ICS65.020.20CCSB05DB1308DB1308/T321—20232023-02-25發(fā)布2023-03-01實施承德市市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB1308/T321—2023本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由承德市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局歸口。本文件起草單位:承德市蔬菜技術(shù)推廣站、圍場滿族蒙古族自治縣蔬菜環(huán)保站、興隆縣工商業(yè)聯(lián)合會。本文件主要起草人：王玉宏、鄭鵬婧、姜紅玉、姜濤、李兵、劉博、王春紅、劉斯超、唐麗麗、卞穎。DB1308/T321—20231春季蘿卜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了蘿卜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的術(shù)語和定義、培養(yǎng)條件、操作流程、操作方法以及檔案管理等內(nèi)容。本文件適用于春季蘿卜游離小孢子培養(yǎng)，十字花科蔬菜游離小孢子的培養(yǎng)可參照執(zhí)行。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術(shù)語和定義3.1游離小孢子不形成配子的游離狀的單核細(xì)胞。3.2游離小孢子培養(yǎng)在合成培養(yǎng)基上，改變花粉的發(fā)育途徑，使其不形成配子，而是像體細(xì)胞一樣進(jìn)行分裂、分化、最終發(fā)育成完整植株。4培養(yǎng)條件4.1實驗室環(huán)境整潔，干凈衛(wèi)生，有溫度調(diào)節(jié)設(shè)備，室內(nèi)溫度控制在20℃~27℃。4.2試劑或材料培養(yǎng)用水符合GB/T6682中規(guī)定的三級水，除非另有規(guī)定，在培養(yǎng)過程中僅使用分析純試劑，試劑或材料包括：a)B5培養(yǎng)基基鹽干粉（含維生素）；b)NLN培養(yǎng)基基鹽干粉（不含維生素）；c)肌醇，純度≥90.0%；d)蔗糖；e)瓊脂；f)萘乙酸；DB1308/T321—20232g)還原型谷胱甘肽，純度≥99%；h)L-谷氨酰胺，純度≥99%；i)L-絲氨酸，純度≥99%；j)一水嗎啉乙磺酸，純度>99%；l)次氯酸鈉溶液，5%；m)硝酸鈣溶液，25%；n)秋水仙堿溶液，0.3%；D-生物素0.0025g，加蒸餾水定容到500ml。4.3儀器設(shè)備與器具4.3.1儀器設(shè)備a)超凈工作臺；b)立式壓力蒸汽滅菌器：壓力0.25MPa，溫度139℃;c)生化培養(yǎng)箱；d)酸堿度測試儀；e)電子天平：最大稱量：220g，實際分度值：0g)隔膜真空泵：真空度200i)流式細(xì)胞儀。4.3.2器具c)大燒杯：1L；j)眼科鑷子：10cm；k)手術(shù)刀；3號；5操作流程培養(yǎng)基配置→超凈工作臺操作→環(huán)境培養(yǎng)→小孢子植株移栽→留種。DB1308/T321—202336操作方法6.1培養(yǎng)基配置6.1.1B5液體培養(yǎng)基稱取B5培養(yǎng)基基鹽干粉（含維生素）3.164g，加入0.1g肌醇和130g蔗糖，加蒸餾水定容到1L，將培養(yǎng)基pH值調(diào)至5.8，分裝于100ml三角瓶中，使用蒸汽滅菌器120℃濕熱滅菌20min，滅菌后取出4℃保存。6.1.2B5固體培養(yǎng)基稱取B5培養(yǎng)基基鹽干粉（含維生素）3.164g，加入肌醇0.1g、蔗糖30g和瓊脂7.5g，加蒸餾水定容到1L，將培養(yǎng)基pH值調(diào)至5.8，分裝于100ml三角瓶中，每瓶40ml，使用蒸汽滅菌器120℃濕熱滅菌20min，滅菌后取出，待冷卻凝固后4℃保存。6.1.3改良1/2NLN培養(yǎng)基稱取NLN培養(yǎng)基基鹽干粉（不含維生素）0.387g，加入硝酸鈣溶液2ml、100×維生素液10ml、肌醇0.1g、還原型谷胱甘肽0.03g、L-谷氨酰胺0.8g、L-絲氨酸0.1g、蔗糖130g和一水嗎啉乙磺酸0.6396g，使用大燒杯加蒸餾水定容到1L，將培養(yǎng)基pH值調(diào)到5.8，使用隔膜真空泵，將培養(yǎng)基經(jīng)0.2μm水系微孔過濾膜反復(fù)過濾三次，之后在超凈工作臺中，使用longer-pump蠕動泵，將過濾后的培養(yǎng)基再經(jīng)0.22μm過濾器過濾到已經(jīng)滅菌的三角瓶中，錫泊紙封口，4℃保存。6.2超凈工作臺操作6.2.1設(shè)備消毒將50ml燒杯、研缽、10ml試管、古式漏斗用錫箔紙包扎好，蒸汽滅菌器120℃滅菌20min。將超凈工作臺內(nèi)用75%乙醇全面擦拭一遍。將離心機(jī)、酒精燈、50ml燒杯、10ml試管、研缽、古式漏斗、乙醇、次氯酸鈉、瓶裝無菌水、B5液體培養(yǎng)基、改良1/2NLN培養(yǎng)基、60mm一次性培養(yǎng)皿、石蠟封口膜等必需品放入超凈工作臺，紫外線滅菌30min。6.2.2準(zhǔn)備花蕾待蘿卜抽苔后，選取花序上第一朵花開放后的主枝、一級分枝、二級分枝和三級分枝上的蘿卜花蕾，經(jīng)4℃低溫處理1d～3d，備用。制備時，選取長度2.5mm～3mm的完整花蕾，去除殘次的和長度不符的花蕾。將選取的花蕾放入燒杯中，清水沖洗30min，倒出水將花蕾放入超凈工作臺備用。6.2.3花蕾消毒先將沖洗干凈的花蕾用乙醇表面消毒30s，期間搖動燒杯，燒杯間不要碰撞。然后使用次氯酸鈉深度消毒15min，期間多次搖動燒杯，燒杯間不要碰撞，每次搖動結(jié)束后，要用乙醇擦拭臺面。最后，使用無菌水清洗5min，期間搖動燒杯，充分清洗，此步驟重復(fù)操作3次，燒杯間不要碰撞，完成清洗后用乙醇擦拭臺面。6.2.4研磨花蕾將消毒過的花蕾放于研缽中，倒入B5液體培養(yǎng)基，液面高出花蕾即可，輕敲研缽，使所有花蕾破裂，花粉釋放出即可，加入B5液體培養(yǎng)基定容到10ml。DB1308/T321—202346.2.5花蕾液過濾將研磨好的10ml花蕾液倒入古式漏斗，經(jīng)400目紗網(wǎng)過濾后，移至10ml離心管，使用離心機(jī)1000r/min離心3min，倒掉上清液，倒入1mlB5液體培養(yǎng)基，將沉淀搖起，定容到10ml，經(jīng)3次反復(fù)操作后，倒掉上清液，得到純凈的花粉母細(xì)胞液。6.2.6分裝在純凈的花粉母細(xì)胞液中加入1ml改良1/2NLN培養(yǎng)基，將沉淀搖起垂懸，定容到10ml，分裝到10個60mm的培養(yǎng)皿中，每皿加入5ml改良1/2NLN培養(yǎng)基稀釋，并添加活性炭懸浮液1ml，最后用石蠟封口膜封口，培養(yǎng)皿表面做好標(biāo)記。6.2.7超凈工作臺注意事項超凈工作臺使用過程中，要求雙手不能離開臺內(nèi)，操作中雙手要低于物品、水平活動，每一步操作結(jié)束后都要用乙醇擦拭臺面消毒。6.3環(huán)境培養(yǎng)6.3.1現(xiàn)胚培養(yǎng)將分裝好的培養(yǎng)皿放入生化培養(yǎng)箱中，33℃避光熱激24h，后調(diào)至25℃避光培養(yǎng)2～3周，即可現(xiàn)胚。6.3.2再生培養(yǎng)在超凈工作臺環(huán)境下，用眼科鑷子將子葉型胚接種至B5固體培養(yǎng)基上。接種后在25℃自然光下培養(yǎng)，三周后子葉型胚發(fā)育成幼苗。6.3.3復(fù)壯培養(yǎng)在超凈工作臺環(huán)境下，取出幼苗，手術(shù)刀去除葉片和根區(qū)，長柄鑷子將剩余組織接種到新的B5固體培養(yǎng)基中，在25℃自然光下進(jìn)行培養(yǎng)，之后繼代培養(yǎng)3～5代，待苗莖粗達(dá)到0.1cm～0.2cm，萌發(fā)出2葉1心，具有一定抗性且生根后，進(jìn)行煉苗。如根系生長不完善，可在培養(yǎng)基中加入適量萘乙酸，促進(jìn)根系長成。6.4小孢子植株移栽打開瓶口鍛煉5d～7d，之后將苗取出洗凈根部瓊脂，移植于營養(yǎng)杯中，精心管理，在4℃~5℃低溫環(huán)境下10d～20d通過春化，3周后統(tǒng)計成活率，當(dāng)苗長到4葉1心時達(dá)到成苗標(biāo)準(zhǔn)，即可移栽定植。定植后，用