ALS死后神經(jīng)病理診斷標(biāo)準(zhǔn)方案演講人04/ALS死后神經(jīng)病理診斷標(biāo)準(zhǔn)方案03/ALS的核心病理學(xué)特征02/ALS死后神經(jīng)病理診斷的臨床意義與研究背景01/ALS死后神經(jīng)病理診斷標(biāo)準(zhǔn)方案06/技術(shù)進(jìn)展對診斷標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)化的推動05/ALS死后病理診斷的鑒別診斷目錄07/總結(jié)與展望01ALS死后神經(jīng)病理診斷標(biāo)準(zhǔn)方案02ALS死后神經(jīng)病理診斷的臨床意義與研究背景ALS臨床診斷的局限性肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）是一種累及上、下運(yùn)動神經(jīng)元的致命性神經(jīng)退行性疾病，臨床診斷主要依據(jù)修訂的ElEscorial標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合肌電圖、神經(jīng)傳導(dǎo)及臨床表現(xiàn)進(jìn)行。然而，在臨床實(shí)踐中，我們常面臨諸多挑戰(zhàn)：早期癥狀的非特異性（如肢體無力、肌肉萎縮）易與頸椎病、周圍神經(jīng)病混淆；缺乏特異性的生物標(biāo)志物導(dǎo)致誤診率高達(dá)10%-20%；不同亞型（如延髓起病型、肢體起病型）的病理進(jìn)展差異進(jìn)一步增加診斷難度。我曾接診一例以“構(gòu)音障礙”起病的患者，臨床初步診斷為“進(jìn)行性延髓麻痹”，但死后病理顯示脊髓前角神經(jīng)元廣泛丟失伴TDP-43包涵體，最終確診為ALS。這一案例深刻揭示：臨床診斷的“不確定性”需要病理學(xué)作為“最終裁決者”。死后病理診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”地位ALS的死后神經(jīng)病理診斷是確認(rèn)疾病本質(zhì)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。通過系統(tǒng)性的組織學(xué)檢查，不僅能明確運(yùn)動神經(jīng)元變性的程度與分布，還能識別特異性蛋白包涵體、膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)等關(guān)鍵病理特征，為臨床診斷提供最終依據(jù)。更重要的是，病理樣本是研究疾病機(jī)制（如蛋白異常聚集、神經(jīng)炎癥）的核心材料，也是開發(fā)靶向治療（如TDP-43抑制劑）的基礎(chǔ)。在過去的20年中，全球ALS病理研究網(wǎng)絡(luò)的建立，使得我們能夠通過多中心樣本共享，逐步揭示ALS的異質(zhì)性與共同通路。診斷標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)展歷程對ALS病理特征的描述始于19世紀(jì)（如Charcot的臨床觀察），但系統(tǒng)化的診斷標(biāo)準(zhǔn)直至20世紀(jì)末才形成。1990年，ElEscorial標(biāo)準(zhǔn)首次提出“上、下運(yùn)動神經(jīng)元受累”的臨床診斷框架；2000年，AirlieHouse標(biāo)準(zhǔn)將病理診斷分為“definite”“probable”“possible”三個等級；2015年，修訂的ConsensusCriteria進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)“TDP-43病理”的核心地位，并整合了免疫組化與分子病理技術(shù)。這些標(biāo)準(zhǔn)的演進(jìn)，本質(zhì)是病理認(rèn)知不斷深化的過程——從宏觀的神經(jīng)元丟失，到微觀的蛋白包涵體，再到分子水平的基因突變關(guān)聯(lián)。03ALS的核心病理學(xué)特征運(yùn)動神經(jīng)元的變性與丟失ALS的病理核心是運(yùn)動神經(jīng)元的進(jìn)行性丟失，這一過程具有“選擇性”與“階段性”特征。運(yùn)動神經(jīng)元的變性與丟失脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元是最早受累的部位之一，表現(xiàn)為神經(jīng)元數(shù)量顯著減少（較正常減少50%-80%），殘留神經(jīng)元胞體萎縮、尼氏體溶解（虎斑樣改變），軸突腫脹形成“軸突球”（axonalspheroids）。在頸段脊髓，尤其以前角外側(cè)群（支配上肢）受累明顯；腰段以前角內(nèi)側(cè)群（支配下肢）為主。我曾在一例病程5年的ALS患者尸檢中發(fā)現(xiàn)，其腰段前角神經(jīng)元丟失達(dá)70%，但殘留神經(jīng)元中可見大量TDP-43陽性包涵體，提示“神經(jīng)元丟失”與“包涵體形成”可能存在平行進(jìn)展的關(guān)系。運(yùn)動神經(jīng)元的變性與丟失腦干運(yùn)動神經(jīng)元延髓的迷走神經(jīng)核、舌下神經(jīng)核是常見受累部位，與患者的吞咽困難、呼吸功能障礙直接相關(guān)。病理表現(xiàn)為神經(jīng)元胞體固縮、核深染，周圍可見膠質(zhì)細(xì)胞聚集（膠質(zhì)結(jié)節(jié)）。值得注意的是，腦干病變的嚴(yán)重程度與病程長短呈正相關(guān)——晚期患者甚至可見腦干運(yùn)動核團(tuán)的幾乎完全消失。運(yùn)動神經(jīng)元的變性與丟失皮質(zhì)運(yùn)動神經(jīng)元包括額葉中央前回的Betz細(xì)胞（巨型錐體細(xì)胞）及III層、V層中小錐體細(xì)胞。早期表現(xiàn)為BetZ細(xì)胞數(shù)量減少（約減少30%-50%），胞體樹突萎縮；晚期可見皮層III、V層神經(jīng)元層狀丟失，伴膠質(zhì)增生。這種“皮層-脊髓”的連續(xù)性受累，是ALS區(qū)別于其他運(yùn)動神經(jīng)元?。ㄈ鏢MA）的關(guān)鍵特征。皮質(zhì)脊髓束與皮質(zhì)延髓束的變性作為上運(yùn)動神經(jīng)元的“輸出通路”，皮質(zhì)脊髓束（錐體束）的變性是ALS的另一核心特征。病理表現(xiàn)為：內(nèi)囊后肢、大腦腳、腦干錐體束的脫髓鞘改變，軸索腫脹斷裂，髓鞘碎片被巨噬細(xì)胞吞噬；慢性期可見膠質(zhì)增生束（gliosis），形成“硬化”的錐體束。我曾通過LFB-PAS染色觀察到一例患者的錐體束髓鞘呈“蟲蝕樣”破壞，與臨床“錐體束征”（腱反射亢進(jìn)、病理征陽性）高度一致。膠質(zhì)細(xì)胞的活化與反應(yīng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞）的活化是ALS病理的“伴隨現(xiàn)象”，也是神經(jīng)炎癥的重要標(biāo)志。膠質(zhì)細(xì)胞的活化與反應(yīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為GFAP（膠質(zhì)纖維酸性蛋白）表達(dá)顯著升高，胞體肥大，突觸增粗，形成“反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞”。在脊髓前角，星形膠質(zhì)細(xì)胞與殘留神經(jīng)元聚集形成“膠質(zhì)結(jié)節(jié)”；在皮層，可見“阿爾茨海默型星形膠質(zhì)細(xì)胞”（ALGs，胞質(zhì)內(nèi)含細(xì)小顆粒，TDP-43陽性）。這種活化既是神經(jīng)元損傷的結(jié)果，也可能通過釋放炎癥因子（如IL-6、TNF-α）加速疾病進(jìn)展。膠質(zhì)細(xì)胞的活化與反應(yīng)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)上從“分枝狀”變?yōu)椤鞍⒚装蜆印?，Iba1（離子鈣接頭分子1）染色強(qiáng)陽性，提示吞噬活性增強(qiáng)。在包涵體周圍，可見小膠質(zhì)細(xì)胞聚集，形成“微炎癥灶”。研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度與神經(jīng)元丟失呈正相關(guān)，可能是ALS進(jìn)展的“驅(qū)動因素”之一。特異性蛋白包涵體ALS的“病理標(biāo)志物”是異常折疊蛋白形成的包涵體，其中TDP-43蛋白包涵體最具特征性。特異性蛋白包涵體TDP-43蛋白包涵體TDP-43是一種DNA/RNA結(jié)合蛋白，正常位于細(xì)胞核，在ALS患者中發(fā)生異常磷酸化、泛素化，并移位至胞質(zhì)形成包涵體。約97%的散發(fā)性ALS患者存在TDP-43病理，其分布具有“區(qū)域性”：脊髓前角、腦干運(yùn)動神經(jīng)元以“胞質(zhì)包涵體”為主；皮層神經(jīng)元以“核內(nèi)包涵體”和“突觸包涵體”為主。免疫組化顯示，磷酸化TDP-43（pTDP-43）陽性包涵體呈球形、嗜酸性，是診斷的核心依據(jù)。特異性蛋白包涵體Bunina小體一種嗜酸性、直徑1-3μm的胞質(zhì)內(nèi)包涵體，H-E染色呈圓形，由泛素和半胱氨酸蛋白酶抑制劑組成。陽性率約30%-60%，是ALS相對特異性的病理改變，常見于殘留的運(yùn)動神經(jīng)元中。特異性蛋白包涵體其他包涵體少數(shù)家族性ALS患者可出現(xiàn)FUS蛋白包涵體（與FUS基因突變相關(guān)），或SOD1蛋白包涵體（與SOD1基因突變相關(guān)）。這些包涵體的形態(tài)與分布特征，有助于區(qū)分ALS與其他運(yùn)動神經(jīng)元病。04ALS死后神經(jīng)病理診斷標(biāo)準(zhǔn)方案ALS死后神經(jīng)病理診斷標(biāo)準(zhǔn)方案基于上述病理特征，國際神經(jīng)病理學(xué)會（ISN）于2018年提出《ALS死后神經(jīng)病理診斷共識標(biāo)準(zhǔn)》，將診斷分為“definiteALS”“probableALS”“possibleALS”三個等級，強(qiáng)調(diào)“運(yùn)動神經(jīng)元變性+特異性包涵體”的核心地位。診斷標(biāo)準(zhǔn)的分層體系DefiniteALS（確診ALS）需滿足以下全部條件：（1）運(yùn)動神經(jīng)元變性證據(jù)：脊髓和/或腦干前角運(yùn)動神經(jīng)元丟失，伴膠質(zhì)增生（GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞聚集）；皮質(zhì)運(yùn)動神經(jīng)元（Betz細(xì)胞）丟失，伴皮層III、V層神經(jīng)元層狀排列紊亂。（2）錐體束變性證據(jù)：皮質(zhì)脊髓束（內(nèi)囊、大腦腳）和/或皮質(zhì)延髓束（腦干）脫髓鞘、軸索腫脹，伴膠質(zhì)增生。（3）特異性包涵體證據(jù)：至少一個部位（脊髓、腦干、皮層）存在TDP-43陽性包涵體（pTDP-43免疫組化陽性），或Bunina小體（H-E染色陽性）。診斷標(biāo)準(zhǔn)的分層體系ProbableALS（很可能ALS）滿足以下任一組合：（1）運(yùn)動神經(jīng)元變性（脊髓/腦干）+錐體束變性+TDP-43包涵體（但未累及皮層）；（2）運(yùn)動神經(jīng)元變性（脊髓/腦干）+錐體束變性，無包涵體，但存在廣泛膠質(zhì)反應(yīng)（如脊髓前角膠質(zhì)結(jié)節(jié)）；（3）皮層運(yùn)動神經(jīng)元丟失+錐體束變性+TDP-43包涵體（但無脊髓前角病變）。診斷標(biāo)準(zhǔn)的分層體系PossibleALS（可能ALS）適用于早期或不典型病例，滿足以下任一條件：1（1）局灶性運(yùn)動神經(jīng)元變性（如僅頸段脊髓前角輕度丟失），伴TDP-43包涵體，但無錐體束變性；2（2）非特異性軸索變性（如周圍神經(jīng)軸突腫脹），伴輕度膠質(zhì)反應(yīng)，但無明確運(yùn)動神經(jīng)元丟失；3（3）存在TDP-43包涵體，但病變局限于皮層（無脊髓/腦干病變）。4組織學(xué)檢查的技術(shù)規(guī)范取材部位與固定方法（1）必取部位：脊髓（頸段C5-C7、胸段T5-T8、腰段L1-L3）、腦干（延髓橄欖核、腦橋基底部、中腦大腦腳）、運(yùn)動皮層（額葉中央前回）、錐體束（內(nèi)囊后肢）。（2）固定方法：組織樣本置于10%中性福爾馬林固定24-48小時，石蠟包埋，連續(xù)切片（5μm厚度）。組織學(xué)檢查的技術(shù)規(guī)范染色與免疫組化方案（1）常規(guī)染色：H-E染色（觀察神經(jīng)元形態(tài)、膠質(zhì)增生）、Nissl染色（顯示尼氏體）、LFB-PAS染色（顯示髓鞘）。（2）免疫組化抗體組合：-神經(jīng)元標(biāo)志物：NeuN（神經(jīng)元核抗原，標(biāo)記神經(jīng)元胞體）；-膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物：GFAP（星形膠質(zhì)細(xì)胞）、Iba1（小膠質(zhì)細(xì)胞）；-包涵體標(biāo)志物：pTDP-43（磷酸化TDP-43，核心標(biāo)志物）、ubiquitin（泛素，輔助標(biāo)記包涵體）；-運(yùn)動神經(jīng)元標(biāo)志物：ChAT（膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶，標(biāo)記前角運(yùn)動神經(jīng)元）。（3）結(jié)果判讀：采用半定量評分（0-3分，0分：無陽性；1分：局灶陽性；2分：彌漫陽性；3分：強(qiáng)彌漫陽性），結(jié)合陽性細(xì)胞占比與分布部位綜合判斷。診斷流程的標(biāo)準(zhǔn)化1.初步篩選：通過H-E染色觀察神經(jīng)元丟失、膠質(zhì)增生等基本病變，排除其他疾病（如腫瘤、感染）。12.免疫組化確認(rèn)：對疑似病例進(jìn)行pTDP-43、GFAP、Iba1染色，明確包涵體存在及膠質(zhì)活化程度。23.多部位病變評估：根據(jù)脊髓、腦干、皮層、錐體束的病變分布，判斷是否符合“皮層-脊髓-腦干”連續(xù)性受累特征。34.臨床資料交叉驗(yàn)證：結(jié)合生前臨床表現(xiàn)（如肌電圖顯示廣泛神經(jīng)源性損害、肌萎縮部位），排除其他運(yùn)動神經(jīng)元病。405ALS死后病理診斷的鑒別診斷ALS死后病理診斷的鑒別診斷ALS的病理表現(xiàn)并非絕對特異，需與其他運(yùn)動神經(jīng)元病、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病進(jìn)行鑒別，避免誤診。其他運(yùn)動神經(jīng)元病的鑒別脊肌萎縮癥（SMA）（1）病理特征：僅脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元丟失，無皮質(zhì)運(yùn)動神經(jīng)元丟失和錐體束變性；包涵體為SMN蛋白相關(guān)（無TDP-43包涵體）；（2）鑒別要點(diǎn)：SMA患者脊髓前角神經(jīng)元丟失呈“選擇性”（如頸段重于腰段），而ALS為“彌漫性”丟失；免疫組化SMN蛋白陽性可確診。其他運(yùn)動神經(jīng)元病的鑒別原發(fā)性側(cè)索硬化（PLS）（1）病理特征：僅有皮質(zhì)運(yùn)動神經(jīng)元丟失和錐體束變性，無脊髓前角神經(jīng)元丟失；無TDP-43包涵體；（2）鑒別要點(diǎn)：PLS患者脊髓前角神經(jīng)元數(shù)量正常，但錐體束膠質(zhì)增生顯著；臨床表現(xiàn)為“純上運(yùn)動神經(jīng)元受累”（無肌萎縮、肌束震顫）。其他運(yùn)動神經(jīng)元病的鑒別進(jìn)行性肌萎縮（PMA）（1）病理特征：僅有脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元丟失，無皮質(zhì)病變；部分患者可出現(xiàn)TDP-43包涵體（與ALS重疊）；（2）鑒別要點(diǎn)：PMA患者錐體束正常，肌電圖顯示“局限神經(jīng)源性損害”（ALS為廣泛損害）；長期隨訪（>5年）無皮質(zhì)受累癥狀可支持PMA診斷。與額顳葉癡呆（FTD）的鑒別約50%的ALS患者合并FTD（稱為ALS-FTD），病理表現(xiàn)均為TDP-43包涵體，但病變分布存在差異：-ALS：以運(yùn)動系統(tǒng)（脊髓、腦干、皮層錐體束）受累為主，F(xiàn)TD癥狀（如認(rèn)知障礙、行為異常）較輕；-FTD：以額顳葉皮層（尤其是II、III層）神經(jīng)元丟失為主，包涵體分布于皮層神經(jīng)元；-鑒別要點(diǎn)：免疫組化標(biāo)記TDP-43包涵體分布（運(yùn)動系統(tǒng)vs額顳葉皮層），結(jié)合臨床認(rèn)知評估（如MMSE評分、FTD-CDR）。其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的排除多發(fā)性硬化（MS）（1）病理特征：脫髓斑（白質(zhì)內(nèi)多發(fā)邊界清晰的病灶），炎癥細(xì)胞浸潤（T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞），無運(yùn)動神經(jīng)元丟失；（2）鑒別要點(diǎn)：MS患者腦脊液IgG指數(shù)升高，MRI可見“卵圓形”脫髓斑；免疫組化CD68陽性（巨噬細(xì)胞）可區(qū)分。其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的排除感染性疾?。ㄈ缈袢。?）病理特征：神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)Negri小體（嗜酸性、圓形），包涵體呈“靶心樣”；（2）鑒別要點(diǎn)：狂犬病患者有動物咬傷史，免疫組化狂犬病毒抗原陽性；Negri小體常見于海馬、小腦浦肯野細(xì)胞，而非運(yùn)動系統(tǒng)。06技術(shù)進(jìn)展對診斷標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)化的推動技術(shù)進(jìn)展對診斷標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)化的推動隨著病理學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，ALS死后診斷正從“形態(tài)學(xué)描述”向“分子分型”轉(zhuǎn)變，新技術(shù)的應(yīng)用顯著提升了診斷的精準(zhǔn)性與敏感性。免疫組化技術(shù)的革新高靈敏度抗體的應(yīng)用傳統(tǒng)的TDP-43抗體（如C-TDP-43）難以區(qū)分磷酸化與非磷酸化形式，而磷酸化TDP-43（pTDP-43，clones：pS409/410）抗體能更清晰地顯示包涵體，顯著提高陽性率（從80%提升至97%）。我曾對比同一批樣本，使用pS409/410抗體后，TDP-43包涵體的檢出率提高了25%，尤其對早期輕度病變患者意義顯著。免疫組化技術(shù)的革新多重免疫熒光技術(shù)通過標(biāo)記多種標(biāo)志物（如NeuN+pTDP-43+GFAP），可同時觀察神經(jīng)元、包涵體與膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用。例如，在一例家族性ALS患者中，我發(fā)現(xiàn)pTDP-43包涵體不僅位于神經(jīng)元胞質(zhì)，還存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞突觸中，提示“非細(xì)胞自主性損傷”機(jī)制。分子病理學(xué)的整合基因檢測與病理分型約10%的ALS患者存在基因突變（如SOD1、C9ORF72、FUS），不同基因突變對應(yīng)的病理特征存在差異：01-C9ORF72突變：TDP-43包涵體分布于皮層、脊髓及小腦，部分患者可見“核仁周圍染色質(zhì)聚集”；03基因檢測與病理結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)對ALS的“分子分型”，為精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。05-SOD1突變：包涵體為SOD1陽性（而非TDP-43），常見于前角神經(jīng)元胞質(zhì)；02-FUS突變：包涵體為FUS陽性，常見于皮層神經(jīng)元胞核與胞質(zhì)。04分子病理學(xué)的整合RNA原位雜交技術(shù)針對C9ORF72六核苷酸重復(fù)（GGGGCC）的RNA原位雜交（如RNAscope），可檢測重復(fù)擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄物在神經(jīng)元中的表達(dá)水平。我曾在一例C9ORF72突變患者中發(fā)現(xiàn)，其脊髓前角神經(jīng)元內(nèi)存在大量RNAfoci（點(diǎn)狀陽性信號），與TDP-43包涵體分布高度一致，提示“RNA毒性”可能參與ALS發(fā)病。數(shù)字病理與人工智能數(shù)字切片掃描與遠(yuǎn)程診斷通過全切片掃描（wholeslideimaging，WSI）將病理切片轉(zhuǎn)化為高分辨率數(shù)字圖像，可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)程會診與多中心共享。我所在中心已建立ALS數(shù)字病理數(shù)據(jù)庫，收錄了全球200余例樣本的WSI圖像，使偏遠(yuǎn)地區(qū)的患者也能獲得權(quán)威病理診斷。數(shù)字病理與人工智能人工智能輔助的病變識別基于深度學(xué)習(xí)的算法（如卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，CNN）可自動識別神經(jīng)元丟失、膠質(zhì)增生等病變區(qū)域。例如，通過訓(xùn)練10萬張病理圖像，AI模型對脊髓前角神經(jīng)元丟失的判讀準(zhǔn)確率達(dá)92%，較傳統(tǒng)人工計(jì)數(shù)效率提高5倍以上。多模態(tài)診斷體系的構(gòu)建將生前臨床資料（肌電圖、MRI、腦脊液標(biāo)志物）與死后病理結(jié)果整合，可構(gòu)建“從臨床到病理”的閉環(huán)診斷體系。例如，腦脊液神經(jīng)絲輕鏈蛋白（NfL）水平與神經(jīng)元丟失程度呈正相關(guān)，MRI顯示皮質(zhì)脊髓束“高信號”與錐體束變性相關(guān)，這些指標(biāo)可作為病理診斷的“補(bǔ)充證據(jù)”。07總結(jié)與展望ALS死后神經(jīng)病理診斷標(biāo)準(zhǔn)的核心價值A(chǔ)LS死后神經(jīng)病理診斷標(biāo)準(zhǔn)是連接臨床與基礎(chǔ)、理論與實(shí)踐的橋梁。其核心價值在于：通過系統(tǒng)化的病理檢查，明確疾病本質(zhì)，為臨床診斷提供“最終確認(rèn)”；通過識別特