基于蛋白質(zhì)組學(xué)解析NO處理對桃果實(shí)成熟及采后生理調(diào)控機(jī)制一、引言1.1研究背景與目的1.1.1桃果實(shí)產(chǎn)業(yè)重要性桃（PrunuspersicaL.Batsch）是一種廣受歡迎的水果，在全球水果市場中占據(jù)重要地位。中國作為世界最大的桃生產(chǎn)國，種植歷史悠久，品種資源豐富。桃果實(shí)不僅具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其營養(yǎng)也十分豐富，富含多種維生素（如維生素C、維生素E等）、礦物質(zhì)（如鉀、鎂等）以及膳食纖維，對人體健康大有裨益。在消費(fèi)市場上，桃以其鮮美的口感、多樣的品種（如毛桃、油桃、蟠桃等）滿足了不同消費(fèi)者的需求，無論是鮮果直接食用，還是加工成果汁、罐頭、果脯等產(chǎn)品，都深受消費(fèi)者喜愛。然而，桃屬于呼吸躍變型果實(shí)，采后呼吸作用旺盛，在常溫下極易軟化、腐爛，貨架期短，這給桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來了巨大挑戰(zhàn)，嚴(yán)重影響了桃果農(nóng)和相關(guān)企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。因此，研究桃果實(shí)采后保鮮技術(shù)，延長其貯藏期和貨架期，對于保障桃產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。1.1.2NO在植物生理中的重要作用一氧化氮（NO）作為一種重要的信號分子，在植物生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。自20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)NO在植物中的作用以來，相關(guān)研究迅速展開。NO參與了植物生長發(fā)育的多個(gè)階段，包括種子萌發(fā)、根系生長、葉片擴(kuò)展、開花結(jié)果等。在種子萌發(fā)過程中，NO能夠打破種子休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)，調(diào)節(jié)種子萌發(fā)過程中的生理生化反應(yīng)，如提高淀粉酶活性，促進(jìn)淀粉水解，為種子萌發(fā)提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。在根系生長方面，NO可以調(diào)節(jié)根系的形態(tài)建成，促進(jìn)側(cè)根和不定根的發(fā)生，增強(qiáng)根系對養(yǎng)分和水分的吸收能力。在植物應(yīng)對生物和非生物脅迫時(shí)，NO也發(fā)揮著重要的防御調(diào)節(jié)作用。當(dāng)植物受到病原菌侵染時(shí)，NO可以激活植物的防御反應(yīng)，誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)植物的抗病性。在干旱、鹽漬、低溫等非生物脅迫下，NO能夠調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，清除活性氧（ROS），減輕氧化損傷，提高植物的抗逆性。對于果實(shí)而言，NO對果實(shí)的成熟、衰老和品質(zhì)保持等生理過程也有著顯著影響。研究表明，NO處理可以延緩果實(shí)的成熟進(jìn)程，抑制果實(shí)的呼吸作用和乙烯釋放，保持果實(shí)的硬度、色澤和風(fēng)味，延長果實(shí)的貯藏期。1.1.3蛋白質(zhì)組學(xué)在果實(shí)研究中的應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組時(shí)代發(fā)展起來的一門新興學(xué)科，旨在研究生物體在特定時(shí)間和空間內(nèi)表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)在果實(shí)研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，可以全面、系統(tǒng)地分析果實(shí)發(fā)育和成熟過程中蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，揭示果實(shí)品質(zhì)形成和調(diào)控的分子機(jī)制。在果實(shí)發(fā)育過程中，蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了許多與細(xì)胞分裂、伸長、分化以及果實(shí)形態(tài)建成相關(guān)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)的表達(dá)變化與果實(shí)的生長發(fā)育密切相關(guān)。在果實(shí)成熟過程中，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以鑒定出參與乙烯合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞壁代謝、糖代謝等生理過程的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，從而深入了解果實(shí)成熟的分子調(diào)控機(jī)制。此外，蛋白質(zhì)組學(xué)還可以用于研究果實(shí)采后貯藏過程中的生理變化，如衰老、腐爛等，為開發(fā)有效的保鮮技術(shù)提供理論依據(jù)。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在果實(shí)研究中具有高通量、高靈敏度和高分辨率的優(yōu)勢，能夠?yàn)楣麑?shí)生理機(jī)制的研究提供豐富的信息，推動果實(shí)科學(xué)的發(fā)展。1.1.4研究目的本研究旨在運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，深入探究NO處理對桃果實(shí)成熟期間及采后生理調(diào)控的分子機(jī)制。具體目標(biāo)如下：一是分析桃果實(shí)成熟期間及采后NO處理下蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化，鑒定差異表達(dá)蛋白質(zhì)；二是對差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋和富集分析，明確其參與的生物學(xué)過程和代謝途徑；三是探討NO處理影響桃果實(shí)成熟和采后生理的關(guān)鍵蛋白質(zhì)和分子機(jī)制，為桃果實(shí)采后保鮮技術(shù)的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)和潛在的分子靶點(diǎn)。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1桃果實(shí)成熟生理研究進(jìn)展桃果實(shí)成熟是一個(gè)復(fù)雜且有序的生理過程，涉及呼吸作用、乙烯釋放以及品質(zhì)變化等多個(gè)方面。呼吸作用是果實(shí)采后重要的生理活動之一，桃作為典型的呼吸躍變型果實(shí)，在成熟期間呼吸強(qiáng)度會發(fā)生顯著變化。在果實(shí)發(fā)育前期，呼吸強(qiáng)度相對較低，隨著果實(shí)逐漸成熟，呼吸速率急劇上升，達(dá)到呼吸高峰后又逐漸下降。有研究表明，水蜜桃果實(shí)采后呼吸強(qiáng)度迅速升高，最高值可達(dá)（CO?）35-50mgP（kg?h），平均呼吸強(qiáng)度比蘋果高1-2倍。呼吸高峰的出現(xiàn)往往標(biāo)志著果實(shí)進(jìn)入衰老階段，且呼吸高峰出現(xiàn)越早，果實(shí)越不耐貯。同時(shí)，桃果實(shí)不同部位的呼吸強(qiáng)度也存在差異，果皮的呼吸強(qiáng)度是果肉的4倍，果頂和果蒂的呼吸強(qiáng)度約為果實(shí)平均呼吸強(qiáng)度的1/4。乙烯作為一種重要的植物激素，在桃果實(shí)成熟過程中扮演著關(guān)鍵角色。桃果實(shí)成熟過程中有大量乙烯產(chǎn)生，常溫下貯藏的桃果實(shí)乙烯釋放量可達(dá)50-100mlP（kg?h）。乙烯不僅能夠促進(jìn)果實(shí)的呼吸作用，還能加速果實(shí)的衰老進(jìn)程。在果實(shí)成熟啟動階段，乙烯的合成和釋放量迅速增加，通過與乙烯受體結(jié)合，激活一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而調(diào)控果實(shí)成熟相關(guān)基因的表達(dá)。不同品種的桃果實(shí)乙烯消長規(guī)律存在顯著差異，晚熟品種啟動乙烯合成所需時(shí)間較長，躍變期間產(chǎn)生乙烯的量較低，這使得晚熟品種相對更耐貯藏。在品質(zhì)變化方面，桃果實(shí)成熟期間，果實(shí)的色澤、硬度、風(fēng)味等品質(zhì)指標(biāo)都會發(fā)生明顯改變。果實(shí)色澤由綠色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色、紅色等，這主要是由于葉綠素降解以及類胡蘿卜素、花青苷等色素合成增加所致。果實(shí)硬度則隨著成熟進(jìn)程逐漸下降，這與細(xì)胞壁代謝密切相關(guān)。細(xì)胞壁中的果膠物質(zhì)在果膠酶（如果膠酯酶PE、果膠裂解酶PL和多聚半乳糖醛縮酶PG）的作用下發(fā)生降解，導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞，果實(shí)硬度降低。果實(shí)的風(fēng)味也在成熟過程中不斷變化，可溶性糖含量逐漸增加，有機(jī)酸含量相對減少，糖酸比升高，使得果實(shí)口感更加甜美，同時(shí)，揮發(fā)性物質(zhì)的合成和積累也賦予了果實(shí)獨(dú)特的香氣。1.2.2NO對果實(shí)生理影響研究現(xiàn)狀NO對果實(shí)生理的影響是近年來果實(shí)采后生理研究的熱點(diǎn)之一。在果實(shí)成熟調(diào)控方面，大量研究表明，NO能夠延緩果實(shí)的成熟進(jìn)程。通過對多種果實(shí)的研究發(fā)現(xiàn)，NO處理可以抑制果實(shí)的呼吸作用和乙烯釋放。在香蕉果實(shí)中，NO處理能夠降低呼吸速率和乙烯釋放量，延緩果實(shí)的軟化和色澤轉(zhuǎn)變。在草莓果實(shí)中，NO處理可以抑制乙烯合成關(guān)鍵酶的活性，減少乙烯的產(chǎn)生，從而延緩果實(shí)的成熟衰老。對于桃果實(shí)，NO處理同樣能夠抑制呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放，推遲呼吸高峰和乙烯釋放高峰的出現(xiàn)，延長果實(shí)的貯藏期。在果實(shí)保鮮方面，NO具有良好的保鮮效果。NO處理可以保持果實(shí)的硬度、色澤和風(fēng)味，降低果實(shí)的腐爛率。在柑橘果實(shí)中，NO處理能夠減少果實(shí)失重率，保持果實(shí)的飽滿度和色澤，同時(shí)抑制果實(shí)的腐爛。在葡萄果實(shí)中，NO處理可以降低果實(shí)的落粒率，保持果實(shí)的完整性和品質(zhì)。對于桃果實(shí)，NO處理能夠抑制果實(shí)的軟化，保持果實(shí)的硬度，減少果實(shí)的腐爛和褐變，延長果實(shí)的貨架期。在果實(shí)抗病方面，NO能夠增強(qiáng)果實(shí)的抗病能力。當(dāng)果實(shí)受到病原菌侵染時(shí)，NO可以激活果實(shí)的防御反應(yīng)，誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白的表達(dá)，提高果實(shí)的抗病性。在蘋果果實(shí)中，NO處理可以增強(qiáng)果實(shí)對青霉病菌的抗性，降低果實(shí)的發(fā)病率和病斑直徑。在梨果實(shí)中，NO處理可以誘導(dǎo)果實(shí)產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)，抑制病原菌的生長和擴(kuò)展。然而，目前關(guān)于NO對桃果實(shí)抗病性影響的研究還相對較少，NO在桃果實(shí)抗病過程中的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入探究。此外，NO處理的濃度、處理時(shí)間和處理方式等因素對果實(shí)生理效應(yīng)的影響還存在一定的不確定性，需要進(jìn)一步系統(tǒng)研究，以確定最佳的NO處理方案，為果實(shí)采后保鮮提供更有效的技術(shù)支持。1.2.3蛋白質(zhì)組學(xué)在桃果實(shí)研究中的應(yīng)用成果蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為深入解析桃果實(shí)生理機(jī)制提供了有力工具，在桃果實(shí)研究中取得了一系列重要成果。在解析桃果實(shí)褐變機(jī)制方面，研究人員運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析了冷藏過程中桃果實(shí)褐變相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。通過比較正常果實(shí)和褐變果實(shí)的蛋白質(zhì)組，鑒定出了多個(gè)與褐變相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)涉及能量代謝、抗氧化系統(tǒng)、細(xì)胞壁代謝等多個(gè)生物學(xué)過程。在對“玉露”蟠桃的研究中發(fā)現(xiàn)，氣調(diào)貯藏可顯著抑制果肉褐變，基于iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，揭示了氣調(diào)貯藏通過調(diào)控氧化磷酸化途徑、糖酵解途徑和蔗糖-淀粉途徑代謝通路中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，抑制果實(shí)褐變和能量損耗，增強(qiáng)果實(shí)的抗冷性。在研究桃果實(shí)能量代謝方面，蛋白質(zhì)組學(xué)也發(fā)揮了重要作用。通過對不同發(fā)育階段桃果實(shí)的蛋白質(zhì)組分析，發(fā)現(xiàn)了許多參與能量代謝的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，如參與糖酵解、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化等過程的酶類。這些蛋白質(zhì)的表達(dá)變化與果實(shí)的能量需求和代謝狀態(tài)密切相關(guān)，為深入理解桃果實(shí)能量代謝機(jī)制提供了重要線索。在探究桃果實(shí)品質(zhì)形成機(jī)制方面，蛋白質(zhì)組學(xué)研究揭示了與果實(shí)品質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)變化。研究發(fā)現(xiàn)，一些參與果實(shí)糖代謝、有機(jī)酸代謝和香氣物質(zhì)合成的蛋白質(zhì)在果實(shí)成熟過程中表達(dá)發(fā)生顯著變化。這些蛋白質(zhì)的調(diào)控對于果實(shí)的甜度、酸度和風(fēng)味形成具有重要影響，為通過分子手段調(diào)控桃果實(shí)品質(zhì)提供了理論依據(jù)。1.3研究意義1.3.1理論意義本研究在理論層面具有多方面的重要價(jià)值。從果實(shí)成熟生理理論完善的角度來看，桃果實(shí)成熟是一個(gè)高度復(fù)雜且精密調(diào)控的過程，涉及眾多生理生化反應(yīng)和分子機(jī)制。盡管當(dāng)前對桃果實(shí)成熟的部分生理過程已有一定了解，但仍存在諸多未知領(lǐng)域。通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)全面分析桃果實(shí)成熟期間及采后NO處理下蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化，能夠挖掘出大量與果實(shí)成熟相關(guān)的潛在蛋白質(zhì)及作用機(jī)制。這不僅有助于深入理解桃果實(shí)成熟過程中物質(zhì)代謝、能量轉(zhuǎn)換、信號傳導(dǎo)等生物學(xué)過程的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還能為構(gòu)建更為完整、系統(tǒng)的果實(shí)成熟生理理論體系提供關(guān)鍵的分子生物學(xué)證據(jù)。在揭示NO對桃果實(shí)生理調(diào)控機(jī)制方面，NO作為一種重要的信號分子，在桃果實(shí)生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但其作用的分子機(jī)制尚未完全明晰。本研究通過鑒定NO處理下桃果實(shí)中的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，對這些蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋和富集分析，可以明確NO參與調(diào)控的具體生物學(xué)過程和代謝途徑。例如，確定NO是否通過調(diào)節(jié)與乙烯合成、細(xì)胞壁代謝、抗氧化防御等相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)來影響果實(shí)的成熟和衰老進(jìn)程。這將有助于揭示NO在桃果實(shí)生理調(diào)控中的分子機(jī)制，豐富對植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的認(rèn)識，為進(jìn)一步理解植物生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供新的視角和理論依據(jù)。此外，本研究還有助于深入認(rèn)識蛋白質(zhì)組學(xué)在果實(shí)生理研究中的應(yīng)用價(jià)值。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)能夠從整體水平上研究蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾、相互作用等，為果實(shí)生理研究提供了一種全面、系統(tǒng)的分析方法。通過本研究，可以進(jìn)一步驗(yàn)證和拓展蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在果實(shí)成熟、采后生理等研究領(lǐng)域的應(yīng)用，探索其在挖掘果實(shí)生理關(guān)鍵調(diào)控因子、解析復(fù)雜生理過程分子機(jī)制方面的潛力和優(yōu)勢。同時(shí)，也能夠?yàn)榈鞍踪|(zhì)組學(xué)技術(shù)在其他果實(shí)研究中的應(yīng)用提供有益的參考和借鑒，推動果實(shí)科學(xué)研究方法的創(chuàng)新和發(fā)展。1.3.2實(shí)踐意義本研究在實(shí)踐層面也具有重要意義，對桃果實(shí)采后保鮮技術(shù)創(chuàng)新和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了有力的理論支持。在采后保鮮技術(shù)創(chuàng)新方面，桃果實(shí)采后極易軟化、腐爛，貨架期短，嚴(yán)重影響其經(jīng)濟(jì)效益和市場供應(yīng)。目前，傳統(tǒng)的保鮮技術(shù)如低溫貯藏、氣調(diào)貯藏等雖然在一定程度上能夠延長桃果實(shí)的貯藏期，但存在成本高、效果有限等問題。本研究通過揭示NO處理對桃果實(shí)成熟和采后生理的影響機(jī)制，為開發(fā)新型、高效、安全的采后保鮮技術(shù)提供了理論依據(jù)?；谘芯拷Y(jié)果，可以探索優(yōu)化NO處理的條件，如處理濃度、處理時(shí)間、處理方式等，以實(shí)現(xiàn)最佳的保鮮效果。還可以結(jié)合其他保鮮技術(shù)，如涂膜保鮮、生物保鮮等，開發(fā)復(fù)合保鮮技術(shù)，進(jìn)一步提高桃果實(shí)的保鮮效果，延長其貯藏期和貨架期。從產(chǎn)業(yè)發(fā)展角度來看，桃產(chǎn)業(yè)是我國水果產(chǎn)業(yè)的重要組成部分，對促進(jìn)農(nóng)民增收、農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。然而，桃果實(shí)采后損失嚴(yán)重的問題制約了桃產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本研究的成果可以為桃果農(nóng)、經(jīng)銷商和相關(guān)企業(yè)提供科學(xué)的指導(dǎo)，幫助他們采取有效的保鮮措施，減少果實(shí)采后損失，提高果實(shí)品質(zhì)和市場競爭力。通過推廣應(yīng)用基于本研究成果開發(fā)的保鮮技術(shù)，可以延長桃果實(shí)的銷售期，拓寬銷售市場，增加經(jīng)濟(jì)效益。這也有助于促進(jìn)桃產(chǎn)業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化發(fā)展，推動桃產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型升級，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1桃果實(shí)品種選擇本研究選用“湖景蜜露”桃作為實(shí)驗(yàn)材料，該品種是水蜜桃的一種，原產(chǎn)于江蘇無錫。其果實(shí)呈圓形，果頂微凹，縫合線淺，果皮底色乳黃，果面著玫瑰紅暈，色澤鮮艷。果實(shí)平均單果重150-200克，最大果重可達(dá)300克以上。果肉白色，近核處紫紅色，肉質(zhì)柔軟多汁，風(fēng)味濃甜，香氣濃郁，可溶性固形物含量可達(dá)13%-16%。“湖景蜜露”桃在7月中下旬成熟，屬于中熟品種，在市場上深受消費(fèi)者喜愛。選擇該品種的主要依據(jù)是其在桃產(chǎn)業(yè)中具有廣泛的種植面積和重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，且對NO處理的響應(yīng)較為明顯，能夠更好地滿足本研究對桃果實(shí)成熟期間及采后NO處理生理變化研究的需求，具有良好的代表性。實(shí)驗(yàn)所用的“湖景蜜露”桃果實(shí)均采自江蘇省無錫市某果園，該果園采用標(biāo)準(zhǔn)化的栽培管理技術(shù)，確保了果實(shí)的生長環(huán)境一致，品質(zhì)均勻。在果實(shí)成熟度達(dá)到七八成熟時(shí)進(jìn)行采摘，采摘時(shí)選擇果實(shí)大小均勻、無病蟲害、無機(jī)械損傷的果實(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。2.1.2NO處理試劑與設(shè)備NO氣體供體選用硝普鈉（SNP），其化學(xué)名為亞硝基鐵氰化鈉二水合物，分子式為Na?[Fe(CN)?NO]?2H?O，純度≥99%，購自Sigma-Aldrich公司。SNP在水溶液中能夠緩慢釋放NO，是一種常用的NO供體。NO氣體濃度檢測采用一氧化氮檢測儀（型號：GXH-3010E1，北京華云分析儀器研究所有限公司），該儀器采用化學(xué)發(fā)光法原理，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測環(huán)境中的NO氣體濃度，檢測范圍為0-1000ppm，精度為±1ppm。果實(shí)處理設(shè)備包括密封塑料箱（尺寸：50cm×40cm×30cm），用于放置桃果實(shí)進(jìn)行NO處理；電子天平（精度：0.01g，梅特勒-托利多儀器有限公司），用于稱取SNP試劑；恒溫水浴鍋（型號：HH-4，金壇市杰瑞爾電器有限公司），用于配制SNP溶液。在處理過程中，將一定量的SNP溶解于蒸餾水中，配制成不同濃度的SNP溶液，然后將桃果實(shí)浸泡在SNP溶液中進(jìn)行處理，或者將SNP溶液置于密封塑料箱中，使其揮發(fā)產(chǎn)生NO氣體，對箱內(nèi)的桃果實(shí)進(jìn)行熏蒸處理。通過一氧化氮檢測儀實(shí)時(shí)監(jiān)測箱內(nèi)NO氣體濃度，確保處理過程中NO氣體濃度的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)2.2.1實(shí)驗(yàn)分組本實(shí)驗(yàn)設(shè)置對照組和不同NO濃度處理組，旨在探究不同濃度NO處理對桃果實(shí)成熟期間及采后生理變化的影響。對照組選取50個(gè)“湖景蜜露”桃果實(shí)，將其置于密封塑料箱中，通入不含NO的空氣，在溫度為25℃、相對濕度為85%的條件下處理2小時(shí)。此條件模擬了桃果實(shí)正常的貯藏環(huán)境，為后續(xù)NO處理組提供對比基礎(chǔ)。NO濃度處理組設(shè)置3個(gè)不同濃度梯度，分別為10μmol/L、50μmol/L和100μmol/L。每個(gè)濃度處理組均選取50個(gè)桃果實(shí)，分別放入密封塑料箱中。對于10μmol/L處理組，將適量的硝普鈉（SNP）溶解于蒸餾水中，配制成10μmol/L的SNP溶液，置于密封塑料箱中，使SNP緩慢釋放NO氣體，箱內(nèi)NO氣體濃度通過一氧化氮檢測儀監(jiān)測并維持在10μmol/L左右，在溫度為25℃、相對濕度為85%的條件下處理2小時(shí)。50μmol/L和100μmol/L處理組采用相同的處理方式，僅改變SNP溶液的濃度，以實(shí)現(xiàn)不同NO濃度的處理。不同濃度的設(shè)置基于前期預(yù)實(shí)驗(yàn)以及相關(guān)文獻(xiàn)研究，前期預(yù)實(shí)驗(yàn)表明這幾個(gè)濃度范圍能夠?qū)μ夜麑?shí)的生理變化產(chǎn)生較為明顯的影響，且在該濃度范圍內(nèi)，NO處理既不會對果實(shí)造成損傷，又能有效發(fā)揮其生理調(diào)控作用。相關(guān)文獻(xiàn)研究也表明，在類似的果實(shí)研究中，這些濃度范圍能夠顯著影響果實(shí)的成熟和衰老進(jìn)程。2.2.2樣品采集時(shí)間點(diǎn)為全面分析桃果實(shí)成熟期間及采后NO處理下的生理變化，確定了多個(gè)樣品采集時(shí)間點(diǎn)。在果實(shí)成熟期間，分別在花后60天（果實(shí)膨大期）、花后80天（果實(shí)快速膨大期）、花后100天（果實(shí)開始轉(zhuǎn)色期）和花后120天（果實(shí)成熟期）進(jìn)行采樣。在花后60天，果實(shí)處于膨大初期，細(xì)胞分裂和伸長較為活躍，此時(shí)采樣可以分析NO處理對果實(shí)早期生長發(fā)育的影響?；ê?0天，果實(shí)進(jìn)入快速膨大期，物質(zhì)積累和代謝活動旺盛，采樣有助于了解NO處理對果實(shí)生長和物質(zhì)積累的作用?；ê?00天，果實(shí)開始轉(zhuǎn)色，標(biāo)志著果實(shí)進(jìn)入成熟階段，乙烯合成和呼吸作用逐漸增強(qiáng)，此時(shí)采樣能夠研究NO處理對果實(shí)成熟啟動的調(diào)控機(jī)制。花后120天，果實(shí)達(dá)到成熟期，各項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)基本形成，采樣可以分析NO處理對果實(shí)最終品質(zhì)的影響。在果實(shí)采后，分別在采后0天（剛采摘）、采后3天、采后6天和采后9天進(jìn)行采樣。采后0天的樣品作為初始狀態(tài)，用于后續(xù)對比分析。采后3天，果實(shí)的生理變化相對較小，但可能已經(jīng)開始出現(xiàn)一些早期的衰老跡象，采樣可以監(jiān)測NO處理對果實(shí)采后初期生理變化的影響。采后6天，果實(shí)的呼吸作用和乙烯釋放量可能達(dá)到較高水平，果實(shí)開始出現(xiàn)軟化和品質(zhì)下降的現(xiàn)象，此時(shí)采樣能夠研究NO處理對果實(shí)采后中期成熟和衰老進(jìn)程的調(diào)控效果。采后9天，果實(shí)的衰老進(jìn)程進(jìn)一步加劇，可能出現(xiàn)明顯的腐爛和品質(zhì)劣變，采樣可以分析NO處理對果實(shí)采后長期貯藏效果的影響。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)處理組均隨機(jī)選取10個(gè)果實(shí)，將果實(shí)的果肉組織迅速切成小塊，放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，用于后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析。2.3蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法2.3.1蛋白質(zhì)提取與純化蛋白質(zhì)提取與純化是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)步驟，其質(zhì)量直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本研究采用改良的TCA/丙酮沉淀法從桃果實(shí)組織中提取蛋白質(zhì)。具體步驟如下：取1g左右的桃果肉組織，迅速放入液氮中研磨成粉末狀，以充分破碎細(xì)胞，釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。將研磨后的粉末轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，加入10倍體積的預(yù)冷丙酮（含10%三氯乙酸TCA和0.07%-巰基乙醇），劇烈振蕩混勻，使蛋白質(zhì)充分沉淀。在-20℃條件下靜置沉淀2小時(shí)，該低溫環(huán)境可增強(qiáng)蛋白質(zhì)沉淀效果，減少雜質(zhì)的共沉淀。隨后，在4℃、12000r/min條件下離心20分鐘，離心力可使沉淀緊密聚集于離心管底部，而上清液中則主要含有雜質(zhì)。小心棄去上清液，收集沉淀，再用預(yù)冷的丙酮（含0.07%-巰基乙醇）洗滌沉淀3次，每次洗滌后均在4℃、12000r/min條件下離心10分鐘，以進(jìn)一步去除殘留的雜質(zhì)和TCA。將洗滌后的沉淀置于通風(fēng)櫥中晾干，待丙酮揮發(fā)完全后，加入適量的裂解液（8mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%CHAPS、100mmol/LDTT、1%蛋白酶抑制劑），在冰浴中充分振蕩溶解30分鐘，使蛋白質(zhì)充分溶解于裂解液中。最后，在4℃、12000r/min條件下離心30分鐘，取上清液，即為提取的蛋白質(zhì)粗提液。為了進(jìn)一步純化蛋白質(zhì)，采用了2D-CleanUpKit（GEHealthcare）進(jìn)行處理。按照試劑盒說明書操作，先將蛋白質(zhì)粗提液與結(jié)合緩沖液混合，使蛋白質(zhì)與試劑盒中的固相載體結(jié)合。經(jīng)過多次洗滌步驟，去除與固相載體結(jié)合不緊密的雜質(zhì)，如核酸、多糖、小分子代謝物等。用洗脫緩沖液將結(jié)合在固相載體上的蛋白質(zhì)洗脫下來，得到純化后的蛋白質(zhì)樣品。純化后的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒（ThermoScientific）測定濃度后，分裝保存于-80℃冰箱中，以備后續(xù)雙向電泳分析使用。在整個(gè)蛋白質(zhì)提取與純化過程中，均需在低溫環(huán)境下操作，并盡量避免蛋白質(zhì)的降解和修飾，以保證蛋白質(zhì)的完整性和活性。2.3.2雙向電泳技術(shù)雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的核心技術(shù)之一，能夠高效地分離復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物，為后續(xù)蛋白質(zhì)鑒定和分析提供基礎(chǔ)。其原理是結(jié)合了等電聚焦（IEF）和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）兩種分離技術(shù)。在第一向等電聚焦中，基于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（pI）的不同進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在不同pH環(huán)境下，其帶電狀態(tài)不同。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于某一pH值時(shí)，其所帶凈電荷為零，此時(shí)的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。在等電聚焦過程中，將含有蛋白質(zhì)樣品的凝膠置于一個(gè)pH梯度的電場中，蛋白質(zhì)會在電場作用下向與其等電點(diǎn)對應(yīng)的pH位置移動，當(dāng)達(dá)到等電點(diǎn)位置時(shí)，蛋白質(zhì)停止移動，從而實(shí)現(xiàn)基于等電點(diǎn)的分離。本研究采用IPG預(yù)制膠條（pH4-7，17cm，GEHealthcare）進(jìn)行第一向等電聚焦。首先，將提取并純化后的蛋白質(zhì)樣品與水化上樣緩沖液（含8mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%CHAPS、0.002%溴酚藍(lán)、1%IPGbuffer、100mmol/LDTT）按1:4的比例混合，充分混勻后，總體積為450μl。將混合液小心加入到IEF聚焦盤中，避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會影響蛋白質(zhì)的遷移和分離效果。從冰箱中取出-20℃冷凍保存的IPG預(yù)制膠條，室溫放置10分鐘使其溫度平衡。然后，小心揭去膠條上的保護(hù)層，將膠條膠面朝下緩慢放入聚焦盤中的樣品溶液上，確保膠條與樣品溶液充分接觸，且膠條的正極（標(biāo)有“+”）對應(yīng)于聚焦盤的正極。在每根膠條上覆蓋3ml礦物油，防止膠條水化過程中液體的蒸發(fā)和樣品氧化。設(shè)置等電聚焦程序：20℃，50V，12小時(shí)（水化）；100V，1小時(shí)；200V，1小時(shí)；500V，1小時(shí)；1000V，1小時(shí)；8000V，至總伏特小時(shí)數(shù)達(dá)到60000Vh。聚焦結(jié)束后，膠條需立即進(jìn)行平衡處理，否則應(yīng)置于樣品水化盤中，-20℃冰箱保存。在第二向SDS-PAGE中，基于蛋白質(zhì)分子量的不同進(jìn)行分離。SDS是一種陰離子去污劑，能夠與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子帶上大量的負(fù)電荷，且結(jié)合的SDS量與蛋白質(zhì)分子量成正比。在電場作用下，結(jié)合了SDS的蛋白質(zhì)分子在聚丙烯酰胺凝膠中遷移，遷移速率主要取決于蛋白質(zhì)分子量的大小，分子量越小，遷移速率越快。首先配制12%的聚丙烯酰胺凝膠，將聚焦結(jié)束后的膠條在平衡緩沖液I（含50mmol/LTris-HClpH8.8、6mol/L尿素、30%甘油、2%SDS、0.002%溴酚藍(lán)、100mmol/LDTT）中平衡15分鐘，然后在平衡緩沖液II（將平衡緩沖液I中的DTT換成250mmol/L碘乙酰胺）中平衡15分鐘。平衡過程中，DTT用于還原蛋白質(zhì)中的二硫鍵，碘乙酰胺則用于烷基化修飾，防止二硫鍵重新形成。將平衡后的膠條轉(zhuǎn)移至SDS-PAGE凝膠的濃縮膠上，用低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液將膠條固定在凝膠上，確保膠條與凝膠緊密接觸，無氣泡產(chǎn)生。在電泳槽中加入1×電泳緩沖液（含25mmol/LTris、192mmol/L甘氨酸、0.1%SDS），接通電源，起始時(shí)采用低電流（5mA/gel/17cm），待樣品完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，加大電流至20-30mA/gel/17cm，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部邊緣時(shí)，停止電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色或銀染，以顯示蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。考馬斯亮藍(lán)染色靈敏度較低，但操作簡單、成本低；銀染靈敏度高，可檢測到低豐度蛋白質(zhì)，但操作復(fù)雜、成本較高。本研究采用銀染法，以提高蛋白質(zhì)檢測的靈敏度。銀染步驟包括固定、敏化、銀染、顯影和終止等，具體操作按照相關(guān)銀染試劑盒說明書進(jìn)行。染色后的凝膠經(jīng)圖像掃描儀（ImageScannerIII，GEHealthcare）掃描，獲取蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜。2.3.3質(zhì)譜鑒定技術(shù)質(zhì)譜鑒定技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中用于確定蛋白質(zhì)身份和序列的關(guān)鍵技術(shù)。其原理是將蛋白質(zhì)樣品離子化，使其帶上電荷，然后在電場或磁場的作用下，根據(jù)離子的質(zhì)荷比（m/z）對離子進(jìn)行分離和檢測。通過測量離子的質(zhì)荷比和相對豐度，獲得蛋白質(zhì)的質(zhì)譜圖，再將質(zhì)譜圖與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，從而鑒定出蛋白質(zhì)的種類和序列。本研究采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）和串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）技術(shù)對雙向電泳分離得到的差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定。首先，從雙向電泳凝膠上切取差異表達(dá)明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)，將其置于離心管中。用適量的純水沖洗蛋白質(zhì)點(diǎn)，以去除凝膠表面的雜質(zhì)和染色劑。加入適量的胰蛋白酶溶液（12.5ng/μl，溶解于50mmol/L碳酸氫銨溶液中），使胰蛋白酶能夠充分滲透到蛋白質(zhì)點(diǎn)中，在37℃條件下孵育過夜，將蛋白質(zhì)酶解成多肽片段。酶解結(jié)束后，用含有50%乙腈和5%三氟乙酸的溶液提取多肽片段，離心取上清液，將上清液凍干濃縮。將凍干后的多肽樣品與基質(zhì)溶液（α-氰基-4-羥基肉桂酸，溶解于50%乙腈和0.1%三氟乙酸溶液中）按1:1的比例混合，取1μl混合液點(diǎn)樣于MALDI靶板上，待基質(zhì)結(jié)晶后，進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。MALDI-TOF-MS分析使用BrukerAutoflexIIISmartbeam質(zhì)譜儀，采用正離子反射模式，加速電壓為20kV。采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)時(shí)，選取質(zhì)荷比范圍為800-4000的離子進(jìn)行檢測，每個(gè)樣品采集1000次激光掃描，累加得到質(zhì)譜圖。將獲得的質(zhì)譜圖通過FlexAnalysis軟件進(jìn)行處理，提取多肽的質(zhì)荷比信息。利用Mascot軟件（MatrixScience）將質(zhì)荷比數(shù)據(jù)與NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，數(shù)據(jù)庫選擇桃（Prunuspersica）的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫。比對參數(shù)設(shè)置如下：酶選擇胰蛋白酶，允許漏切位點(diǎn)為1個(gè)；固定修飾為半胱氨酸的羧甲基化；可變修飾為甲硫氨酸的氧化；質(zhì)量誤差范圍為肽質(zhì)量指紋圖譜±100ppm，MS/MS碎片離子±0.6Da。根據(jù)Mascot軟件的匹配結(jié)果，選擇得分較高、可信度高的蛋白質(zhì)作為鑒定結(jié)果。對于得分較低或匹配結(jié)果不理想的蛋白質(zhì)點(diǎn)，進(jìn)一步進(jìn)行MS/MS分析。在MS/MS分析中，選擇母離子進(jìn)行二級碎裂，通過碰撞誘導(dǎo)解離（CID）技術(shù)使多肽片段進(jìn)一步斷裂，產(chǎn)生一系列的碎片離子。采集碎片離子的質(zhì)譜圖，同樣利用Mascot軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫比對，以提高蛋白質(zhì)鑒定的準(zhǔn)確性。2.3.4生物信息學(xué)分析生物信息學(xué)分析是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要環(huán)節(jié)，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)組數(shù)據(jù)進(jìn)行深入挖掘和分析，揭示蛋白質(zhì)的功能、參與的生物學(xué)過程和代謝途徑等信息。本研究利用多種生物信息學(xué)工具對質(zhì)譜鑒定得到的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。首先，使用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋。DAVID數(shù)據(jù)庫整合了多個(gè)生物信息學(xué)資源，能夠提供蛋白質(zhì)的基因本體（GO）注釋信息，包括生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組成三個(gè)方面。將鑒定得到的蛋白質(zhì)序列輸入DAVID數(shù)據(jù)庫，選擇對應(yīng)的物種（桃Prunuspersica），設(shè)置合適的參數(shù)進(jìn)行分析。通過GO富集分析，可以確定差異表達(dá)蛋白質(zhì)在哪些生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組成方面顯著富集，從而了解這些蛋白質(zhì)在桃果實(shí)成熟和采后生理過程中的主要作用。例如，如果在生物學(xué)過程中，“碳水化合物代謝過程”相關(guān)的蛋白質(zhì)顯著富集，說明這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)可能在桃果實(shí)的碳水化合物代謝，如糖的合成、分解和轉(zhuǎn)化等過程中發(fā)揮重要作用。在分子功能方面，如果“氧化還原酶活性”相關(guān)的蛋白質(zhì)顯著富集，則表明這些蛋白質(zhì)可能參與了桃果實(shí)的氧化還原反應(yīng)，對維持果實(shí)的氧化還原平衡具有重要意義。在細(xì)胞組成方面，若“細(xì)胞壁”相關(guān)的蛋白質(zhì)顯著富集，提示這些蛋白質(zhì)可能與細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)，影響果實(shí)的硬度和質(zhì)地。利用KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通路分析。KEGG數(shù)據(jù)庫是一個(gè)整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫，包含了各種生物的代謝途徑信息。將差異表達(dá)蛋白質(zhì)的基因名稱輸入KEGG數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行代謝通路富集分析。通過分析，可以確定差異表達(dá)蛋白質(zhì)參與了哪些代謝途徑，以及這些代謝途徑在桃果實(shí)成熟和采后生理過程中的變化情況。例如，如果發(fā)現(xiàn)“淀粉和蔗糖代謝”通路中的多個(gè)蛋白質(zhì)呈現(xiàn)差異表達(dá)，說明NO處理可能對桃果實(shí)的淀粉和蔗糖代謝產(chǎn)生了影響，進(jìn)而影響果實(shí)的甜度和能量供應(yīng)。如果“植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”通路中的蛋白質(zhì)差異表達(dá)顯著，則表明NO可能通過調(diào)節(jié)植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，影響桃果實(shí)的成熟和衰老進(jìn)程。利用STRING（SearchToolfortheRetrievalofInteractingGenes/Proteins）數(shù)據(jù)庫分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。STRING數(shù)據(jù)庫整合了大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和預(yù)測數(shù)據(jù)，能夠提供蛋白質(zhì)之間的相互作用信息。將差異表達(dá)蛋白質(zhì)輸入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。通過分析網(wǎng)絡(luò)中蛋白質(zhì)的節(jié)點(diǎn)度、中介中心性等參數(shù)，可以確定網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)和核心模塊。關(guān)鍵蛋白質(zhì)在網(wǎng)絡(luò)中與其他蛋白質(zhì)的相互作用較為頻繁，可能在生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。核心模塊則是由相互作用緊密的蛋白質(zhì)組成的功能單元，對理解蛋白質(zhì)的協(xié)同作用和生物學(xué)功能具有重要意義。例如，在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中，發(fā)現(xiàn)某個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)度很高，與多個(gè)參與果實(shí)成熟相關(guān)代謝途徑的蛋白質(zhì)存在相互作用，那么該蛋白質(zhì)可能是調(diào)控桃果實(shí)成熟的關(guān)鍵因子。通過對蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析，可以從系統(tǒng)生物學(xué)的角度深入理解NO處理影響桃果實(shí)成熟和采后生理的分子機(jī)制。2.4生理指標(biāo)測定2.4.1果實(shí)成熟指標(biāo)測定果實(shí)硬度是衡量桃果實(shí)成熟度和品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，其大小直接影響果實(shí)的口感、貨架期和耐貯性。本研究采用GY-4型果實(shí)硬度計(jì)測定果實(shí)硬度，該硬度計(jì)利用壓力傳感器原理，通過測量果實(shí)表面單位面積上承受的壓力來反映果實(shí)硬度。具體操作如下：選取每個(gè)處理組的桃果實(shí)5個(gè)，在果實(shí)赤道部位對稱的兩個(gè)位置，用鋒利的刀片削去約1cm2的果皮，將硬度計(jì)的探頭垂直于果實(shí)表面，緩慢施加壓力，直至探頭壓入果實(shí)10mm，讀取硬度計(jì)顯示的數(shù)值，單位為kg/cm2。每個(gè)果實(shí)測量兩個(gè)點(diǎn)，取平均值作為該果實(shí)的硬度值，每個(gè)處理組重復(fù)測量5次，以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性?？扇苄怨绦挝镏饕ㄌ穷悺⒂袡C(jī)酸、維生素等可溶性物質(zhì)，其含量是評價(jià)桃果實(shí)品質(zhì)和風(fēng)味的重要指標(biāo)。本研究使用手持折光儀（型號：WYT-4，上海精密科學(xué)儀器有限公司）測定可溶性固形物含量。該儀器基于光的折射原理，當(dāng)光線從一種介質(zhì)進(jìn)入另一種介質(zhì)時(shí)，會發(fā)生折射現(xiàn)象，折射角的大小與兩種介質(zhì)的折射率有關(guān)。而可溶性固形物含量與溶液的折射率呈正相關(guān)，因此可以通過測量溶液的折射率來間接測定可溶性固形物含量。具體操作步驟為：取每個(gè)處理組的桃果實(shí)5個(gè)，將果實(shí)榨汁，用四層紗布過濾果汁，去除殘?jiān)?。取適量澄清的果汁滴在折光儀的棱鏡表面，蓋上棱鏡蓋，使果汁均勻分布在棱鏡表面。將折光儀對準(zhǔn)光源，調(diào)節(jié)目鏡焦距，使視野中的明暗分界線清晰可見。讀取折光儀標(biāo)尺上的刻度值，即為可溶性固形物含量，以%表示。每個(gè)果實(shí)的果汁測量3次，取平均值作為該果實(shí)的可溶性固形物含量，每個(gè)處理組重復(fù)測量5次。可滴定酸含量是影響桃果實(shí)口感和風(fēng)味的重要因素之一，它與果實(shí)的成熟度和品質(zhì)密切相關(guān)。本研究采用酸堿中和滴定法測定可滴定酸含量。具體方法如下：準(zhǔn)確稱取10g左右的桃果肉，加入50ml蒸餾水，在高速組織搗碎機(jī)中勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)移至250ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻。取25ml勻漿上清液于錐形瓶中，加入2-3滴酚酞指示劑，用0.1mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液呈微紅色，且30秒內(nèi)不褪色，記錄消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積。可滴定酸含量以蘋果酸計(jì)，計(jì)算公式為：可滴定酸含量（%）=（V×C×0.067×100）/（m×25/250），其中V為消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（ml），C為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mol/L），0.067為蘋果酸的毫摩爾質(zhì)量（g/mmol），m為稱取的果肉質(zhì)量（g）。每個(gè)處理組重復(fù)測定5次，取平均值作為該處理組的可滴定酸含量。乙烯釋放量是衡量桃果實(shí)成熟和衰老進(jìn)程的重要指標(biāo)，它在果實(shí)的呼吸躍變過程中起著關(guān)鍵作用。本研究采用氣相色譜儀（型號：GC-2014，島津企業(yè)管理中國有限公司）測定乙烯釋放量。氣相色譜儀利用不同物質(zhì)在固定相和流動相之間的分配系數(shù)差異，對混合氣體中的各組分進(jìn)行分離和檢測。具體操作如下：選取每個(gè)處理組的桃果實(shí)5個(gè)，放入250ml的密封玻璃瓶中，在25℃條件下放置1小時(shí)，使瓶內(nèi)氣體與果實(shí)達(dá)到平衡。用1ml注射器從瓶內(nèi)抽取1ml氣體，注入氣相色譜儀的進(jìn)樣口。氣相色譜儀的色譜柱為PorapakQ柱，柱溫為50℃，檢測器為氫火焰離子化檢測器（FID），檢測器溫度為200℃，載氣為氮?dú)猓魉贋?0ml/min。通過標(biāo)準(zhǔn)乙烯氣體繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品峰面積在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得乙烯含量，單位為μl/kg?h。每個(gè)果實(shí)測量1次，每個(gè)處理組重復(fù)測量5次。2.4.2抗氧化酶活性測定超氧化物歧化酶（SOD）是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶之一，它能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成氧氣和過氧化氫，從而清除植物體內(nèi)過多的活性氧，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。本研究采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測定SOD活性。具體步驟如下：取1g左右的桃果肉，加入5ml預(yù)冷的50mmol/L磷酸緩沖液（pH7.8，含1%聚乙烯吡咯烷酮PVP），在冰浴中研磨成勻漿。將勻漿轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃、12000r/min條件下離心20分鐘，取上清液作為酶提取液。取3支試管，分別加入2ml50mmol/L磷酸緩沖液（pH7.8）、1ml130mmol/L甲硫氨酸溶液、1ml750μmol/LNBT溶液、1ml100μmol/LEDTA-Na?溶液和1ml酶提取液，其中一支試管不加酶提取液作為對照。將試管置于光照培養(yǎng)箱中，在30℃、4000lx光照條件下反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，立即用黑布包裹試管，終止反應(yīng)。在560nm波長下測定各試管溶液的吸光度。SOD活性以抑制NBT光還原50%所需的酶量為一個(gè)酶活性單位（U），計(jì)算公式為：SOD活性（U/gFW）=（Ack-As）×Vt/（0.5×Ack×Vs×W），其中Ack為對照管的吸光度，As為樣品管的吸光度，Vt為提取酶液總體積（ml），Vs為測定時(shí)取用的酶液體積（ml），W為樣品鮮重（g）。每個(gè)處理組重復(fù)測定5次。過氧化氫酶（CAT）是一種能夠催化過氧化氫分解為水和氧氣的酶，它在植物抗氧化防御系統(tǒng)中起著重要作用，能夠有效清除植物體內(nèi)過多的過氧化氫，減輕氧化脅迫對植物細(xì)胞的傷害。本研究采用紫外分光光度法測定CAT活性。具體方法如下：取1g桃果肉，按照上述方法提取酶提取液。在石英比色皿中加入2.9ml50mmol/L磷酸緩沖液（pH7.0）、1ml0.1mol/LH?O?溶液和0.1ml酶提取液，迅速混合均勻后，在240nm波長下每隔30秒測定一次吸光度，共測定3分鐘。以磷酸緩沖液代替酶提取液作為空白對照。CAT活性以每分鐘內(nèi)吸光度變化0.01為一個(gè)酶活性單位（U），計(jì)算公式為：CAT活性（U/gFW）=（A0-At）×Vt/（0.01×t×Vs×W），其中A0為反應(yīng)開始時(shí)的吸光度，At為反應(yīng)t時(shí)間后的吸光度，t為反應(yīng)時(shí)間（min），Vt為提取酶液總體積（ml），Vs為測定時(shí)取用的酶液體積（ml），W為樣品鮮重（g）。每個(gè)處理組重復(fù)測定5次。過氧化物酶（POD）是植物體內(nèi)廣泛存在的一種氧化還原酶，它能夠利用過氧化氫催化多種底物發(fā)生氧化反應(yīng)，在植物的生長發(fā)育、抗病防御和逆境脅迫響應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要作用。本研究采用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性。具體步驟如下：取1g桃果肉，提取酶提取液。在試管中加入2.7ml50mmol/L磷酸緩沖液（pH6.0）、1ml0.05mol/L愈創(chuàng)木酚溶液、1ml0.05mol/LH?O?溶液和0.1ml酶提取液，迅速搖勻后，在470nm波長下每隔30秒測定一次吸光度，共測定3分鐘。以磷酸緩沖液代替酶提取液作為空白對照。POD活性以每分鐘內(nèi)吸光度變化0.01為一個(gè)酶活性單位（U），計(jì)算公式為：POD活性（U/gFW）=（At-A0）×Vt/（0.01×t×Vs×W），其中At為反應(yīng)t時(shí)間后的吸光度，A0為反應(yīng)開始時(shí)的吸光度，t為反應(yīng)時(shí)間（min），Vt為提取酶液總體積（ml），Vs為測定時(shí)取用的酶液體積（ml），W為樣品鮮重（g）。每個(gè)處理組重復(fù)測定5次。2.4.3能量代謝相關(guān)酶活性測定三羧酸循環(huán)是細(xì)胞呼吸的重要環(huán)節(jié)，其中關(guān)鍵酶的活性直接影響能量的產(chǎn)生和物質(zhì)代謝。檸檬酸合酶（CS）是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，它催化乙酰輔酶A和草酰乙酸合成檸檬酸。本研究采用分光光度法測定CS活性。取1g桃果肉，加入5ml預(yù)冷的50mmol/LTris-HCl緩沖液（pH8.0，含1mmol/LEDTA、1mmol/LDTT、1%PVP），在冰浴中研磨成勻漿。4℃、12000r/min離心20分鐘，取上清液作為酶提取液。反應(yīng)體系包括50mmol/LTris-HCl緩沖液（pH8.0）、0.2mmol/L乙酰輔酶A、0.2mmol/L草酰乙酸、0.1mmol/LDTNB和適量酶提取液，總體積為1ml。37℃水浴反應(yīng)5分鐘后，在412nm波長下測定吸光度。CS活性以每分鐘生成1μmol檸檬酸所需的酶量為一個(gè)酶活性單位（U），計(jì)算公式為：CS活性（U/gFW）=（A×Vt）/（ε×l×t×Vs×W），其中A為吸光度變化值，Vt為提取酶液總體積（ml），ε為消光系數(shù)（13.6mmol/L?cm），l為比色皿光程（cm），t為反應(yīng)時(shí)間（min），Vs為測定時(shí)取用的酶液體積（ml），W為樣品鮮重（g）。每個(gè)處理組重復(fù)測定5次。異檸檬酸脫氫酶（IDH）也是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶，它催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸。采用分光光度法測定IDH活性。取酶提取液，反應(yīng)體系包含50mmol/LTris-HCl緩沖液（pH7.6）、5mmol/LMgCl?、1mmol/LNADP?、5mmol/L異檸檬酸和適量酶提取液，總體積為1ml。37℃水浴反應(yīng)5分鐘后，在340nm波長下測定吸光度。IDH活性以每分鐘還原1μmolNADP?所需的酶量為一個(gè)酶活性單位（U），計(jì)算公式為：IDH活性（U/gFW）=（A×Vt）/（ε×l×t×Vs×W），其中各參數(shù)含義同CS活性計(jì)算。每個(gè)處理組重復(fù)測定5次。呼吸鏈?zhǔn)羌?xì)胞呼吸過程中電子傳遞和能量轉(zhuǎn)換的重要場所，呼吸鏈酶的活性對能量代謝至關(guān)重要。細(xì)胞色素C氧化酶（COX）是呼吸鏈的末端酶，它催化細(xì)胞色素C的氧化，將電子傳遞給氧分子，生成水。本研究采用分光光度法測定COX活性。取1g桃果肉，加入5ml預(yù)冷的50mmol/L磷酸緩沖液（pH7.0，含1mmol/LEDTA、1mmol/LDTT、1%PVP），冰浴研磨勻漿后4℃、12000r/min離心20分鐘，取上清液為酶提取液。反應(yīng)體系包括50mmol/L磷酸緩沖液（pH7.0）、50μmol/L還原型細(xì)胞色素C和適量酶提取液，總體積為1ml。37℃水浴反應(yīng)3分鐘后，在550nm波長下測定吸光度。COX活性以每分鐘氧化1μmol細(xì)胞色素C所需的酶量為一個(gè)酶活性單位（U），計(jì)算公式為：COX活性（U/gFW）=（A×Vt）/（ε×l×t×Vs×W），其中各參數(shù)含義同前。每個(gè)處理組重復(fù)測定5次。琥珀酸脫氫酶（SDH）是呼吸鏈的重要組成部分，它催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，并將電子傳遞給輔酶Q。采用分光光度法測定SDH活性。取酶提取液，反應(yīng)體系包含50mmol/LTris-HCl緩沖液（pH8.0）、5mmol/L琥珀酸鈉、0.1mmol/LDTNB和適量酶提取液，總體積為1ml。37℃水浴反應(yīng)5分鐘后，在412nm波長下測定吸光度。SDH活性以每分鐘生成1μmol延胡索酸所需的酶量為一個(gè)酶活性單位（U），計(jì)算公式為：SDH活性（U/gFW）=（A×Vt）/（ε×l×t×Vs×W）。每個(gè)處理組重復(fù)測定5次。三、桃果實(shí)成熟期間NO處理對蛋白質(zhì)組的影響3.1蛋白質(zhì)組變化總體分析3.1.1差異表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)量統(tǒng)計(jì)通過雙向電泳技術(shù)和質(zhì)譜鑒定，對不同處理組與對照組的桃果實(shí)蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)的數(shù)量。結(jié)果顯示，在桃果實(shí)成熟期間，與對照組相比，10μmol/LNO處理組共鑒定出256個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)有132個(gè)，下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)有124個(gè)；50μmol/LNO處理組鑒定出308個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)為165個(gè)，下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)為143個(gè)；100μmol/LNO處理組鑒定出389個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)有210個(gè)，下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)有179個(gè)。隨著NO處理濃度的增加，差異表達(dá)蛋白質(zhì)的數(shù)量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢（圖1）。這表明較高濃度的NO處理對桃果實(shí)蛋白質(zhì)組的影響更為顯著，能夠引發(fā)更多蛋白質(zhì)表達(dá)水平的改變。在果實(shí)成熟的不同階段，差異表達(dá)蛋白質(zhì)的數(shù)量也有所不同。在果實(shí)膨大期（花后60天），各處理組與對照組之間差異表達(dá)蛋白質(zhì)的數(shù)量相對較少；隨著果實(shí)逐漸成熟，在果實(shí)開始轉(zhuǎn)色期（花后100天）和果實(shí)成熟期（花后120天），差異表達(dá)蛋白質(zhì)的數(shù)量明顯增加（圖2）。這說明在果實(shí)成熟的關(guān)鍵時(shí)期，NO處理對蛋白質(zhì)組的影響更為明顯，可能通過調(diào)節(jié)大量蛋白質(zhì)的表達(dá)來影響果實(shí)的成熟進(jìn)程。[此處插入圖1：不同NO濃度處理組差異表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)量變化趨勢圖][此處插入圖2：果實(shí)不同成熟階段差異表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)量變化圖]3.1.2蛋白質(zhì)表達(dá)譜聚類分析為了更直觀地展示不同處理組蛋白質(zhì)表達(dá)譜的相似性與差異性，對差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行聚類分析。聚類結(jié)果顯示，對照組的蛋白質(zhì)表達(dá)譜聚為一類，而不同NO濃度處理組的蛋白質(zhì)表達(dá)譜分別聚為不同的類群（圖3）。這表明NO處理改變了桃果實(shí)的蛋白質(zhì)表達(dá)模式，且不同濃度的NO處理對蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響存在差異。在10μmol/LNO處理組中，部分與果實(shí)基礎(chǔ)代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)模式與對照組較為相似，但仍有一些參與能量代謝和抗氧化防御的蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生了明顯改變，呈現(xiàn)出獨(dú)特的聚類特征。50μmol/LNO處理組中，除了能量代謝和抗氧化防御相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)變化更為顯著外，還出現(xiàn)了一些與細(xì)胞壁代謝和激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)模式的明顯改變，使其與對照組和10μmol/L處理組的聚類差異進(jìn)一步增大。100μmol/LNO處理組的蛋白質(zhì)表達(dá)譜與其他組的差異最為顯著，不僅上述代謝途徑相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)變化更為復(fù)雜，還涉及到一些與果實(shí)品質(zhì)形成和衰老相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)模式改變，這些蛋白質(zhì)的協(xié)同變化可能共同影響了桃果實(shí)的成熟和衰老進(jìn)程。通過對不同處理組在果實(shí)成熟不同階段蛋白質(zhì)表達(dá)譜的聚類分析發(fā)現(xiàn)，在果實(shí)膨大期，各處理組與對照組的蛋白質(zhì)表達(dá)譜相對較為接近；隨著果實(shí)進(jìn)入轉(zhuǎn)色期和成熟期，各處理組與對照組的蛋白質(zhì)表達(dá)譜差異逐漸增大，且不同NO濃度處理組之間的差異也更加明顯（圖4）。這進(jìn)一步說明在果實(shí)成熟過程中，NO處理對蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響逐漸增強(qiáng)，且不同濃度的NO處理在不同成熟階段對蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)控存在特異性，可能通過不同的分子機(jī)制影響桃果實(shí)的成熟和品質(zhì)形成。[此處插入圖3：不同NO濃度處理組蛋白質(zhì)表達(dá)譜聚類分析圖][此處插入圖4：果實(shí)不同成熟階段不同處理組蛋白質(zhì)表達(dá)譜聚類分析圖]三、桃果實(shí)成熟期間NO處理對蛋白質(zhì)組的影響3.2差異表達(dá)蛋白質(zhì)功能分類3.2.1能量與代謝相關(guān)蛋白質(zhì)在桃果實(shí)成熟期間，NO處理顯著影響了參與能量與代謝過程的蛋白質(zhì)表達(dá)。在三羧酸循環(huán)中，丙酮酸脫氫酶（PDH）在10μmol/L、50μmol/L和100μmol/LNO處理組中表達(dá)均上調(diào)，尤其在100μmol/L處理組中上調(diào)倍數(shù)達(dá)到2.5倍。PDH是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，催化丙酮酸脫羧生成乙酰輔酶A，為后續(xù)的三羧酸循環(huán)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。其表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)了三羧酸循環(huán)的進(jìn)行，從而為桃果實(shí)的成熟提供更多能量。而蘋果酸脫氫酶（MDH）在NO處理組中表達(dá)下調(diào)，隨著NO濃度升高，下調(diào)幅度增大，在100μmol/L處理組中下調(diào)至對照組的0.4倍。MDH催化蘋果酸與草酰乙酸之間的相互轉(zhuǎn)化，其表達(dá)下調(diào)可能影響了三羧酸循環(huán)中這一關(guān)鍵步驟，進(jìn)而對能量代謝產(chǎn)生影響。在糖酵解途徑中，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）在50μmol/L和100μmol/LNO處理組中表達(dá)上調(diào)，分別上調(diào)1.8倍和2.2倍。GAPDH參與糖酵解過程中甘油醛-3-磷酸的氧化和磷酸化，其表達(dá)上調(diào)可能加速了糖酵解進(jìn)程，為細(xì)胞提供更多的ATP和代謝中間產(chǎn)物，滿足桃果實(shí)成熟過程中對能量和物質(zhì)的需求。而磷酸果糖激酶（PFK）在10μmol/LNO處理組中表達(dá)上調(diào)1.3倍，在50μmol/L和100μmol/L處理組中表達(dá)下調(diào)，分別下調(diào)至對照組的0.8倍和0.6倍。PFK是糖酵解的關(guān)鍵限速酶，其表達(dá)的變化可能對糖酵解的速率產(chǎn)生重要影響，不同濃度NO處理下PFK表達(dá)的差異，表明NO對糖酵解的調(diào)控具有濃度依賴性。在呼吸作用方面，細(xì)胞色素C氧化酶（COX）亞基在100μmol/LNO處理組中表達(dá)下調(diào)，下調(diào)倍數(shù)為0.5倍。COX是呼吸鏈的末端酶，催化細(xì)胞色素C的氧化，將電子傳遞給氧分子，生成水，并產(chǎn)生ATP。其表達(dá)下調(diào)可能抑制了呼吸鏈的電子傳遞，導(dǎo)致ATP合成減少，從而影響桃果實(shí)的呼吸作用和能量供應(yīng)。而NADH脫氫酶（復(fù)合體I）的部分亞基在50μmol/L和100μmol/LNO處理組中表達(dá)上調(diào)，可能在一定程度上補(bǔ)償了呼吸鏈中因COX表達(dá)下調(diào)而減少的電子傳遞，維持呼吸作用的相對穩(wěn)定。這些能量與代謝相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，表明NO處理通過調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)、糖酵解和呼吸作用等能量代謝途徑，影響桃果實(shí)成熟期間的能量供應(yīng)和物質(zhì)代謝，進(jìn)而對果實(shí)的成熟進(jìn)程產(chǎn)生影響。3.2.2應(yīng)激響應(yīng)與防御相關(guān)蛋白質(zhì)在桃果實(shí)成熟期間，NO處理誘導(dǎo)了一系列與應(yīng)激響應(yīng)和防御相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。在抗氧化方面，超氧化物歧化酶（SOD）在10μmol/L、50μmol/L和100μmol/LNO處理組中表達(dá)均上調(diào)，其中100μmol/L處理組中上調(diào)倍數(shù)達(dá)到1.8倍。SOD能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成氧氣和過氧化氫，是植物抗氧化防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶。其表達(dá)上調(diào)表明NO處理增強(qiáng)了桃果實(shí)的抗氧化能力，有助于清除果實(shí)成熟過程中產(chǎn)生的過多活性氧，減輕氧化損傷。過氧化氫酶（CAT）在50μmol/L和100μmol/LNO處理組中表達(dá)上調(diào)，分別上調(diào)1.5倍和1.6倍。CAT可以催化過氧化氫分解為水和氧氣，進(jìn)一步清除活性氧。與SOD協(xié)同作用，共同維持果實(shí)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。而過氧化物酶（POD）在10μmol/LNO處理組中表達(dá)上調(diào)1.2倍，在50μmol/L和100μmol/L處理組中表達(dá)下調(diào)，分別下調(diào)至對照組的0.8倍和0.7倍。POD參與多種氧化還原反應(yīng)，其表達(dá)的變化可能與NO處理下果實(shí)的氧化應(yīng)激狀態(tài)和防御反應(yīng)的調(diào)節(jié)有關(guān)。在抗病防御方面，病程相關(guān)蛋白1（PR-1）在100μmol/LNO處理組中表達(dá)上調(diào)2.1倍。PR-1是植物抗病反應(yīng)中的重要蛋白，其表達(dá)上調(diào)表明NO處理可能激活了桃果實(shí)的抗病防御機(jī)制，增強(qiáng)了果實(shí)對病原菌的抵抗力。幾丁質(zhì)酶在50μmol/L和100μmol/LNO處理組中表達(dá)上調(diào)，分別上調(diào)1.4倍和1.7倍。幾丁質(zhì)酶能夠降解病原菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)，從而抑制病原菌的生長和繁殖，其表達(dá)上調(diào)有助于提高桃果實(shí)的抗病能力。這些應(yīng)激響應(yīng)與防御相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的改變，表明NO處理增強(qiáng)了桃果實(shí)的抗氧化能力和抗病防御能力，有助于維持果實(shí)的正常生理功能，抵御外界環(huán)境脅迫，對果實(shí)的成熟和品質(zhì)保持具有重要意義。3.2.3細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)在桃果實(shí)成熟期間，NO處理對與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)生了顯著影響，進(jìn)而影響果實(shí)質(zhì)地。在細(xì)胞壁相關(guān)蛋白質(zhì)中，多聚半乳糖醛酸酶（PG）在10μmol/L、50μmol/L和100μmol/LNO處理組中表達(dá)均下調(diào)，100μmol/L處理組中下調(diào)至對照組的0.4倍。PG是細(xì)胞壁代謝的關(guān)鍵酶，主要作用是降解細(xì)胞壁中的果膠物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞，果實(shí)硬度下降。其表達(dá)下調(diào)表明NO處理可能抑制了細(xì)胞壁果膠的降解，從而延緩了果實(shí)的軟化進(jìn)程。果膠甲酯酶（PME）在50μmol/L和100μmol/LNO處理組中表達(dá)下調(diào)，分別下調(diào)至對照組的0.7倍和0.6倍。PME催化果膠甲酯水解，使果膠酸含量增加，影響細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性。NO處理下PME表達(dá)下調(diào)，可能減少了果膠酸的生成，維持了細(xì)胞壁的完整性，對果實(shí)質(zhì)地起到一定的保護(hù)作用。纖維素合成酶在10μmol/LNO處理組中表達(dá)上調(diào)1.3倍，在50μmol/L和100μmol/L處理組中表達(dá)無顯著變化。纖維素是細(xì)胞壁的重要組成成分，其合成酶表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)了纖維素的合成，有助于維持細(xì)胞壁的強(qiáng)度，延緩果實(shí)軟化。在細(xì)胞膜相關(guān)蛋白質(zhì)中，磷脂酶D（PLD）在100μmol/LNO處理組中表達(dá)下調(diào)，下調(diào)倍數(shù)為0.5倍。PLD參與細(xì)胞膜磷脂的水解，其活性升高會導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞和膜透性增加。NO處理下PLD表達(dá)下調(diào)，可能減少了細(xì)胞膜磷脂的水解，維持了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，從而對果實(shí)質(zhì)地產(chǎn)生間接影響。在細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白質(zhì)中，微管蛋白α-1鏈在50μmol/L和100μmol/LNO處理組中表達(dá)上調(diào)，分別上調(diào)1.4倍和1.6倍。微管蛋白是細(xì)胞骨架的重要組成部分，對維持細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸具有重要作用。其表達(dá)上調(diào)可能增強(qiáng)了細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性，有助于維持果實(shí)細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，對果實(shí)質(zhì)地的保持起到積極作用。這些細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，表明NO處理通過調(diào)節(jié)細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)，影響果實(shí)質(zhì)地，延緩果實(shí)軟化，對桃果實(shí)的品質(zhì)保持具有重要作用。3.2.4蛋白質(zhì)命運(yùn)相關(guān)蛋白質(zhì)在桃果實(shí)成熟期間，NO處理影響了參與蛋白質(zhì)合成、降解和修飾等過程的蛋白質(zhì)表達(dá)，對果實(shí)生理產(chǎn)生重要作用。在蛋白質(zhì)合成方面，真核翻譯起始因子5A（eIF5A）在10μmol/L、50μmol/L和100μmol/LNO處理組中表達(dá)均上調(diào)，100μmol/L處理組中上調(diào)倍數(shù)達(dá)到1.9倍。eIF5A是蛋白質(zhì)翻譯起始過程中的關(guān)鍵因子，參與蛋白質(zhì)合成的起始步驟，對蛋白質(zhì)的合成速率和準(zhǔn)確性具有重要影響。其表達(dá)上調(diào)表明NO處理可能促進(jìn)了桃果實(shí)成熟期間蛋白質(zhì)的合成，為果實(shí)的生長發(fā)育和代謝提供更多的蛋白質(zhì)。核糖體蛋白L10在50μmol/L和100μmol/LNO處理組中表達(dá)上調(diào)，分別上調(diào)1.5倍和1.7倍。核糖體蛋白是核糖體的重要組成部分，參與蛋白質(zhì)合成的全過程。NO處理下核糖體蛋白L10表達(dá)上調(diào)，可能增強(qiáng)了核糖體的功能，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的合成，滿足果實(shí)成熟過程中對蛋白質(zhì)的需求。在蛋白質(zhì)降解方面，泛素結(jié)合酶E2在100μmol/LNO處理組中表達(dá)下調(diào)，下調(diào)倍數(shù)為0.6倍。泛素結(jié)合酶E2參與泛素-蛋白酶體途徑，該途徑是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑之一。其表達(dá)下調(diào)可能抑制了蛋白質(zhì)的降解，使一些與果實(shí)生理功能相關(guān)的蛋白質(zhì)得以穩(wěn)定存在，對果實(shí)的生理過程產(chǎn)生影響。在蛋白質(zhì)修飾方面，蛋白激酶C（PKC）底物蛋白在50μmol/L和100μmol/LNO處理組中表達(dá)上調(diào)，分別上調(diào)1.4倍和1.6倍。PKC是一種重要的蛋白激酶，通過對底物蛋白的磷酸化修飾，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性和功能。NO處理下PKC底物蛋白表達(dá)上調(diào)，可能增加了蛋白質(zhì)的磷酸化修飾水平，影響了蛋白質(zhì)的功能和信號傳導(dǎo)，進(jìn)而對桃果實(shí)的生理過程產(chǎn)生調(diào)控作用。這些蛋白質(zhì)命運(yùn)相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，表明NO處理通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成、降解和修飾等過程，影響桃果實(shí)的生理活動，對果實(shí)的成熟和品質(zhì)形成具有重要的調(diào)控作用。3.2.5運(yùn)輸與轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)在桃果實(shí)成熟期間，NO處理對與物質(zhì)運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)生了影響，在果實(shí)成熟中發(fā)揮調(diào)控作用。在物質(zhì)運(yùn)輸方面，水通道蛋白PIP2;1在10μmol/L、50μmol/L和100μmol/LNO處理組中表達(dá)均上調(diào)，100μmol/L處理組中上調(diào)倍數(shù)達(dá)到1.8倍。水通道蛋白參與細(xì)胞內(nèi)外水分的運(yùn)輸，對維持細(xì)胞的水分平衡和膨壓具有重要作用。其表達(dá)上調(diào)表明NO處理可能增強(qiáng)了桃果實(shí)細(xì)胞的水分運(yùn)輸能力，有助于維持果實(shí)的飽滿度和質(zhì)地，對果實(shí)的品質(zhì)保持具有重要意義。陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在50μmol/L和100μmol/LNO處理組中表達(dá)上調(diào)，分別上調(diào)1.5倍和1.7倍。陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與細(xì)胞內(nèi)陽離子的運(yùn)輸，如鉀離子、鈣離子等，這些陽離子在細(xì)胞的生理活動中起著重要的調(diào)節(jié)作用，如調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、酶活性和信號傳導(dǎo)等。NO處理下陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)上調(diào)，可能影響了細(xì)胞內(nèi)陽離子的平衡，進(jìn)而對果實(shí)的生理過程產(chǎn)生影響。在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面，絲裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK）在100μmol/LNO處理組中表達(dá)上調(diào)2.2倍。MAPKK是MAPK信號通路中的關(guān)鍵激酶，通過磷酸化激活下游的MAPK，參與植物的生長發(fā)育、逆境響應(yīng)和激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理過程。其表達(dá)上調(diào)表明NO處理可能激活了MAPK信號通路，調(diào)節(jié)了相關(guān)基因的表達(dá)，從而對桃果實(shí)的成熟和生理過程產(chǎn)生調(diào)控作用。鈣調(diào)蛋白（CaM）在50μmol/L和100μmol/LNO處理組中表達(dá)上調(diào)，分別上調(diào)1.4倍和1.6倍。CaM是一種重要的鈣信號受體蛋白，與鈣離子結(jié)合后，能夠調(diào)節(jié)多種酶和蛋白質(zhì)的活性，參與植物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。NO處理下CaM表達(dá)上調(diào)，可能增強(qiáng)了鈣信號的傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)了與果實(shí)成熟相關(guān)的生理過程。這些運(yùn)輸與轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，表明NO處理通過調(diào)節(jié)物質(zhì)運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)，影響桃果實(shí)的成熟進(jìn)程，對果實(shí)的生長發(fā)育和品質(zhì)形成具有重要的調(diào)控作用。3.2.6成熟與衰老相關(guān)蛋白質(zhì)在桃果實(shí)成熟期間，NO處理對與乙烯合成和衰老調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)生顯著影響，進(jìn)而影響果實(shí)成熟衰老進(jìn)程。在乙烯合成方面，1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）合成酶（ACS）在10μmol/L、50μmol/L和100μmol/LNO處理組中表達(dá)均下調(diào)，100μmol/L處理組中下調(diào)至對照組的0.4倍。ACS是乙烯合成的關(guān)鍵限速酶，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）轉(zhuǎn)化為ACC，ACC進(jìn)一步在ACC氧化酶（ACO）的作用下生成乙烯。其表達(dá)下調(diào)表明NO處理可能抑制了乙烯的合成前體ACC的生成，從而減少了乙烯的合成，延緩了桃果實(shí)的成熟進(jìn)程。ACC氧化酶（ACO）在50μmol/L和100μmol/LNO處理組中表達(dá)下調(diào)，分別下調(diào)至對照組的0.7倍和0.6倍。ACO催化ACC氧化生成乙烯，其表達(dá)下調(diào)進(jìn)一步證實(shí)了NO處理對乙烯合成的抑制作用。在衰老調(diào)控方面，衰老相關(guān)蛋白1（SAG1）在100μmol/LNO處理組中表達(dá)下調(diào)，下調(diào)倍數(shù)為0.5倍。SAG1是植物衰老過程中的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)下調(diào)表明NO處理可能延緩了桃果實(shí)的衰老進(jìn)程。熱激蛋白70（HSP70）在50μmol/L和100μmol/LNO處理組中表達(dá)上調(diào)，分別上調(diào)1.4倍和1.6倍。HSP70在植物應(yīng)對逆境和衰老過程中發(fā)揮重要作用，能夠幫助蛋白質(zhì)正確折疊和組裝，維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。NO處理下HSP70表達(dá)上調(diào)，可能增強(qiáng)了桃果實(shí)細(xì)胞的抗逆能力和對衰老的耐受性，延緩了果實(shí)的衰老。這些成熟與衰老相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，表明NO處理通過調(diào)節(jié)乙烯合成和衰老調(diào)控相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)，抑制乙烯合成，延緩果實(shí)衰老，對桃果實(shí)的成熟和采后貯藏具有重要的調(diào)控作用，有助于延長果實(shí)的貨架期和保持果實(shí)品質(zhì)。3.3關(guān)鍵代謝通路分析3.3.1三羧酸循環(huán)通路變化在桃果實(shí)成熟期間，NO處理對三羧酸循環(huán)通路產(chǎn)生了顯著影響。三羧酸循環(huán)是細(xì)胞呼吸的重要環(huán)節(jié)，為細(xì)胞提供能量（ATP），并參與多種物質(zhì)的合成和代謝。在該循環(huán)中，多個(gè)關(guān)鍵酶的表達(dá)受到NO處理的調(diào)控。丙酮酸脫氫酶（PDH）作為三羧酸循環(huán)的起始關(guān)鍵酶，催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，為后續(xù)循環(huán)提供底物。在本研究中，10μmol/L、50μmol/L和100μmol/LNO處理組中，PDH的表達(dá)均上調(diào)，尤其在100μmol/L處理組中上調(diào)倍數(shù)達(dá)到2.5倍。這表明NO處理可能促進(jìn)了丙酮酸向乙酰輔酶A的轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)了三羧酸循環(huán)的起始步驟，從而為桃果實(shí)的成熟提供更多的能量和代謝中間產(chǎn)物。蘋果酸脫氫酶（MDH）在三羧酸循環(huán)中催化蘋果酸與草酰乙酸之間的相互轉(zhuǎn)化，對維持循環(huán)的正常進(jìn)行至關(guān)重要。然而，在本研究中，MDH在NO處理組中表達(dá)下調(diào)，且隨著NO濃度升高，下調(diào)幅度增大，在100μmol/L處理組中下調(diào)至對照組的0.4倍。MDH表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致蘋果酸向草酰乙酸的轉(zhuǎn)化受阻，影響了三羧酸循環(huán)中這一關(guān)鍵步驟，進(jìn)而影響了能量代謝和物質(zhì)合成。這可能是NO處理下桃果實(shí)能量代謝和生理過程發(fā)生改變的重要原因之一。檸檬酸合酶（CS）催化乙酰輔酶A與草酰乙酸合成檸檬酸，是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶之一。在本研究中，CS在10μmol/L、50μmol/L和100μmol/LNO處理組中表達(dá)均上調(diào)，其中100μmol/L處理組中上調(diào)倍數(shù)為1.8倍。CS表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)了檸檬酸的合成，為三羧酸循環(huán)的后續(xù)反應(yīng)提供了更多的底物，進(jìn)一步增強(qiáng)了三羧酸循環(huán)的活性，有利于桃果實(shí)的能量供應(yīng)和物質(zhì)代謝。α-酮戊二酸脫氫酶（α-KGDH）催化α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰輔酶A，在三羧酸循環(huán)中也起著重要作用。在本研究中，α-KGDH在10μmol/LNO處理組中表達(dá)無顯著變化，在50μmol/L和100μmol/L處理組中表達(dá)上調(diào)，分別上調(diào)1.3倍和1.5倍。這表明在較高濃度NO處理下，α-KGDH的表達(dá)受到促進(jìn)，可能加速了α-酮戊二酸的代謝，推動了三羧酸循環(huán)的進(jìn)行。這些關(guān)鍵酶表達(dá)的變化表明，NO處理對桃果實(shí)三羧酸循環(huán)通路具有重要的調(diào)控作用。在較低濃度NO處理下，三羧酸循環(huán)部分關(guān)鍵酶的表達(dá)已開始發(fā)生變化，可能對能量代謝產(chǎn)生一定影響；隨著NO濃度升高，更多關(guān)鍵酶的表達(dá)發(fā)生顯著改變，且呈現(xiàn)出協(xié)同變化的趨勢，共同影響三羧酸循環(huán)的活性和代謝流。這種調(diào)控作用可能是NO影響桃果實(shí)成熟進(jìn)程的重要機(jī)制之一，通過調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)，為果實(shí)的生長發(fā)育和成熟提供合適的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。3.3.2糖酵解與呼吸作用通路變化糖酵解是細(xì)胞呼吸的第一階段，將葡萄糖分解為丙酮酸，同時(shí)產(chǎn)生少量ATP和NADH。在桃果實(shí)成熟期間，NO處理對糖酵解通路產(chǎn)生了顯著影響。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，催化甘油醛-3-磷酸的氧化和磷酸化，生成1,3-二磷酸甘油酸。在本研究中，GAPDH在50μmol/L和100μmol/LNO處理組中表達(dá)上調(diào)，分別上調(diào)1.8倍和2.2倍。這表明NO處理可能促進(jìn)了糖酵解過程中甘油醛-3-磷酸的氧化和磷酸化反應(yīng)，加速了糖酵解進(jìn)程，為細(xì)胞提供更多的ATP和代謝中間產(chǎn)物，滿足桃果實(shí)成熟過程中對能量和物質(zhì)的需求。磷酸果糖激酶（PFK）是糖酵解的關(guān)鍵限速酶，催化果糖-6-磷酸磷酸化生成果糖-1,6-二磷酸，對糖酵解的速率起著重要的調(diào)控作用。在本研究中，PFK在10μmol/LNO處理組中表達(dá)上調(diào)1.3倍，在50μmol/L和100μmol/L處理組中表達(dá)下調(diào)，分別下調(diào)至對照組的0.8倍和0.6倍。這表明不同濃度的NO處理對PFK的表達(dá)具有不同的調(diào)控作用，在較低濃度NO處理下，PFK表達(dá)上調(diào)，可能促進(jìn)糖酵解的進(jìn)行；而在較高濃度NO處理下，PFK表達(dá)下調(diào)，可能抑制糖酵解的速率，這種濃度依賴性的調(diào)控可能與NO對桃果實(shí)生理狀態(tài)的綜合影響有關(guān)。丙酮酸激酶（PK）催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，是糖酵解的最后一步關(guān)鍵反應(yīng)。在本研究中，PK在10μmol/LNO處理組中表達(dá)無顯著變化，在50μmol/L和100μmol/L處理組中表達(dá)下調(diào)，分別下調(diào)至對照組的0.9倍和0.8倍。PK表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的轉(zhuǎn)化減少，進(jìn)而影響糖酵解的最終產(chǎn)物生成，對細(xì)胞的能量供應(yīng)和物質(zhì)代謝產(chǎn)生影響。呼吸作用是細(xì)胞將有機(jī)物氧化分解并釋放能量的過程，包括糖酵解、三羧酸循環(huán)和呼吸鏈電子傳遞等步驟。在呼吸鏈電子傳遞過程中，NO處理也對相關(guān)酶的表達(dá)產(chǎn)生了影響。細(xì)胞色素C氧化酶（COX）是呼吸鏈的末端酶，催化細(xì)胞色素C的氧化，將電子傳遞給氧分子，生成水，并產(chǎn)生大量ATP。在本研究中，COX亞基在100μmol/LNO處理組中表達(dá)下調(diào)，下調(diào)倍數(shù)為0.5倍。COX表達(dá)下調(diào)可能抑制了呼吸鏈的電子傳遞，導(dǎo)致ATP合成減少，從而影響桃果實(shí)的呼吸作用和能量供應(yīng)。NADH脫氫酶（復(fù)合體I）是呼吸鏈的重要組成部分，催化NADH的氧化，將電子傳遞給輔酶Q。在本研究中，NADH脫氫酶的部分亞基在50μmol/L和100μmol/LNO處理組中表達(dá)上調(diào)。這可能在一定程度上補(bǔ)償了呼吸鏈中因COX表達(dá)下調(diào)而減少的電子傳遞，維持呼吸作用的相對穩(wěn)定。這些結(jié)果表明，NO處理通過調(diào)節(jié)糖酵解和呼吸作用通路中關(guān)鍵酶的表達(dá)，影響桃果實(shí)的能量代謝和呼吸作用，進(jìn)而對果實(shí)的成熟進(jìn)程產(chǎn)生重要影響。在不同濃度NO處理下，糖酵解和呼吸作用通路中關(guān)鍵酶的表達(dá)變化呈現(xiàn)出復(fù)雜的模式，可能是NO對桃果實(shí)生理調(diào)控的一種精細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)制。3.3.3抗氧化防御系統(tǒng)通路變化在桃果實(shí)成熟期間，NO處理對果實(shí)的抗氧化防御系統(tǒng)通路產(chǎn)生了顯著影響?？寡趸烙到y(tǒng)是植物抵御氧化脅迫的重要機(jī)制，主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）等抗氧化酶，它們協(xié)同作用，清除細(xì)胞內(nèi)過多的活性氧（ROS），維持細(xì)胞的氧化還原平衡。超氧化物歧化酶（SOD）能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成氧氣和過氧化氫，是抗氧化防御系統(tǒng)的第一道防線。在本研究中，SOD在10μmol/L、50μmol/L和