TIL-T在黑色素瘤個(gè)體化應(yīng)用進(jìn)展演講人01TIL-T在黑色素瘤個(gè)體化應(yīng)用進(jìn)展TIL-T在黑色素瘤個(gè)體化應(yīng)用進(jìn)展作為腫瘤免疫治療領(lǐng)域的重要探索方向，腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（Tumor-InfiltratingLymphocytes,TIL）療法以其獨(dú)特的個(gè)體化特性在黑色素瘤治療中展現(xiàn)出突破性潛力。TIL-T是指從患者腫瘤組織中分離、體外擴(kuò)增后回輸?shù)淖泽wT淋巴細(xì)胞，其通過(guò)識(shí)別腫瘤特異性抗原發(fā)揮抗腫瘤作用。近年來(lái)，隨著腫瘤免疫學(xué)、細(xì)胞工程技術(shù)和基因組學(xué)的快速發(fā)展，TIL-T在黑色素瘤個(gè)體化治療中的制備工藝、臨床療效及聯(lián)合策略均取得顯著進(jìn)展。本文將從作用機(jī)制、制備技術(shù)革新、臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)、聯(lián)合治療策略及未來(lái)挑戰(zhàn)五個(gè)維度，系統(tǒng)闡述TIL-T在黑色素瘤個(gè)體化應(yīng)用中的前沿進(jìn)展，以期為臨床實(shí)踐與科研轉(zhuǎn)化提供參考。02###一、TIL-T的作用機(jī)制與個(gè)體化治療的理論基礎(chǔ)###一、TIL-T的作用機(jī)制與個(gè)體化治療的理論基礎(chǔ)####（一）TIL-T的生物學(xué)特性與抗腫瘤機(jī)制TIL-T起源于腫瘤微環(huán)境（TumorMicroenvironment,TME）中的浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞，其組成以CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）和CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞為主，同時(shí)包含部分調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）及自然殺傷細(xì)胞（NK）。與體外誘導(dǎo)的CAR-T、TCR-T不同，TIL-T的優(yōu)勢(shì)在于其天然攜帶腫瘤抗原特異性T細(xì)胞受體（TCR），能夠識(shí)別多種腫瘤新抗原（Neoantigen）和腫瘤相關(guān)抗原（TAA），克服了傳統(tǒng)免疫治療中抗原譜單一的局限。研究表明，TIL-T的抗腫瘤效應(yīng)主要通過(guò)三重機(jī)制實(shí)現(xiàn)：①CTL通過(guò)穿孔素/顆粒酶途徑和Fas/FasL通路直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；②CD4+T細(xì)胞通過(guò)分泌IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子激活巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞，###一、TIL-T的作用機(jī)制與個(gè)體化治療的理論基礎(chǔ)增強(qiáng)免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)；③部分TIL亞群可抑制腫瘤血管生成及基質(zhì)重塑，逆轉(zhuǎn)免疫抑制微環(huán)境。值得注意的是，TIL-T的TCR多樣性使其能夠應(yīng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗原逃逸突變，這是其在晚期黑色素瘤中持久應(yīng)答的關(guān)鍵基礎(chǔ)。####（二）黑色素瘤的免疫微環(huán)境特征與個(gè)體化治療需求黑色素瘤作為免疫原性最強(qiáng)的實(shí)體瘤之一，其免疫微環(huán)境具有顯著異質(zhì)性：部分患者表現(xiàn)為“熱腫瘤”（高TIL浸潤(rùn)、PD-L1高表達(dá)），對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）敏感；而另一些患者則呈現(xiàn)“冷腫瘤”（低TIL浸潤(rùn)、免疫抑制細(xì)胞富集），需通過(guò)個(gè)體化策略打破免疫耐受。###一、TIL-T的作用機(jī)制與個(gè)體化治療的理論基礎(chǔ)傳統(tǒng)ICI治療（如抗PD-1/PD-L1抗體）雖可改善部分患者預(yù)后，但仍有40%-50%的患者原發(fā)性耐藥或繼發(fā)性耐藥。TIL-T的個(gè)體化特性恰好彌補(bǔ)了這一缺陷：一方面，其直接來(lái)源于患者自身腫瘤，TCR庫(kù)與腫瘤抗原譜高度匹配；另一方面，通過(guò)體外擴(kuò)增可富集高親和力TIL，克服TME中的抑制性因素。臨床數(shù)據(jù)顯示，對(duì)于ICI耐藥的晚期黑色素瘤患者，TIL-T治療仍可取得客觀緩解，這為個(gè)體化治療提供了新的選擇。03###二、個(gè)體化TIL-T制備技術(shù)的關(guān)鍵突破###二、個(gè)體化TIL-T制備技術(shù)的關(guān)鍵突破TIL-T的個(gè)體化特性對(duì)制備工藝提出了極高要求，其核心在于“從患者中來(lái)，到患者中去”的全程定制化流程。近年來(lái)，從腫瘤組織獲取到TIL回輸?shù)母鳝h(huán)節(jié)均取得技術(shù)革新，顯著提升了TIL-T的可及性與療效穩(wěn)定性。####（一）腫瘤組織獲取與處理的精細(xì)化04樣本選擇標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)化樣本選擇標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)化早期TIL-T治療多依賴(lài)轉(zhuǎn)移灶手術(shù)樣本，但并非所有腫瘤組織均適用于TIL分離。目前研究認(rèn)為，原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的TIL質(zhì)量存在差異：皮膚及淺表淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的TIL數(shù)量顯著高于內(nèi)臟轉(zhuǎn)移灶（如肺、腦），可能與局部免疫應(yīng)答強(qiáng)度相關(guān)。因此，臨床實(shí)踐中需優(yōu)先選擇手術(shù)創(chuàng)傷小、TIL富集的病灶作為樣本來(lái)源。對(duì)于無(wú)法獲取手術(shù)樣本的患者，經(jīng)皮穿刺活檢亦可獲得足夠TIL，但需注意穿刺組織量（建議≥100mg）及缺血時(shí)間（控制在30分鐘內(nèi)），避免細(xì)胞活性下降。05組織消化與TIL初始分離的改進(jìn)組織消化與TIL初始分離的改進(jìn)傳統(tǒng)組織消化多采用機(jī)械研磨聯(lián)合膠原酶IV，但該方法易導(dǎo)致TIL損傷。近年來(lái)，酶解方案優(yōu)化為“兩步消化法”：先用含EDTA的緩沖液分離上皮細(xì)胞，再用低濃度膠原酶XI（0.5-1mg/mL）和DNaseI（100U/mL）消化間質(zhì)，可顯著提高TIL得率（提升30%-50%）。此外，基于密度梯度離心（如Ficoll-Paque）的TIL純化步驟中，通過(guò)調(diào)整離心力（400×g，20分鐘）和洗滌次數(shù)，可有效去除紅細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞碎片，保證初始TIL活性＞70%。####（二）體外擴(kuò)增體系的標(biāo)準(zhǔn)化與高效化TIL的體外擴(kuò)增是制備流程的核心環(huán)節(jié)，直接影響回輸細(xì)胞的數(shù)量與質(zhì)量。傳統(tǒng)“快速擴(kuò)增方案”（RapidExpansionProtocol,REP）需使用高劑量IL-2（6000IU/mL）及照射后的異體feeder細(xì)胞，存在成本高、周期長(zhǎng)（3-4周）及細(xì)胞過(guò)度分化等問(wèn)題。06無(wú)血清培養(yǎng)體系的建立無(wú)血清培養(yǎng)體系的建立為避免異源成分引發(fā)不良反應(yīng)，臨床逐步轉(zhuǎn)向無(wú)血清培養(yǎng)基（如X-VIVO15、AIM-V），其添加人血白蛋白、胰島素及轉(zhuǎn)鐵蛋白等成分，既保證了TIL生長(zhǎng)需求，又降低了免疫原性。研究顯示，無(wú)血清培養(yǎng)下的TIL擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)1000-5000倍，且CD8+T細(xì)胞比例較傳統(tǒng)培養(yǎng)提高15%-20%，細(xì)胞毒活性增強(qiáng)。07細(xì)胞因子組合的優(yōu)化細(xì)胞因子組合的優(yōu)化IL-2仍是TIL擴(kuò)增的關(guān)鍵因子，但大劑量IL-2易激活Treg并引發(fā)毛細(xì)血管滲漏綜合征。近年研究提出“低劑量IL-2（1000-3000IU/mL）+IL-15（10ng/mL）+IL-21（50ng/mL）”的組合方案：IL-15促進(jìn)CD8+T細(xì)胞增殖而不擴(kuò)增Treg，IL-21則增強(qiáng)TIL的干細(xì)胞樣記憶（Tscm）表型，從而提高長(zhǎng)期抗腫瘤能力。臨床數(shù)據(jù)顯示，優(yōu)化細(xì)胞因子方案可使TIL中Tscm比例提升至20%-30%，患者無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）延長(zhǎng)50%以上。08微載體技術(shù)的應(yīng)用微載體技術(shù)的應(yīng)用傳統(tǒng)培養(yǎng)多采用T75培養(yǎng)瓶，擴(kuò)增規(guī)模受限。微載體（如Cytodex-3）結(jié)合生物反應(yīng)器的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了TIL的大規(guī)模擴(kuò)增：在3Lstirred-tank生物反應(yīng)器中，微載體表面積達(dá)1.5m2，可支持100億級(jí)TIL擴(kuò)增，且細(xì)胞均一性更好。該技術(shù)已成功應(yīng)用于多中心臨床試驗(yàn)，將制備周期縮短至14-21天，為臨床推廣奠定基礎(chǔ)。####（三）TIL篩選與修飾的個(gè)體化策略09腫瘤抗原特異性TIL的富集腫瘤抗原特異性TIL的富集并非所有TIL均具有抗腫瘤活性，需通過(guò)功能篩選富集特異性克隆。目前主流技術(shù)包括：①I(mǎi)FN-γ分泌捕獲法：利用腫瘤細(xì)胞裂解物刺激TIL，通過(guò)抗IFN-γ抗體捕獲分泌型TIL，特異性提升3-5倍；②MHC多聚體染色：基于患者腫瘤抗原譜（如NY-ESO-1、MART-1）構(gòu)建MHC多聚體，直接分選抗原特異性TIL，該方法準(zhǔn)確性高但成本較高，適用于新抗原負(fù)荷高的患者。10基因編輯增強(qiáng)TIL功能基因編輯增強(qiáng)TIL功能為克服TME中的抑制性因素，基因編輯技術(shù)被引入TIL改造：①PD-1敲除：利用CRISPR/Cas9敲除TIL中PD-1基因，回輸后可抵抗腫瘤細(xì)胞PD-L1介導(dǎo)的抑制，臨床前實(shí)驗(yàn)顯示敲除PD-1的TIL殺傷效率提升2-3倍；②TCR基因編輯：將高親和力TCR導(dǎo)入TIL，增強(qiáng)對(duì)低表達(dá)抗原的識(shí)別能力，如針對(duì)酪氨酸酶的TCR修飾TIL在黑色素瘤模型中完全緩解率達(dá)60%。###三、TIL-T在黑色素瘤個(gè)體化治療中的臨床應(yīng)用進(jìn)展####（一）晚期黑色素瘤的療效驗(yàn)證自2010年美國(guó)MD安德森癌癥中心首次報(bào)道TIL-T治療晚期黑色素瘤的I期臨床數(shù)據(jù)以來(lái)，全球已開(kāi)展數(shù)十項(xiàng)關(guān)鍵研究，證實(shí)了其在難治性患者中的顯著療效。11客觀緩解率（ORR）與完全緩解（CR）率客觀緩解率（ORR）與完全緩解（CR）率2022年發(fā)表在《NatureMedicine》的II期臨床試驗(yàn)（NCT02360595）顯示，接受TIL-T治療的120例晚期黑色素瘤患者（80%為ICI耐藥）中，ORR達(dá)36%，其中CR率為15%，中緩解持續(xù)時(shí)間（DOR）未達(dá)到，6個(gè)月PFS率為45%。值得注意的是，基線TIL數(shù)量＞10億的患者ORR顯著高于＜10億組（52%vs21%），提示TIL回輸數(shù)量是療效預(yù)測(cè)因素之一。12長(zhǎng)期生存獲益長(zhǎng)期生存獲益針對(duì)長(zhǎng)期隨訪數(shù)據(jù)的分析表明，TIL-T可誘導(dǎo)部分患者實(shí)現(xiàn)“功能性治愈”。一項(xiàng)納入15年隨訪的研究顯示，接受TIL-T治療的晚期黑色素瘤患者中，有18%的患者無(wú)進(jìn)展生存超過(guò)10年，且部分患者停止治療后仍持續(xù)緩解，這與CAR-T治療在血液腫瘤中的長(zhǎng)期緩解模式類(lèi)似。13特殊人群的應(yīng)用特殊人群的應(yīng)用對(duì)于腦轉(zhuǎn)移黑色素瘤患者，由于血腦屏障的存在，傳統(tǒng)藥物難以穿透。TIL-T作為一種活細(xì)胞療法，可通過(guò)歸巢效應(yīng)浸潤(rùn)腦組織。I期臨床數(shù)據(jù)顯示，12例腦轉(zhuǎn)移患者接受TIL-T治療后，顱內(nèi)ORR達(dá)33%，其中2例實(shí)現(xiàn)顱內(nèi)CR，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移患者提供了新的治療選擇。####（二）個(gè)體化療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物的探索盡管TIL-T療效顯著，但仍有部分患者原發(fā)性耐藥，因此尋找預(yù)測(cè)療效的標(biāo)志物是個(gè)體化治療的關(guān)鍵。14腫瘤相關(guān)標(biāo)志物腫瘤相關(guān)標(biāo)志物-腫瘤突變負(fù)荷（TMB）：高TMB（＞10mut/Mb）患者的新抗原負(fù)荷更高，TIL-T的TCR多樣性更豐富，ORR可達(dá)45%-50%，而低TMB患者ORR不足20%。-PD-L1表達(dá)：PD-L1陽(yáng)性（CPS≥1）患者的TIL-T療效優(yōu)于陰性患者，可能與ICI聯(lián)合治療的協(xié)同作用相關(guān)。15TIL相關(guān)標(biāo)志物TIL相關(guān)標(biāo)志物-TIL浸潤(rùn)密度：基線腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)＞50個(gè)/HPF的患者，ORR顯著高于低密度組（41%vs18%）。-TCR克隆型多樣性：通過(guò)高通量TCR測(cè)序發(fā)現(xiàn)，TCR克隆型數(shù)＞1000的患者PFS顯著更長(zhǎng)（中位PFS12.1個(gè)月vs6.3個(gè)月），提示TIL庫(kù)多樣性是療效預(yù)測(cè)的重要指標(biāo)。16宿主相關(guān)標(biāo)志物宿主相關(guān)標(biāo)志物外周血淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)（ALC）＞1000/μL、中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值（NLR）＜3的患者，TIL-T治療后不良反應(yīng)發(fā)生率更低，且緩解率更高，反映了宿主免疫狀態(tài)對(duì)療效的影響。###四、TIL-T個(gè)體化聯(lián)合治療策略的優(yōu)化為進(jìn)一步提升療效，TIL-T與其他治療模式的聯(lián)合成為近年研究熱點(diǎn)。聯(lián)合策略需基于患者個(gè)體化特征（如免疫微環(huán)境狀態(tài)、既往治療史）進(jìn)行設(shè)計(jì)，以實(shí)現(xiàn)協(xié)同增效。####（一）與免疫檢查點(diǎn)抑制劑的聯(lián)合17序貫聯(lián)合序貫聯(lián)合對(duì)于初治的晚期黑色素瘤患者，先ICI治療（抗PD-1抗體）2-3周期，待腫瘤微環(huán)境“熱化”后再行TIL-T治療，可提高TIL的擴(kuò)增效率及回輸活性。II期臨床數(shù)據(jù)顯示，序貫聯(lián)合的ORR達(dá)52%，顯著高于TIL-T單藥（36%），且3級(jí)以上不良反應(yīng)發(fā)生率未增加。18同步聯(lián)合同步聯(lián)合對(duì)于ICI耐藥患者，TIL-T回輸聯(lián)合低劑量抗PD-1抗體（每2周1次，100mg），可逆轉(zhuǎn)TIL的耗竭狀態(tài)。研究顯示，聯(lián)合治療的患者TIL中PD-1表達(dá)下降40%，IFN-γ分泌增加2倍，ORR提升至41%。####（二）與化療或放療的聯(lián)合化療（如環(huán)磷酰胺、紫杉醇）和放療可通過(guò)誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡（ICD），釋放腫瘤抗原，增強(qiáng)TIL的抗原識(shí)別能力。臨床前研究顯示，低劑量環(huán)磷酰胺（300mg/m2）預(yù)處理后，TIL歸巢至腫瘤組織的效率提升3倍。I期臨床探索發(fā)現(xiàn)，TIL-T聯(lián)合局部放療（腦轉(zhuǎn)移灶）的顱內(nèi)CR率達(dá)50%，優(yōu)于單純TIL-T治療（33%）。####（三）與靶向治療的聯(lián)合同步聯(lián)合對(duì)于BRAFV600突變黑色素瘤患者，BRAF抑制劑（如維莫非尼）可快速降低腫瘤負(fù)荷，但易耐藥。TIL-T與BRAFi聯(lián)合可通過(guò)“靶向治療降期+免疫治療鞏固”的策略延長(zhǎng)生存。I期數(shù)據(jù)顯示，聯(lián)合治療的ORR達(dá)68%，中PFS達(dá)15.6個(gè)月，較BRAFi單藥延長(zhǎng)8個(gè)月。###五、挑戰(zhàn)與未來(lái)方向盡管TIL-T在黑色素瘤個(gè)體化治療中取得顯著進(jìn)展，但其臨床推廣仍面臨諸多挑戰(zhàn)，需通過(guò)技術(shù)創(chuàng)新與多學(xué)科協(xié)作解決。####（一）當(dāng)前面臨的主要挑戰(zhàn)19制備成本高、周期長(zhǎng)制備成本高、周期長(zhǎng)個(gè)體化TIL-T制備涉及手術(shù)、細(xì)胞分離、擴(kuò)增等多個(gè)環(huán)節(jié)，單例治療成本可達(dá)30-50萬(wàn)美元，且制備周期（2-4周）可能延誤患者治療時(shí)機(jī)。20療效個(gè)體差異大療效個(gè)體差異大約30%-40%的患者對(duì)TIL-T治療無(wú)應(yīng)答，其機(jī)制可能與TIL耗竭、腫瘤抗原丟失及免疫抑制微環(huán)境未被完全逆轉(zhuǎn)相關(guān)。21安全性問(wèn)題安全性問(wèn)題TIL-T治療可引發(fā)細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）和神經(jīng)毒性，其中3級(jí)CRS發(fā)生率為5%-10%，雖低于CAR-T治療，但仍需密切監(jiān)測(cè)。此外，長(zhǎng)期隨訪發(fā)現(xiàn)部分患者出現(xiàn)繼發(fā)性自身免疫性疾病（如甲狀腺炎），提示TIL-T可能打破自身免疫耐受。####（二）未來(lái)發(fā)展方向22制備工藝的標(biāo)準(zhǔn)化與自動(dòng)化制備工藝的標(biāo)準(zhǔn)化與自動(dòng)化開(kāi)發(fā)自動(dòng)化封閉式制備平臺(tái)（如GMP級(jí)細(xì)胞制備機(jī)器人），縮短擴(kuò)增周期至7-10天，降低人為誤差；建立“現(xiàn)貨型”TIL庫(kù)，通過(guò)HLA分型匹配供受者，實(shí)現(xiàn)“off-the-shelf”治療，但需解決免疫排斥問(wèn)題。23預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建基于多組學(xué)數(shù)據(jù)（基因組、轉(zhuǎn)錄組、免疫組化）建立機(jī)器學(xué)習(xí)預(yù)測(cè)模型，整合TMB、TCR克隆型、PD-L1表達(dá)等指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)患者分層與療效預(yù)測(cè)，指導(dǎo)個(gè)體化治療方案選擇。24新型細(xì)胞療法的探索新型細(xì)