免疫檢測(cè)技術(shù)點(diǎn)介紹與操作規(guī)范免疫檢測(cè)技術(shù)依托抗原-抗體特異性結(jié)合的生物學(xué)原理，通過標(biāo)記物放大信號(hào)或直接檢測(cè)結(jié)合事件，廣泛應(yīng)用于臨床診斷、生物科研及食品安全等領(lǐng)域。以下從核心技術(shù)分類、操作規(guī)范體系及質(zhì)量控制維度展開，梳理關(guān)鍵技術(shù)點(diǎn)與實(shí)踐要求。一、核心免疫檢測(cè)技術(shù)原理與操作要點(diǎn)（一）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）技術(shù)原理：利用抗原或抗體的固相化（包被）與液相中待測(cè)物的特異性結(jié)合，通過酶標(biāo)記的二抗或親和素放大信號(hào)，最終經(jīng)酶催化底物顯色，吸光度與待測(cè)物濃度正相關(guān)（雙抗體夾心法、間接法、競爭法等模式適配不同檢測(cè)需求）。關(guān)鍵技術(shù)點(diǎn)包被優(yōu)化：包被抗原/抗體濃度需通過棋盤滴定確定（通常0.1-10μg/ml），包被液選擇pH9.6碳酸鹽緩沖液或pH7.4PBS，4℃過夜或37℃2h；包被后需封閉（5%脫脂奶或1%BSA，37℃1h），阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。孵育控制：樣本與一抗孵育溫度（37℃1h或4℃過夜）、時(shí)間需嚴(yán)格遵循方案，避免抗原抗體結(jié)合不充分或非特異性吸附；二抗孵育后需用含0.05%Tween-20的PBST洗滌3次（每次5min），徹底去除未結(jié)合抗體。顯色與終止：TMB或OPD底物需避光保存，顯色時(shí)間（通常10-30min）需與陰性對(duì)照對(duì)比，待陽性孔明顯顯色后立即加終止液（如2MH?SO?或2MHCl），15min內(nèi)用酶標(biāo)儀（450nm或492nm）讀數(shù)。操作規(guī)范1.樣本處理：血清樣本采集后2h內(nèi)3000rpm離心10min分離，避免溶血（紅細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶干擾顯色）；若需保存，-20℃分裝凍存，避免反復(fù)凍融。2.試劑準(zhǔn)備：所有試劑使用前平衡至室溫，標(biāo)準(zhǔn)品需梯度稀釋（如1:2或1:5），避免移液器吹打產(chǎn)生氣泡；酶標(biāo)板拆封后剩余板條密封保存（含干燥劑）。3.加樣與孵育：加樣順序?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品、樣本、質(zhì)控品，加樣量準(zhǔn)確（如100μl/孔），使用多道移液器減少誤差；孵育時(shí)酶標(biāo)板加蓋或封膜，防止蒸發(fā)導(dǎo)致邊緣效應(yīng)。（二）化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）技術(shù)原理：基于化學(xué)發(fā)光物質(zhì)（如吖啶酯、魯米諾衍生物）在催化劑/氧化劑作用下的發(fā)光反應(yīng)，信號(hào)強(qiáng)度與抗原/抗體結(jié)合量成正比，通過光電倍增管檢測(cè)發(fā)光值（分為直接發(fā)光、酶促發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光等類型）。關(guān)鍵技術(shù)點(diǎn)試劑穩(wěn)定性：吖啶酯類試劑需避光、-20℃保存，避免與金屬離子接觸；磁珠包被抗體需注意分散性，使用前超聲振蕩10s復(fù)懸。磁分離效率：反應(yīng)后需經(jīng)磁分離裝置充分分離（如3000rpm離心5min或磁架吸附5min），洗滌液（含0.1%BSA的PBST）需徹底去除未結(jié)合物，殘留磁珠會(huì)導(dǎo)致背景信號(hào)升高。儀器校準(zhǔn)：每月用廠家提供的標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)發(fā)光儀，確保光電檢測(cè)靈敏度；定期清潔光路系統(tǒng)（如用無水乙醇擦拭），避免灰塵干擾。操作規(guī)范1.樣本采集：全血樣本需EDTA或肝素抗凝，采集后4h內(nèi)檢測(cè)；若冷藏（2-8℃）不超過24h，冷凍樣本需-80℃保存，復(fù)融后充分混勻。2.試劑操作：液體試劑避免反復(fù)凍融，凍干試劑用指定稀釋液復(fù)溶（如1ml稀釋液吹打10次溶解），現(xiàn)配現(xiàn)用；磁珠試劑使用前需顛倒混勻，避免沉淀。3.反應(yīng)與讀數(shù)：加樣后室溫振蕩孵育（如25℃15min），磁分離后加發(fā)光底物，立即放入儀器檢測(cè)（發(fā)光信號(hào)衰減快，需在1min內(nèi)讀數(shù)）。（三）免疫熒光技術(shù)（IFA/FCM）技術(shù)原理：熒光素（FITC、PE、APC等）標(biāo)記抗體，通過熒光顯微鏡（IFA）或流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)抗原分布或細(xì)胞亞群，熒光強(qiáng)度反映抗原表達(dá)量（需注意熒光素光譜重疊，避免串色）。關(guān)鍵技術(shù)點(diǎn)標(biāo)本制備：細(xì)胞涂片需自然干燥后甲醇固定（10min，-20℃），組織切片需脫蠟、抗原修復(fù)（如檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)），防止抗原遮蔽。封閉與孵育：用5%正常血清（與二抗種屬同源）封閉30min（室溫），一抗孵育（4℃過夜或37℃1h）后用含0.3%Tween-20的PBS洗滌3次（每次5min），去除未結(jié)合抗體。熒光保護(hù)：所有操作需避光（如用錫箔紙包裹孵育盒），封片時(shí)用抗淬滅封片劑（如含DABCO的甘油），延長熒光壽命。操作規(guī)范1.抗體稀釋：熒光抗體按說明書稀釋（如1:100），避免濃度過高導(dǎo)致非特異性結(jié)合；多色標(biāo)記時(shí)需預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化抗體比例，防止光譜重疊。2.鏡檢與流式：IFA鏡檢時(shí)調(diào)節(jié)曝光時(shí)間（如FITC用488nm激發(fā)，曝光100-500ms），避免過曝；FCM需設(shè)置陰性對(duì)照（同型抗體），調(diào)節(jié)電壓使陰性峰在101熒光強(qiáng)度以下。（四）免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)原理：蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至NC或PVDF膜，通過抗體特異性結(jié)合與化學(xué)發(fā)光/顯色底物檢測(cè)目標(biāo)蛋白，分子量與條帶位置對(duì)應(yīng)。關(guān)鍵技術(shù)點(diǎn)電泳與轉(zhuǎn)膜：膠濃度根據(jù)蛋白分子量選擇（如30-200kD選10%膠），上樣量20-50μg總蛋白；轉(zhuǎn)膜條件（恒壓200mA60min或恒壓30V過夜）需適配膜面積，PVDF膜需用甲醇預(yù)激活（浸泡10s）。封閉與抗體孵育：5%脫脂奶（檢測(cè)非磷酸化蛋白）或5%BSA（檢測(cè)磷酸化蛋白）封閉1h（室溫）；一抗4℃過夜（濃度1:1000-1:5000），二抗室溫1h（濃度1:5000-1:____，避免交叉反應(yīng)）。顯色優(yōu)化：ECL底物需現(xiàn)配現(xiàn)用，曝光時(shí)間（10s-10min）根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度調(diào)整，可多次曝光（如先10s預(yù)曝光，再優(yōu)化時(shí)間），避免過曝導(dǎo)致條帶失真。操作規(guī)范1.樣品處理：蛋白樣品加LoadingBuffer后100℃煮5min，瞬時(shí)離心后上樣，避免蛋白降解；上樣前膠孔需用樣品緩沖液沖洗，去除殘留尿素。2.轉(zhuǎn)膜操作：膠與膜之間用濾紙緊密貼合，排除氣泡（氣泡導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不完全）；轉(zhuǎn)膜槽內(nèi)加冰浴，防止蛋白變性。3.洗滌與顯色：抗體孵育后用含0.1%Tween-20的TBST洗滌3次（每次10min）；顯色時(shí)膜需完全覆蓋底物，避光反應(yīng)1-5min后曝光。二、通用操作規(guī)范與質(zhì)量控制體系（一）樣本管理規(guī)范采集與處理：使用無酶、無熱原的一次性容器，血清分離后立即檢測(cè)或分裝凍存（-20℃可存1個(gè)月，-80℃長期保存）；避免樣本反復(fù)凍融（建議分裝為單次用量）。干擾因素控制：溶血樣本（血紅蛋白≥1g/L）、脂血樣本（甘油三酯≥5mmol/L）需預(yù)處理（如過柱或稀釋），避免干擾抗原抗體結(jié)合或信號(hào)檢測(cè)。（二）試劑與設(shè)備維護(hù)試劑管理：按說明書溫度保存（如ELISA試劑2-8℃，CLIA磁珠-20℃），開封后標(biāo)注失效期（通常為原有效期的1/3）；不同批號(hào)試劑需做比對(duì)實(shí)驗(yàn)（用同一樣本檢測(cè)，偏差≤15%方可替換）。設(shè)備校準(zhǔn)：酶標(biāo)儀每周用標(biāo)準(zhǔn)光片校準(zhǔn)（450nm、630nm等波長）；洗板機(jī)每月清潔管路（用1%次氯酸鈉沖洗后，再用蒸餾水沖洗）；離心機(jī)每季度校準(zhǔn)轉(zhuǎn)速（誤差≤5%）。（三）質(zhì)量控制實(shí)施質(zhì)控品設(shè)置：每次實(shí)驗(yàn)需帶陰性質(zhì)控（確認(rèn)無交叉污染）、陽性質(zhì)控（驗(yàn)證方法靈敏度）、標(biāo)準(zhǔn)品（繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線），質(zhì)控品需與樣本同批次處理。失控處理：若質(zhì)控值超出±3SD范圍，需分析原因（如試劑失效、孵育溫度偏差、加樣誤差），重新實(shí)驗(yàn)并記錄整改措施（如更換試劑、校準(zhǔn)設(shè)備）。三、常見問題與解決方案問題類型可能原因解決方案假陽性結(jié)果非特異性結(jié)合、樣本污染優(yōu)化封閉液（換BSA）、增加洗滌次數(shù)（4次）、更換無污染耗材假陰性結(jié)果鉤狀效應(yīng)（抗原過量）、抗體失效稀釋樣本（1:10或1:100）、更換新批次抗體背景信號(hào)過高洗滌不充分、封閉不足用含Tween-20的洗液洗滌、延長封閉時(shí)間（2h）結(jié)果重復(fù)性差加樣誤差、孵育溫度不均使用多道移液器、用孵育箱替代水浴（控溫±0.5℃）四、技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)與實(shí)踐建議（一）技術(shù)創(chuàng)新方向Multiplex檢測(cè)：液相芯片（如Luminex）實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)（如細(xì)胞因子譜、自身抗體譜），需注意抗體交叉反應(yīng)驗(yàn)證。POCT免疫檢測(cè)：膠體金試紙條、熒光免疫層析技術(shù)向“床旁化”發(fā)展，需優(yōu)化樣本前處理（如全血直接檢測(cè)）和定量算法。AI輔助判讀：結(jié)合深度學(xué)習(xí)算法分析熒光圖像或化學(xué)發(fā)光曲線，減少人為判讀誤差（如病理切片的免疫組化評(píng)分）。（二）實(shí)踐建議方法驗(yàn)證：新方法需驗(yàn)證特異性（交叉反應(yīng)率≤