-0.38683（R2=0.99983）；槲皮素(檢測(cè)波長(zhǎng)：365nm)的線性回歸方程為y=0.60833x-6.63288（R2=0.9990）；蘆丁(檢測(cè)波長(zhǎng)：275nm)的線性回歸方程為y=1.19x-16.3（R2=0.9998）。表明在濃度50-1000μM間，阿加曲班、槲皮素和蘆丁的濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。圖SEQ圖\*ARABIC1.1阿加曲班在裸柱上的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖1.2槲皮素在裸柱上的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖1.3蘆丁在裸柱上的標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)限與定量限根據(jù)方法2.3.2，空白電解質(zhì)溶液信號(hào)為1，在測(cè)定阿加曲班、槲皮素、蘆丁的色譜與空白電解質(zhì)溶液信號(hào)比為3和10時(shí)的藥物濃度。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到，阿加曲班的檢測(cè)限與定量限分別為50μM、200μM。阿加曲班的檢測(cè)限與定量限分別為50μM、150μM。蘆丁的檢測(cè)限與定量限分別為50μM、100μM。精密度試驗(yàn)按照方法2.3.3測(cè)得結(jié)果如表1所示，經(jīng)數(shù)據(jù)計(jì)算處理得到，阿加曲班、槲皮素、蘆丁的精密度RSD（%）分別為0.42%、1.79%、1.44%，結(jié)果表明此方法精密度良好。表SEQ表\*ARABIC1精密度試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)123456峰面積RSD(%)阿加曲班81.281.580.880.781.581.20.42%槲皮素612.6618.5615.6624.8604.2611.61.79%蘆丁1207.81181.71190.31175.31163.91163.01.44%重復(fù)性試驗(yàn)按照方法2.3.4測(cè)得結(jié)果如表2所示，經(jīng)數(shù)據(jù)計(jì)算處理得到，阿加曲班、槲皮素、蘆丁的重復(fù)性RSD（%）分別為4.34%、2.92%、5.54%，結(jié)果表明此方法重復(fù)性良好。表SEQ表\*ARABIC2重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)123456峰面積RSD(%)阿加曲班90.081.685.783.079.882.24.34%槲皮素624.8595.7588.7582.2580.4610.32.92%蘆丁1224.611931162.31183.31129.61042.15.54%小結(jié)對(duì)建立的CZE方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果如表3所示。這些驗(yàn)證結(jié)果表明，CZE方法能夠可靠、準(zhǔn)確地用于目標(biāo)分析，適用于進(jìn)行進(jìn)一步的ACE實(shí)驗(yàn)。表SEQ表\*ARABIC3方法學(xué)考察結(jié)果數(shù)據(jù)總結(jié)標(biāo)準(zhǔn)曲線（50-1000μM）檢測(cè)限(μM)定量限(μM)精密度RSD（%）重復(fù)性RSD(%)阿加曲班y=0.08166x-0.38683（R2=0.99983）502000.42%4.34%槲皮素y=0.60833x-6.63288（R2=0.9990）501501.79%2.92%蘆丁y=1.19x-16.3（R2=0.9998）501001.44%5.54%ACE預(yù)實(shí)驗(yàn)在開(kāi)展基于親和毛細(xì)管電泳的抗凝藥物篩選研究前，先開(kāi)展預(yù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定陽(yáng)性藥物阿加曲班具有多方面的重要意義，這有助于確保實(shí)驗(yàn)方法的有效性和可靠性，為后續(xù)的藥物篩選提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。阿加曲班作為一種已知的直接凝血酶抑制劑ADDINNE.Ref.{465B6888-8558-493D-BA01-9C7778DF50AB}[10]，其與凝血酶的結(jié)合特性已經(jīng)得到了廣泛研究。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定阿加曲班與凝血酶的結(jié)合常數(shù)可以驗(yàn)證ACE實(shí)驗(yàn)的可行性，并且通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)可以幫助優(yōu)化ACE實(shí)驗(yàn)的條件。實(shí)驗(yàn)原理淌度（mobility，μ）是指單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的平均電泳速度。淌度與離子所帶的有效電荷、離子的表觀液態(tài)動(dòng)力學(xué)半、介質(zhì)的粘度等因素有關(guān)。在親和毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)在背景電解質(zhì)緩沖液中加入被分析樣品的帶電親和配體時(shí)，樣品分子進(jìn)入緩沖液體系后會(huì)與配體發(fā)生特異結(jié)合，從而改變樣品有效所帶電荷等性質(zhì)ADDINNE.Ref.{B74BE71A-4B32-409B-A6D3-1A87D20D3893}[11]，導(dǎo)致其電泳淌度發(fā)生變化。利用淌度遷移值法，比較被分析樣品在配體加入前后的遷移時(shí)間變化可以判斷樣品與配體是否發(fā)生了特異性結(jié)合。通過(guò)Scatchard方程ADDINNE.Ref.{331120C1-FD6D-4036-E1C6}[12]可以計(jì)算出樣品與配體的結(jié)合常數(shù)，從而估計(jì)兩者親和能力的大小。根據(jù)藥物遷移時(shí)間的變化可以計(jì)算得到在不同配體濃度下的藥物淌度，計(jì)算公式如下：μ式中，lc為毛細(xì)管總長(zhǎng)；ld為毛細(xì)管的有效長(zhǎng)度；t為藥物遷移時(shí)間；V為運(yùn)行電壓。在ACE實(shí)驗(yàn)中，藥物與配體結(jié)合的Kb值可以根據(jù)藥物淌度的變化計(jì)算得到，即淌度遷移值法，其計(jì)算公式（Scatchard方程）如下：μ式中，Kb為藥物與配體的結(jié)合常數(shù)；[L]為配體濃度；μf為游離的藥物的電泳淌度，μc為結(jié)合的藥物的電泳淌度；μi為藥物在對(duì)應(yīng)配體濃度下的電泳淌度。預(yù)實(shí)驗(yàn)操作電泳條件電泳條件選擇為20kV，100mbar，5s，裸柱。背景電解質(zhì)溶液為磷酸鹽緩沖液，pH為7.4。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前先用0.1MNaOH、純化水、磷酸鹽緩沖液依次沖洗毛細(xì)管電泳柱2min。每次進(jìn)樣前用磷酸鹽緩沖液沖洗毛細(xì)管電泳柱1min。測(cè)定樣品前，先用0.01%DMF溶液跑至基線平穩(wěn)。溶液配制將方法2.2.2制得的1M阿加曲班溶液稀釋成800μM進(jìn)樣。保持藥物濃度不變，不斷改變背景電解質(zhì)凝血酶濃度。凝血酶溶液由10μM用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度稀釋成10μM、7.5μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0μM。結(jié)果與討論改變背景電解質(zhì)凝血酶濃度，阿加曲班隨著凝血酶濃度的降低，遷移時(shí)間在不斷縮短，說(shuō)明阿加曲班與凝血酶發(fā)生了特異性結(jié)合，電泳圖譜如圖2.1所示。圖2.1不同凝血酶濃度下阿加曲班電泳圖根據(jù)淌度計(jì)算公式可以計(jì)算出不同凝血酶濃度下的阿加曲班的淌度，再利用Scatchard方程，以（μi-μf）為橫坐標(biāo)，（μi-μf）/[L]為縱坐標(biāo)作圖，斜率為Kb。曲線方程式為y=-0.33991x+0.69322（R2=0.9730），得出阿加曲班與凝血酶作用的Kb值為3.4×105L/mol。結(jié)果如圖2.2所示。圖2.2阿加曲班與凝血酶相互作用標(biāo)準(zhǔn)曲線小結(jié)正式實(shí)驗(yàn)前，先進(jìn)行了阿加曲班與凝血酶相互作用的預(yù)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)方法可行性。隨著凝血酶濃度的不斷下降，阿加曲班的電泳圖譜改變，遷移時(shí)間縮短，證明阿加曲班與凝血酶發(fā)生相互作用。根據(jù)遷移時(shí)間的變化，計(jì)算得到不同凝血酶濃度下的淌度，再利用淌度遷移值法，計(jì)算出阿加曲班與凝血酶相互作用的結(jié)合常數(shù)Kb值為3.4×105L/mol。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定陽(yáng)性藥物阿加曲班與凝血酶的結(jié)合常數(shù)驗(yàn)證了ACE實(shí)驗(yàn)的可行性，為后續(xù)的藥物篩選提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。ACE藥物篩選黃酮類(lèi)藥物是一類(lèi)具有廣泛生物活性的天然產(chǎn)物。在結(jié)構(gòu)上，2-苯基色酮和C6-C3-C6形成黃酮類(lèi)藥物的主鏈。這類(lèi)化合物廣泛存在于植物界中，由于基本母體結(jié)構(gòu)或取代基的結(jié)構(gòu)多樣性不同，這些化合物具有多種藥理作用ADDINNE.Ref.{5810A383-42A2-4E57-B4EC-C12FB9A0BCF1}[13]。特別注意的是，黃酮類(lèi)化合物還具有抗凝活性，這使得它們?cè)陬A(yù)防和治療血栓性疾病方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值A(chǔ)DDINNE.Ref.{70BF40EF-6F69-437C-8C65-533D9C561B12}[14]。因此，針對(duì)抗凝藥物的篩選研究可以優(yōu)先考慮以黃酮類(lèi)化合物作為研究對(duì)象。圖3.1黃酮類(lèi)藥物結(jié)構(gòu)式黃酮類(lèi)藥物結(jié)構(gòu)中C2、C3雙鍵是其發(fā)揮抗凝活性的關(guān)鍵藥效團(tuán)ADDINNE.Ref.{95EFA212-F62A-47CC-9401-88155F1100BF}[15]，因此抗凝藥物的篩選主要針對(duì)具有該結(jié)構(gòu)特征的黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行。目前，已成功篩選出兩個(gè)具有抗凝活性的藥物，分別為槲皮素、蘆丁，結(jié)構(gòu)式如下：圖3.2槲皮素結(jié)構(gòu)式圖3.3蘆丁結(jié)構(gòu)式實(shí)驗(yàn)操作電泳條件電泳條件選擇為20kV，100mbar，5s，裸柱。背景電解質(zhì)溶液為磷酸鹽緩沖液，pH為7.4。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前先用0.1MNaOH、純化水、磷酸鹽緩沖液依次沖洗毛細(xì)管電泳柱2min,每次進(jìn)樣前用磷酸鹽緩沖液沖洗毛細(xì)管電泳柱1min。測(cè)定樣品前，先用0.01%DMF溶液跑至基線平穩(wěn)。溶液配制將方法2.2.2制得的1M槲皮素、蘆丁溶液分別稀釋成400μM、100μM進(jìn)樣。保持藥物濃度不變，不斷改變背景電解質(zhì)凝血酶濃度。凝血酶溶液由10μM用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度稀釋成10μM、7.5μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0μM。結(jié)果與討論槲皮素與凝血酶相互作用分析如圖4.1色譜圖所示，改變背景電解質(zhì)凝血酶濃度，隨著凝血酶濃度的降低，槲皮素的電泳遷移時(shí)間在不斷縮短，說(shuō)明槲皮素與凝血酶發(fā)生了特異性結(jié)合。圖4.1不同凝血酶濃度下槲皮素電泳圖根據(jù)淌度計(jì)算公式可以計(jì)算出不同凝血酶濃度下的槲皮素的淌度，再利用Scatchard方程，以（μi-μf）為橫坐標(biāo)，（μi-μf）/[L]為縱坐標(biāo)作圖，斜率為Kb。曲線方程式為y=-0.03923x+0.06933（R2=0.87829），因此槲皮素與凝血酶作用的Kb值為3.9×104L/mol。結(jié)果如圖4.2所示。圖STYLEREF1\s4.2槲皮素與凝血酶相互作用標(biāo)準(zhǔn)曲線蘆丁與凝血酶相互作用分析改變背景電解質(zhì)凝血酶濃度，隨著凝血酶濃度的降低，蘆丁的電泳遷移時(shí)間在不斷縮短，說(shuō)明蘆丁與凝血酶發(fā)生了特異性結(jié)合，電泳圖譜如圖5.1所示。圖5.1不同凝血酶濃度下蘆丁電泳圖根據(jù)淌度計(jì)算公式可以計(jì)算出不同凝血酶濃度下的阿加曲班的淌度，再利用Scatchard方程，以（μi-μf）為橫坐標(biāo)，（μi-μf）/[L]為縱坐標(biāo)作圖，斜率為Kb。曲線方程式為y=-0.02109x+0.0489（R2=0.92603），因此蘆丁與凝血酶作用的Kb值為2.1×104L/mol。結(jié)果如圖5.2所示。圖5.2蘆丁與凝血酶相互作用標(biāo)準(zhǔn)曲線小結(jié)本研究采用親和毛細(xì)管電泳（ACE）方法進(jìn)行藥物篩選，確定了以黃酮類(lèi)化合物作為篩選體系。黃酮類(lèi)藥物結(jié)構(gòu)中C2、C3位雙鍵是此類(lèi)化合物發(fā)揮抗凝血酶活性的關(guān)鍵藥效團(tuán)，因此本研究的抗凝藥物篩選主要針對(duì)結(jié)構(gòu)中具有C2、C3雙鍵的黃酮類(lèi)化合物。槲皮素和蘆丁均為典型的黃酮類(lèi)藥物，且其化學(xué)結(jié)構(gòu)中均具有C2、C3雙鍵這一關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征。通過(guò)ACE實(shí)驗(yàn)，我們觀察到隨著背景電解質(zhì)中凝血酶濃度的梯度降低，槲皮素和蘆丁的電泳遷移時(shí)間呈現(xiàn)明顯的縮短趨勢(shì)，這一現(xiàn)象證實(shí)了槲皮素和蘆丁與凝血酶發(fā)生了特異性結(jié)合，表明二者均具有顯著的抗凝活性。通過(guò)淌度遷移值法計(jì)算得到槲皮素和蘆丁與凝血酶作用的結(jié)合常數(shù)Kb值分別為3.9×104L/mol和2.1×104L/mol。槲皮素與凝血酶作用的結(jié)合常數(shù)大于蘆丁，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致：在類(lèi)黃酮化合物上C3位點(diǎn)引入O-糖基會(huì)顯著減弱甚至導(dǎo)致凝血酶抑制活性喪失。從分子結(jié)構(gòu)上分析，與槲皮素相比，蘆丁在C3位上引入了O-糖基這一修飾基團(tuán)，因此蘆丁對(duì)凝血酶的抑制作用弱于槲皮素ADDINNE.Ref.{844B6B2D-8512-4DE6-9AEF-BCF2E8C0CBDB}[16]。原因分析：槲皮素在C3位保持游離羥基，有利于與凝血酶活性位點(diǎn)形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)，而蘆丁C3位O-糖基的引入導(dǎo)致其產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，阻礙與酶活性中心的結(jié)合，C3位O-糖基的引入使其氫鍵供體能力降低，糖基的自由旋轉(zhuǎn)使分子柔性增加，降低結(jié)合穩(wěn)定性。結(jié)論本研究基于親和毛細(xì)管電泳技術(shù)建立了一種抗凝藥物篩選新方法。首先建立CZE方法并通過(guò)考察線性、檢測(cè)限、定量限、精密度、重復(fù)性等方法學(xué)參數(shù)驗(yàn)證了CZE方法的可靠性，能夠檢測(cè)出待分析物質(zhì)，適用于進(jìn)行進(jìn)一步的ACE實(shí)驗(yàn)。對(duì)陽(yáng)性藥物進(jìn)行ACE方法的預(yù)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定陽(yáng)性藥物的結(jié)合常數(shù)，證實(shí)了方法的可行性，并測(cè)定出阿加曲班與凝血酶的結(jié)合常數(shù)為3.4×105L/mol。利用建立的親和毛細(xì)管電泳方法篩選黃酮類(lèi)化合物，成功篩選出槲皮素和蘆丁具有抗凝活性，并計(jì)算出槲皮素和蘆丁與凝血酶作用的結(jié)合常數(shù)Kb值分別為3.9×104L/mol和2.1×104L/mol。槲皮素與凝血酶作用的結(jié)合常數(shù)大于蘆丁，是由于在黃酮類(lèi)化合物上C3位點(diǎn)引入O-糖基會(huì)顯著減弱甚至導(dǎo)致凝血酶抑制活性喪失。該篩選的方法為評(píng)價(jià)并篩選抗凝血酶藥物提供重要的研究方法基礎(chǔ)，有利于促進(jìn)藥物的發(fā)現(xiàn)與開(kāi)發(fā)。 ADDINNE.Bib參考文獻(xiàn)[1] BRUNI-FITZGERALDKR.Venousthromboembolism:Anoverview[J].JVascNurs,2015,33(3):95-99.[2] HUISMANM.Pulmonaryembolism[J].NatRevDisPrimers,2018,4:18031.[3] KIMJH.Pulmonaryembolism[J].NatRevDisPrimers,2018,4:18031.[4] MYERSK,LYDENA.AReviewontheNewandOldAnticoagulants[J].OrthopNurs,2019,38(1):43-52.[5] NINGJ,BAOX,CHENH,etal.Ahighlysensitiveandspecificfluorescentprobeforthrombindetectionandhigh-throughputscreeningofthrombininhibitorsincomplexmatrices[J].SpectrochimActaAMolBiomolSpectrosc,2025,325:125136.[6] HUANGC,DAIJ,HEX,etal.ScreeningofanticoagulantactivecomponentsinXuefuZhuyudecoctionviaaffinity-ultrafiltrationcoupledwithmassspectrometry[J].AnalMethods,2024,16(44):7576-7588.[7] ML?OCHOVáH,RATIHR,MICHALCOVáL,etal.Comparisonofmobilityshiftaffinitycapillaryelectrophoresisandcapillaryelectrophoresisfrontalanalysisforbindingconstantdeterminationbetweenhumanserumalbuminandsmalldrugs[J].Electrophoresis,2022,43(16-17):1724-1734.[8] WOJCIKR,ZHUG,ZHANGZ,etal.Capillaryzoneelectrophoresisasatoolforbottom-upproteinanalysis[J].Bioanalysis,2016,8(2):89-92.[9] KREBSF,ZAGSTH,STEINM,etal.Strategiesforcapillaryelectrophoresis:Methoddevelopmentandvalidationforpharmaceuticalandbiologicalapplications-Updatedandcompletelyrevisededition[J].Electrophoresis,2023,44(17-18):1279-1341.[10] ESCOLARG,BOZZOJ,MARAGALLS.Argatroban:adirectthrombininhibitorwithreliableandpredictableanticoagulantactions[J].DrugsToday(Barc),2006,42(4):223-236.[11] DUBSKYP,DVO?áKM,ANSORGEM.Affinitycapillaryelectrophoresis:thetheoryofelectromigration[J].AnalBioanalChem,2016,408(30):8623-8641.[12] RUNDLETTKL,ARMSTRONGDW.Examinationoftheorigin,variation,andproperuseofexpressionsfortheestimationofassociationconstantsbycapillaryelectrophoresis[J].JournalofChromatographyA,1996,721(1):173-186.[13] TIWARIP,MISHRAR,MAZUMDERA,etal.AnInsightintoDiverseActivitiesandTargetsofFlavonoids[J].CurrDrugTargets,2023,24(1):89-102.[14] LIC,HUM,JIANGS,etal.EvaluationProcoagulantActivityandMechanismofAstragalin[J].Molecules,2020,25(1).[15] LIUL,MAH,YANGN,etal.Aseriesofnaturalflavonoidsasthrombininhibitors:structure-activityrelationships[J].ThrombRes,2010,126(5):e365-e378.[16] WANGX,YANGZ,SUF,etal.StudyonStructureActivityRelationshipofNaturalFlavonoidsagainstThrombinbyMolecularDockingVirtualScreeningCombinedwithActivityEvaluationInVitro[J].Molecules,2020,25(2).綜述抗凝藥物研究的研究進(jìn)展摘要《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2023》顯示，心血管疾?。╟ardiovasculardiseases，CVD）已成為威脅我國(guó)居民健康的首要致死因素。其中，靜脈血栓栓塞癥（venousthromboembolism，VTE)）位居第三位。靜脈血栓治療的藥物主要為抗凝血酶藥物。目前，臨床上使用的抗凝藥物主要有四種。此外，多種天然植物來(lái)源的中藥單體成分已被證實(shí)具有顯著的抗凝活性。盡管抗血栓藥物的研發(fā)和臨床應(yīng)用已取得顯著進(jìn)展，能夠較為有效地防治血栓形成，但靜脈血栓栓塞的致死率仍然居高不下。因此，還需要開(kāi)發(fā)更多的藥物篩選的方法來(lái)篩選出更多具有凝血酶抑制活性的藥物。本文將綜述抗凝血酶藥物的研究現(xiàn)狀。關(guān)鍵詞：靜脈血栓；抗凝藥物；凝血酶；研究進(jìn)展ResearchprogressonanticoagulantdrugsABSTRACTTheChinaCardiovascularHealthandDiseaseReport2023revealsthatcardiovasculardiseases(CVD)havebecometheleadingcauseofdeaththreateningthehealthofChineseresidents.Amongthem,venousthromboembolism(VTE)ranksthird.Theprimarymedicationsfortreatingvenousthrombosisareantithrombindrugs.Currently,therearefourmaintypesofanticoagulantsusedinclinicalpractice.Additionally,variousmonomericcomponentsderivedfromnaturalplantsintraditionalChinesemedicinehavebeenconfirmedtopossesssignificantanticoagulantactivity.Althoughsignificantprogresshasbeenmadeintheresearch,development,andclinicalapplicationofantithromboticdrugs,allowingrelativelyeffectivepreventionandtreatmentofthrombosis,themortalityrateofvenousthromboembolismremainshigh.Therefore,moredrugscreeningmethodsarestillneededtoidentifyadditionaldrugswiththrombin-inhibitingactivity.Thisarticlewillreviewthecurrentresearchstatusofantithrombindrugs.Keywords：Venousthrombosis,Anticoagulantdrugs,Thrombin,Researchprogress前言靜脈血栓栓塞癥（Venousthromboembolismevent，VTE）是一類(lèi)由靜脈內(nèi)血液異常凝結(jié)引發(fā)的循環(huán)系統(tǒng)疾病，包括深靜脈血栓和肺栓塞。深靜脈血栓好發(fā)于下肢深靜脈，當(dāng)血栓部分脫落并隨血流移行至肺部，阻塞肺動(dòng)脈導(dǎo)致血流中斷時(shí)，即可能引發(fā)肺栓塞這一嚴(yán)重并發(fā)癥。靜脈系統(tǒng)形成的血栓富含纖維蛋白和截留的紅細(xì)胞，臨床上稱為"紅血栓"。Virchow三聯(lián)征完整闡述了靜脈血栓的病理生理機(jī)制ADDINNE.Ref.{589105BE-CA06-466E-B4BD-13245ABC72E8}[1]。遺傳因素與環(huán)境因素也可增加血栓栓塞風(fēng)險(xiǎn)。在遺傳性靜脈血栓性疾病中，可能表現(xiàn)為凝血因子功能增強(qiáng)或生理性抗凝蛋白缺乏。靜脈血栓栓塞癥的獲得性危險(xiǎn)因素包括惡性腫瘤、肥胖癥及重大外科手術(shù)等。此外，位于凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)頂端的循環(huán)組織因子TF含量升高，通過(guò)激活外源性凝血途徑啟動(dòng)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，破壞凝血-抗凝平衡，也可能引發(fā)靜脈血栓形成?？鼓委熓谴蠖鄶?shù)確診靜脈血栓栓塞患者的一線治療方式。對(duì)于接受抗凝治療的患者，其治療過(guò)程可分為三個(gè)階段。首先需要通過(guò)快速?gòu)?qiáng)效的抗凝藥物（如普通肝素、低分子肝素或直接口服抗凝藥）阻斷活動(dòng)性血栓形成，即“初始管理”階段。所有急性靜脈血栓栓塞癥患者在“主要治療”階段需接受3至6個(gè)月的抗凝治療（直接口服抗凝藥或華法林），此階段患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)最高，機(jī)體通過(guò)自然纖溶過(guò)程實(shí)現(xiàn)靜脈再通，并將急性血栓轉(zhuǎn)化為慢性纖維蛋白。最后，對(duì)于存在持續(xù)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的眾多患者，在主要治療期后繼續(xù)進(jìn)行“二級(jí)預(yù)防”，采用長(zhǎng)期或無(wú)限期抗凝策略（如低劑量直接口服抗凝藥），平衡血栓復(fù)發(fā)與出血風(fēng)險(xiǎn)?？鼓幬锔鶕?jù)作用靶點(diǎn)可分為四大類(lèi)：肝素類(lèi)、直接凝血酶抑制劑類(lèi)、維生素K拮抗劑類(lèi)、Xa因子抑制劑類(lèi)ADDINNE.Ref.{ECE49C66-6E49-44FC-98AF-6387A0C5012F}[2]。此外，多種天然植物來(lái)源的中藥單體成分已被證實(shí)具有顯著的抗凝活性，這些活性成分通過(guò)特異性作用于凝血系統(tǒng)的不同環(huán)節(jié)發(fā)揮抗凝作用。雖然抗凝藥物眾多，但普遍存在出血風(fēng)險(xiǎn)大、個(gè)體差異大、治療窗口狹窄、特殊人群限制等不足。因此，還需要開(kāi)發(fā)藥物篩選新方法，篩選出更多有效的抗凝藥物。在本文獻(xiàn)綜述中，主要介紹目前臨床上的抗凝藥物的作用機(jī)制與優(yōu)缺點(diǎn)，以及對(duì)未來(lái)抗凝藥物篩選的展望。凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)定義凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)（CoagulationCascade）是指機(jī)體在血管損傷后啟動(dòng)的一系列有序的酶促反應(yīng)過(guò)程，通過(guò)多種凝血因子的逐級(jí)激活，最終導(dǎo)致纖維蛋白形成和血液凝固的精密調(diào)控機(jī)制。凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)可分為三條途徑，包括內(nèi)源性途徑、外源性途徑和共同途徑ADDINNE.Ref.{AC5847FD-9764-4D24-B591-5CEBB846CB4F}[3]。分類(lèi)外源性途徑外源性凝血途徑因炎癥反應(yīng)而激活，由組織因子（TF）暴露而觸發(fā)。TF是一種跨膜糖蛋白，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮下層組織和活化的白細(xì)胞中，在機(jī)體應(yīng)對(duì)組織損傷或病原體入侵的防御反應(yīng)時(shí)，TF成為連接凝血系統(tǒng)與炎癥的關(guān)鍵介質(zhì)。正常生理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮屏障能有效阻隔TF與血漿促凝蛋白接觸，且白細(xì)胞不表達(dá)TF；但在化學(xué)/物理?yè)p傷、炎性細(xì)胞因子、病原相關(guān)分子模式（PAMPs）或損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）刺激下，TF表達(dá)會(huì)迅速上調(diào)。因此，當(dāng)血管損傷和/或炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，TF得以與血漿凝血系統(tǒng)蛋白相互作用。TF與凝血因子VIIa（FVIIa）和Ca2+結(jié)合形成復(fù)合物（FVIIa-組織因子復(fù)合物）ADDINNE.Ref.{47CD8BD2-968F-4C02-ACD8-1E9703839B71}[4]，進(jìn)而激活FX生成FXa。內(nèi)源性途徑內(nèi)源性凝血途徑由病原體模式分子和受損“自身”物質(zhì)的直接識(shí)別觸發(fā)ADDINNE.Ref.{6D7C4763-5725-4DA9-BE80-8F5D925993EA}[5]。內(nèi)源性凝血途徑是一種由酶原因子X(jué)II（FXII）激活啟動(dòng)的蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)。FXII是一種分子量約為90kDa的糖蛋白，具有獨(dú)特的自身激活特性。當(dāng)接觸帶有“異物特征”的人工或生物表面時(shí)，F(xiàn)XII可發(fā)生自發(fā)激活。FXIIa通過(guò)蛋白水解作用切割血漿前激肽釋放酶（PK），生成的血漿激肽釋放酶（pKa）進(jìn)而從高分子量激肽原（HK）中釋放九肽緩激肽（BK）。pKa與FXIIa通過(guò)相互蛋白水解激活形成正反饋調(diào)節(jié)。接觸系統(tǒng)的核心在于自發(fā)激活、相互激活及級(jí)聯(lián)放大。當(dāng)酶原與帶負(fù)電荷表面共孵育時(shí)，F(xiàn)XII的自發(fā)激活速率較慢；而在血漿、HK或PK存在時(shí)，該過(guò)程顯著加速。FXII的構(gòu)象變化引發(fā)其自剪切，形成具有活性的絲氨酸蛋白酶。隨后，F(xiàn)XIIa依次激活FXI和FIX，活化的FIXa與輔因子（FVIIIa）結(jié)合形成內(nèi)源性途徑因子X(jué)酶復(fù)合物，進(jìn)而激活FX。共同途徑外源性途徑和內(nèi)源性途徑生成的FXa匯聚到共同途徑中，啟動(dòng)共同途徑。FXa在凝血因子Va（FVa）作為輔因子的作用下，與鈣離子在磷脂表面共同形成凝血酶原酶復(fù)合物，該復(fù)合物將凝血酶原水解為具有活性的凝血酶。凝血酶進(jìn)一步將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，發(fā)揮抗凝作用?？鼓幬飶哪獧C(jī)制的角度分析，凝血酶的生成是整個(gè)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，該酶一旦大量形成，便會(huì)顯著促進(jìn)后續(xù)凝血反應(yīng)的進(jìn)行，促使血栓的形成。因此，預(yù)防及治療靜脈血栓藥物主要為抗凝藥物，抗凝藥物是通過(guò)直接或間接降低凝血酶活性或減少凝血酶的生成來(lái)達(dá)到抗凝血的作用。肝素類(lèi)作用機(jī)制抗凝血酶（AT）是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，AT能共價(jià)結(jié)合絲氨酸蛋白酶的絲氨酸殘基，導(dǎo)致其失活。在肝素存在的情況下，藥物分子中的戊糖序列與AT?結(jié)合，誘導(dǎo)AT?構(gòu)象改變，使其抑制絲氨酸蛋白酶的能力提高數(shù)百至上千倍。因此，肝素類(lèi)藥物主要通過(guò)增強(qiáng)AT的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)抗凝目的。此外，肝素類(lèi)藥物還能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放組織因子途徑抑制物（TFPI）ADDINNE.Ref.{A7A9D4A5-B771-403F-B0C7-1D2256A96DAA}[6]，進(jìn)一步抑制外源性凝血途徑。代表藥物普通肝素由靜脈注射后立即發(fā)揮抗凝作用，適用于急性血栓栓塞的緊急治療。可被魚(yú)精蛋白完全中和，在出血或需緊急手術(shù)時(shí)能快速逆轉(zhuǎn)抗凝作用。但其藥代動(dòng)力學(xué)不可預(yù)測(cè)，個(gè)體劑量差異大，需頻繁監(jiān)測(cè)活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）調(diào)整用量，出血風(fēng)險(xiǎn)較高。低分子肝素的出血風(fēng)險(xiǎn)有一定的下降，不需要額外監(jiān)測(cè)凝血功能。但是，低分子肝素的注射給藥途徑仍然不利于居家用藥，目前主要用于靜脈血栓的住院治療及手術(shù)治療等ADDINNE.Ref.{B3C0ADE0-294F-435B-A1E7-E7D05FCEA7F3}[7]。直接凝血酶抑制劑類(lèi)作用機(jī)制直接凝血酶抑制劑是直接與凝血酶活性位點(diǎn)特異性結(jié)合，降低凝血酶活性，阻斷其將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白的過(guò)程ADDINNE.Ref.{C4D9D190-5FD0-4C8B-B074-E85784EB0C00}[8]，而抑制血栓的形成。代表藥物水蛭素是一種具有強(qiáng)效抗凝活性的天然生物活性物質(zhì)，主要來(lái)源于醫(yī)用水蛭的唾液腺分泌物ADDINNE.Ref.{84D3CF2A-4627-4DBD-B4F5-57D104F3A543}[9]。能夠不可逆的結(jié)合凝血酶活性位點(diǎn)，且對(duì)游離凝血酶和已與纖維蛋白結(jié)合的凝血酶均有效ADDINNE.Ref.{D96A146A-152D-4334-81BC-03A6127461DE}[10]。水蛭素起效快但半衰期短，需持續(xù)靜脈給藥，且可能產(chǎn)生抗體導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)。無(wú)特異性拮抗劑，出血時(shí)難以快速逆轉(zhuǎn)。阿加曲班是一種小分子直接凝血酶抑制劑。因其小分子結(jié)構(gòu)使其能夠穿透血栓，能夠可逆性結(jié)合凝血酶活性位點(diǎn)ADDINNE.Ref.{199FFC94-3E21-4886-BA7F-F354BBE49977}[11]，抑制游離型和纖維蛋白結(jié)合型凝血酶。阿加曲班半衰期短，起效迅速，個(gè)體差異性較小。但由于其但其出血風(fēng)險(xiǎn)、缺乏拮抗劑及較高的成本限制了它的應(yīng)用。達(dá)比加群酯是首個(gè)上市的口服直接凝血酶抑制劑前藥ADDINNE.Ref.{48AE363B-3152-4C30-9BF2-F21AC2E6A732}[12]，對(duì)凝血酶活性表現(xiàn)為可逆抑制作用。將達(dá)比加群的羧基酯化形成達(dá)比加群酯，能夠降低分子極性，使其更易穿過(guò)胃腸黏膜屏障，提升生物利用度。作為新型口服抗凝藥代表，其優(yōu)勢(shì)包括固定劑量給藥、無(wú)需常規(guī)凝血監(jiān)測(cè)、起效迅速，且不受食物影響。2015年其特異性拮抗劑伊達(dá)賽珠單抗上市進(jìn)一步提高了用藥安全性。常見(jiàn)不良反應(yīng)為消化道不適和出血風(fēng)險(xiǎn)。維生素K拮抗劑類(lèi)作用機(jī)制維生素K拮抗劑主要是通過(guò)干擾肝臟內(nèi)維生素K的代謝過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)抗凝效果。這類(lèi)藥物能夠特異性抑制維生素K環(huán)氧化物還原酶的活性，阻斷維生素K由氧化態(tài)向還原態(tài)（氫醌形式）的轉(zhuǎn)化ADDINNE.Ref.{02AED8A4-2B31-48A4-8E60-2B53253B3149}[13]，進(jìn)而影響維生素K的生物利用度。作為γ-羧化反應(yīng)的關(guān)鍵輔因子，維生素K的缺乏會(huì)直接導(dǎo)致依賴其活化的多種凝血因子（包括Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子）以及天然抗凝物質(zhì)（如蛋白C和蛋白S）的合成障礙，使得凝血途徑的多個(gè)關(guān)鍵步驟受到抑制，從而有效延長(zhǎng)凝血時(shí)間，產(chǎn)生預(yù)期的抗凝治療效果。代表藥物作為香豆素類(lèi)抗凝劑的代表藥物，華法林在臨床血栓防治中占據(jù)重要地位。該藥物通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制維生素K而發(fā)揮藥理作用。其作用機(jī)制主要表現(xiàn)為選擇性阻斷肝臟合成維生素K依賴性凝血因子ADDINNE.Ref.{40047E73-AB10-4FC7-8589-E7E3E1D97D6B}[14]的過(guò)程。因其對(duì)血液中已激活的凝血因子并不產(chǎn)生直接影響，所以華法林在體外不能發(fā)揮抗凝作用。其顱內(nèi)出血風(fēng)險(xiǎn)高，個(gè)體差異大,其藥效易受多種因素干擾，包括維生素K含量高的食物攝入、酒精過(guò)度飲用、以及同時(shí)服用抗生素及其他影響CYP2C9酶的藥物等。Xa因子抑制劑類(lèi)作用機(jī)制Xa因子作為凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的外源性途徑和內(nèi)源性途徑的匯聚點(diǎn)，抑制其活性能減少凝血酶原復(fù)合物的生成ADDINNE.Ref.{60623EF7-59D3-4BC3-9DA5-AB36C4FFF411}[15]，從而抑制凝血酶生成。代表藥物利伐沙班是首個(gè)被應(yīng)用于臨床的口服直接X(jué)a因子抑制劑，能特異性結(jié)合Xa因子活性中心，抑制其活性。具有用藥便捷、起效快和無(wú)需常規(guī)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，能有效治療靜脈血栓，且顱內(nèi)出血風(fēng)險(xiǎn)較華法林低。但其存在消化道出血風(fēng)險(xiǎn)較高、需根據(jù)腎功能調(diào)整劑量ADDINNE.Ref.{C676B03D-2BE2-4F77-851C-4CB7728BDB5A}[16]、缺乏拮抗劑等不足。璜達(dá)肝癸鈉是一種高選擇性的間接X(jué)a因子抑制劑。通過(guò)增強(qiáng)抗凝血酶III活性來(lái)抑制Xa因子活性。該藥物具有多重優(yōu)勢(shì)：皮下注射可達(dá)100%絕對(duì)生物利用度、起效迅速、半衰期較長(zhǎng)、直接經(jīng)腎臟排泄，與直接口服抗凝劑相比不良反應(yīng)發(fā)生率更低。在口服抗凝劑使用受限或患者對(duì)低分子肝素不耐受的情況下，璜達(dá)肝癸鈉是一種理想的替代選擇。但由于該藥物主要經(jīng)腎臟排泄，腎功能不全患者使用時(shí)需特別謹(jǐn)慎。中藥單體在植物界中，許多中藥單體已被證實(shí)具有抗凝活性，這些單體通過(guò)不同的機(jī)制發(fā)揮抗凝作用，為預(yù)防和治療血栓栓塞性疾病提供