2025年生物制藥(生物制藥工程技術(shù)與應(yīng)用)及答案一、單項(xiàng)選擇題（每題1分，共20分）1.在CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，最常用的啟動(dòng)子是A.CMVB.SV40C.EF1αD.UBC答案：A2.下列哪項(xiàng)不是單克隆抗體人源化的目的A.降低免疫原性B.提高親和力C.延長(zhǎng)半衰期D.降低生產(chǎn)成本答案：D3.用于檢測(cè)宿主細(xì)胞殘留DNA的法定方法是A.qPCRB.ELISAC.WesternblotD.HPLC答案：A4.在蛋白A親和層析中，洗脫pH通常控制在A.7.4B.6.0C.4.5D.3.0答案：D5.下列哪種病毒常用于慢病毒載體包裝A.VSV-GB.Ad5C.AAV2D.HSV-1答案：A6.關(guān)于CRISPR-Cas9系統(tǒng)，下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是A.Cas9蛋白具有核酸內(nèi)切酶活性B.sgRNA決定靶向特異性C.PAM序列為5'-NGG-3'D.只能實(shí)現(xiàn)基因敲除答案：D7.在生物反應(yīng)器放大過(guò)程中，保持不變的參數(shù)通常是A.葉輪尖端線速度B.體積傳氧系數(shù)kLaC.功率輸入P/VD.混合時(shí)間答案：B8.下列哪項(xiàng)不屬于抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）的關(guān)鍵細(xì)胞A.NK細(xì)胞B.巨噬細(xì)胞C.樹(shù)突狀細(xì)胞D.中性粒細(xì)胞答案：C9.用于測(cè)定蛋白熱穩(wěn)定性的技術(shù)為A.DSCB.DLSC.AUCD.ITC答案：A10.在下游純化中，病毒去除的常用納米膜孔徑為A.35nmB.50nmC.75nmD.100nm答案：A11.關(guān)于mRNA疫苗，下列說(shuō)法正確的是A.需進(jìn)入細(xì)胞核才能翻譯B.5'帽結(jié)構(gòu)為抗反轉(zhuǎn)錄關(guān)鍵C.修飾核苷可降低先天免疫激活D.脂質(zhì)體僅起緩釋作用答案：C12.下列哪種培養(yǎng)基添加劑可有效抑制細(xì)胞凋亡A.胰島素B.Z-VADC.轉(zhuǎn)鐵蛋白D.氫化可的松答案：B13.用于測(cè)定單抗電荷異構(gòu)體的首選技術(shù)是A.IEFB.CE-SDSC.cIEFD.HIC答案：C14.關(guān)于連續(xù)制造，下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是A.可縮短生產(chǎn)周期B.需實(shí)時(shí)放行檢測(cè)C.設(shè)備利用率下降D.可降低批次間差異答案：C15.在細(xì)胞株構(gòu)建中，最常用的篩選標(biāo)記是A.DHFRB.NeoC.BSDD.PAC答案：A16.下列哪項(xiàng)不是蛋白聚集的主要誘因A.高離子強(qiáng)度B.反復(fù)凍融C.界面剪切D.糖基化增加答案：D17.用于測(cè)定宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留的行業(yè)金標(biāo)方法是A.ELISAB.LC-MS/MSC.WesternblotD.2D-DIGE答案：A18.關(guān)于雙特異性抗體，下列說(shuō)法正確的是A.僅IgG樣格式可商業(yè)化B.knob-into-hole技術(shù)解決重鏈錯(cuò)配C.不能介導(dǎo)ADCCD.半衰期一定長(zhǎng)于單抗答案：B19.在凍干制劑中，最常用的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度調(diào)節(jié)劑是A.蔗糖B.甘露醇C.甘氨酸D.聚山梨酯80答案：A20.下列哪項(xiàng)不是FDA對(duì)IND藥學(xué)資料的核心要求A.化學(xué)制造與控制（CMC）B.藥理毒理C.臨床方案D.市場(chǎng)預(yù)測(cè)答案：D二、配伍選擇題（每題1分，共10分）A.離子交換層析B.疏水層析C.分子篩層析D.羥基磷灰石層析E.親和層析21.利用蛋白表面電荷差異進(jìn)行分離答案：A22.利用蛋白與樹(shù)脂上配體的生物特異性結(jié)合答案：E23.可去除聚集體，按水合半徑分離答案：C24.在高鹽條件下結(jié)合，低鹽條件下洗脫答案：B25.利用蛋白與鈣離子的弱相互作用答案：DA.35%B.45%C.55%D.65%E.75%26.典型IgG4抗體在280nm處的消光系數(shù)約為答案：B27.采用ProteinA層析后，單抗純度通?？蛇_(dá)答案：E28.凍干制劑水分控制一般要求低于答案：A29.連續(xù)灌流培養(yǎng)中，細(xì)胞密度可穩(wěn)定維持在答案：D30.采用TFF濃縮后，蛋白回收率通常大于答案：C三、判斷題（每題1分，共10分，正確打“√”，錯(cuò)誤打“×”）31.在CHO細(xì)胞中，谷氨酰胺代謝產(chǎn)生的銨離子是主要抑制因素。答案：√32.采用DO-stat補(bǔ)料策略時(shí)，溶氧越高越有利于產(chǎn)物表達(dá)。答案：×33.對(duì)于mRNA疫苗，5'UTR長(zhǎng)度越長(zhǎng)翻譯效率越高。答案：×34.蛋白A層析對(duì)IgG亞型無(wú)選擇性差異。答案：×35.在下游純化中，低pH孵育可滅活包膜病毒。答案：√36.采用高通量微型生物反應(yīng)器可顯著縮短工藝開(kāi)發(fā)周期。答案：√37.雙特異性抗體的分子量一定大于傳統(tǒng)單抗。答案：×38.凍干保護(hù)劑蔗糖與蛋白的摩爾比通常為10:1以上。答案：√39.采用連續(xù)層析時(shí)，樹(shù)脂壽命通常短于批次模式。答案：√40.對(duì)于ADC藥物，DAR值越高藥效越強(qiáng)且毒性越低。答案：×四、填空題（每空1分，共20分）41.在單抗生產(chǎn)中，補(bǔ)料分批培養(yǎng)的峰值細(xì)胞密度可達(dá)________×10?cells/mL，產(chǎn)物滴度普遍超過(guò)________g/L。答案：20；1042.用于mRNA合成的帽類似物中，________類似物可提高轉(zhuǎn)錄效率并降低免疫原性。答案：CleanCap43.根據(jù)ICHQ5E，變更前后可比性研究需至少連續(xù)________批數(shù)據(jù)，并采用________統(tǒng)計(jì)方法評(píng)估。答案：3；方差分析44.在ADC藥物中，常用的可裂解連接子為_(kāi)_______和________兩類。答案：Val-Cit；MC-VC-PAB45.用于測(cè)定蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的光譜技術(shù)為_(kāi)_______，測(cè)定三級(jí)結(jié)構(gòu)為_(kāi)_______。答案：圓二色譜；熒光光譜46.連續(xù)灌流培養(yǎng)中，常用細(xì)胞截留設(shè)備包括________和________。答案：TFF；ATF47.用于去除內(nèi)毒素的樹(shù)脂配基為_(kāi)_______，其原理為_(kāi)_______作用。答案：多粘菌素B；靜電與疏水協(xié)同48.在病毒清除驗(yàn)證中，________病毒用于模擬大病毒，________病毒用于模擬小病毒。答案：MuLV；PPV49.根據(jù)USP<1046>，細(xì)胞庫(kù)需建立________庫(kù)和________庫(kù)兩級(jí)。答案：主；工作50.用于測(cè)定單抗熱穩(wěn)定性的加速試驗(yàn)條件為_(kāi)_______℃/________%RH。答案：40；75五、簡(jiǎn)答題（每題8分，共40分）51.簡(jiǎn)述CHO細(xì)胞基因組編輯中，利用CRISPR-Cas9實(shí)現(xiàn)GS基因敲除的步驟及注意事項(xiàng)。答案：（1）sgRNA設(shè)計(jì)：選擇GS基因外顯子2區(qū)域，避免脫靶，GC含量40–60%。（2）載體構(gòu)建：將sgRNA克隆至pX330，共轉(zhuǎn)染Cas9與sgRNA。（3）轉(zhuǎn)染：采用電穿孔，條件為250V、5ms、1×10?cells，效率>90%。（4）單克隆篩選：有限稀釋至0.5cells/孔，添加MSX50μM，存活克隆即為GS?/?。（5）驗(yàn)證：PCR擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域，T7E1酶切確認(rèn)突變；TOPO克隆測(cè)序，確保雙等位基因移碼。注意事項(xiàng)：①需設(shè)計(jì)2條sgRNA提高敲除率；②避免脫靶需全基因組測(cè)序；③MSX濃度需預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化；④單克隆需擴(kuò)增后凍存，防止遺傳漂變。52.闡述連續(xù)蛋白A層析相比批次模式在工藝經(jīng)濟(jì)性與質(zhì)量方面的優(yōu)勢(shì)。答案：（1）設(shè)備利用率：連續(xù)層析采用SMB或PCC，樹(shù)脂利用率提高40–60%，柱體積縮小30%。（2）緩沖液消耗：因柱體積減小，緩沖液節(jié)省35–50%，廢水排放同步下降。（3）產(chǎn)能：相同樹(shù)脂量下，年產(chǎn)量可提升3–5倍，固定資產(chǎn)投資降低20%。（4）質(zhì)量：穩(wěn)態(tài)操作使產(chǎn)物質(zhì)量一致，HCP殘留下降0.5log，聚集體降低0.3%。（5）驗(yàn)證：連續(xù)模式需建立實(shí)時(shí)HCP與聚集體監(jiān)測(cè)，采用PAT技術(shù)，如在線FTIR與光散射。（6）監(jiān)管：FDA鼓勵(lì)連續(xù)制造，可比性方案需證明質(zhì)量等同，通常需3批連續(xù)數(shù)據(jù)。53.說(shuō)明mRNA疫苗脂質(zhì)納米顆粒（LNP）中四種脂質(zhì)的功能及比例優(yōu)化策略。答案：（1）可電離脂質(zhì)：pH7.4時(shí)中性，內(nèi)涵體中質(zhì)子化，介導(dǎo)膜破裂，常用DLin-MC3-DMA；比例40–50%。（2）磷脂：提供穩(wěn)定雙層，如DSPC，比例10–15%。（3）膽固醇：調(diào)節(jié)膜流動(dòng)性，增強(qiáng)穩(wěn)定性，比例35–45%。（4）PEG-脂質(zhì)：延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間，降低RES清除，比例1–2%。優(yōu)化策略：①采用DesignofExperiment（DoE），以粒徑<100nm、包封率>90%為響應(yīng)值；②通過(guò)微流控芯片控制流速比（水相：乙醇=3:1），總流速12mL/min；③體內(nèi)實(shí)驗(yàn)篩選半衰期與表達(dá)效率，常用小鼠模型，肌肉注射后24h檢測(cè)熒光素酶信號(hào)；④穩(wěn)定性考察：40℃加速2周，粒徑增長(zhǎng)<10%為合格。54.描述雙特異性抗體（BsAb）在下游純化中解決錯(cuò)配與聚集體問(wèn)題的策略。答案：（1）knob-into-hole設(shè)計(jì)：在CH3區(qū)引入T366W與Y407A突變，促進(jìn)異源二聚，同源二聚減少90%。（2）離子交換精細(xì)洗脫：采用pH梯度洗脫，錯(cuò)配體因等電點(diǎn)差異被分離，收集pI±0.2區(qū)間。（3）分子篩層析：使用Superdex200Increase，流速30cm/h，去除>10%聚集體。（4）疏水層析：在高鹽下結(jié)合，聚集體因暴露疏水面被吸附，產(chǎn)物在0.8M硫酸銨下流穿。（5）重折疊：對(duì)包涵體形式，采用氧化還原體系（GSH/GSSG=5:1），梯度降溫至10℃，重折疊率>60%。（6）分析：采用CE-SDS非還原法，目標(biāo)峰純度>95%；cIEF檢測(cè)電荷異構(gòu)體，主峰>75%。55.分析ADC藥物DAR值過(guò)高導(dǎo)致毒性的機(jī)制及控制策略。答案：機(jī)制：（1）高DAR（>8）使疏水性顯著增加，血漿清除加快，導(dǎo)致肝攝取升高；（2）非特異性內(nèi)吞增加，靶向外組織毒性，如中性粒細(xì)胞減少；（3）連接子不穩(wěn)定，早期釋放細(xì)胞毒藥物，損傷正常組織?？刂撇呗裕海?）位點(diǎn)偶聯(lián)：引入非天然氨基酸（pAcPhe），利用肟鍵連接，DAR=2或4，均一性>95%；（2）酶法偶聯(lián)：采用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，識(shí)別抗體Q295位點(diǎn)，DAR=2，體內(nèi)毒性下降50%；（3）調(diào)節(jié)藥物抗體比：通過(guò)還原劑（TCEP）摩爾比控制，DAR3–5為最佳窗口；（4）毒理實(shí)驗(yàn)：采用大鼠與猴模型，NOAEL劑量需>10倍臨床劑量；（5）臨床監(jiān)測(cè)：關(guān)注AST/ALT及中性粒細(xì)胞，設(shè)立即時(shí)停藥規(guī)則。六、綜合設(shè)計(jì)題（共30分）56.某公司擬將抗HER2單抗改為雙特異型（同時(shí)結(jié)合CD3），并采用連續(xù)灌流+連續(xù)蛋白A層析工藝，年產(chǎn)100kg。請(qǐng)完成以下任務(wù)：（1）設(shè)計(jì)細(xì)胞株構(gòu)建路線（6分）；（2）制定連續(xù)灌流培養(yǎng)方案，含設(shè)備、參數(shù)與PAT（8分）；（3）設(shè)計(jì)連續(xù)蛋白A層析方案，含柱型、循環(huán)周期與病毒清除（8分）；（4）計(jì)算年產(chǎn)能匹配所需培養(yǎng)規(guī)模與樹(shù)脂量（4分）；（5）列出可比性研究需檢測(cè)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）與放行標(biāo)準(zhǔn)（4分）。答案：（1）細(xì)胞株構(gòu)建：①采用knob-into-hole與CrossMab技術(shù)，防止輕鏈錯(cuò)配；②雙基因共轉(zhuǎn)：重鏈1（knob）+輕鏈1，重鏈2（hole）+輕鏈2，摩爾比1:1；③載體：pCHO1.0，CMV啟動(dòng)子，DHFR/MTX篩選；④轉(zhuǎn)染：CHO-K1，電穿孔，MTX500nM遞增；⑤單克隆：有限稀釋，克隆率>90%，產(chǎn)量>5g/L；⑥建庫(kù)：主庫(kù)（MCB）10?cells/支，工作庫(kù)（WCB）10?cells/支，全外顯子測(cè)序確認(rèn)無(wú)脫靶。（2）連續(xù)灌流方案：設(shè)備：50L一次性反應(yīng)器（SartoriusSTR50），ATF6TFF截留，0.2μm中空纖維；參數(shù)：pH7.0±0.05，DO40%，溫度37℃，灌流速1reactorvolume/day（RV/day），細(xì)胞密度50×10?cells/mL，活力>95%；PAT：在線Raman（KaiserRXN）測(cè)葡萄糖與乳酸，在線電容（ABER）測(cè)活細(xì)胞密度；控制：葡萄糖<2g/L，乳酸<1g/L，滲透壓<400mOsm/kg；收獲：每日收獲液經(jīng)0.22μm過(guò)濾，2–8℃保存<24h，進(jìn)入下游。（3）連續(xù)蛋白A方案：柱型：4×25cmPCC層析柱，樹(shù)脂MabSelectPrismA，循環(huán)周期15min（上樣5min、洗雜5min、洗脫3min、CIP2min）；上樣：載量30g/L，流速300cm/h，UV280nm監(jiān)測(cè)；洗脫：pH3.0，50mM檸檬酸，即時(shí)中和至pH