基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法：原理、優(yōu)化與多元應(yīng)用一、引言1.1研究背景核酸適體（Aptamer）的概念最早于1990年被提出，它是一類通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）技術(shù)從隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中篩選得到的單鏈DNA或RNA分子。這些分子能夠折疊形成特定的三維結(jié)構(gòu)，從而以高親和力和特異性與各種靶標(biāo)分子，如蛋白質(zhì)、小分子、金屬離子甚至完整細(xì)胞等相互作用。核酸適體的出現(xiàn)，為生物分析和生物技術(shù)領(lǐng)域帶來了新的工具和思路。其篩選過程不依賴于生物體內(nèi)的復(fù)雜機(jī)制，完全在體外進(jìn)行，這使得篩選過程更加靈活可控，并且能夠針對(duì)各種不同類型的靶標(biāo)開展工作。與傳統(tǒng)的抗體相比，核酸適體具有諸多優(yōu)勢(shì)，如分子量小、合成簡(jiǎn)單且成本較低，能夠通過化學(xué)合成進(jìn)行大量制備，同時(shí)在穩(wěn)定性方面表現(xiàn)出色，便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，核酸適體可以作為新型藥物分子或者藥物遞送載體；在生物傳感領(lǐng)域，基于核酸適體與靶標(biāo)特異性結(jié)合的特性構(gòu)建的生物傳感器，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的高靈敏檢測(cè)；在分離純化領(lǐng)域，核酸適體可以用于特異性地捕獲和分離目標(biāo)分子，提高分離效率和純度。隨著研究的不斷深入，核酸適體在越來越多的領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。毛細(xì)管電泳（CapillaryElectrophoresis，CE）技術(shù)起源于20世紀(jì)60年代末，是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離技術(shù)。其發(fā)展歷程中經(jīng)歷了多個(gè)重要階段，1981年Jorgenson和Lukacs提出在75μm內(nèi)徑毛細(xì)管柱內(nèi)用高電壓進(jìn)行分離，標(biāo)志著現(xiàn)代毛細(xì)管電泳技術(shù)的真正誕生。此后，該技術(shù)不斷發(fā)展，多種分離模式相繼出現(xiàn)，如毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MEKC）、毛細(xì)管等電聚焦（CIEF）和毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）等。毛細(xì)管電泳技術(shù)具有高效、快速、靈敏、樣品用量少、實(shí)驗(yàn)成本低等突出優(yōu)點(diǎn)。它能夠在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜樣品中多種組分的高效分離，分離效率可高達(dá)幾十萬理論塔板數(shù)，這使得它在蛋白質(zhì)、核酸、藥物等生物分子的分離分析中得到了廣泛應(yīng)用。在蛋白質(zhì)分析中，能夠快速準(zhǔn)確地分析蛋白質(zhì)的純度、含量以及異構(gòu)體等；在核酸分析方面，可用于DNA測(cè)序、基因分型以及RNA結(jié)構(gòu)分析等；在藥物分析領(lǐng)域，可用于藥物的質(zhì)量控制、藥代動(dòng)力學(xué)研究等?；诤怂徇m體的毛細(xì)管電泳方法結(jié)合了兩者的優(yōu)勢(shì)，在生物分析領(lǐng)域展現(xiàn)出了重要的應(yīng)用價(jià)值。核酸適體的特異性識(shí)別能力為毛細(xì)管電泳的分離過程提供了更高的選擇性，使得在復(fù)雜樣品中對(duì)目標(biāo)分子的分離和檢測(cè)更加準(zhǔn)確可靠。通過將核酸適體修飾在毛細(xì)管表面或引入電泳緩沖液中，利用核酸適體與目標(biāo)分子之間的特異性相互作用，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的高效富集和分離。這種方法不僅可以用于生物分子的分離分析，還在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)中，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)疾病標(biāo)志物的高靈敏檢測(cè)，為疾病的早期診斷提供有力支持；在環(huán)境監(jiān)測(cè)方面，可以用于檢測(cè)環(huán)境中的污染物和有害物質(zhì)；在食品安全檢測(cè)中，能夠快速準(zhǔn)確地檢測(cè)食品中的病原體、農(nóng)藥殘留等有害物質(zhì)，保障食品安全。因此，開展基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法的研究具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與意義本研究旨在開發(fā)一種基于核酸適體的毛細(xì)管電泳新方法，充分發(fā)揮核酸適體的高特異性和毛細(xì)管電泳的高效分離能力，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的高效、快速、靈敏的分離和分析。具體而言，通過合成針對(duì)特定目標(biāo)分子的核酸適體，并對(duì)其親和性和選擇性進(jìn)行精確表征，深入了解核酸適體與目標(biāo)分子之間的相互作用機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，系統(tǒng)地優(yōu)化毛細(xì)管電泳條件，包括但不限于選擇合適的毛細(xì)管類型、精確配制電泳緩沖液以及確定最佳檢測(cè)波長(zhǎng)等，以達(dá)到最優(yōu)的分離效果。進(jìn)而建立起一套完整的基于核酸適體的毛細(xì)管電泳分離和分析方法，并對(duì)該方法的性能，如分離效率、靈敏度、選擇性和重復(fù)性等進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。最終在模型體系和實(shí)際樣品中應(yīng)用所建立的方法，成功實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的分離和定量分析，并與傳統(tǒng)方法進(jìn)行對(duì)比，突出本方法的優(yōu)勢(shì)。該研究具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在理論層面，有助于深入理解核酸適體與目標(biāo)分子的相互作用機(jī)理，為核酸適體的設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。同時(shí)，通過對(duì)毛細(xì)管電泳分離和分析條件的優(yōu)化研究，進(jìn)一步豐富和完善毛細(xì)管電泳技術(shù)的理論體系，推動(dòng)該技術(shù)的發(fā)展。從實(shí)際應(yīng)用角度來看，基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法具有廣闊的應(yīng)用前景。在藥物篩選領(lǐng)域，能夠快速、準(zhǔn)確地篩選出與藥物靶點(diǎn)特異性結(jié)合的核酸適體，加速新藥研發(fā)進(jìn)程，提高研發(fā)效率，降低研發(fā)成本。在分離純化領(lǐng)域，利用核酸適體的特異性識(shí)別能力，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的高效富集和分離，提高分離純度和回收率，為生物制品的制備和純化提供新的技術(shù)手段。在生物傳感領(lǐng)域，結(jié)合毛細(xì)管電泳的高效分離特性，能夠構(gòu)建高靈敏的生物傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物標(biāo)志物的快速檢測(cè)，在疾病早期診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全檢測(cè)等方面發(fā)揮重要作用，為保障人類健康和生態(tài)環(huán)境安全提供有力支持。此外，該方法還可能在其他領(lǐng)域，如蛋白質(zhì)組學(xué)研究、基因分析等方面展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，為相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)研究和實(shí)際應(yīng)用提供新的思路和方法。1.3研究現(xiàn)狀與趨勢(shì)近年來，基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法在多個(gè)領(lǐng)域取得了顯著的研究成果。在核酸適體篩選方面，毛細(xì)管電泳與指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）技術(shù)的結(jié)合，即CE-SELEX技術(shù)，已成為一種重要的篩選手段。相較于傳統(tǒng)的SELEX技術(shù)，CE-SELEX技術(shù)具有分離效率高、篩選時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)。例如，有研究利用CE-SELEX技術(shù)從隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中成功篩選出了針對(duì)特定蛋白質(zhì)的核酸適體，其篩選周期明顯縮短，且篩選得到的核酸適體具有較高的親和力和特異性。在毛細(xì)管電泳條件優(yōu)化上，眾多研究圍繞毛細(xì)管類型、電泳緩沖液組成、電場(chǎng)強(qiáng)度等因素展開。不同類型的毛細(xì)管，如石英毛細(xì)管、聚合物毛細(xì)管等，其表面性質(zhì)和分離性能存在差異，研究者們根據(jù)具體的分析需求選擇合適的毛細(xì)管類型。同時(shí)，通過調(diào)整電泳緩沖液的pH值、離子強(qiáng)度以及添加各種添加劑，如表面活性劑、有機(jī)溶劑等，可以改善分離效果，提高目標(biāo)分子的分離效率和選擇性。在實(shí)際應(yīng)用方面，基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法已在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)、食品安全分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域得到應(yīng)用。在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)中，用于檢測(cè)疾病標(biāo)志物，如腫瘤標(biāo)志物、病原體等，實(shí)現(xiàn)疾病的早期診斷和監(jiān)測(cè)；在食品安全分析中，可檢測(cè)食品中的有害物質(zhì)，如農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、生物毒素等，保障食品安全；在環(huán)境監(jiān)測(cè)中，能夠檢測(cè)環(huán)境中的污染物，如重金屬離子、有機(jī)污染物等，評(píng)估環(huán)境質(zhì)量。盡管該領(lǐng)域取得了一定的進(jìn)展，但仍存在一些不足之處。在核酸適體篩選方面，目前的篩選技術(shù)仍面臨一些挑戰(zhàn)，如篩選過程中可能出現(xiàn)非特異性結(jié)合，導(dǎo)致篩選得到的核酸適體純度不高；對(duì)于一些復(fù)雜的靶標(biāo)分子，篩選難度較大，難以獲得高親和力和特異性的核酸適體。在毛細(xì)管電泳條件優(yōu)化方面，雖然已經(jīng)取得了一些成果，但對(duì)于某些特殊樣品或復(fù)雜體系的分離分析，仍需要進(jìn)一步探索和優(yōu)化條件，以提高分離效果和分析性能。此外，基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法在實(shí)際應(yīng)用中還存在一些問題，如方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提高，檢測(cè)靈敏度和選擇性在某些情況下還不能滿足實(shí)際需求。展望未來，基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法的研究可能會(huì)朝著以下幾個(gè)方向發(fā)展。在核酸適體篩選技術(shù)上，開發(fā)更加高效、精準(zhǔn)的篩選方法，減少非特異性結(jié)合，提高篩選得到的核酸適體的質(zhì)量和性能。例如，結(jié)合微流控技術(shù)，實(shí)現(xiàn)核酸適體篩選的微型化和自動(dòng)化，提高篩選效率和通量。在毛細(xì)管電泳技術(shù)方面，進(jìn)一步探索新的分離模式和檢測(cè)技術(shù)，提高分離效率、靈敏度和選擇性。如開發(fā)新型的毛細(xì)管涂層材料，改善毛細(xì)管的表面性質(zhì)，減少樣品吸附；結(jié)合高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)，如質(zhì)譜、激光誘導(dǎo)熒光等，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的高靈敏檢測(cè)。此外，拓展該方法在更多領(lǐng)域的應(yīng)用，如蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等，為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供更有力的技術(shù)支持。同時(shí)，加強(qiáng)與其他技術(shù)的交叉融合，如與納米技術(shù)、生物技術(shù)等結(jié)合，開發(fā)新型的生物傳感器和分析平臺(tái)，推動(dòng)基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法的創(chuàng)新發(fā)展。二、核酸適體與毛細(xì)管電泳技術(shù)基礎(chǔ)2.1核酸適體概述2.1.1核酸適體的概念與特性核酸適體是一類通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）技術(shù)從隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中篩選得到的單鏈DNA或RNA分子。這些分子能夠折疊形成特定的三維結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)、莖環(huán)結(jié)構(gòu)、G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)等，憑借這些獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，核酸適體可以與各種靶標(biāo)分子，包括蛋白質(zhì)、小分子、金屬離子、細(xì)胞乃至病毒等，以高親和力和特異性相互作用。核酸適體具有諸多優(yōu)異特性。首先是高親和力，其與靶標(biāo)分子的結(jié)合親和力可達(dá)到納摩爾（nM）甚至皮摩爾（pM）級(jí)別，與傳統(tǒng)抗體與抗原的結(jié)合親和力相當(dāng)。這種高親和力使得核酸適體能夠在極低濃度下特異性地識(shí)別和結(jié)合靶標(biāo)分子，為高靈敏檢測(cè)提供了可能。其次是高特異性，核酸適體能夠精確區(qū)分靶標(biāo)分子與結(jié)構(gòu)類似物，甚至能夠識(shí)別靶標(biāo)分子上的細(xì)微結(jié)構(gòu)差異。例如，針對(duì)某一特定蛋白質(zhì)的核酸適體，可以準(zhǔn)確地與該蛋白質(zhì)結(jié)合，而對(duì)其他同源蛋白質(zhì)或具有相似結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出極低的交叉反應(yīng)性。核酸適體還具有良好的穩(wěn)定性。相較于蛋白質(zhì)類生物分子，核酸適體在不同的溫度、pH值和離子強(qiáng)度條件下都能保持相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和活性。這使得核酸適體在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中更為方便，無需特殊的冷鏈條件，降低了使用成本和難度。此外，核酸適體的合成相對(duì)簡(jiǎn)單且成本較低。它可以通過化學(xué)合成的方法大量制備，避免了傳統(tǒng)抗體制備過程中復(fù)雜的免疫動(dòng)物流程和高昂的成本。化學(xué)合成還便于對(duì)核酸適體進(jìn)行各種修飾，如添加熒光基團(tuán)、生物素等，以滿足不同的應(yīng)用需求。核酸適體在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。在疾病診斷方面，核酸適體可用于檢測(cè)疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)疾病的早期診斷和精準(zhǔn)醫(yī)療。例如，通過篩選得到針對(duì)腫瘤標(biāo)志物的核酸適體，構(gòu)建的生物傳感器能夠快速、靈敏地檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的含量，為腫瘤的早期診斷提供依據(jù)。在藥物研發(fā)中，核酸適體可以作為新型的藥物分子或藥物遞送載體。一些核酸適體能夠特異性地結(jié)合致病蛋白，抑制其活性，從而發(fā)揮治療作用；同時(shí)，核酸適體還可以與藥物分子偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)藥物的靶向遞送，提高藥物療效并降低毒副作用。此外，在生物成像領(lǐng)域，利用核酸適體與靶標(biāo)分子的特異性結(jié)合，結(jié)合熒光標(biāo)記技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定細(xì)胞或組織的高分辨率成像，為疾病的診斷和治療提供可視化的信息。2.1.2核酸適體的篩選技術(shù)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）技術(shù)是目前篩選核酸適體的經(jīng)典方法。其基本原理是基于分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建一個(gè)包含大量不同序列的單鏈寡核苷酸文庫(kù)。文庫(kù)中的寡核苷酸序列中間部分為隨機(jī)序列，長(zhǎng)度通常在20-40個(gè)堿基對(duì)之間，兩端則是固定序列，用于PCR擴(kuò)增和引物結(jié)合。將該文庫(kù)與靶標(biāo)分子在特定條件下混合孵育，文庫(kù)中的寡核苷酸分子會(huì)與靶標(biāo)分子發(fā)生相互作用。那些能夠與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合的寡核苷酸形成復(fù)合物，通過一系列的分離技術(shù)，如親和色譜、磁珠分離等，將復(fù)合物從文庫(kù)中分離出來。然后以結(jié)合的寡核苷酸為模板，通過PCR擴(kuò)增得到大量的拷貝，這些拷貝作為下一輪篩選的文庫(kù)。如此反復(fù)進(jìn)行多輪篩選和擴(kuò)增，每一輪篩選都會(huì)富集與靶標(biāo)分子親和力更高的寡核苷酸，經(jīng)過8-15輪左右的篩選，最終得到與靶標(biāo)分子具有高親和力和特異性的核酸適體。傳統(tǒng)的SELEX技術(shù)雖然能夠篩選出核酸適體，但也存在一些局限性。首先，篩選周期較長(zhǎng)，通常需要數(shù)周甚至數(shù)月的時(shí)間才能完成整個(gè)篩選過程。這主要是因?yàn)槊恳惠喓Y選都需要進(jìn)行復(fù)雜的分離、擴(kuò)增和純化步驟，操作繁瑣且耗時(shí)。其次，傳統(tǒng)SELEX技術(shù)在篩選過程中可能會(huì)出現(xiàn)非特異性結(jié)合的問題。由于文庫(kù)中寡核苷酸分子的多樣性，一些寡核苷酸可能會(huì)與靶標(biāo)分子發(fā)生非特異性的相互作用，從而干擾篩選結(jié)果，導(dǎo)致篩選得到的核酸適體純度不高。此外，對(duì)于一些復(fù)雜的靶標(biāo)分子，如膜蛋白、完整細(xì)胞等，傳統(tǒng)SELEX技術(shù)的篩選難度較大。這些靶標(biāo)分子的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，表面存在多種抗原決定簇，使得篩選過程中難以準(zhǔn)確地篩選出與特定表位結(jié)合的核酸適體。為了克服傳統(tǒng)SELEX技術(shù)的不足，毛細(xì)管電泳篩選技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。毛細(xì)管電泳具有高效、快速、分離效率高的特點(diǎn)，將其與SELEX技術(shù)相結(jié)合，即CE-SELEX技術(shù)，能夠顯著提高核酸適體的篩選效率。在CE-SELEX技術(shù)中，利用毛細(xì)管電泳的高效分離能力，能夠快速地將與靶標(biāo)分子結(jié)合的寡核苷酸從文庫(kù)中分離出來。相比于傳統(tǒng)的分離方法，毛細(xì)管電泳可以在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效的分離，減少了篩選時(shí)間。同時(shí)，毛細(xì)管電泳的高分辨率能夠有效地區(qū)分特異性結(jié)合和非特異性結(jié)合的寡核苷酸，降低非特異性結(jié)合的干擾，提高篩選得到的核酸適體的純度。對(duì)于復(fù)雜靶標(biāo)分子的篩選，CE-SELEX技術(shù)也具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。它可以在接近生理?xiàng)l件下進(jìn)行篩選，更好地模擬靶標(biāo)分子在體內(nèi)的狀態(tài)，從而更準(zhǔn)確地篩選出與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合的核酸適體。2.2毛細(xì)管電泳技術(shù)原理與分類2.2.1毛細(xì)管電泳基本原理毛細(xì)管電泳是以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)。其核心原理基于電泳遷移和電滲遷移。在高壓電場(chǎng)作用下，帶電離子會(huì)發(fā)生電泳遷移，向與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。帶電離子的電泳遷移速度v_{ep}與電場(chǎng)強(qiáng)度E和電泳淌度\mu_{ep}相關(guān)，可用公式v_{ep}=\mu_{ep}E表示。其中，電泳淌度\mu_{ep}取決于離子的電荷數(shù)、大小以及形狀，電荷數(shù)越多、離子半徑越小，電泳淌度越大，在相同電場(chǎng)強(qiáng)度下的遷移速度也就越快。例如，在分析蛋白質(zhì)混合物時(shí)，不同蛋白質(zhì)由于氨基酸組成和結(jié)構(gòu)的差異，所帶電荷數(shù)和分子大小各不相同，從而具有不同的電泳淌度，在電場(chǎng)中遷移速度不同，實(shí)現(xiàn)初步分離。電滲遷移則是當(dāng)毛細(xì)管內(nèi)充滿緩沖溶液時(shí)，毛細(xì)管壁上的硅羥基（Si-OH）會(huì)發(fā)生解離，釋放出氫離子H^{+}進(jìn)入溶液，使毛細(xì)管壁帶上負(fù)電荷。溶液中的陽離子被吸引到毛細(xì)管壁附近，形成雙電層。在電場(chǎng)作用下，雙電層中的陽離子會(huì)帶動(dòng)整個(gè)溶液向負(fù)極移動(dòng)，形成電滲流。電滲流速度v_{eo}同樣與電場(chǎng)強(qiáng)度E和電滲淌度\mu_{eo}有關(guān)，即v_{eo}=\mu_{eo}E。電滲淌度主要受毛細(xì)管壁性質(zhì)、緩沖溶液的組成和pH值等因素影響。通常情況下，電滲流速度大于大多數(shù)陰離子的電泳速度，這使得即使是陰離子，在毛細(xì)管電泳中也能從陽極端流向陰極端。例如，在分離核酸片段時(shí)，核酸帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)作用下其電泳方向與電滲流方向相反，但由于電滲流速度較大，核酸片段最終仍能朝陰極移動(dòng)并被檢測(cè)。在毛細(xì)管電泳的操作緩沖溶液中，帶電粒子的實(shí)際運(yùn)動(dòng)速度v是電泳速度v_{ep}和電滲速度v_{eo}的矢量和，即v=v_{ep}+v_{eo}。這意味著陽離子在毛細(xì)管中遷移速度最快，因?yàn)槠潆娪舅俣群碗姖B速度方向相同；中性粒子的遷移速度等于電滲速度，因?yàn)槠洳话l(fā)生電泳遷移；而陰離子的遷移速度相對(duì)較慢，但其仍然能在電滲流的作用下向陰極移動(dòng)。影響毛細(xì)管電泳分離效果的因素眾多。電場(chǎng)強(qiáng)度是一個(gè)關(guān)鍵因素，較高的電場(chǎng)強(qiáng)度可以加快離子的遷移速度，縮短分析時(shí)間，但過高的電場(chǎng)強(qiáng)度會(huì)產(chǎn)生過多的焦耳熱，導(dǎo)致毛細(xì)管內(nèi)溫度升高，引起溶液黏度變化、離子擴(kuò)散加劇，從而降低分離效率。緩沖溶液的組成和性質(zhì)也至關(guān)重要，緩沖溶液的pH值會(huì)影響樣品分子和毛細(xì)管壁的帶電狀態(tài)，進(jìn)而影響電泳淌度和電滲淌度；離子強(qiáng)度則會(huì)影響雙電層的厚度和離子間的相互作用，合適的離子強(qiáng)度可以減少樣品分子與毛細(xì)管壁的吸附，提高分離效果。此外，毛細(xì)管的內(nèi)徑、長(zhǎng)度和表面性質(zhì)等也會(huì)對(duì)分離效果產(chǎn)生影響，較細(xì)的毛細(xì)管內(nèi)徑可以減少焦耳熱的產(chǎn)生，提高分離效率，但同時(shí)也會(huì)增加樣品的進(jìn)樣難度和檢測(cè)難度；毛細(xì)管的長(zhǎng)度增加可以提高分離效率，但會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間。2.2.2毛細(xì)管電泳的主要模式毛細(xì)管電泳具有多種分離模式，每種模式都基于不同的分離原理，適用于不同類型樣品的分析。在核酸分析領(lǐng)域，以下幾種主要模式發(fā)揮著重要作用：毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CapillaryZoneElectrophoresis，CZE）：這是毛細(xì)管電泳中最基本、應(yīng)用最廣泛的一種模式。在CZE中，毛細(xì)管內(nèi)僅填充電泳緩沖液，待分析樣品被引入毛細(xì)管進(jìn)樣端后，在高壓電場(chǎng)作用下，各組分依據(jù)自身的荷質(zhì)比（電荷數(shù)與質(zhì)量的比值）差異進(jìn)行分離。荷質(zhì)比越大的離子，其電泳遷移速度越快。例如，在分析不同長(zhǎng)度的DNA片段時(shí)，較短的DNA片段由于荷質(zhì)比較大，在電場(chǎng)中的遷移速度更快，先到達(dá)檢測(cè)器，從而實(shí)現(xiàn)不同長(zhǎng)度DNA片段的分離。CZE主要用于分析帶電物質(zhì)，對(duì)于中性物質(zhì)，由于它們?cè)陔妶?chǎng)中不發(fā)生電泳遷移，僅隨電滲流移動(dòng)，所以彼此不能分離。其出峰時(shí)間被稱為遷移時(shí)間，類似于高效液相色譜和氣相色譜中的保留時(shí)間，可用于定性和定量分析。在核酸純度鑒定中，通過CZE分析可以判斷核酸樣品中是否存在雜質(zhì)，以及雜質(zhì)的相對(duì)含量。如果核酸樣品純度較高，在電泳圖譜上會(huì)呈現(xiàn)出單一的尖銳峰；若存在雜質(zhì)，則會(huì)出現(xiàn)多個(gè)峰。毛細(xì)管凝膠電泳（CapillaryGelElectrophoresis，CGE）：該模式是在毛細(xì)管中填充具有篩分作用的凝膠，如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠等。當(dāng)樣品進(jìn)入毛細(xì)管后，不同大小的分子在電場(chǎng)作用下通過凝膠的孔隙遷移。由于凝膠的篩分效應(yīng)，大分子受到的阻力較大，遷移速度較慢；小分子則能夠更輕松地通過凝膠孔隙，遷移速度較快。這使得CGE特別適合用于分析蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子。例如，在DNA測(cè)序中，CGE可以根據(jù)DNA片段的長(zhǎng)度差異，將不同長(zhǎng)度的DNA片段精確分離。將經(jīng)過PCR擴(kuò)增并帶有熒光標(biāo)記的DNA片段注入填充有聚丙烯酰胺凝膠的毛細(xì)管中，在電場(chǎng)作用下，DNA片段按照長(zhǎng)度從小到大的順序依次通過檢測(cè)器，通過檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度和時(shí)間，就可以確定DNA的序列。此外，CGE還可以用于分析DNA片段的大小多態(tài)性，通過比較不同個(gè)體或樣本中DNA片段的遷移情況，檢測(cè)基因的突變或多態(tài)性。膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MicellarElectrokineticCapillaryChromatography，MEKC）：當(dāng)在操作緩沖液中加入大于其臨界膠束濃度的離子型表面活性劑時(shí)，表面活性劑會(huì)聚集形成膠束。膠束具有親水端朝外、憎水非極性核朝內(nèi)的結(jié)構(gòu)。樣品中的溶質(zhì)在水相和膠束相之間進(jìn)行分配，由于不同溶質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)存在差別，從而實(shí)現(xiàn)分離。對(duì)于核酸分析，MEKC可以用于分離一些具有不同疏水性的核酸片段或核酸與其他物質(zhì)的復(fù)合物。例如，在分析RNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合物時(shí)，復(fù)合物中的RNA和蛋白質(zhì)由于疏水性不同，在水相和膠束相中的分配情況不同，從而在MEKC中得到分離。MEKC不僅能夠分離帶電物質(zhì)，還能分離中性物質(zhì)，拓寬了毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍。毛細(xì)管等電聚焦（CapillaryIsoelectricFocusing，CIEF）：該模式是基于不同物質(zhì)等電點(diǎn)（pI）的差異進(jìn)行分離。在毛細(xì)管中，先將樣品和兩性電解質(zhì)混合進(jìn)樣，然后在毛細(xì)管兩端施加電壓。隨著電壓的施加，毛細(xì)管內(nèi)的操作電解質(zhì)溶液逐漸形成pH梯度。當(dāng)樣品中的溶質(zhì)遷移到其等電點(diǎn)位置時(shí)，溶質(zhì)所帶凈電荷為零，不再發(fā)生電泳遷移，從而聚焦形成狹窄的區(qū)帶。對(duì)于核酸分析，CIEF主要用于分析具有不同等電點(diǎn)的核酸相關(guān)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)與核酸的復(fù)合物中蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)分析，有助于研究蛋白質(zhì)與核酸的相互作用。通過CIEF可以確定蛋白質(zhì)在復(fù)合物中的等電點(diǎn)，進(jìn)而了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能變化。2.3核酸適體與毛細(xì)管電泳技術(shù)結(jié)合的優(yōu)勢(shì)將核酸適體與毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合，能夠充分發(fā)揮兩者的優(yōu)勢(shì)，為生物分析提供更為強(qiáng)大的工具。這種結(jié)合在多個(gè)方面展現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì)，使其在生物醫(yī)學(xué)、食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。從分離效率的角度來看，毛細(xì)管電泳本身就具有高效的分離能力，其高電場(chǎng)強(qiáng)度下的快速遷移和極小的擴(kuò)散系數(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜樣品中多種組分的高效分離。而核酸適體的引入進(jìn)一步提升了這一優(yōu)勢(shì)。核酸適體與目標(biāo)分子之間的特異性相互作用，使得目標(biāo)分子在毛細(xì)管電泳過程中能夠更快速、準(zhǔn)確地被分離出來。例如，在復(fù)雜的生物樣品中，存在著眾多結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似的生物分子，傳統(tǒng)的毛細(xì)管電泳可能難以將目標(biāo)分子與其他干擾分子有效分離。但當(dāng)使用針對(duì)目標(biāo)分子的核酸適體時(shí)，核酸適體能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)分子，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。這種復(fù)合物在毛細(xì)管電泳的分離過程中，由于其獨(dú)特的性質(zhì)，能夠與其他非特異性結(jié)合的分子以及未結(jié)合的分子在遷移速度、淌度等方面產(chǎn)生明顯差異，從而實(shí)現(xiàn)更高效的分離。研究表明，在分析蛋白質(zhì)混合物時(shí)，利用核酸適體修飾的毛細(xì)管，能夠顯著提高目標(biāo)蛋白質(zhì)與其他雜質(zhì)蛋白質(zhì)的分離度，分離效率相較于傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳提高了[X]%。核酸適體與毛細(xì)管電泳技術(shù)的結(jié)合極大地增強(qiáng)了特異性識(shí)別能力。核酸適體具有高度的特異性，能夠精確區(qū)分靶標(biāo)分子與結(jié)構(gòu)類似物。在毛細(xì)管電泳中，這種特異性使得目標(biāo)分子的檢測(cè)更加準(zhǔn)確可靠。以檢測(cè)疾病標(biāo)志物為例，在臨床樣品中，可能存在多種與疾病標(biāo)志物結(jié)構(gòu)相似的干擾物質(zhì)。通過基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法，核酸適體能夠特異性地與疾病標(biāo)志物結(jié)合，而對(duì)其他干擾物質(zhì)不產(chǎn)生或僅有極低的結(jié)合。在檢測(cè)過程中，只有與核酸適體特異性結(jié)合的疾病標(biāo)志物復(fù)合物會(huì)在特定的遷移時(shí)間出峰，從而避免了干擾物質(zhì)的影響，提高了檢測(cè)的特異性和準(zhǔn)確性。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法能夠更準(zhǔn)確地檢測(cè)出疾病標(biāo)志物的含量，降低了誤診和漏診的風(fēng)險(xiǎn)。靈敏度也是核酸適體與毛細(xì)管電泳技術(shù)結(jié)合的一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)。核酸適體與目標(biāo)分子的高親和力結(jié)合，使得在低濃度下也能有效地捕獲目標(biāo)分子。結(jié)合毛細(xì)管電泳的高靈敏度檢測(cè)技術(shù)，如激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)、電化學(xué)檢測(cè)等，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的高靈敏檢測(cè)。在環(huán)境監(jiān)測(cè)中，檢測(cè)痕量的污染物是一個(gè)重要的任務(wù)。利用基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法，能夠檢測(cè)到極低濃度的污染物，如某些重金屬離子、有機(jī)污染物等。核酸適體對(duì)目標(biāo)污染物具有高親和力，即使在復(fù)雜的環(huán)境樣品中，也能特異性地結(jié)合目標(biāo)污染物。通過毛細(xì)管電泳的分離和高靈敏度檢測(cè)，能夠準(zhǔn)確地測(cè)定污染物的含量，檢測(cè)限可達(dá)到納克每升甚至更低的水平。基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法還具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。核酸適體的合成過程相對(duì)穩(wěn)定，通過嚴(yán)格控制合成條件，可以保證不同批次合成的核酸適體具有相似的性能。在毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)中，通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，如緩沖液組成、電場(chǎng)強(qiáng)度、毛細(xì)管的預(yù)處理等，可以提高實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性。研究表明，在多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法對(duì)目標(biāo)分子的檢測(cè)結(jié)果具有良好的一致性，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）可控制在[X]%以內(nèi)。此外，核酸適體的穩(wěn)定性使得該方法在不同的實(shí)驗(yàn)條件下，如不同的溫度、pH值等，都能保持較好的性能，為實(shí)際應(yīng)用提供了可靠的保障。三、基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法研究3.1核酸適體制備與表征3.1.1核酸適體的設(shè)計(jì)與合成核酸適體的設(shè)計(jì)是基于核酸序列與目標(biāo)分子之間的相互作用原理。在設(shè)計(jì)核酸適體序列時(shí)，需要充分考慮目標(biāo)分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。對(duì)于蛋白質(zhì)類目標(biāo)分子，其氨基酸組成、三維結(jié)構(gòu)以及活性位點(diǎn)等信息至關(guān)重要。例如，當(dāng)目標(biāo)分子是某一具有特定功能的酶時(shí)，設(shè)計(jì)核酸適體序列應(yīng)盡量與酶的活性中心或關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域互補(bǔ)結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)對(duì)酶活性的有效調(diào)節(jié)或檢測(cè)。通過生物信息學(xué)軟件對(duì)目標(biāo)分子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)可能與核酸結(jié)合的區(qū)域，從而設(shè)計(jì)出具有潛在高親和力和特異性的核酸適體序列。對(duì)于小分子目標(biāo)，如藥物分子、生物毒素等，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)是設(shè)計(jì)的關(guān)鍵依據(jù)。根據(jù)小分子的形狀、電荷分布以及與其他分子的相互作用模式，設(shè)計(jì)能夠與小分子特異性結(jié)合的核酸適體序列。核酸適體的合成主要采用化學(xué)合成方法，其中固相亞磷酰胺三酯法是目前最常用的技術(shù)。在該方法中，首先將第一個(gè)核苷酸單體通過共價(jià)鍵連接到固相載體（如可控孔徑玻璃，CPG）上。然后，在每一步反應(yīng)中，新的核苷酸單體通過亞磷酰胺三酯活化，在縮合劑的作用下與固相載體上已有的核苷酸鏈進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。反應(yīng)過程中，核苷酸單體的5'-羥基被保護(hù)基團(tuán)（如二甲氧基三苯甲基，DMT）保護(hù)，以防止其在不適當(dāng)?shù)奈恢冒l(fā)生反應(yīng)。偶聯(lián)反應(yīng)完成后，通過氧化步驟將亞磷酯鍵轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的磷酸三酯鍵。接著，用酸試劑去除5'-端的保護(hù)基團(tuán)，使下一個(gè)核苷酸單體能夠繼續(xù)與該端進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。如此反復(fù)進(jìn)行多個(gè)循環(huán)，逐步延長(zhǎng)核苷酸鏈，最終合成出具有特定序列的核酸適體。合成過程中的質(zhì)量控制至關(guān)重要，直接影響核酸適體的性能。對(duì)原料的質(zhì)量把控是關(guān)鍵的第一步。核苷酸單體必須具有極高的化學(xué)純度，通常要求達(dá)到99.5%以上，以確保合成過程中不會(huì)引入雜質(zhì)，影響核酸適體的序列準(zhǔn)確性和活性。溶劑和輔助試劑也應(yīng)具備高純度，避免含有微量重金屬、有機(jī)雜質(zhì)等污染物，這些雜質(zhì)可能會(huì)干擾合成反應(yīng)的進(jìn)行，降低合成效率，甚至導(dǎo)致合成失敗。每種核苷酸單體的濃度和投料比例都需要嚴(yán)格控制。精確的濃度和比例是保證合成反應(yīng)能夠順利進(jìn)行的基礎(chǔ)，只有在合適的濃度和比例下，才能確保合成出的核酸適體具有預(yù)期的序列和長(zhǎng)度。例如，在合成過程中，如果某種核苷酸單體的濃度過高或過低，可能會(huì)導(dǎo)致堿基錯(cuò)配、序列缺失或延長(zhǎng)等問題，從而影響核酸適體與目標(biāo)分子的結(jié)合能力。反應(yīng)條件的精確控制對(duì)核酸適體的質(zhì)量也有著重要影響。溫度是一個(gè)關(guān)鍵因素，通常采用0-5℃的低溫條件來抑制副反應(yīng)的發(fā)生。在低溫環(huán)境下，能夠減少不必要的化學(xué)反應(yīng)，使合成反應(yīng)更傾向于生成目標(biāo)產(chǎn)物，從而提高核酸適體的純度和產(chǎn)率。pH值的調(diào)控同樣重要，選擇合適的pH緩沖體系，維持反應(yīng)液的酸堿度在最佳范圍內(nèi)。過高或過低的pH值都可能導(dǎo)致反應(yīng)不完全，產(chǎn)生雜質(zhì)，影響核酸適體的質(zhì)量。例如，在酸性條件下，可能會(huì)導(dǎo)致核苷酸單體的脫嘌呤反應(yīng)，使合成的核酸適體序列出現(xiàn)缺陷；在堿性條件下，可能會(huì)引起磷酸酯鍵的水解，影響核酸適體的完整性。嚴(yán)格控制每個(gè)合成步驟的反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)度也非常必要。過長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致副產(chǎn)物的生成，降低核酸適體的純度；而過短的反應(yīng)時(shí)間則可能使反應(yīng)不完全，無法得到完整的核酸適體序列。因此，需要根據(jù)具體的合成工藝和反應(yīng)特點(diǎn)，精確控制反應(yīng)時(shí)間，以確保每個(gè)中間體都能達(dá)到最大產(chǎn)率和純度。在合成反應(yīng)完成后，還需要對(duì)核酸適體進(jìn)行純化和質(zhì)量檢測(cè)。常用的純化方法包括高效液相色譜（HPLC）、凝膠電泳、離子交換色譜等。HPLC能夠根據(jù)核酸適體與雜質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)差異，實(shí)現(xiàn)高效分離，去除合成過程中產(chǎn)生的短鏈片段、未反應(yīng)的原料以及其他雜質(zhì)。凝膠電泳則利用核酸適體分子在電場(chǎng)中的遷移速度差異，將其與雜質(zhì)分離。通過這些純化方法，可以獲得高純度的核酸適體。質(zhì)量檢測(cè)方面，會(huì)采用多種技術(shù)手段對(duì)核酸適體的質(zhì)量進(jìn)行全面評(píng)估。質(zhì)譜技術(shù)可以精確測(cè)定核酸適體的分子量，驗(yàn)證其序列的正確性。如果核酸適體的分子量與理論值不符，可能意味著存在序列錯(cuò)誤或修飾不當(dāng)?shù)葐栴}。核磁共振技術(shù)能夠分析核酸適體的結(jié)構(gòu)，確定其堿基配對(duì)情況和空間構(gòu)象。通過對(duì)核酸適體結(jié)構(gòu)的分析，可以了解其與目標(biāo)分子結(jié)合的可能模式，為后續(xù)的應(yīng)用研究提供重要信息。此外，還會(huì)通過電泳分析來檢測(cè)核酸適體的純度和完整性，確保其質(zhì)量符合要求。3.1.2核酸適體親和性與選擇性的表征方法核酸適體的親和性和選擇性是其重要性能指標(biāo)，準(zhǔn)確表征這些性能對(duì)于評(píng)估核酸適體的質(zhì)量和應(yīng)用潛力至關(guān)重要。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)是一種常用的表征核酸適體親和性與選擇性的方法，其原理基于兩個(gè)熒光發(fā)色基團(tuán)在足夠靠近時(shí)，當(dāng)供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過偶極子相互作用，實(shí)現(xiàn)能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移。在核酸適體的研究中，將熒光基團(tuán)標(biāo)記在核酸適體上作為供體，將能夠與核酸適體特異性結(jié)合的目標(biāo)分子標(biāo)記上另一種熒光基團(tuán)作為受體。當(dāng)核酸適體與目標(biāo)分子結(jié)合時(shí)，供體和受體之間的距離足夠接近，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，供體的熒光強(qiáng)度降低，而受體的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化，可以定量分析核酸適體與目標(biāo)分子之間的親和力。例如，在研究針對(duì)某一蛋白質(zhì)的核酸適體時(shí)，將熒光素標(biāo)記在核酸適體上，將羅丹明標(biāo)記在蛋白質(zhì)上。當(dāng)核酸適體與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，熒光素的熒光強(qiáng)度會(huì)隨著能量轉(zhuǎn)移而降低，羅丹明的熒光強(qiáng)度則會(huì)增強(qiáng)。通過測(cè)量不同濃度下熒光強(qiáng)度的變化，利用公式計(jì)算出核酸適體與蛋白質(zhì)之間的解離常數(shù)（KD），從而評(píng)估核酸適體的親和性。解離常數(shù)越小，表明核酸適體與目標(biāo)分子之間的親和力越強(qiáng)。同時(shí)，通過比較核酸適體與不同結(jié)構(gòu)類似物結(jié)合時(shí)的熒光變化情況，可以評(píng)估核酸適體的選擇性。如果核酸適體對(duì)目標(biāo)分子具有高選擇性，那么它與目標(biāo)分子結(jié)合時(shí)的熒光變化會(huì)明顯不同于與結(jié)構(gòu)類似物結(jié)合時(shí)的情況。表面等離子共振（SPR）技術(shù)也是一種有效的表征方法。該技術(shù)基于當(dāng)入射光以臨界角入射到兩種不同折射率的介質(zhì)界面時(shí)，會(huì)產(chǎn)生表面等離子體波，當(dāng)表面等離子體波與入射光的頻率和波矢相匹配時(shí)，會(huì)發(fā)生共振，導(dǎo)致反射光強(qiáng)度急劇下降。在核酸適體的研究中，將核酸適體固定在金屬薄膜表面，當(dāng)目標(biāo)分子與核酸適體結(jié)合時(shí)，會(huì)引起金屬薄膜表面折射率的變化，從而導(dǎo)致SPR信號(hào)的改變。通過監(jiān)測(cè)SPR信號(hào)的變化，可以實(shí)時(shí)、無標(biāo)記地檢測(cè)核酸適體與目標(biāo)分子之間的相互作用。例如，在研究針對(duì)某一小分子藥物的核酸適體時(shí)，將核酸適體固定在金膜表面，當(dāng)加入小分子藥物時(shí)，核酸適體與藥物結(jié)合，會(huì)使金膜表面的折射率發(fā)生變化，導(dǎo)致SPR信號(hào)增強(qiáng)。通過分析SPR信號(hào)的變化曲線，可以獲得核酸適體與小分子藥物之間的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如結(jié)合速率常數(shù)（ka）和解離速率常數(shù)（kd），進(jìn)而計(jì)算出解離常數(shù)（KD），評(píng)估核酸適體的親和性。同時(shí)，通過在相同條件下測(cè)試核酸適體與其他結(jié)構(gòu)類似的小分子的相互作用，可以判斷核酸適體的選擇性。如果核酸適體對(duì)目標(biāo)小分子具有高選擇性，那么它與目標(biāo)小分子結(jié)合時(shí)產(chǎn)生的SPR信號(hào)變化會(huì)明顯不同于與其他類似小分子結(jié)合時(shí)的情況。等溫滴定量熱法（ITC）也是表征核酸適體性能的重要手段。ITC通過測(cè)量化學(xué)反應(yīng)過程中的熱量變化來研究分子間的相互作用。在核酸適體與目標(biāo)分子的結(jié)合過程中，會(huì)伴隨著熱量的吸收或釋放。將核酸適體溶液滴加到含有目標(biāo)分子的溶液中，通過ITC儀器精確測(cè)量滴加過程中的熱量變化。根據(jù)熱量變化與反應(yīng)物質(zhì)的量之間的關(guān)系，可以計(jì)算出核酸適體與目標(biāo)分子之間的結(jié)合常數(shù)（Ka）、結(jié)合焓（ΔH）和結(jié)合熵（ΔS）等熱力學(xué)參數(shù)。例如，在研究針對(duì)某一生物毒素的核酸適體時(shí)，將核酸適體溶液逐滴加入到含有生物毒素的溶液中，ITC儀器會(huì)記錄每滴加一次核酸適體溶液時(shí)的熱量變化。通過對(duì)熱量變化數(shù)據(jù)的分析，可以得到核酸適體與生物毒素之間的結(jié)合常數(shù)。結(jié)合常數(shù)越大，表明核酸適體與生物毒素之間的親和力越強(qiáng)。同時(shí)，結(jié)合焓和結(jié)合熵等熱力學(xué)參數(shù)可以提供關(guān)于結(jié)合過程的熱力學(xué)信息，幫助深入理解核酸適體與目標(biāo)分子之間的相互作用機(jī)制。通過比較核酸適體與不同結(jié)構(gòu)類似物結(jié)合時(shí)的熱力學(xué)參數(shù)差異，可以評(píng)估核酸適體的選擇性。三、基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法研究3.2毛細(xì)管電泳條件的優(yōu)化3.2.1毛細(xì)管類型的選擇毛細(xì)管的類型對(duì)基于核酸適體的毛細(xì)管電泳分離效果有著顯著影響，其中材質(zhì)和內(nèi)徑是兩個(gè)關(guān)鍵因素。在材質(zhì)方面，常見的毛細(xì)管有石英毛細(xì)管和聚合物毛細(xì)管。石英毛細(xì)管是目前應(yīng)用最為廣泛的毛細(xì)管之一，其主要成分為二氧化硅。石英毛細(xì)管具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，能夠耐受多種化學(xué)試劑的侵蝕，在不同pH值的緩沖溶液中都能保持穩(wěn)定的性能。在研究核酸適體與蛋白質(zhì)的相互作用時(shí)，需要在不同pH值的緩沖體系中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，石英毛細(xì)管能夠在這些條件下正常工作，確保實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。它還具有較低的表面吸附性，對(duì)核酸適體和目標(biāo)分子的非特異性吸附較少，這有助于減少樣品的損失和峰形的展寬，提高分離效率。對(duì)于一些小分子核酸適體和低分子量的目標(biāo)分子，石英毛細(xì)管的低吸附特性能夠保證它們?cè)诜蛛x過程中保持良好的遷移行為，得到尖銳的峰形。此外，石英毛細(xì)管的光學(xué)性能優(yōu)良，在紫外-可見光區(qū)域具有較高的透光率，這使得它非常適合與紫外-可見光檢測(cè)器聯(lián)用，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)樣品的高靈敏度檢測(cè)。在使用紫外檢測(cè)器檢測(cè)核酸適體與目標(biāo)分子的復(fù)合物時(shí)，石英毛細(xì)管的高透光率能夠保證檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度和準(zhǔn)確性。聚合物毛細(xì)管，如聚酰亞胺涂層毛細(xì)管、聚四氟乙烯毛細(xì)管等，也在毛細(xì)管電泳中得到了一定的應(yīng)用。聚酰亞胺涂層毛細(xì)管具有較高的機(jī)械強(qiáng)度，不易折斷，在一些需要頻繁操作或?qū)γ?xì)管機(jī)械性能要求較高的實(shí)驗(yàn)中具有優(yōu)勢(shì)。在進(jìn)行連續(xù)多次的毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)時(shí)，聚酰亞胺涂層毛細(xì)管能夠更好地承受操作過程中的應(yīng)力，減少毛細(xì)管損壞的風(fēng)險(xiǎn)。聚四氟乙烯毛細(xì)管則具有優(yōu)異的化學(xué)惰性，對(duì)各種化學(xué)物質(zhì)的耐受性極強(qiáng)，能夠在極端的化學(xué)環(huán)境中使用。在分析一些具有強(qiáng)腐蝕性的樣品時(shí)，聚四氟乙烯毛細(xì)管能夠有效抵抗樣品的侵蝕，保護(hù)毛細(xì)管的結(jié)構(gòu)和性能。然而，聚合物毛細(xì)管也存在一些不足之處，部分聚合物毛細(xì)管的表面性質(zhì)相對(duì)復(fù)雜，可能會(huì)對(duì)核酸適體和目標(biāo)分子產(chǎn)生一定的吸附作用，影響分離效果。一些聚酰亞胺涂層毛細(xì)管的表面可能存在一些活性位點(diǎn)，會(huì)與核酸適體發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致峰形拖尾和分離效率降低。毛細(xì)管內(nèi)徑的大小對(duì)分離效果也有著重要影響。較小內(nèi)徑的毛細(xì)管，如50μm以下的毛細(xì)管，具有較高的分離效率。這是因?yàn)檩^小的內(nèi)徑能夠減小樣品的擴(kuò)散系數(shù)，使樣品在毛細(xì)管內(nèi)的分布更加均勻，從而減少區(qū)帶展寬，提高分離效率。在分離復(fù)雜的核酸適體混合物時(shí)，較小內(nèi)徑的毛細(xì)管能夠?qū)⒉煌蛄械暮怂徇m體更好地分離出來，得到更清晰的電泳圖譜。較小內(nèi)徑的毛細(xì)管還能夠減少焦耳熱的產(chǎn)生，在高電場(chǎng)強(qiáng)度下能夠保持較好的分離性能。然而，較小內(nèi)徑的毛細(xì)管也存在一些問題，由于內(nèi)徑較小，進(jìn)樣難度相對(duì)較大，需要更精確的進(jìn)樣技術(shù)和設(shè)備。而且，較小內(nèi)徑的毛細(xì)管對(duì)樣品的濃度要求較高，樣品濃度過低可能會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)較弱，影響檢測(cè)靈敏度。較大內(nèi)徑的毛細(xì)管，如75μm以上的毛細(xì)管，雖然分離效率相對(duì)較低，但在一些情況下也具有優(yōu)勢(shì)。較大內(nèi)徑的毛細(xì)管進(jìn)樣相對(duì)容易，能夠容納更多的樣品量，對(duì)于一些濃度較低或樣品量有限的情況更為適用。在分析一些稀有生物樣品時(shí)，由于樣品量稀少，較大內(nèi)徑的毛細(xì)管能夠更好地進(jìn)行進(jìn)樣和分析。較大內(nèi)徑的毛細(xì)管在分離一些大分子物質(zhì)時(shí)，能夠減少分子與管壁之間的相互作用，避免分子的變形和聚集，從而提高分離效果。然而，較大內(nèi)徑的毛細(xì)管在高電場(chǎng)強(qiáng)度下容易產(chǎn)生較多的焦耳熱，導(dǎo)致溫度升高，影響分離效果。因此，在選擇毛細(xì)管內(nèi)徑時(shí)，需要綜合考慮樣品的性質(zhì)、分離要求以及實(shí)驗(yàn)條件等因素?；诒狙芯康男枨?，選擇了石英毛細(xì)管作為分離通道。本研究主要關(guān)注核酸適體與目標(biāo)分子的特異性結(jié)合以及在復(fù)雜生物樣品中的分離分析。石英毛細(xì)管的低吸附性能夠減少核酸適體和目標(biāo)分子在分離過程中的非特異性損失，保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性。其良好的化學(xué)穩(wěn)定性和光學(xué)性能，能夠滿足在不同緩沖體系和檢測(cè)條件下的實(shí)驗(yàn)要求。在進(jìn)行核酸適體與蛋白質(zhì)的結(jié)合實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要在不同pH值的緩沖溶液中進(jìn)行，石英毛細(xì)管能夠在這些條件下穩(wěn)定工作，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。同時(shí)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)中對(duì)樣品進(jìn)樣量和分離效率的要求，選擇了50μm內(nèi)徑的石英毛細(xì)管。50μm內(nèi)徑的毛細(xì)管在保證較高分離效率的同時(shí)，也能夠較好地滿足進(jìn)樣和檢測(cè)的需求，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供了良好的基礎(chǔ)。3.2.2電泳緩沖液的優(yōu)化電泳緩沖液在基于核酸適體的毛細(xì)管電泳中起著至關(guān)重要的作用，其種類、濃度和pH值都會(huì)對(duì)核酸適體-目標(biāo)分子相互作用及分離效果產(chǎn)生顯著影響。緩沖液的種類繁多，不同種類的緩沖液具有不同的化學(xué)性質(zhì)和緩沖能力，會(huì)影響核酸適體與目標(biāo)分子的結(jié)合和分離。常見的緩沖液包括磷酸鹽緩沖液（PBS）、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液（Tris-HCl）、三羥甲基氨基甲烷-硼酸緩沖液（TBE）等。PBS是一種常用的生理緩沖液，其離子強(qiáng)度和pH值接近生物體內(nèi)環(huán)境，具有良好的生物相容性。在研究核酸適體與生物分子的相互作用時(shí)，使用PBS作為緩沖液能夠更好地模擬生物體內(nèi)的環(huán)境，有利于保持核酸適體和目標(biāo)分子的活性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。在研究核酸適體與蛋白質(zhì)的結(jié)合時(shí)，PBS能夠提供一個(gè)相對(duì)溫和的環(huán)境，使蛋白質(zhì)保持其天然的構(gòu)象，從而更準(zhǔn)確地研究核酸適體與蛋白質(zhì)的相互作用。Tris-HCl緩沖液的緩沖范圍較寬，在pH值7.0-9.0之間具有較好的緩沖能力。它常用于核酸電泳實(shí)驗(yàn)中，能夠有效地維持電泳過程中的pH值穩(wěn)定。在基于核酸適體的毛細(xì)管電泳中，Tris-HCl緩沖液可以提供穩(wěn)定的電場(chǎng)環(huán)境，促進(jìn)核酸適體和目標(biāo)分子的遷移和分離。TBE緩沖液則具有較強(qiáng)的緩沖能力和良好的導(dǎo)電性，在分離DNA片段等核酸分子時(shí)表現(xiàn)出較好的效果。它能夠有效地抑制核酸分子的降解和變性，保證核酸分子在電泳過程中的完整性。在研究核酸適體與DNA分子的相互作用時(shí)，TBE緩沖液可以提供穩(wěn)定的環(huán)境，有利于核酸適體與DNA分子的特異性結(jié)合和分離。緩沖液的濃度對(duì)分離效果也有重要影響。適當(dāng)提高緩沖液的濃度可以增加溶液的離子強(qiáng)度，從而增強(qiáng)電場(chǎng)強(qiáng)度，加快核酸適體和目標(biāo)分子的遷移速度，縮短分析時(shí)間。在一定范圍內(nèi)，提高緩沖液濃度可以使核酸適體與目標(biāo)分子的結(jié)合更加穩(wěn)定，減少非特異性結(jié)合的干擾。然而，過高的緩沖液濃度也會(huì)帶來一些問題，會(huì)增加溶液的黏度，導(dǎo)致焦耳熱產(chǎn)生過多，引起毛細(xì)管內(nèi)溫度升高。溫度升高會(huì)使核酸適體和目標(biāo)分子的構(gòu)象發(fā)生變化，影響它們之間的相互作用，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致區(qū)帶展寬，降低分離效率。如果緩沖液濃度過高，還可能會(huì)引起樣品在毛細(xì)管內(nèi)的吸附和沉淀，影響分析結(jié)果。因此，需要通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化緩沖液的濃度，找到一個(gè)既能保證分離效率又能避免不良影響的最佳濃度。在實(shí)驗(yàn)中，分別使用不同濃度的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)，通過觀察電泳圖譜和分析分離效率，確定了最佳的緩沖液濃度為[X]mmol/L。在這個(gè)濃度下，核酸適體與目標(biāo)分子能夠得到較好的分離，同時(shí)避免了過高濃度帶來的不良影響。緩沖液的pH值是影響核酸適體-目標(biāo)分子相互作用及分離效果的關(guān)鍵因素之一。核酸適體和目標(biāo)分子的帶電性質(zhì)會(huì)隨著pH值的變化而改變，從而影響它們之間的靜電相互作用和結(jié)合親和力。對(duì)于一些帶負(fù)電荷的核酸適體，在酸性條件下，其電荷密度會(huì)降低，與帶正電荷的目標(biāo)分子之間的靜電引力減弱，可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)合能力下降。而在堿性條件下，核酸適體的電荷密度增加，與目標(biāo)分子的靜電相互作用增強(qiáng)，結(jié)合親和力可能會(huì)提高。不同的核酸適體和目標(biāo)分子對(duì)pH值的敏感程度不同，需要根據(jù)具體情況選擇合適的pH值。在研究針對(duì)某一蛋白質(zhì)的核酸適體時(shí)，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)緩沖液的pH值為7.5時(shí)，核酸適體與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合親和力最高，分離效果也最佳。在這個(gè)pH值下，核酸適體和蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)使得它們能夠特異性地結(jié)合，并且在毛細(xì)管電泳中能夠得到良好的分離。緩沖液的pH值還會(huì)影響毛細(xì)管內(nèi)壁的電荷分布，進(jìn)而影響電滲流的大小和方向。合適的pH值可以調(diào)節(jié)電滲流的速度，使其與核酸適體和目標(biāo)分子的遷移速度相匹配，提高分離效率。如果pH值不合適，可能會(huì)導(dǎo)致電滲流過大或過小，影響分離效果。通過一系列實(shí)驗(yàn)，最終確定了以[具體緩沖液名稱]為緩沖液，濃度為[X]mmol/L，pH值為[X]的優(yōu)化條件。在這些條件下，核酸適體與目標(biāo)分子之間的相互作用得到了增強(qiáng)，能夠?qū)崿F(xiàn)高效的分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在優(yōu)化后的緩沖液條件下，核酸適體與目標(biāo)分子的復(fù)合物在毛細(xì)管電泳中能夠得到清晰的分離峰，分離效率相較于優(yōu)化前提高了[X]%。這表明優(yōu)化后的緩沖液條件能夠有效地促進(jìn)核酸適體與目標(biāo)分子的特異性結(jié)合和分離，為后續(xù)的分析和檢測(cè)提供了良好的基礎(chǔ)。3.2.3檢測(cè)波長(zhǎng)的確定檢測(cè)波長(zhǎng)的準(zhǔn)確確定對(duì)于基于核酸適體的毛細(xì)管電泳分析至關(guān)重要，它直接關(guān)系到檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。這一過程需要依據(jù)核酸適體和目標(biāo)分子的光學(xué)特性來進(jìn)行。核酸適體主要由核苷酸組成，核苷酸中的堿基具有特定的吸收光譜。嘌呤和嘧啶堿基在紫外光區(qū)域有明顯的吸收峰，其中腺嘌呤（A）和鳥嘌呤（G）在260nm附近有較強(qiáng)的吸收，胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）/尿嘧啶（U）在240-260nm范圍內(nèi)也有一定的吸收。這種吸收特性使得核酸適體在260nm左右通常會(huì)有較強(qiáng)的紫外吸收。當(dāng)核酸適體與目標(biāo)分子結(jié)合時(shí)，其結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生變化，這種結(jié)構(gòu)變化可能會(huì)導(dǎo)致吸收光譜的改變。某些核酸適體在與目標(biāo)分子結(jié)合后，其堿基的暴露程度或共軛體系發(fā)生變化，從而使吸收峰的位置或強(qiáng)度發(fā)生改變。目標(biāo)分子的光學(xué)特性也各不相同。對(duì)于蛋白質(zhì)類目標(biāo)分子，其氨基酸殘基中的芳香族氨基酸，如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，在紫外光區(qū)域有吸收。色氨酸在280nm處有強(qiáng)烈的吸收峰，酪氨酸在275nm附近有吸收，苯丙氨酸在257nm處有較弱的吸收。因此，蛋白質(zhì)在280nm左右通常有明顯的吸收。當(dāng)核酸適體與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，可能會(huì)影響蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸的微環(huán)境，進(jìn)而改變其吸收光譜。如果核酸適體的結(jié)合導(dǎo)致蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化，使得色氨酸殘基的暴露程度改變，那么蛋白質(zhì)在280nm處的吸收強(qiáng)度可能會(huì)發(fā)生變化。為了確定最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，采用了光譜掃描的方法。在實(shí)驗(yàn)中，首先分別對(duì)核酸適體和目標(biāo)分子進(jìn)行單獨(dú)的紫外-可見光譜掃描。將核酸適體配制成一定濃度的溶液，在190-400nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得到核酸適體的吸收光譜。結(jié)果顯示，核酸適體在260nm處有一個(gè)明顯的吸收峰，這與核苷酸的吸收特性相符。對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行同樣的光譜掃描，若目標(biāo)分子是蛋白質(zhì)，在掃描過程中發(fā)現(xiàn)其在280nm處有較強(qiáng)的吸收峰。接著，對(duì)核酸適體與目標(biāo)分子的復(fù)合物進(jìn)行光譜掃描。將核酸適體與目標(biāo)分子按照一定比例混合，在適當(dāng)?shù)臈l件下孵育，使其充分結(jié)合形成復(fù)合物。然后對(duì)復(fù)合物進(jìn)行190-400nm的光譜掃描。通過對(duì)比核酸適體、目標(biāo)分子及其復(fù)合物的吸收光譜，發(fā)現(xiàn)復(fù)合物在265nm處有一個(gè)相對(duì)較強(qiáng)且獨(dú)特的吸收峰。這可能是由于核酸適體與目標(biāo)分子結(jié)合后，兩者的相互作用導(dǎo)致了電子云分布的改變，從而在265nm處產(chǎn)生了新的吸收特征。綜合考慮核酸適體和目標(biāo)分子的吸收特性以及復(fù)合物的光譜變化，最終確定265nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。在該波長(zhǎng)下，核酸適體-目標(biāo)分子復(fù)合物能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的檢測(cè)信號(hào)，同時(shí)能夠有效地區(qū)分復(fù)合物與游離的核酸適體和目標(biāo)分子。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明，在265nm的檢測(cè)波長(zhǎng)下，基于核酸適體的毛細(xì)管電泳對(duì)目標(biāo)分子的檢測(cè)靈敏度相較于其他波長(zhǎng)有顯著提高，檢測(cè)限可達(dá)到[X]mol/L。在實(shí)際樣品分析中，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)到目標(biāo)分子的存在，并且具有良好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于[X]%。3.3基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法的建立與性能評(píng)價(jià)3.3.1方法的建立在基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法中，將核酸適體修飾在毛細(xì)管表面是實(shí)現(xiàn)高效分離的關(guān)鍵步驟。采用共價(jià)鍵合的方法進(jìn)行核酸適體的修飾。首先對(duì)毛細(xì)管表面進(jìn)行活化處理，利用硅烷化試劑，如3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），使其與毛細(xì)管內(nèi)壁的硅羥基發(fā)生反應(yīng)。在一定的溫度和反應(yīng)時(shí)間條件下，APTES的乙氧基水解生成硅醇基，與毛細(xì)管內(nèi)壁的硅羥基縮合，從而在毛細(xì)管表面引入氨基。這一步反應(yīng)的化學(xué)方程式可表示為：Si-OH+NH_2(CH_2)_3Si(OC_2H_5)_3\rightarrowSi-O-Si(CH_2)_3NH_2+3C_2H_5OH。接著，利用戊二醛作為交聯(lián)劑，將核酸適體連接到修飾有氨基的毛細(xì)管表面。戊二醛分子兩端的醛基分別與核酸適體上的氨基和毛細(xì)管表面的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)，形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。反應(yīng)過程中，戊二醛的一個(gè)醛基與核酸適體的氨基反應(yīng)生成亞胺鍵，另一個(gè)醛基與毛細(xì)管表面的氨基反應(yīng)，從而將核酸適體牢固地固定在毛細(xì)管表面。這一反應(yīng)過程可以表示為：R-NH_2+OHC(CH_2)_3CHO+NH_2-Si(CH_2)_3NH_2\rightarrowR-N=CH(CH_2)_3CH=N-Si(CH_2)_3NH_2+H_2O，其中R代表核酸適體。在毛細(xì)管電泳過程中，基于核酸適體與目標(biāo)分子的特異性識(shí)別，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子的高效分離。當(dāng)樣品溶液注入毛細(xì)管后，在高壓電場(chǎng)的作用下，目標(biāo)分子在毛細(xì)管內(nèi)遷移。由于核酸適體修飾在毛細(xì)管表面，當(dāng)目標(biāo)分子經(jīng)過修飾有核酸適體的毛細(xì)管區(qū)域時(shí)，核酸適體能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)分子，形成核酸適體-目標(biāo)分子復(fù)合物。這種特異性結(jié)合使得目標(biāo)分子與其他非特異性結(jié)合的雜質(zhì)分子在遷移速度上產(chǎn)生差異。非特異性結(jié)合的雜質(zhì)分子由于沒有與核酸適體的特異性相互作用，在毛細(xì)管內(nèi)按照其自身的電泳淌度和電滲淌度進(jìn)行遷移。而核酸適體-目標(biāo)分子復(fù)合物由于其結(jié)構(gòu)和電荷性質(zhì)的改變，遷移速度不同于非特異性結(jié)合的雜質(zhì)分子，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子與雜質(zhì)分子的分離。在分析蛋白質(zhì)混合物時(shí)，針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸適體修飾在毛細(xì)管表面，目標(biāo)蛋白質(zhì)會(huì)與核酸適體特異性結(jié)合，形成復(fù)合物，其遷移速度與其他雜質(zhì)蛋白質(zhì)不同，在電泳圖譜上呈現(xiàn)出不同的遷移時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離。3.3.2性能評(píng)價(jià)指標(biāo)與方法基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法的性能評(píng)價(jià)至關(guān)重要，通過一系列的指標(biāo)和方法能夠全面評(píng)估該方法的優(yōu)劣，為其實(shí)際應(yīng)用提供可靠依據(jù)。分離效率是衡量該方法性能的關(guān)鍵指標(biāo)之一，通常用理論塔板數(shù)（N）來表示。理論塔板數(shù)的計(jì)算公式為N=5.54(t_R/W_{1/2})^2，其中t_R為目標(biāo)分子的遷移時(shí)間，W_{1/2}為半峰寬。在實(shí)際測(cè)量時(shí)，將含有目標(biāo)分子的樣品注入毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，運(yùn)行電泳程序，記錄目標(biāo)分子的電泳圖譜。從圖譜中準(zhǔn)確讀取目標(biāo)分子的遷移時(shí)間t_R和半峰寬W_{1/2}，代入上述公式計(jì)算理論塔板數(shù)。例如，在分析某一核酸適體與目標(biāo)分子的復(fù)合物時(shí)，通過實(shí)驗(yàn)得到復(fù)合物的遷移時(shí)間為[X]分鐘，半峰寬為[X]分鐘，代入公式計(jì)算得到理論塔板數(shù)為[X]，表明該方法在分離該復(fù)合物時(shí)具有較高的分離效率。靈敏度也是一個(gè)重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)，一般通過檢測(cè)限（LimitofDetection，LOD）來衡量。檢測(cè)限是指能夠被可靠檢測(cè)到的目標(biāo)分子的最低濃度。采用逐步稀釋法來測(cè)定檢測(cè)限。將已知濃度的目標(biāo)分子溶液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將稀釋后的溶液依次注入毛細(xì)管電泳系統(tǒng)進(jìn)行分析。隨著稀釋倍數(shù)的增加，目標(biāo)分子的信號(hào)逐漸減弱。當(dāng)目標(biāo)分子的信號(hào)強(qiáng)度與噪聲強(qiáng)度之比達(dá)到3:1時(shí)，此時(shí)對(duì)應(yīng)的目標(biāo)分子濃度即為檢測(cè)限。在研究針對(duì)某一疾病標(biāo)志物的核酸適體的毛細(xì)管電泳檢測(cè)時(shí)，將疾病標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)溶液從高濃度開始逐步稀釋，當(dāng)稀釋到濃度為[X]mol/L時(shí)，檢測(cè)信號(hào)與噪聲之比為3:1，那么該方法對(duì)該疾病標(biāo)志物的檢測(cè)限即為[X]mol/L。選擇性是評(píng)估該方法對(duì)目標(biāo)分子特異性識(shí)別能力的重要指標(biāo)。通過計(jì)算選擇性系數(shù)（\alpha）來衡量選擇性。選擇性系數(shù)的計(jì)算公式為\alpha=k_2/k_1，其中k_1和k_2分別為目標(biāo)分子和干擾分子的容量因子。容量因子k的計(jì)算公式為k=(t_R-t_0)/t_0，t_0為死時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)中，分別測(cè)定目標(biāo)分子和干擾分子的遷移時(shí)間t_R和死時(shí)間t_0，計(jì)算出它們的容量因子，進(jìn)而得到選擇性系數(shù)。例如，在檢測(cè)某一藥物分子時(shí)，存在一種結(jié)構(gòu)類似的干擾分子。通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定，藥物分子的遷移時(shí)間為[X]分鐘，干擾分子的遷移時(shí)間為[X]分鐘，死時(shí)間為[X]分鐘，計(jì)算得到藥物分子的容量因子為[X]，干擾分子的容量因子為[X]，則選擇性系數(shù)為[X]，表明該方法對(duì)藥物分子具有較好的選擇性，能夠有效區(qū)分藥物分子和干擾分子。重復(fù)性用于評(píng)估該方法在相同條件下多次測(cè)量結(jié)果的一致性，通常用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RelativeStandardDeviation，RSD）來表示。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)同一目標(biāo)分子樣品進(jìn)行多次重復(fù)測(cè)量，記錄每次測(cè)量得到的目標(biāo)分子的峰面積或遷移時(shí)間等參數(shù)。根據(jù)公式RSD=(\frac{\sqrt{\frac{\sum_{i=1}^{n}(x_i-\overline{x})^2}{n-1}}}{\overline{x}})\times100\%計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，x_i為第i次測(cè)量的值，\overline{x}為n次測(cè)量值的平均值，n為測(cè)量次數(shù)。例如，對(duì)某一核酸適體-目標(biāo)分子復(fù)合物進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)量，得到的峰面積分別為[X1]、[X2]、[X3]、[X4]、[X5]、[X6]，計(jì)算得到平均值為[X]，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為[X]%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。四、基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法的應(yīng)用案例分析4.1在生物分子分離分析中的應(yīng)用4.1.1蛋白質(zhì)的分離與檢測(cè)以牛血清白蛋白（BSA）為例，說明基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法在蛋白質(zhì)分離和含量測(cè)定中的應(yīng)用效果。牛血清白蛋白是一種廣泛存在于牛血清中的蛋白質(zhì)，在生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中常被用作模型蛋白質(zhì)。針對(duì)牛血清白蛋白，通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）技術(shù)篩選得到了特異性的核酸適體。將該核酸適體修飾在毛細(xì)管表面，建立基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法。在分離實(shí)驗(yàn)中，將含有牛血清白蛋白以及其他雜質(zhì)蛋白質(zhì)的混合樣品注入毛細(xì)管電泳系統(tǒng)。由于核酸適體對(duì)牛血清白蛋白具有特異性識(shí)別能力，牛血清白蛋白會(huì)與修飾在毛細(xì)管表面的核酸適體特異性結(jié)合。在電場(chǎng)作用下，結(jié)合后的復(fù)合物與其他未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白質(zhì)在遷移速度上產(chǎn)生明顯差異。雜質(zhì)蛋白質(zhì)按照自身的電泳淌度和電滲淌度進(jìn)行遷移，而牛血清白蛋白-核酸適體復(fù)合物則由于其特異性結(jié)合導(dǎo)致遷移速度改變。通過這種方式，能夠?qū)⑴Ｑ灏椎鞍讖膹?fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中高效分離出來。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在優(yōu)化的毛細(xì)管電泳條件下，牛血清白蛋白與雜質(zhì)蛋白質(zhì)的分離度達(dá)到了[X]，表明該方法具有良好的分離效果。在含量測(cè)定方面，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。配制一系列不同濃度的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照建立的基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法進(jìn)行分析。以牛血清白蛋白的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，牛血清白蛋白的濃度在[X]mg/L-[X]mg/L范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R^2達(dá)到了[X]。對(duì)于未知樣品，通過測(cè)量其峰面積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得對(duì)應(yīng)的牛血清白蛋白含量。對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行多次測(cè)量，測(cè)量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為[X]%，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分離和檢測(cè)方法，如高效液相色譜法（HPLC）相比，基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法在分離效率和分析速度上具有明顯優(yōu)勢(shì)。HPLC分析牛血清白蛋白需要較長(zhǎng)的分析時(shí)間，且在復(fù)雜樣品中對(duì)牛血清白蛋白的分離效果不如基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法。該方法還具有樣品用量少、成本低等優(yōu)點(diǎn)，為蛋白質(zhì)的分離和檢測(cè)提供了一種新的有效手段。4.1.2核酸的分析基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法在核酸序列分析和核酸-蛋白質(zhì)相互作用研究中發(fā)揮著重要作用。在核酸序列分析方面，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)不同核酸序列的高效分離和準(zhǔn)確鑒定。對(duì)于DNA測(cè)序，傳統(tǒng)的測(cè)序方法如Sanger測(cè)序和新一代測(cè)序技術(shù)雖然能夠準(zhǔn)確測(cè)定DNA序列，但存在操作復(fù)雜、成本較高等問題?；诤怂徇m體的毛細(xì)管電泳方法為DNA測(cè)序提供了一種新的思路。通過設(shè)計(jì)針對(duì)不同堿基的核酸適體，利用核酸適體與堿基的特異性結(jié)合，在毛細(xì)管電泳中根據(jù)不同堿基與核酸適體結(jié)合后的遷移特性差異，實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA序列的分析。在分析一段含有A、T、C、G四種堿基的DNA片段時(shí)，分別設(shè)計(jì)針對(duì)A、T、C、G堿基的核酸適體。將DNA片段與核酸適體混合后進(jìn)行毛細(xì)管電泳，由于不同堿基與相應(yīng)核酸適體結(jié)合后的復(fù)合物在遷移速度上存在差異，在電泳圖譜上會(huì)呈現(xiàn)出不同的遷移時(shí)間，從而可以確定DNA片段中堿基的排列順序。這種方法具有快速、簡(jiǎn)便、成本低的優(yōu)點(diǎn)，為DNA測(cè)序提供了一種補(bǔ)充手段。在核酸-蛋白質(zhì)相互作用研究中，基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法能夠深入探究?jī)烧咧g的相互作用機(jī)制。核酸與蛋白質(zhì)的相互作用在基因表達(dá)調(diào)控、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等生物過程中起著關(guān)鍵作用。利用該方法，可以研究核酸適體與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合親和力、結(jié)合位點(diǎn)以及結(jié)合對(duì)核酸和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的影響。以轉(zhuǎn)錄因子與DNA的相互作用為例，轉(zhuǎn)錄因子是一類能夠與DNA特定序列結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。通過篩選得到針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的核酸適體，將核酸適體與轉(zhuǎn)錄因子和DNA共同孵育。在毛細(xì)管電泳中，由于核酸適體與轉(zhuǎn)錄因子的特異性結(jié)合，會(huì)影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合情況。通過觀察電泳圖譜中核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物的遷移變化，可以分析核酸適體對(duì)轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)加入核酸適體后，轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合能力發(fā)生改變，結(jié)合常數(shù)從[X]變?yōu)閇X]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，核酸適體通過與轉(zhuǎn)錄因子的特定結(jié)構(gòu)域結(jié)合，阻礙了轉(zhuǎn)錄因子與DNA的相互作用，從而影響了基因的轉(zhuǎn)錄過程。這種研究方法為深入理解核酸-蛋白質(zhì)相互作用機(jī)制提供了有力的工具，有助于揭示基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，為疾病的診斷和治療提供理論基礎(chǔ)。四、基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法的應(yīng)用案例分析4.2在疾病診斷中的應(yīng)用4.2.1疾病標(biāo)志物的檢測(cè)疾病標(biāo)志物的檢測(cè)對(duì)于疾病的早期診斷、病情監(jiān)測(cè)和治療效果評(píng)估至關(guān)重要?；诤怂徇m體的毛細(xì)管電泳方法在這一領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力，尤其在腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方面取得了顯著進(jìn)展。以癌胚抗原（CEA）為例，癌胚抗原是一種在多種腫瘤，如結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌等患者血清中高表達(dá)的蛋白質(zhì)，它是臨床上常用的腫瘤標(biāo)志物之一。通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）技術(shù)篩選得到針對(duì)CEA的核酸適體。將該核酸適體修飾在毛細(xì)管表面，建立基于核酸適體的毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法。在檢測(cè)過程中，當(dāng)含有CEA的樣品注入毛細(xì)管后，CEA會(huì)與修飾在毛細(xì)管表面的核酸適體特異性結(jié)合。在電場(chǎng)作用下，CEA-核酸適體復(fù)合物與其他未結(jié)合的雜質(zhì)分子在遷移速度上產(chǎn)生差異，從而實(shí)現(xiàn)CEA的分離和檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對(duì)CEA具有良好的選擇性和靈敏度。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)CEA的檢測(cè)限可達(dá)到[X]ng/mL，能夠滿足臨床對(duì)早期腫瘤診斷的需求。在實(shí)際臨床樣品檢測(cè)中，對(duì)多例結(jié)直腸癌患者和健康志愿者的血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者血清中的CEA含量明顯高于健康志愿者，且檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法具有良好的相關(guān)性。與ELISA法相比，基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法具有分析速度快、樣品用量少等優(yōu)勢(shì)。ELISA法通常需要數(shù)小時(shí)才能完成檢測(cè)，而基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法可以在[X]分鐘內(nèi)完成檢測(cè)?；诤怂徇m體的毛細(xì)管電泳方法所需的樣品量?jī)H為ELISA法的[X]%，這對(duì)于一些珍貴的臨床樣品來說具有重要意義。除了CEA，該方法還可用于其他腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)。例如，針對(duì)甲胎蛋白（AFP）的核酸適體制備和毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法也已得到研究。甲胎蛋白是肝癌的重要標(biāo)志物之一，在肝癌患者的血清中含量顯著升高。通過基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)血清中的AFP含量，為肝癌的早期診斷和病情監(jiān)測(cè)提供有力支持。研究表明，該方法對(duì)AFP的檢測(cè)具有較高的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于[X]%。在臨床應(yīng)用中，結(jié)合CEA和AFP等多種腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法可以提高腫瘤診斷的準(zhǔn)確性和可靠性，為腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和治療提供更全面的信息。4.2.2病原體檢測(cè)基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法在病原體檢測(cè)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)病毒、細(xì)菌等病原體的快速、靈敏檢測(cè)，為傳染病的診斷和防控提供有力支持。在病毒檢測(cè)方面，以新冠病毒（SARS-CoV-2）為例，新冠病毒引發(fā)的全球大流行給公共衛(wèi)生帶來了巨大挑戰(zhàn)，快速準(zhǔn)確的病毒檢測(cè)對(duì)于疫情防控至關(guān)重要。通過篩選得到針對(duì)新冠病毒表面刺突蛋白（S蛋白）的核酸適體。將核酸適體修飾在毛細(xì)管表面，利用基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法對(duì)新冠病毒進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)含有新冠病毒的樣品注入毛細(xì)管后，病毒表面的S蛋白會(huì)與修飾在毛細(xì)管表面的核酸適體特異性結(jié)合。在電場(chǎng)作用下，新冠病毒-核酸適體復(fù)合物與其他雜質(zhì)分子在遷移速度上產(chǎn)生差異，從而實(shí)現(xiàn)新冠病毒的分離和檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對(duì)新冠病毒具有高度的特異性和靈敏度。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)新冠病毒的檢測(cè)限可達(dá)到[X]拷貝/mL，能夠檢測(cè)到極低濃度的病毒。與傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)方法，如逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）相比，基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法具有快速、簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)。RT-PCR需要復(fù)雜的核酸提取和擴(kuò)增步驟，耗時(shí)較長(zhǎng)，而基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法可以直接對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間可縮短至[X]分鐘以內(nèi)。這使得該方法在疫情現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和大規(guī)模篩查中具有重要的應(yīng)用前景。在細(xì)菌檢測(cè)方面，以金黃色葡萄球菌為例，金黃色葡萄球菌是一種常見的致病菌，可引起多種感染性疾病。通過SELEX技術(shù)篩選得到針對(duì)金黃色葡萄球菌表面蛋白A的核酸適體。利用該核酸適體建立基于核酸適體的毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法。在檢測(cè)過程中，金黃色葡萄球菌表面的蛋白A與核酸適體特異性結(jié)合。在電場(chǎng)作用下，金黃色葡萄球菌-核酸適體復(fù)合物與其他雜質(zhì)分子實(shí)現(xiàn)分離，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法對(duì)金黃色葡萄球菌具有良好的選擇性和靈敏度，檢測(cè)限可達(dá)到[X]CFU/mL。在實(shí)際樣品檢測(cè)中，對(duì)食品、環(huán)境水樣等中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該方法能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出樣品中的金黃色葡萄球菌，且檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法具有良好的一致性。與細(xì)菌培養(yǎng)法相比，基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法具有檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。細(xì)菌培養(yǎng)法通常需要數(shù)天時(shí)間才能得到結(jié)果，而基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)效率，有助于及時(shí)采取防控措施，減少感染的傳播。4.3在藥物研發(fā)中的應(yīng)用4.3.1藥物篩選在藥物研發(fā)的早期階段，快速、準(zhǔn)確地篩選出潛在的藥物分子是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法在這一過程中發(fā)揮著重要作用，能夠顯著提高藥物篩選的效率和準(zhǔn)確性。對(duì)于潛在藥物分子的篩選，該方法利用核酸適體與靶標(biāo)分子的特異性結(jié)合特性。首先，構(gòu)建包含大量不同序列的核酸適體文庫(kù)，這些核酸適體具有與各種靶標(biāo)分子結(jié)合的潛力。將文庫(kù)與潛在的藥物分子庫(kù)進(jìn)行混合孵育，在特定的條件下，核酸適體與藥物分子之間會(huì)發(fā)生相互作用。如果某種核酸適體能夠與潛在藥物分子特異性結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，那么在毛細(xì)管電泳中，這種復(fù)合物會(huì)表現(xiàn)出獨(dú)特的遷移行為。通過毛細(xì)管電泳的高效分離能力，能夠?qū)⑴c潛在藥物分子結(jié)合的核酸適體復(fù)合物從文庫(kù)中分離出來。在對(duì)某一疾病相關(guān)的潛在藥物分子進(jìn)行篩選時(shí)，將核酸適體文庫(kù)與多種潛在藥物分子混合，經(jīng)過孵育后進(jìn)行毛細(xì)管電泳。在電泳圖譜中，與潛在藥物分子結(jié)合的核酸適體復(fù)合物會(huì)在特定的遷移時(shí)間出現(xiàn)峰，通過對(duì)這些峰的分析和收集，可以確定與潛在藥物分子結(jié)合的核酸適體序列。進(jìn)一步對(duì)這些核酸適體序列進(jìn)行分析和鑒定，就能夠篩選出具有潛在藥物活性的分子。對(duì)篩選出的潛在藥物分子進(jìn)行活性評(píng)價(jià)也是基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法的重要應(yīng)用。將篩選得到的潛在藥物分子與靶標(biāo)分子進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)，利用核酸適體作為特異性探針。如果潛在藥物分子能夠與靶標(biāo)分子結(jié)合，并且這種結(jié)合能夠影響核酸適體與靶標(biāo)分子的相互作用，那么在毛細(xì)管電泳中，核酸適體-靶標(biāo)分子-潛在藥物分子復(fù)合物的遷移行為會(huì)發(fā)生變化。通過檢測(cè)這種遷移行為的變化，可以評(píng)估潛在藥物分子的活性。在研究針對(duì)某一蛋白質(zhì)靶標(biāo)的潛在藥物分子時(shí)，將潛在藥物分子與蛋白質(zhì)靶標(biāo)和核酸適體共同孵育。如果潛在藥物分子具有活性，它會(huì)與蛋白質(zhì)靶標(biāo)結(jié)合，改變蛋白質(zhì)靶標(biāo)的構(gòu)象，從而影響核酸適體與蛋白質(zhì)靶標(biāo)的結(jié)合。在毛細(xì)管電泳中，核酸適體-蛋白質(zhì)靶標(biāo)-潛在藥物分子復(fù)合物的遷移時(shí)間會(huì)發(fā)生改變，通過與未加入潛在藥物分子時(shí)的遷移時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，可以判斷潛在藥物分子的活性。如果遷移時(shí)間發(fā)生明顯變化，說明潛在藥物分子能夠與靶標(biāo)分子結(jié)合并產(chǎn)生作用，具有潛在的藥物活性；反之，如果遷移時(shí)間沒有明顯變化，則說明潛在藥物分子可能不具有活性。4.3.2藥物與靶標(biāo)相互作用研究藥物與靶標(biāo)分子的結(jié)合機(jī)制研究對(duì)于藥物研發(fā)至關(guān)重要，它能夠?yàn)樗幬锏膬?yōu)化和改進(jìn)提供關(guān)鍵信息。基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法在這一領(lǐng)域具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，能夠深入分析藥物與靶標(biāo)分子之間的結(jié)合機(jī)制。該方法能夠準(zhǔn)確測(cè)定藥物與靶標(biāo)分子之間的結(jié)合常數(shù)。結(jié)合常數(shù)是衡量藥物與靶標(biāo)分子結(jié)合親和力的重要參數(shù)，它反映了藥物與靶標(biāo)分子之間相互作用的強(qiáng)度。在基于核酸適體的毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)中，將不同濃度的藥物分子與固定濃度的靶標(biāo)分子和核酸適體混合孵育。隨著藥物分子濃度的變化，藥物與靶標(biāo)分子結(jié)合的程度也會(huì)發(fā)生改變，從而影響核酸適體-靶標(biāo)分子-藥物分子復(fù)合物的形成。在毛細(xì)管電泳中，復(fù)合物的遷移時(shí)間會(huì)隨著結(jié)合程度的變化而改變。通過測(cè)量不同藥物濃度下復(fù)合物的遷移時(shí)間，并利用相關(guān)的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合，可以計(jì)算出藥物與靶標(biāo)分子之間的結(jié)合常數(shù)。在研究某一抗癌藥物與腫瘤細(xì)胞表面受體的結(jié)合時(shí)，將不同濃度的抗癌藥物與腫瘤細(xì)胞表面受體和針對(duì)該受體的核酸適體混合。隨著抗癌藥物濃度的增加，與受體結(jié)合的藥物分子增多，核酸適體-受體-藥物分子復(fù)合物的遷移時(shí)間逐漸發(fā)生變化。通過對(duì)這些遷移時(shí)間數(shù)據(jù)的分析，利用Scatchard方程等數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合，計(jì)算得到抗癌藥物與腫瘤細(xì)胞表面受體的結(jié)合常數(shù)為[X]，表明兩者之間具有較強(qiáng)的結(jié)合親和力。還可以研究藥物與靶標(biāo)分子結(jié)合對(duì)靶標(biāo)分子結(jié)構(gòu)和功能的影響。核酸適體能夠特異性地識(shí)別靶標(biāo)分子的特定構(gòu)象，當(dāng)藥物與靶標(biāo)分子結(jié)合時(shí)，可能會(huì)引起靶標(biāo)分子構(gòu)象的改變。在毛細(xì)管電泳中，這種構(gòu)象變化會(huì)導(dǎo)致核酸適體-靶標(biāo)分子-藥物分子復(fù)合物的遷移行為發(fā)生變化。通過分析遷移行為的變化，可以推斷藥物與靶標(biāo)分子結(jié)合對(duì)靶標(biāo)分子結(jié)構(gòu)的影響。在研究某一酶抑制劑與酶的結(jié)合時(shí)，酶抑制劑與酶結(jié)合后，可能會(huì)改變酶的活性中心結(jié)構(gòu)，從而影響酶的催化功能。利用基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法，將酶抑制劑、酶和針對(duì)酶的核酸適體混合。在毛細(xì)管電泳中，觀察到核酸適體-酶-酶抑制劑復(fù)合物的遷移時(shí)間和峰形發(fā)生了明顯變化。進(jìn)一步通過圓二色譜、核磁共振等技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，酶抑制劑與酶結(jié)合后，導(dǎo)致酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，α-螺旋含量減少，β-折疊含量增加。這種結(jié)構(gòu)變化影響了酶的活性中心的空間構(gòu)象，使得酶的催化活性降低。這表明基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法能夠有效地研究藥物與靶標(biāo)分子結(jié)合對(duì)靶標(biāo)分子結(jié)構(gòu)和功能的影響，為藥物的作用機(jī)制研究提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。五、與傳統(tǒng)方法的比較及前景展望5.1與傳統(tǒng)分離分析方法的比較與傳統(tǒng)的高效液相色譜（HPLC）和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）等分離分析方法相比，基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法展現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在分離效率方面，毛細(xì)管電泳具有極高的分離效率，其理論塔板數(shù)可高達(dá)幾十萬甚至上百萬。這主要得益于毛細(xì)管的內(nèi)徑極小，能夠有效減少樣品的擴(kuò)散，使樣品在分離過程中保持較為狹窄的區(qū)帶，從而實(shí)現(xiàn)高效分離。而HPLC雖然也是一種常用的分離技術(shù)，但由于其柱效的限制，分離效率相對(duì)較低。在分析復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物時(shí)，基于核酸適體的毛細(xì)管電泳能夠在較短的時(shí)間內(nèi)將多種蛋白質(zhì)組分清晰地分離出來，得到尖銳且分離度高的峰形。而HPLC可能需要更長(zhǎng)的分析時(shí)間，且對(duì)于一些結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)，分離效果可能不如毛細(xì)管電泳。例如，在分離含有多種同工酶的樣品時(shí)，毛細(xì)管電泳能夠根據(jù)同工酶之間細(xì)微的結(jié)構(gòu)差異，實(shí)現(xiàn)高效分離，而HPLC可能會(huì)出現(xiàn)峰重疊的現(xiàn)象，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。特異性是另一個(gè)重要的比較方面。核酸適體具有高度的特異性，能夠精確識(shí)別靶標(biāo)分子，甚至可以區(qū)分靶標(biāo)分子的不同構(gòu)象或異構(gòu)體。在疾病標(biāo)志物檢測(cè)中，基于核酸適體的毛細(xì)管電泳方法能夠特異性地檢測(cè)目標(biāo)疾病標(biāo)志物，對(duì)其他結(jié)構(gòu)類似的干擾物質(zhì)具有極低的交叉反應(yīng)性。而ELISA雖然也是一種常用的特異性檢測(cè)方法，但在實(shí)際應(yīng)用中，由于抗體的特異性有限，可能會(huì)與一些結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。針對(duì)癌胚抗原（CEA）的檢測(cè)，基于核酸適體的