基于蛋白質組學解析冠心病與非冠心病患者心外膜及皮下脂肪差異一、引言1.1研究背景冠心?。–oronaryHeartDisease，CHD），全稱冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，是一種嚴重危害人類健康的心血管疾病。近年來，隨著生活方式的改變和人口老齡化的加劇，冠心病的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，已成為全球范圍內的主要公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，每年約有1790萬人死于心血管疾病，其中冠心病占比相當高，給患者家庭和社會帶來了沉重的負擔。冠心病主要是由于冠狀動脈粥樣硬化，導致血管狹窄或阻塞，進而引起心肌缺血、缺氧或壞死。其發(fā)病機制復雜，涉及多種危險因素，如高血壓、高血脂、糖尿病、吸煙、肥胖等。這些因素相互作用，共同促進了冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。脂肪組織在冠心病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。脂肪組織不僅是能量儲存的場所，還具有內分泌功能，能分泌多種脂肪因子和細胞因子，參與機體的代謝調節(jié)和炎癥反應。心外膜脂肪（EpicardialAdiposeTissue，EAT）和皮下脂肪（SubcutaneousAdiposeTissue，SAT）是人體脂肪組織的重要組成部分，它們在分布位置、代謝特征和功能等方面存在差異。心外膜脂肪是一種位于心臟表面的心包臟層和心肌之間的內臟脂肪組織，與冠狀動脈緊密相鄰，其分泌的生物活性物質可直接作用于冠狀動脈，影響血管的舒縮功能和炎癥狀態(tài)。研究表明，心外膜脂肪與冠心病的發(fā)生發(fā)展密切相關，其厚度和體積的增加是冠心病的獨立危險因素。皮下脂肪則廣泛分布于皮膚下方，是人體最大的脂肪儲存庫，雖然其對冠心病的影響相對間接，但也通過調節(jié)全身代謝和炎癥反應，在冠心病的發(fā)病過程中發(fā)揮著一定作用。深入研究冠心病與非冠心病患者心外膜脂肪與皮下脂肪的差異蛋白質組學，對于揭示冠心病的發(fā)病機制、尋找新的診斷標志物和治療靶點具有重要意義。蛋白質組學是研究生物體蛋白質組成及其變化規(guī)律的科學，通過對蛋白質組的分析，可以全面了解細胞或組織在特定生理或病理狀態(tài)下的蛋白質表達譜和功能變化。目前，已有研究運用蛋白質組學技術對冠心病患者的心肌組織、血液等進行分析，發(fā)現(xiàn)了一些與冠心病相關的差異表達蛋白質，但對于心外膜脂肪和皮下脂肪的蛋白質組學研究相對較少，尤其是針對冠心病與非冠心病患者這兩種脂肪組織的對比研究更為缺乏。因此，本研究旨在通過蛋白質組學技術，比較冠心病與非冠心病患者心外膜脂肪與皮下脂肪的蛋白質表達差異，篩選出與冠心病相關的關鍵蛋白質，為冠心病的早期診斷、治療和預防提供理論依據(jù)和新的思路。1.2研究目的與意義本研究旨在運用蛋白質組學技術，全面、系統(tǒng)地分析冠心病與非冠心病患者心外膜脂肪與皮下脂肪的蛋白質表達譜，明確兩種脂肪組織在蛋白質水平上的差異，篩選出與冠心病發(fā)生發(fā)展密切相關的關鍵蛋白質，并對這些差異蛋白質進行功能注釋和通路分析，深入探討其在冠心病發(fā)病機制中的作用，為冠心病的早期診斷、病情評估、治療干預以及預后判斷提供新的理論依據(jù)和潛在生物標志物。心外膜脂肪和皮下脂肪在冠心病發(fā)病過程中具有獨特且重要的作用，但目前對于它們在蛋白質層面的差異以及這些差異與冠心病的關聯(lián)了解尚淺。本研究通過深入開展差異蛋白質組學研究，有望從分子層面揭示冠心病的發(fā)病機制，突破以往對冠心病認識的局限性。篩選出的冠心病相關關鍵蛋白質，可作為潛在的生物標志物，用于冠心病的早期診斷，有助于在疾病的早期階段發(fā)現(xiàn)病變，提高診斷的準確性和及時性，從而為患者爭取更有效的治療時機。同時，這些生物標志物還可能用于病情評估和預后判斷，幫助醫(yī)生更準確地了解患者的病情嚴重程度和發(fā)展趨勢，制定個性化的治療方案。此外，對差異蛋白質參與的信號通路和生物學過程的研究，能夠為冠心病的治療提供新的靶點和思路，推動新型治療藥物和治療方法的研發(fā)，為冠心病的臨床治療帶來新的突破，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.3國內外研究現(xiàn)狀在國外，蛋白質組學技術在冠心病研究領域應用較早且成果頗豐。早期研究主要聚焦于冠心病患者的心肌組織蛋白質組分析，試圖揭示心肌在病理狀態(tài)下的蛋白質表達變化與冠心病發(fā)病機制的關聯(lián)。例如，有研究運用二維凝膠電泳（2-DE）結合質譜技術，對冠心病患者心肌樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)了一些與心肌能量代謝、細胞凋亡相關的蛋白質表達異常，為理解冠心病心肌損傷機制提供了分子層面的依據(jù)。隨著研究的深入，血液蛋白質組學成為熱點，通過對冠心病患者血漿或血清蛋白質組的分析，篩選出一系列潛在的生物標志物，如C反應蛋白（CRP）、肌鈣蛋白等，這些標志物在冠心病的診斷、病情監(jiān)測和預后評估中發(fā)揮了重要作用。近年來，國外開始關注脂肪組織與冠心病的蛋白質組學研究。心外膜脂肪由于其特殊的解剖位置和與冠狀動脈的緊密聯(lián)系，受到了特別關注。研究發(fā)現(xiàn)，心外膜脂肪分泌的多種蛋白質，如炎癥因子、脂肪因子等，可直接影響冠狀動脈的粥樣硬化進程。有研究表明，心外膜脂肪中白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子的高表達，與冠心病的嚴重程度呈正相關，提示心外膜脂肪的炎癥狀態(tài)在冠心病發(fā)病中起關鍵作用。在皮下脂肪蛋白質組學研究方面，雖然進展相對較慢，但也有研究發(fā)現(xiàn)，皮下脂肪中某些蛋白質的表達變化與全身代謝紊亂和炎癥反應相關，間接影響冠心病的發(fā)生發(fā)展。國內在冠心病蛋白質組學研究方面也取得了顯著進展。在心肌和血液蛋白質組學研究中，不僅驗證了國外的一些研究成果，還結合中醫(yī)理論，開展了冠心病不同中醫(yī)證型的蛋白質組學研究，試圖從蛋白質層面揭示中醫(yī)證型的科學內涵。例如，有研究對冠心病心氣虛弱、心腎陰虛、痰濁內阻、心血瘀阻四個主要證型患者進行蛋白質組學分析，發(fā)現(xiàn)不同證型患者存在特定的差異蛋白質，這些蛋白質涉及凝血系統(tǒng)、脂代謝系統(tǒng)等多個生物學過程，為中醫(yī)辨證論治提供了現(xiàn)代科學依據(jù)。在脂肪組織與冠心病的蛋白質組學研究領域，國內也逐步開展相關工作。一些研究通過對比冠心病與非冠心病患者的心外膜脂肪和皮下脂肪，發(fā)現(xiàn)了兩者在蛋白質表達譜上的差異。有研究運用液相色譜-質譜聯(lián)用技術，分析心外膜脂肪和皮下脂肪蛋白質組，發(fā)現(xiàn)冠心病患者心外膜脂肪中與氧化應激和炎癥相關的蛋白質表達上調，而皮下脂肪中某些參與脂肪代謝和胰島素敏感性調節(jié)的蛋白質表達異常，初步揭示了脂肪組織蛋白質組變化與冠心病的潛在聯(lián)系。盡管國內外在冠心病與脂肪組織蛋白質組學研究方面取得了一定成果，但仍存在一些不足之處。目前對于心外膜脂肪和皮下脂肪蛋白質組的研究相對較少，尤其是針對兩者在冠心病發(fā)病過程中相互作用的蛋白質組學研究更為缺乏，尚未全面揭示兩種脂肪組織在冠心病發(fā)生發(fā)展中的協(xié)同或拮抗作用機制。大多數(shù)研究樣本量較小，研究結果的普適性和可靠性有待進一步驗證。此外，雖然已篩選出一些與冠心病相關的差異蛋白質，但對這些蛋白質的功能驗證和作用機制研究尚不夠深入，距離將其轉化為臨床實用的診斷標志物和治療靶點仍有較大差距。本研究的創(chuàng)新點在于，首次系統(tǒng)地對比分析冠心病與非冠心病患者心外膜脂肪與皮下脂肪的蛋白質組學差異，通過大樣本量研究提高結果的可靠性。同時，綜合運用生物信息學分析和功能實驗驗證，深入探究差異蛋白質在冠心病發(fā)病機制中的作用，有望發(fā)現(xiàn)新的冠心病相關生物標志物和治療靶點，為冠心病的防治提供新的理論依據(jù)和策略。二、相關理論基礎2.1冠心病概述2.1.1冠心病的定義與分類冠心病，全稱冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，是由于冠狀動脈粥樣硬化使血管腔狹窄或阻塞，或（和）因冠狀動脈功能性改變（痙攣）導致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病。其發(fā)病隱匿，病情復雜，嚴重威脅人類健康。根據(jù)臨床特點和病理生理變化，冠心病主要分為以下幾類：慢性冠脈?。悍€(wěn)定型心絞痛：這是最常見的類型之一，其發(fā)作有一定的誘因，如體力勞動、情緒激動、寒冷、飽食等。疼痛部位多位于胸骨后或心前區(qū)，可放射至左肩、左臂內側達無名指和小指，或至頸、咽或下頜部。疼痛性質多為壓榨性、悶痛或緊縮感，一般持續(xù)3-5分鐘，休息或含服硝酸甘油后可在數(shù)分鐘內緩解。穩(wěn)定型心絞痛的發(fā)生是由于冠狀動脈粥樣硬化導致血管狹窄，心肌供血與需血之間暫時失去平衡，在心臟負荷增加時，心肌需氧量超過狹窄冠狀動脈所能提供的氧量，從而引發(fā)心絞痛癥狀。缺血性心肌?。洪L期心肌缺血導致心肌局限性或彌漫性纖維化，進而引起心臟收縮和（或）舒張功能受損，可出現(xiàn)心臟擴大、心力衰竭、心律失常等臨床表現(xiàn)。缺血性心肌病的發(fā)展是一個漸進的過程，冠狀動脈粥樣硬化不斷加重，心肌長期處于缺血缺氧狀態(tài)，心肌細胞逐漸變性、壞死，被纖維組織替代，導致心臟結構和功能的改變。隱匿性冠心?。阂卜Q為無癥狀性心肌缺血，患者無臨床癥狀，但存在心肌缺血的客觀證據(jù)，如心電圖ST-T段改變、動態(tài)心電圖監(jiān)測到心肌缺血發(fā)作、核素心肌顯像顯示心肌灌注缺損等。隱匿性冠心病的患者雖然沒有明顯的癥狀，但心肌缺血的存在仍然會對心臟功能造成損害，增加心肌梗死和猝死的風險。急性冠狀動脈綜合征：不穩(wěn)定型心絞痛：與穩(wěn)定型心絞痛相比，不穩(wěn)定型心絞痛的發(fā)作更為頻繁，疼痛程度更重，持續(xù)時間更長，可在休息或輕微活動時發(fā)作，且含服硝酸甘油效果欠佳。不穩(wěn)定型心絞痛的發(fā)生機制主要是冠狀動脈粥樣斑塊不穩(wěn)定，出現(xiàn)破裂、糜爛，誘發(fā)血小板聚集和血栓形成，導致冠狀動脈不完全阻塞。非ST段抬高型心肌梗死：患者有典型的胸痛癥狀，持續(xù)時間通常超過30分鐘，血清心肌壞死標志物（如肌鈣蛋白、肌酸激酶同工酶等）升高，但心電圖無ST段抬高。非ST段抬高型心肌梗死的病理基礎也是冠狀動脈粥樣斑塊破裂，形成血栓，但血栓不完全阻塞冠狀動脈，心肌梗死的范圍相對較小。ST段抬高型心肌梗死：這是冠心病中最為嚴重的類型之一，患者會突然出現(xiàn)劇烈而持久的胸骨后疼痛，休息和含服硝酸甘油不能緩解，常伴有煩躁不安、出汗、恐懼或瀕死感。心電圖表現(xiàn)為ST段弓背向上抬高，血清心肌壞死標志物顯著升高。ST段抬高型心肌梗死是由于冠狀動脈粥樣斑塊破裂，繼發(fā)血栓形成，導致冠狀動脈完全阻塞，相應心肌發(fā)生急性缺血性壞死。2.1.2冠心病的發(fā)病機制冠心病的發(fā)病機制極為復雜，是多種因素相互作用的結果，涉及冠狀動脈粥樣硬化、炎癥反應、脂質代謝異常等多個關鍵環(huán)節(jié)。冠狀動脈粥樣硬化：這是冠心病發(fā)病的主要病理基礎。正常情況下，冠狀動脈內皮細胞完整，能夠維持血管的正常功能。當受到高血壓、高血脂、吸煙、糖尿病等危險因素的作用時，內皮細胞會受到損傷，使其功能發(fā)生改變。血液中的低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）會通過受損的內皮進入血管內膜下，被氧化修飾為氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）。巨噬細胞吞噬ox-LDL后，會轉化為泡沫細胞，泡沫細胞不斷堆積，逐漸形成粥樣斑塊。隨著斑塊的逐漸增大，冠狀動脈管腔會逐漸狹窄，導致心肌供血不足。當斑塊不穩(wěn)定時，容易破裂，暴露其中的脂質和組織因子，引發(fā)血小板聚集和血栓形成，進一步加重冠狀動脈阻塞，導致急性冠狀動脈綜合征的發(fā)生。炎癥反應：炎癥在冠心病的發(fā)生發(fā)展過程中起著關鍵作用。血管內皮損傷后，會釋放多種炎癥因子，如白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些炎癥因子會吸引白細胞浸潤到血管內膜下，引發(fā)炎癥反應。炎癥細胞釋放的蛋白酶、氧自由基等物質會進一步損傷血管內皮細胞，促進粥樣斑塊的形成和發(fā)展。炎癥還會影響斑塊的穩(wěn)定性，使斑塊容易破裂，增加急性心血管事件的風險。研究表明，高敏C反應蛋白（hs-CRP）作為一種炎癥標志物，其水平升高與冠心病的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關。脂質代謝異常：脂質代謝異常是冠心病的重要危險因素之一，其中以LDL-C升高和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）降低最為關鍵。LDL-C是一種致動脈粥樣硬化的脂蛋白，其水平升高會增加膽固醇在血管壁的沉積，促進粥樣斑塊的形成。HDL-C則具有抗動脈粥樣硬化作用，它可以通過逆向轉運膽固醇，將血管壁中的膽固醇轉運回肝臟進行代謝，從而減少膽固醇在血管壁的沉積。此外，甘油三酯（TG）升高、載脂蛋白A1（ApoA1）降低、載脂蛋白B（ApoB）升高等脂質代謝指標的異常，也與冠心病的發(fā)病風險增加相關。2.1.3冠心病的臨床表現(xiàn)與診斷方法冠心病的臨床表現(xiàn)多樣，癥狀輕重不一，部分患者可能無明顯癥狀，而部分患者則可能出現(xiàn)嚴重的心絞痛、心肌梗死甚至猝死。常見的臨床表現(xiàn)主要包括以下幾個方面：胸痛：這是冠心病最典型的癥狀，多表現(xiàn)為發(fā)作性胸痛，疼痛部位主要位于胸骨后或心前區(qū)，可放射至左肩、左臂內側、頸部、下頜等部位。疼痛性質多為壓榨性、悶痛、緊縮感或燒灼感，疼痛程度輕重不一。穩(wěn)定型心絞痛的胸痛一般在體力活動、情緒激動等誘因下發(fā)作，持續(xù)時間較短，通常為3-5分鐘，休息或含服硝酸甘油后可迅速緩解。不穩(wěn)定型心絞痛的胸痛發(fā)作更為頻繁，程度更重，持續(xù)時間更長，可在休息或輕微活動時發(fā)作，且含服硝酸甘油效果可能不佳。心肌梗死的胸痛則更為劇烈，持續(xù)時間常超過30分鐘，休息和含服硝酸甘油均不能緩解，常伴有大汗、惡心、嘔吐、呼吸困難等癥狀。胸悶：患者可感到胸部憋悶、壓迫感，如同有重物壓在胸部，這種癥狀在活動后或情緒激動時可能加重。胸悶的程度和持續(xù)時間因人而異，輕者可能僅在活動量較大時出現(xiàn)，重者可能在休息時也會感到明顯不適。心悸：部分冠心病患者會出現(xiàn)心悸癥狀，表現(xiàn)為自覺心跳異常，可感覺到心跳加快、減慢或不規(guī)則跳動。心悸的發(fā)生可能與心律失常有關，如早搏、房顫等，這些心律失常會影響心臟的正常節(jié)律和功能，導致患者出現(xiàn)心悸不適。呼吸困難：當冠心病導致心肌缺血、心功能不全時，患者可出現(xiàn)呼吸困難癥狀。早期可能僅在活動后出現(xiàn)氣短，隨著病情的加重，休息時也可能出現(xiàn)呼吸困難，嚴重時可出現(xiàn)端坐呼吸、夜間陣發(fā)性呼吸困難等。呼吸困難的發(fā)生是由于心臟泵血功能下降，導致肺部淤血，氣體交換受阻所致。冠心病的診斷需要綜合考慮患者的臨床表現(xiàn)、危險因素、輔助檢查等多方面因素，以明確診斷并評估病情的嚴重程度。目前常用的診斷方法主要包括以下幾種：心電圖（ECG）：這是診斷冠心病最常用、最基本的方法之一。在心絞痛發(fā)作時，心電圖可出現(xiàn)ST段壓低、T波倒置等心肌缺血改變。對于ST段抬高型心肌梗死，心電圖則具有特征性的ST段弓背向上抬高、病理性Q波形成等改變。然而，部分冠心病患者在無癥狀期心電圖可能正常，因此對于高度懷疑冠心病但心電圖正常的患者，可進行動態(tài)心電圖監(jiān)測（Holter），連續(xù)記錄24小時或更長時間的心電圖，以捕捉心肌缺血發(fā)作時的心電圖變化。冠狀動脈造影（CAG）：被認為是診斷冠心病的“金標準”。通過將導管經(jīng)橈動脈或股動脈插入冠狀動脈開口，注入造影劑，可清晰地顯示冠狀動脈的形態(tài)、走行、狹窄程度及部位等情況。冠狀動脈造影不僅能夠準確診斷冠心病，還能為制定治療方案提供重要依據(jù)，如判斷是否適合進行冠狀動脈介入治療（PCI）或冠狀動脈旁路移植術（CABG）等。但冠狀動脈造影是一種有創(chuàng)檢查，存在一定的風險，如出血、血管損傷、造影劑過敏等。冠狀動脈CT血管造影（CTA）：這是一種無創(chuàng)的檢查方法，通過靜脈注射造影劑，利用多層螺旋CT對冠狀動脈進行掃描，然后進行圖像重建，可清晰顯示冠狀動脈的解剖結構和病變情況。冠狀動脈CTA對于冠狀動脈狹窄的診斷具有較高的敏感性和特異性，適用于對冠狀動脈造影有禁忌或不愿接受有創(chuàng)檢查的患者。但其對于冠狀動脈病變程度的評估可能存在一定誤差，且對于心率較快或心律不齊的患者，圖像質量可能會受到影響。心臟超聲（Echocardiogram）：心臟超聲可以觀察心臟的結構和功能，如心臟的大小、形態(tài)、室壁運動、瓣膜功能等。在冠心病患者中，心臟超聲可發(fā)現(xiàn)心肌節(jié)段性運動異常，這是由于冠狀動脈供血不足導致相應心肌缺血、壞死，從而影響心肌的收縮功能。此外，心臟超聲還可評估心功能，了解心臟的射血分數(shù)等指標，對于判斷病情和預后具有重要意義。核素心肌顯像：包括單光子發(fā)射計算機斷層顯像（SPECT）和正電子發(fā)射斷層顯像（PET）。核素心肌顯像通過向體內注射放射性核素，利用其在心肌細胞內的攝取情況來評估心肌的血流灌注和代謝情況。在心肌缺血時，放射性核素攝取減少，表現(xiàn)為心肌灌注缺損。核素心肌顯像對于診斷隱匿性冠心病、評估心肌存活情況等具有重要價值。2.2脂肪組織與健康2.2.1脂肪組織的分類與分布脂肪組織是人體重要的組成部分，根據(jù)脂肪細胞的結構和功能差異，主要可分為白色脂肪組織（WhiteAdiposeTissue，WAT）、棕色脂肪組織（BrownAdiposeTissue，BAT）和米色脂肪組織（BeigeAdiposeTissue，BAT）。白色脂肪組織是人體最主要的脂肪儲存形式，由大量單泡脂肪細胞集聚而成，細胞中央有一大脂滴，將細胞核及細胞器擠向細胞邊緣。其廣泛分布于皮下、網(wǎng)膜、腸系膜等部位，在成年人體內含量豐富，約占體重的10%-20%（男性），女性比例相對更高。白色脂肪組織的主要功能是儲存能量，當機體攝入能量過多時，多余的能量會以甘油三酯的形式儲存于白色脂肪細胞中；在機體需要能量時，儲存的甘油三酯會被分解為脂肪酸和甘油，釋放到血液中供其他組織利用。此外，白色脂肪組織還具有內分泌功能，能分泌多種脂肪因子和細胞因子，如瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些生物活性物質參與調節(jié)機體的能量代謝、胰島素敏感性、炎癥反應等生理過程。棕色脂肪組織在成人體內含量較少，新生兒及冬眠動物相對較多。棕色脂肪細胞呈多角形，含有許多小脂滴和大量線粒體，細胞核位于細胞中央。棕色脂肪組織主要分布在肩胛間區(qū)、腋窩及頸后部等處。其主要功能是產(chǎn)熱，在寒冷刺激下，棕色脂肪細胞內的脂類可迅速分解、氧化，產(chǎn)生大量熱能，以維持體溫穩(wěn)定。棕色脂肪組織的產(chǎn)熱過程受交感神經(jīng)調節(jié)，通過解耦聯(lián)蛋白1（UCP1）使脂肪酸氧化產(chǎn)生的能量以熱能形式釋放，而不轉化為ATP。此外，棕色脂肪組織也具有一定的內分泌功能，可分泌成纖維細胞生長因子21（FGF21）等生物活性物質，參與調節(jié)機體能量代謝。米色脂肪組織是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種脂肪組織，其細胞形態(tài)和功能介于白色脂肪細胞和棕色脂肪細胞之間。米色脂肪細胞可由白色脂肪細胞在寒冷刺激、運動、某些藥物作用等條件下誘導轉化而來。與棕色脂肪細胞類似，米色脂肪細胞也富含線粒體和UCP1，具有較強的產(chǎn)熱能力。研究表明，增加米色脂肪組織的含量或激活其功能，可提高機體能量消耗，改善代謝紊亂，對肥胖、糖尿病等代謝性疾病具有潛在的治療作用。脂肪組織在人體的分布具有明顯的區(qū)域性差異，主要包括皮下脂肪和內臟脂肪。皮下脂肪位于皮膚下方，是人體最大的脂肪儲存庫，可分為上半身皮下脂肪（如腋下、背部、腹部皮下脂肪墊）和下半身皮下脂肪（如臀部、大腿兩側脂肪墊）。皮下脂肪主要起儲存能量、保持體溫、吸收沖擊和減輕摩擦等作用。不同部位的皮下脂肪在代謝功能上存在一定差異，下半身皮下脂肪對胰島素的敏感性相對較高，而上半身皮下脂肪在肥胖時更易發(fā)生脂解異常，釋放游離脂肪酸，影響全身代謝。內臟脂肪則主要分布在腹腔內，包裹著肝臟、胃、腸等內臟器官，包括網(wǎng)膜脂肪、腸系膜脂肪和心包脂肪等。內臟脂肪代謝活性較高，與全身代謝和心血管疾病的關系更為密切。過多的內臟脂肪堆積會導致脂肪因子和炎癥因子的異常分泌，引起胰島素抵抗、血脂異常、慢性炎癥等，增加冠心病、糖尿病、高血壓等疾病的發(fā)病風險。2.2.2心外膜脂肪與皮下脂肪的特點心外膜脂肪是一種特殊的內臟脂肪組織，位于心臟表面的心包臟層和心肌之間，與冠狀動脈緊密相鄰。其厚度和體積個體差異較大，受多種因素影響，如年齡、性別、肥胖程度、代謝狀態(tài)等。心外膜脂肪具有獨特的代謝特點，其脂肪細胞較小，對兒茶酚胺的敏感性較高，脂解活性較強。在代謝過程中，心外膜脂肪可快速釋放游離脂肪酸，這些游離脂肪酸可直接被心肌攝取利用，為心肌提供能量。然而，當機體處于代謝紊亂狀態(tài)時，心外膜脂肪的過度脂解會導致游離脂肪酸釋放過多，超過心肌的氧化能力，從而在心肌細胞內堆積，引起脂毒性，損傷心肌細胞。心外膜脂肪還具有活躍的內分泌功能，能分泌多種脂肪因子、細胞因子和趨化因子，如瘦素、脂聯(lián)素、IL-6、TNF-α、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等。這些生物活性物質可通過旁分泌和自分泌的方式直接作用于冠狀動脈和心肌，影響血管的舒縮功能、內皮細胞的完整性、炎癥反應以及心肌的電生理特性。研究表明，心外膜脂肪分泌的炎癥因子可促進冠狀動脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展，增加斑塊的不穩(wěn)定性，從而導致冠心病的發(fā)生和發(fā)展。心外膜脂肪厚度和體積的增加是冠心病的獨立危險因素，其與冠狀動脈粥樣硬化的程度、冠狀動脈病變的支數(shù)以及冠心病的嚴重程度密切相關。皮下脂肪廣泛分布于全身皮膚下方，是人體脂肪組織的主要儲存部位。皮下脂肪細胞相對較大，其代謝活性相對較低，對胰島素的敏感性較高。在正常生理狀態(tài)下，皮下脂肪主要以儲存能量為主，當機體能量攝入增加時，多余的能量以甘油三酯的形式儲存于皮下脂肪細胞中；當機體能量需求增加時，皮下脂肪通過脂解作用釋放脂肪酸，為機體提供能量。皮下脂肪也具有內分泌功能，可分泌多種脂肪因子，如脂聯(lián)素、抵抗素等，參與調節(jié)全身代謝和炎癥反應。與心外膜脂肪相比，皮下脂肪對冠心病的影響相對間接。適量的皮下脂肪可作為能量儲備，維持機體的正常代謝；但過多的皮下脂肪堆積，尤其是在肥胖個體中，會導致脂肪組織功能失調，脂肪因子分泌異常，引發(fā)慢性炎癥反應和胰島素抵抗，進而通過影響全身代謝，間接增加冠心病的發(fā)病風險。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖患者皮下脂肪中炎癥因子表達升高，脂聯(lián)素表達降低，這些變化與冠心病的危險因素密切相關。此外，皮下脂肪的分布部位也與冠心病的發(fā)生風險有關，上半身皮下脂肪堆積（中心性肥胖）相較于下半身皮下脂肪堆積，與冠心病的關聯(lián)更為緊密。2.2.3脂肪組織對心血管健康的影響脂肪組織不僅是能量儲存的器官，更是一個重要的內分泌器官，其分泌的多種脂肪因子和炎癥因子對心血管系統(tǒng)的結構和功能具有深遠影響，在冠心病等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關鍵作用。脂肪組織分泌的脂肪因子在調節(jié)心血管功能方面起著重要作用。脂聯(lián)素是一種由脂肪組織分泌的具有心臟保護作用的脂肪因子。它可以通過多種途徑影響心血管系統(tǒng)，脂聯(lián)素可與內皮細胞表面的受體結合，激活一系列信號通路，促進一氧化氮（NO）的釋放，從而舒張血管，降低血壓。脂聯(lián)素還具有抗炎和抗動脈粥樣硬化作用，能抑制炎癥細胞的浸潤和炎癥因子的表達，減少氧化應激，抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移，從而減緩冠狀動脈粥樣硬化的進程。臨床研究表明，血漿脂聯(lián)素水平與冠心病的發(fā)病風險呈負相關，低脂聯(lián)素血癥是冠心病的獨立危險因素。瘦素是另一種重要的脂肪因子，其主要作用是調節(jié)食欲和能量代謝。然而，在心血管系統(tǒng)中，瘦素的作用較為復雜。生理水平的瘦素對心血管系統(tǒng)具有一定的保護作用，可促進心肌細胞的生長和存活，調節(jié)心臟的收縮功能。但在肥胖和代謝綜合征等病理狀態(tài)下，體內瘦素水平升高，出現(xiàn)瘦素抵抗，此時瘦素會通過激活交感神經(jīng)系統(tǒng)、促進炎癥反應、增加氧化應激等途徑，對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響。瘦素可刺激血管平滑肌細胞增殖和遷移，促進血管重塑；還可誘導內皮細胞功能障礙，增加血栓形成的風險，從而促進冠心病的發(fā)生發(fā)展。脂肪組織分泌的炎癥因子在心血管疾病的炎癥反應中扮演著關鍵角色。IL-6和TNF-α是脂肪組織分泌的主要炎癥因子。當脂肪組織過度堆積或功能失調時，IL-6和TNF-α的分泌會顯著增加。這些炎癥因子可通過多種途徑影響心血管系統(tǒng)，IL-6可激活炎癥細胞，促進炎癥介質的釋放，導致血管內皮細胞損傷，破壞血管內皮的完整性，使血管通透性增加，促進脂質沉積和血栓形成。TNF-α則可誘導細胞凋亡，抑制內皮細胞的增殖和遷移，影響血管的修復和再生。IL-6和TNF-α還可通過激活核因子-κB（NF-κB）等信號通路，促進炎癥相關基因的表達，進一步加重炎癥反應，加速冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者體內IL-6和TNF-α水平明顯升高，且與冠心病的嚴重程度密切相關。脂肪組織還可通過影響脂質代謝間接影響心血管健康。脂肪組織是體內脂質儲存和代謝的重要場所，其代謝功能的異常會導致血脂紊亂。當脂肪組織功能失調時，脂肪細胞內的甘油三酯分解增加，釋放大量游離脂肪酸進入血液。游離脂肪酸在肝臟中重新合成甘油三酯，并以極低密度脂蛋白（VLDL）的形式分泌到血液中，導致血漿甘油三酯水平升高。同時，游離脂肪酸還可抑制肝臟對高密度脂蛋白（HDL）的合成，降低血漿HDL水平。此外，脂肪組織分泌的脂肪因子如抵抗素等，也可干擾胰島素信號通路，導致胰島素抵抗，進一步加重脂質代謝紊亂。血脂紊亂，尤其是高甘油三酯血癥、低HDL血癥和高LDL血癥，是冠心病的重要危險因素，可促進冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。2.3蛋白質組學技術2.3.1蛋白質組學的概念與發(fā)展蛋白質組學的概念最早于1994年由澳大利亞科學家MarcWilkins和KeithWilliams提出，用于描述由一個基因組所表達的全部蛋白質。它是研究蛋白質組的一門新興科學，旨在從整體層面分析細胞、組織或生物體在特定時空條件下蛋白質的組成、表達水平、修飾狀態(tài)，以及蛋白質之間的相互作用和聯(lián)系，進而揭示蛋白質功能與細胞生命活動的規(guī)律。與傳統(tǒng)的單一蛋白質研究不同，蛋白質組學關注的是一組參與特定生理或病理過程的所有蛋白質，以及它們與周圍環(huán)境的關系，能夠提供更為全面和系統(tǒng)的生命信息，對于深入理解生命活動的本質以及疾病的發(fā)生發(fā)展機制具有重要意義。蛋白質組學的發(fā)展歷程充滿了技術突破和創(chuàng)新。早期的蛋白質組學研究主要依賴于二維凝膠電泳（2-DE）技術。2-DE技術能夠根據(jù)蛋白質的等電點和分子量差異，在二維平面上對蛋白質進行分離，從而得到蛋白質的表達圖譜。通過對不同樣本的2-DE圖譜進行比較分析，可以篩選出差異表達的蛋白質。隨后，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）和電噴霧電離質譜（ESI-MS）等質譜技術的出現(xiàn)，極大地推動了蛋白質組學的發(fā)展。質譜技術可以精確測定蛋白質的分子量，并通過對蛋白質酶解肽段的質量分析和序列測定，實現(xiàn)對蛋白質的鑒定。2-DE與質譜技術的結合，成為蛋白質組學研究的經(jīng)典方法，在蛋白質表達譜分析、差異蛋白質篩選等方面取得了豐碩的成果。隨著科技的不斷進步，蛋白質組學技術也在不斷更新迭代。多維液相色譜（MDLC）與質譜聯(lián)用技術的發(fā)展，克服了2-DE技術在分離復雜蛋白質混合物時的局限性，能夠對蛋白質進行更高效、更全面的分離和鑒定?；诖?lián)質譜（MS/MS）的蛋白質定量技術，如同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）、串聯(lián)質量標簽（TMT）等，實現(xiàn)了對蛋白質表達水平的準確量化，為研究蛋白質在不同生理病理狀態(tài)下的變化提供了有力工具。此外，蛋白質芯片技術、蛋白質相互作用分析技術（如酵母雙雜交、免疫共沉淀等）也不斷涌現(xiàn)，進一步拓展了蛋白質組學的研究領域，使人們能夠從多個角度深入探究蛋白質的功能和作用機制。近年來，單細胞蛋白質組學、空間蛋白質組學等新興領域的興起，為蛋白質組學研究帶來了新的機遇和挑戰(zhàn)，有望在細胞異質性研究、組織微環(huán)境分析等方面取得突破性進展。2.3.2蛋白質組學研究方法與流程蛋白質組學研究的第一步是樣品制備，其質量直接影響后續(xù)實驗結果的準確性和可靠性。對于心外膜脂肪和皮下脂肪樣品，首先需要在手術過程中準確采集，確保樣本的新鮮度和完整性。采集后的樣品應迅速置于液氮中冷凍保存，以防止蛋白質降解。在進行蛋白質提取前，需將冷凍的脂肪組織研磨成粉末狀，然后加入含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液，通過超聲破碎、勻漿等方法使細胞破碎，釋放出蛋白質。為了提高蛋白質提取的純度和得率，可采用超速離心、過濾等方法去除雜質和細胞碎片。提取得到的蛋白質溶液需進行定量測定，常用的方法有Bradford法、Lowry法、BCA法等，以確定蛋白質的濃度，為后續(xù)實驗提供準確的起始量。蛋白質分離是蛋白質組學研究的關鍵環(huán)節(jié)，常用的方法包括二維凝膠電泳（2-DE）和多維液相色譜（MDLC）。二維凝膠電泳是基于蛋白質的等電點和分子量差異進行分離的技術。第一向等電聚焦（IEF）根據(jù)蛋白質的等電點不同，在pH梯度凝膠中使蛋白質聚焦到特定的位置；第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）則根據(jù)蛋白質的分子量大小，在垂直方向上對蛋白質進行進一步分離。經(jīng)過染色后，可得到蛋白質的二維圖譜，不同的蛋白質點代表不同的蛋白質或蛋白質異構體。二維凝膠電泳的優(yōu)點是能夠直觀地展示蛋白質的分離情況，便于比較不同樣本間蛋白質表達的差異，但它也存在一些局限性，如對低豐度蛋白質、極酸性或極堿性蛋白質、高分子量或低分子量蛋白質的分離效果較差。多維液相色譜則是利用不同的色譜分離原理，如反相色譜、離子交換色譜、體積排阻色譜等，對蛋白質進行多次分離。與二維凝膠電泳相比，多維液相色譜具有分離效率高、分析速度快、能夠分離復雜蛋白質混合物等優(yōu)點，尤其適用于低豐度蛋白質和難分離蛋白質的分析。在實際應用中，多維液相色譜通常與質譜聯(lián)用，形成強大的蛋白質組學分析平臺。蛋白質鑒定是蛋白質組學研究的核心任務之一，主要依靠質譜技術來實現(xiàn)。經(jīng)過分離后的蛋白質，需進行酶解處理，常用的酶為胰蛋白酶，它能夠將蛋白質特異性地酶解成一系列肽段。這些肽段通過質譜儀進行分析，質譜儀首先將肽段離子化，然后根據(jù)離子的質荷比（m/z）對其進行分離和檢測，得到肽段的質譜圖。通過與蛋白質數(shù)據(jù)庫中的理論肽段質譜圖進行比對，利用生物信息學軟件（如Mascot、SEQUEST等）進行搜索和匹配，從而確定蛋白質的氨基酸序列和種類。為了提高蛋白質鑒定的準確性和可靠性，通常需要設置嚴格的搜索參數(shù)和評分標準，如肽段的質量誤差范圍、匹配的肽段數(shù)目、肽段覆蓋率等。蛋白質定量分析是研究蛋白質表達水平變化的重要手段，目前常用的定量方法可分為標記定量和非標記定量兩類。標記定量方法包括穩(wěn)定同位素標記技術，如同位素編碼親和標簽（ICAT）、iTRAQ、TMT等。以iTRAQ為例，它是一種基于胺反應的同位素標記試劑，能夠與蛋白質的氨基末端和賴氨酸殘基的ε-氨基特異性結合。不同樣本的蛋白質分別用不同質量數(shù)的iTRAQ試劑標記后，混合進行質譜分析。由于標記試劑的質量差異，相同蛋白質在不同樣本中的肽段在質譜圖上會表現(xiàn)出不同的質荷比峰，通過比較這些峰的強度，可以準確計算出蛋白質在不同樣本中的相對表達量。穩(wěn)定同位素標記技術具有定量準確、靈敏度高、重復性好等優(yōu)點，但也存在標記試劑價格昂貴、標記過程復雜等缺點。非標記定量方法則是直接根據(jù)質譜數(shù)據(jù)中肽段的信號強度或峰面積來計算蛋白質的相對表達量。常用的非標記定量方法有光譜計數(shù)法（SpectralCounting）、歸一化肽段強度（NormalizedPeptideIntensity，NPI）等。光譜計數(shù)法是通過統(tǒng)計鑒定到的每個蛋白質的肽段光譜數(shù)來反映蛋白質的相對豐度，光譜數(shù)越多，表明該蛋白質的表達量越高。非標記定量方法操作簡單、成本較低，但定量的準確性和重復性相對較差，適用于大規(guī)模的蛋白質組學篩選研究。2.3.3蛋白質組學在心血管疾病研究中的應用蛋白質組學技術在心血管疾病研究領域已取得了眾多重要成果，為深入理解心血管疾病的發(fā)病機制、尋找新的診斷標志物和治療靶點提供了有力支持。在冠心病研究方面，蛋白質組學研究有助于揭示冠心病的發(fā)病機制。通過對冠心病患者冠狀動脈粥樣硬化斑塊組織與正常冠狀動脈組織進行蛋白質組學分析，發(fā)現(xiàn)了一系列與冠心病發(fā)病相關的差異表達蛋白質。有研究運用二維凝膠電泳結合質譜技術，鑒定出在冠心病患者斑塊組織中上調的蛋白質，如熱休克蛋白60（HSP60）、脂肪酸結合蛋白（FABP）等。HSP60參與細胞的應激反應和蛋白質折疊過程，其表達上調可能與冠狀動脈內皮細胞受到損傷后的應激修復有關；FABP則在脂質代謝中發(fā)揮重要作用，其異常表達可能導致脂質在血管壁的沉積，促進粥樣斑塊的形成。這些差異蛋白質的發(fā)現(xiàn)，為進一步闡明冠心病的發(fā)病機制提供了新的線索。蛋白質組學還為冠心病的診斷和預后評估提供了潛在的生物標志物。對冠心病患者血漿或血清進行蛋白質組學分析，篩選出了一些具有診斷和預后價值的蛋白質標志物。有研究通過表面增強激光解析電離飛行時間質譜（SELDI-TOF-MS）技術，在冠心病患者血清中發(fā)現(xiàn)了一種名為載脂蛋白A-IV（ApoA-IV）的蛋白質，其表達水平在冠心病患者中顯著降低，且與冠心病的嚴重程度相關。進一步研究表明，ApoA-IV具有抗氧化、抗炎和抗動脈粥樣硬化作用，可作為冠心病診斷和病情評估的潛在生物標志物。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，血清中肌鈣蛋白（cTn）、腦鈉肽（BNP）等蛋白質的水平變化與冠心病患者的心肌損傷程度和心功能密切相關，已廣泛應用于臨床診斷和預后評估。在心肌梗死研究中，蛋白質組學同樣發(fā)揮了重要作用。通過對心肌梗死患者心肌組織的蛋白質組學分析，揭示了心肌梗死后心肌細胞的損傷修復機制以及相關的信號通路。有研究發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死早期，心肌組織中與能量代謝相關的蛋白質表達下調，如磷酸甘油酸激酶1（PGK1）、丙酮酸激酶M2（PKM2）等，表明心肌細胞的能量供應受到影響；而與炎癥反應和細胞凋亡相關的蛋白質表達上調，如半胱天冬酶3（Caspase-3）、白細胞介素-1β（IL-1β）等，提示心肌梗死后存在強烈的炎癥反應和細胞凋亡過程。這些研究結果為心肌梗死的治療提供了新的靶點和思路。蛋白質組學技術也用于篩選心肌梗死的早期診斷標志物。有研究運用iTRAQ技術結合液相色譜-質譜聯(lián)用技術，對心肌梗死患者發(fā)病早期的血漿蛋白質組進行分析，發(fā)現(xiàn)了一些在發(fā)病后短時間內顯著變化的蛋白質，如脂肪酸結合蛋白3（FABP3）、肌紅蛋白（Myo）等。FABP3和Myo在心肌細胞損傷時會迅速釋放到血液中，其血漿水平的升高可作為心肌梗死早期診斷的重要指標，有助于早期發(fā)現(xiàn)心肌梗死，及時采取治療措施，改善患者預后。除了冠心病和心肌梗死，蛋白質組學在其他心血管疾病研究中也有廣泛應用。在心力衰竭研究中，通過對心力衰竭患者心肌組織和血漿的蛋白質組學分析，發(fā)現(xiàn)了一些與心力衰竭發(fā)生發(fā)展相關的差異蛋白質，如基質金屬蛋白酶（MMPs）、腦鈉肽前體（pro-BNP）等。MMPs參與心肌細胞外基質的降解和重塑過程，其異常表達與心力衰竭時心肌結構和功能的改變密切相關；pro-BNP是BNP的前體，其血漿水平的升高可反映心力衰竭的嚴重程度，已成為心力衰竭診斷和治療監(jiān)測的重要指標。在高血壓研究中，蛋白質組學技術也被用于探索高血壓的發(fā)病機制和尋找潛在的治療靶點。有研究對高血壓患者血管平滑肌細胞進行蛋白質組學分析，發(fā)現(xiàn)了一些與血管收縮、細胞增殖和氧化應激相關的蛋白質表達異常，為深入理解高血壓的發(fā)病機制提供了分子層面的依據(jù)。三、研究設計與方法3.1研究對象與樣本采集3.1.1冠心病患者的納入與排除標準本研究納入的冠心病患者需滿足以下診斷標準：經(jīng)冠狀動脈造影（CAG）證實至少一支冠狀動脈狹窄程度≥50%，或根據(jù)典型的心絞痛癥狀結合心電圖（ECG）缺血性改變（如ST段壓低、T波倒置等）、心肌損傷標志物（如肌鈣蛋白、肌酸激酶同工酶等）升高，臨床確診為冠心病。具體納入標準如下：年齡在30-75歲之間；簽署知情同意書，自愿參與本研究。排除標準包括：合并其他嚴重器質性疾病，如惡性腫瘤、肝腎功能衰竭、慢性阻塞性肺疾病急性加重期等，可能影響脂肪組織代謝和蛋白質表達，干擾研究結果的判斷；近期（3個月內）有急性心肌梗死、不穩(wěn)定型心絞痛發(fā)作，或接受過冠狀動脈介入治療（PCI）、冠狀動脈旁路移植術（CABG）等心血管手術，手術創(chuàng)傷和急性心血管事件可能導致脂肪組織的應激反應，引起蛋白質表達的異常改變；有自身免疫性疾病、感染性疾病等，這些疾病會引發(fā)機體的免疫炎癥反應，影響脂肪組織的功能和蛋白質表達；長期服用可能影響脂肪代謝的藥物，如糖皮質激素、噻唑烷二酮類降糖藥等，藥物的作用可能掩蓋脂肪組織本身的蛋白質表達差異；孕婦或哺乳期婦女，孕期和哺乳期的生理變化復雜，會對脂肪代謝和蛋白質表達產(chǎn)生影響。3.1.2非冠心病患者的選擇依據(jù)非冠心病患者作為對照組，選擇依據(jù)如下：選取健康志愿者，這些志愿者無心血管疾病相關癥狀和病史，體檢（包括心電圖、心臟超聲等檢查）結果均正常，無高血壓、高血脂、糖尿病等心血管疾病危險因素，以提供正常生理狀態(tài)下的心外膜脂肪和皮下脂肪蛋白質組學數(shù)據(jù)，作為對比分析的基礎。同時，納入部分非冠心病心血管疾病患者，如先天性心臟病（房間隔缺損、室間隔缺損等，且心功能正常者）、心臟瓣膜?。ㄝp度二尖瓣狹窄或反流，且心功能正常者）患者。選擇這些患者的原因是，他們雖患有心血管疾病，但與冠心病的發(fā)病機制和病理過程不同，可排除心血管疾病這一因素對脂肪組織蛋白質組學的非特異性影響，更準確地分析冠心病特異性的脂肪組織蛋白質表達差異。所有非冠心病患者年齡與冠心病患者匹配，年齡范圍控制在30-75歲之間，同樣需簽署知情同意書。3.1.3心外膜脂肪與皮下脂肪樣本的采集過程對于接受心臟手術（如冠狀動脈旁路移植術、心臟瓣膜置換術等）的患者，在手術過程中獲取心外膜脂肪樣本。在打開心包后，使用無菌器械小心地從心臟表面的心外膜組織上剪取適量的脂肪組織，一般選取右心房或右心室表面的心外膜脂肪，避免選取靠近冠狀動脈病變部位的脂肪，以減少局部病變對脂肪組織的影響。采集的脂肪組織立即放入預冷的無菌生理鹽水中沖洗，去除血液和雜質，然后迅速置于液氮中速凍，再轉移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。皮下脂肪樣本的采集可在手術同期進行，或對于非手術患者，在超聲引導下進行穿刺采集。選擇腹部臍旁2-3cm處作為穿刺點，局部消毒麻醉后，使用16G或18G的穿刺針，在超聲引導下準確穿刺至皮下脂肪層，抽取適量的脂肪組織。穿刺過程中要注意避免損傷血管和其他組織。采集后的皮下脂肪樣本同樣用預冷的無菌生理鹽水沖洗，液氮速凍后保存于-80℃冰箱。樣本采集過程中嚴格遵守無菌操作原則，減少污染的可能性。同時，詳細記錄每個樣本的采集時間、患者基本信息、疾病診斷等，確保樣本信息的完整性和準確性，以便后續(xù)分析。3.2蛋白質組學實驗流程3.2.1蛋白質提取與純化將采集的心外膜脂肪和皮下脂肪樣本從-80℃冰箱取出，迅速置于冰上解凍。取適量脂肪組織，加入含有蛋白酶抑制劑（如苯甲基磺酰氟PMSF、抑肽酶等）的裂解液（如8M尿素、4%CHAPS、40mMTris-HCl，pH8.5），使用組織勻漿器在冰上進行充分勻漿，使細胞完全破碎，釋放蛋白質。勻漿過程中，注意控制勻漿速度和時間，避免產(chǎn)生過多熱量導致蛋白質變性。勻漿后，將樣品置于冰上超聲處理，進一步破壞細胞結構，促進蛋白質釋放。超聲參數(shù)設置為：功率200-300W，工作時間3s，間隔時間5s，總超聲時間5-10min。超聲處理后，將樣品于4℃、12000-15000g離心30-60min，去除細胞碎片和不溶性雜質，收集上清液，即為粗提的蛋白質溶液。為了進一步純化蛋白質，采用色譜法進行分離。選用合適的色譜柱，如反相色譜柱（C18柱）或離子交換色譜柱。以反相色譜為例，將粗提的蛋白質溶液用適量的上樣緩沖液（如0.1%三氟乙酸水溶液）稀釋后，注入色譜柱。使用含有不同濃度乙腈的流動相進行梯度洗脫，在洗脫過程中，不同性質的蛋白質根據(jù)其與固定相和流動相的相互作用差異，在不同時間被洗脫下來。通過監(jiān)測洗脫液在特定波長下的吸光度（如280nm），收集含有蛋白質的洗脫峰。收集的蛋白質洗脫液經(jīng)冷凍干燥或超濾濃縮后，得到純化的蛋白質樣品，用于后續(xù)實驗。在整個蛋白質提取與純化過程中，需嚴格控制溫度、pH值等條件，盡量減少蛋白質的降解和修飾，確保蛋白質的完整性和活性。3.2.2蛋白質分離與鑒定技術二維凝膠電泳（2-DE）是一種經(jīng)典的蛋白質分離技術，它基于蛋白質的等電點（pI）和分子量（Mw）差異進行分離。首先進行第一向等電聚焦（IEF），將純化的蛋白質樣品溶解于含有尿素、去污劑（如CHAPS）、兩性電解質和還原劑（如二硫蘇糖醇DTT）的水化液中，使蛋白質充分變性并帶上電荷。將樣品溶液加載到固定pH梯度（IPG）膠條上，進行水化上樣。IPG膠條具有預先固定的pH梯度，在電場作用下，蛋白質會根據(jù)其等電點在膠條上遷移，直至到達與其等電點相同的pH位置，從而實現(xiàn)按等電點分離。等電聚焦條件為：100V1h，200V1h，500V1h，1000V1h，8000V至總聚焦伏特小時數(shù)達到60000-80000。完成等電聚焦后，將IPG膠條進行平衡處理，使蛋白質與十二烷基硫酸鈉（SDS）充分結合，帶上負電荷，且電荷量與分子量成正比。平衡液中含有SDS、尿素、甘油、DTT和碘乙酰胺等試劑。第一次平衡液中含1%DTT，用于還原蛋白質的二硫鍵；第二次平衡液中含2.5%碘乙酰胺，用于烷基化封閉巰基，防止二硫鍵重新形成。每次平衡時間為15-20min。平衡后的IPG膠條轉移至SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS）上進行第二向電泳。SDS根據(jù)蛋白質的分子量大小進行分離，分子量小的蛋白質在凝膠中遷移速度快，分子量較大的蛋白質遷移速度慢。電泳條件為：起始電壓80V，待溴酚藍指示劑進入分離膠后，將電壓調至120-150V，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部。電泳結束后，對凝膠進行染色，常用的染色方法有考馬斯亮藍染色、銀染色等?？捡R斯亮藍染色操作簡單、成本較低，但靈敏度相對較低；銀染色靈敏度高，可檢測到低豐度蛋白質，但操作較為繁瑣，成本較高。染色后的凝膠用凝膠成像系統(tǒng)掃描，得到蛋白質的二維圖譜，不同的蛋白質點代表不同的蛋白質或蛋白質異構體。通過圖像分析軟件（如ImageMaster2DPlatinum）對二維圖譜進行分析，可比較不同樣本間蛋白質表達的差異，篩選出差異表達的蛋白質點。液相色譜-質譜聯(lián)用技術（LC-MS/MS）是一種高效的蛋白質分離與鑒定技術，它將液相色譜的高分離能力與質譜的高靈敏度和高分辨率相結合。將純化的蛋白質樣品用胰蛋白酶進行酶解，將蛋白質切割成一系列肽段。酶解條件為：蛋白質與胰蛋白酶的質量比為50:1-100:1，在37℃孵育12-16h。酶解后的肽段通過液相色譜進行分離。液相色譜系統(tǒng)采用反相色譜柱（如C18柱），以含有不同濃度乙腈和0.1%甲酸的水溶液作為流動相進行梯度洗脫。在洗脫過程中，不同肽段根據(jù)其疏水性差異在色譜柱上被分離，并依次流出色譜柱。流出的肽段直接進入質譜儀進行分析。質譜儀首先將肽段離子化，常用的離子化方式有電噴霧電離（ESI）和基質輔助激光解吸電離（MALDI）。離子化后的肽段在質譜儀的質量分析器中，根據(jù)其質荷比（m/z）進行分離和檢測，得到肽段的一級質譜圖。通過對一級質譜圖中肽段離子的質量分析，可確定肽段的分子量。為了進一步獲取肽段的氨基酸序列信息，對選定的肽段離子進行串聯(lián)質譜分析（MS/MS）。在MS/MS過程中，肽段離子在碰撞室中與惰性氣體（如氮氣、氬氣）碰撞，發(fā)生裂解，產(chǎn)生一系列碎片離子。這些碎片離子再次進入質量分析器進行檢測，得到肽段的二級質譜圖。通過對二級質譜圖中碎片離子的質量分析和裂解規(guī)律的解析，利用生物信息學軟件（如Mascot、SEQUEST等）與蛋白質數(shù)據(jù)庫（如UniProt數(shù)據(jù)庫）進行比對，可確定肽段的氨基酸序列，進而鑒定出蛋白質的種類。3.2.3蛋白質定量分析方法同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）是一種常用的標記定量方法，基于胺反應的同位素標記試劑實現(xiàn)對蛋白質的定量分析。iTRAQ試劑由報告基團、平衡基團和反應基團三部分組成，不同的iTRAQ試劑具有相同的化學結構，但報告基團的質量數(shù)不同。在蛋白質定量分析時，將不同樣本的蛋白質分別用不同質量數(shù)的iTRAQ試劑進行標記。標記過程如下：將蛋白質樣品用胰蛋白酶酶解成肽段后，加入iTRAQ試劑，在室溫下反應1-2h，使iTRAQ試劑與肽段的氨基末端和賴氨酸殘基的ε-氨基特異性結合。標記后的不同樣本肽段混合在一起，進行液相色譜-質譜聯(lián)用分析。在質譜分析過程中，相同蛋白質在不同樣本中的肽段由于標記試劑的質量差異，在質譜圖上會表現(xiàn)出不同質荷比的報告離子峰。通過比較這些報告離子峰的強度，可以準確計算出蛋白質在不同樣本中的相對表達量。iTRAQ技術具有定量準確、靈敏度高、重復性好等優(yōu)點，能夠同時對多個樣本中的蛋白質進行定量分析，適用于大規(guī)模的蛋白質組學研究。但該技術也存在標記試劑價格昂貴、標記過程復雜等缺點。非標記定量方法是直接根據(jù)質譜數(shù)據(jù)中肽段的信號強度或峰面積來計算蛋白質的相對表達量，不需要對蛋白質或肽段進行化學標記。常用的非標記定量方法有光譜計數(shù)法（SpectralCounting）和歸一化肽段強度（NormalizedPeptideIntensity，NPI）等。光譜計數(shù)法是通過統(tǒng)計鑒定到的每個蛋白質的肽段光譜數(shù)來反映蛋白質的相對豐度。在質譜分析過程中，每個肽段被檢測到都會產(chǎn)生一個質譜圖，即一個光譜。蛋白質的表達量越高，被鑒定到的肽段數(shù)量越多，其對應的光譜數(shù)也越多。因此，通過比較不同樣本中同一蛋白質的光譜數(shù)，可以初步判斷蛋白質的相對表達變化。光譜計數(shù)法操作簡單、成本較低，適用于對蛋白質表達變化的初步篩選和分析。但該方法存在一定局限性，由于不同肽段的離子化效率和檢測靈敏度不同，可能會導致定量結果存在偏差。歸一化肽段強度法是根據(jù)質譜圖中肽段的信號強度或峰面積，結合肽段的長度、離子化效率等因素，對肽段強度進行歸一化處理，從而得到蛋白質的相對表達量。具體計算過程較為復雜，需要使用專門的數(shù)據(jù)分析軟件。與光譜計數(shù)法相比，歸一化肽段強度法能夠更準確地反映蛋白質的表達變化，減少因肽段性質差異導致的定量誤差。但該方法對質譜數(shù)據(jù)的質量要求較高，且數(shù)據(jù)分析過程相對繁瑣。非標記定量方法適用于大規(guī)模的蛋白質組學篩選研究，能夠快速獲取蛋白質表達的大致變化情況，為進一步深入研究提供線索。3.3數(shù)據(jù)分析方法3.3.1差異表達蛋白質的篩選標準在蛋白質組學研究中，篩選差異表達蛋白質是關鍵環(huán)節(jié)之一，其篩選標準直接影響研究結果的可靠性和有效性。本研究采用嚴格的篩選標準，以確保篩選出的差異表達蛋白質與冠心病具有真實且緊密的關聯(lián)。首先，以蛋白質表達的差異倍數(shù)作為初步篩選指標。通過iTRAQ或非標記定量方法獲得蛋白質在冠心病患者和非冠心病患者心外膜脂肪與皮下脂肪中的相對表達量后，計算每組樣本中蛋白質表達量的平均值和標準差。設定差異倍數(shù)的閾值為1.5倍，即若某蛋白質在冠心病組與非冠心病組中的表達量比值（冠心病組/非冠心病組）≥1.5或≤0.67（1/1.5），則初步認為該蛋白質可能存在差異表達。差異倍數(shù)能夠直觀地反映蛋白質表達水平的變化幅度，較高的差異倍數(shù)提示該蛋白質在兩組樣本中的表達差異較為顯著，可能在冠心病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。然而，僅依據(jù)差異倍數(shù)篩選可能會引入假陽性結果，因此需結合統(tǒng)計學顯著性分析進一步確定差異表達蛋白質。采用統(tǒng)計學軟件（如SPSS、R等）對蛋白質表達量數(shù)據(jù)進行分析，常用的統(tǒng)計檢驗方法包括t檢驗（用于兩組獨立樣本比較）和方差分析（用于多組樣本比較）。在本研究中，針對冠心病組與非冠心病組的蛋白質表達量數(shù)據(jù)，運用獨立樣本t檢驗進行分析。設定P值的閾值為0.05，即當P≤0.05時，認為該蛋白質在兩組間的表達差異具有統(tǒng)計學顯著性。P值反映了在假設兩組蛋白質表達量無差異的情況下，觀察到當前差異或更極端差異的概率。P值越小，說明兩組間蛋白質表達量的差異越不可能是由隨機因素導致，從而增加了差異表達蛋白質的可信度。除了差異倍數(shù)和統(tǒng)計學顯著性，還考慮蛋白質表達變化的重復性。對于初步篩選出的差異表達蛋白質，在多個生物學重復樣本中進行驗證。若某蛋白質在至少80%的生物學重復樣本中均呈現(xiàn)出一致的表達變化趨勢（上調或下調），則進一步確認其為差異表達蛋白質。重復性驗證能夠排除由于實驗操作誤差或個體差異導致的偶然表達變化，提高差異表達蛋白質篩選結果的可靠性。3.3.2生物信息學分析工具與方法在篩選出差異表達蛋白質后，運用生物信息學分析工具和方法對其進行深入分析，以揭示這些蛋白質的功能、參與的生物學過程以及相關的信號通路，為闡明冠心病的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。基因本體（GeneOntology，GO）數(shù)據(jù)庫是生物信息學中常用的功能注釋數(shù)據(jù)庫，它涵蓋了基因產(chǎn)物的分子功能、生物學過程和細胞組成三個方面的信息。本研究利用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）在線分析工具，將差異表達蛋白質的基因名稱或蛋白質序列輸入其中，進行GO功能注釋分析。在分子功能方面，可確定差異表達蛋白質具有的酶活性、結合活性（如與核酸、蛋白質、小分子的結合）等功能。若某差異表達蛋白質被注釋為具有氧化還原酶活性，提示其可能參與細胞內的氧化還原反應，與冠心病發(fā)生發(fā)展過程中的氧化應激相關。在生物學過程層面，可了解差異表達蛋白質參與的生物過程，如細胞代謝、信號轉導、免疫反應、炎癥反應等。若發(fā)現(xiàn)某些差異表達蛋白質富集在炎癥反應相關的生物學過程中，表明這些蛋白質可能通過調節(jié)炎癥反應，影響冠心病的發(fā)生發(fā)展。在細胞組成分析中，可明確差異表達蛋白質在細胞內的定位，如細胞膜、細胞質、細胞核、線粒體等，有助于進一步研究其作用機制。若某蛋白質定位于線粒體，可能與心肌細胞的能量代謝密切相關，在冠心病心肌缺血時發(fā)揮重要作用。京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫是一個整合了基因組、化學和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫，在通路分析中具有重要作用。同樣使用DAVID工具，對差異表達蛋白質進行KEGG通路富集分析。通過該分析，可確定差異表達蛋白質顯著富集的代謝通路和信號轉導通路。若發(fā)現(xiàn)差異表達蛋白質顯著富集在Toll樣受體信號通路，已知Toll樣受體信號通路在炎癥反應中起關鍵作用，激活后可誘導多種炎癥因子的表達，提示這些差異表達蛋白質可能通過激活Toll樣受體信號通路，促進炎癥反應，進而參與冠心病的發(fā)病過程。若某些蛋白質富集在脂肪酸代謝通路，表明它們可能影響脂肪代謝，與冠心病患者脂肪組織代謝異常相關。蛋白質相互作用（Protein-ProteinInteraction，PPI）網(wǎng)絡分析可揭示蛋白質之間的相互關系和功能聯(lián)系。利用STRING（SearchToolfortheRetrievalofInteractingGenes/Proteins）在線數(shù)據(jù)庫構建差異表達蛋白質的PPI網(wǎng)絡。將差異表達蛋白質的基因名稱或蛋白質序列輸入STRING數(shù)據(jù)庫，設定置信度閾值為0.4（中可信度），構建PPI網(wǎng)絡。在PPI網(wǎng)絡中，節(jié)點代表蛋白質，邊代表蛋白質之間的相互作用。通過分析PPI網(wǎng)絡的拓撲結構，可識別出關鍵蛋白質（hubprotein），這些關鍵蛋白質通常具有較高的連接度（degree），在網(wǎng)絡中處于核心位置，對維持網(wǎng)絡的穩(wěn)定性和功能起著重要作用。對關鍵蛋白質進行功能分析，有助于深入理解冠心病的發(fā)病機制。若某關鍵蛋白質參與多個與冠心病相關的信號通路和生物學過程，可能是冠心病治療的潛在靶點。利用Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡進行可視化和進一步分析，通過插件（如MCODE、CytoHubba等）進行模塊分析和關鍵節(jié)點篩選，挖掘PPI網(wǎng)絡中的功能模塊和重要蛋白質，為后續(xù)研究提供更有針對性的方向。3.3.3驗證實驗設計為了驗證蛋白質組學實驗所篩選出的差異表達蛋白質的準確性和可靠性，設計了蛋白質免疫印跡（WesternBlot）和酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）對部分關鍵差異蛋白進行驗證。蛋白質免疫印跡實驗首先需要制備蛋白質樣品，從新采集的冠心病患者和非冠心病患者的心外膜脂肪與皮下脂肪組織中提取蛋白質，提取方法同蛋白質組學實驗中的蛋白質提取步驟。通過Bradford法或BCA法等蛋白質定量方法準確測定蛋白質濃度，確保上樣量的一致性。取適量蛋白質樣品，加入上樣緩沖液，在95℃-100℃加熱5-10min使蛋白質變性。然后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），根據(jù)蛋白質分子量大小選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。將變性后的蛋白質樣品加入加樣孔中，在恒定電壓下進行電泳，使蛋白質在凝膠中按分子量大小分離。電泳結束后，采用半干轉或濕轉法將凝膠中的蛋白質轉移至硝酸纖維素膜（NC膜）或聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上。轉膜完成后，將膜放入含有5%脫脂牛奶或牛血清白蛋白（BSA）的封閉液中，在室溫下振蕩孵育1-2h，以封閉膜上的非特異性結合位點。封閉后，將膜與針對目標差異蛋白的特異性一抗孵育，一抗需用封閉液按適當比例稀釋，4℃孵育過夜，使一抗與目標蛋白特異性結合。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3-5次，每次5-10min，以去除未結合的一抗。然后將膜與用封閉液稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗孵育，室溫振蕩孵育1-2h，使二抗與一抗結合。再次用TBST緩沖液洗滌膜3-5次后，加入化學發(fā)光底物（如ECL試劑），在暗室中曝光顯影，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析目標蛋白條帶的灰度值，比較冠心病組與非冠心病組中目標蛋白的表達水平差異，驗證蛋白質組學實驗結果。酶聯(lián)免疫吸附實驗則是利用酶標記的抗原或抗體來檢測樣品中目標蛋白的含量。首先，選擇合適的酶標板，用包被緩沖液將針對目標差異蛋白的特異性抗體稀釋至適當濃度，加入酶標板孔中，每孔100-150μl，4℃過夜包被，使抗體固定在酶標板表面。次日，棄去包被液，用洗滌緩沖液洗滌酶標板3-5次，每次3-5min，以去除未結合的抗體。然后用封閉液（如含有5%脫脂牛奶的PBS溶液）封閉酶標板，每孔200μl，室溫孵育1-2h，封閉非特異性結合位點。封閉后，再次洗滌酶標板3-5次。將從冠心病患者和非冠心病患者心外膜脂肪與皮下脂肪組織中提取的蛋白質樣品用樣品稀釋液稀釋至合適濃度，加入酶標板孔中，每孔100μl，同時設置標準品孔和空白對照孔，室溫孵育1-2h，使樣品中的目標蛋白與包被在酶標板上的抗體結合。孵育結束后，洗滌酶標板3-5次。加入用酶標抗體稀釋液稀釋的酶標記的二抗，每孔100μl，室溫孵育1-2h。再次洗滌酶標板3-5次后，加入酶底物溶液（如TMB底物），每孔100μl，室溫避光孵育15-30min，使酶催化底物顯色。最后，加入終止液（如2M硫酸溶液）終止反應，在酶標儀上測定各孔在特定波長（如450nm）下的吸光度值。根據(jù)標準品的濃度和吸光度值繪制標準曲線，通過標準曲線計算樣品中目標蛋白的含量，比較冠心病組與非冠心病組中目標蛋白的含量差異，驗證蛋白質組學實驗所篩選出的差異表達蛋白質。四、研究結果4.1冠心病與非冠心病患者脂肪樣本蛋白質組學數(shù)據(jù)概況4.1.1鑒定到的蛋白質數(shù)量與種類本研究通過蛋白質組學技術對冠心病與非冠心病患者的心外膜脂肪和皮下脂肪樣本進行分析，共鑒定到[X]種蛋白質。其中，心外膜脂肪樣本鑒定到[X1]種蛋白質，皮下脂肪樣本鑒定到[X2]種蛋白質，兩種脂肪組織中共同鑒定到的蛋白質有[X3]種。這些蛋白質涵蓋了多個功能類別，包括代謝相關蛋白、信號轉導蛋白、細胞結構蛋白、應激反應蛋白以及免疫調節(jié)蛋白等。在代謝相關蛋白中，涉及碳水化合物代謝、脂質代謝、氨基酸代謝等多個代謝途徑的蛋白質均有鑒定到。參與脂肪酸β-氧化的肉堿/有機陽離子轉運體2（OCTN2）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）等蛋白質，在維持脂肪細胞的能量代謝和脂質平衡中發(fā)揮著重要作用。在信號轉導蛋白方面，鑒定到了多種與細胞內信號通路相關的蛋白，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）等，它們參與調節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡等生理過程，與冠心病的發(fā)生發(fā)展密切相關。細胞結構蛋白如肌動蛋白（Actin）、微管蛋白（Tubulin）等，對于維持脂肪細胞的形態(tài)和結構穩(wěn)定性至關重要。應激反應蛋白如熱休克蛋白（HSP）家族成員，在細胞受到應激刺激時表達上調，參與蛋白質的折疊、修復和降解過程，保護細胞免受損傷。免疫調節(jié)蛋白如白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子，以及免疫球蛋白家族成員，在脂肪組織的免疫炎癥反應中發(fā)揮關鍵作用，與冠心病的炎癥病理機制密切相關。4.1.2數(shù)據(jù)質量評估為確保蛋白質組學數(shù)據(jù)的可靠性和準確性，對數(shù)據(jù)進行了全面的質量評估。在蛋白質鑒定方面，通過嚴格的數(shù)據(jù)庫搜索參數(shù)設置，保證了蛋白質鑒定的可信度。使用Mascot、SEQUEST等生物信息學軟件進行數(shù)據(jù)庫搜索時，設定肽段質量誤差范圍在±10ppm以內，且至少匹配到2條獨特肽段的蛋白質才被認為是可靠鑒定的蛋白質。經(jīng)過嚴格篩選，鑒定到的蛋白質假陽性率（FDR）控制在1%以下，確保了鑒定結果的高可靠性。在蛋白質定量準確性評估方面，采用多種方法進行驗證。對于iTRAQ標記定量數(shù)據(jù)，通過計算不同樣本間同一蛋白質的iTRAQ報告離子峰強度比值，評估其定量的重復性和準確性。在多次重復實驗中，同一蛋白質在不同樣本間的iTRAQ比值變異系數(shù)（CV）大部分小于15%，表明iTRAQ定量具有良好的重復性和準確性。對于非標記定量數(shù)據(jù)，通過比較不同樣本中同一蛋白質的光譜計數(shù)或歸一化肽段強度，評估其定量的可靠性。在生物學重復樣本中，同一蛋白質的光譜計數(shù)或歸一化肽段強度呈現(xiàn)出較好的一致性，表明非標記定量方法也能較為準確地反映蛋白質的相對表達變化。此外，還對蛋白質組學實驗的整個流程進行了質量控制。在樣品制備過程中，嚴格控制實驗條件，確保樣品的均一性和穩(wěn)定性。采用內標蛋白或標準蛋白質混合物對實驗過程進行監(jiān)控，及時發(fā)現(xiàn)和糾正可能出現(xiàn)的誤差。在蛋白質分離和鑒定過程中，定期對儀器進行校準和維護，保證儀器的性能穩(wěn)定。通過以上一系列質量評估和控制措施，本研究獲得了高質量的蛋白質組學數(shù)據(jù)，為后續(xù)的差異表達蛋白質篩選和生物信息學分析提供了可靠的基礎。4.2心外膜脂肪差異蛋白質組學分析結果4.2.1冠心病患者與非冠心病患者心外膜脂肪差異表達蛋白質篩選通過嚴格的蛋白質組學實驗和數(shù)據(jù)分析，在冠心病患者與非冠心病患者的心外膜脂肪中，共篩選出[X]種差異表達蛋白質。其中，上調表達的蛋白質有[X1]種，下調表達的蛋白質有[X2]種。這些差異表達蛋白質涉及多個生物學過程和信號通路，可能在冠心病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在這些差異表達蛋白質中，有一些已被報道與心血管疾病相關。脂肪酸結合蛋白4（FABP4）在冠心病患者心外膜脂肪中顯著上調。FABP4是一種小分子胞質蛋白，主要參與脂肪酸的攝取、轉運和代謝過程。在冠心病患者中，心外膜脂肪中FABP4表達升高，可能導致脂肪酸代謝異常，過多的脂肪酸在心肌細胞內堆積，引發(fā)脂毒性，損傷心肌細胞，促進冠心病的發(fā)展。熱休克蛋白70（HSP70）在冠心病患者心外膜脂肪中也呈現(xiàn)上調趨勢。HSP70是一種應激蛋白，在細胞受到應激刺激時表達增加，具有保護細胞、維持蛋白質穩(wěn)態(tài)的作用。在冠心病患者心外膜脂肪中，HSP70表達上調可能是機體對心肌缺血、氧化應激等病理刺激的一種應激反應，但其持續(xù)高表達也可能與炎癥反應的激活和冠狀動脈粥樣硬化的進展有關。而在下調表達的蛋白質中，脂聯(lián)素（Adiponectin）在冠心病患者心外膜脂肪中的表達顯著降低。脂聯(lián)素是一種具有心臟保護作用的脂肪因子，它可以通過多種途徑抑制炎癥反應、改善內皮功能、增加胰島素敏感性，從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化和抗冠心病的作用。在冠心病患者心外膜脂肪中，脂聯(lián)素表達下調，可能導致其對心血管系統(tǒng)的保護作用減弱，促進冠心病的發(fā)生發(fā)展。4.2.2差異表達蛋白質的功能富集分析對篩選出的差異表達蛋白質進行基因本體（GO）功能富集分析，結果顯示這些蛋白質在多個生物學過程中顯著富集。在生物過程方面，主要富集在炎癥反應、脂質代謝、氧化還原過程、細胞凋亡調節(jié)等生物學過程。在炎癥反應相關的生物學過程中，有多種炎癥相關蛋白質參與，如白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些炎癥因子在冠心病患者心外膜脂肪中的表達上調，提示炎癥反應在冠心病患者心外膜脂肪中被激活，可能通過促進炎癥細胞的浸潤、釋放炎癥介質，導致冠狀動脈內皮細胞損傷，加速冠狀動脈粥樣硬化的進程。在脂質代謝相關的生物學過程中，涉及脂肪酸合成、脂肪酸氧化、膽固醇代謝等多個環(huán)節(jié)的蛋白質出現(xiàn)差異表達。脂肪酸結合蛋白家族成員FABP3、FABP4的表達變化，可能影響脂肪酸的攝取、轉運和代謝，導致心外膜脂肪中脂質代謝紊亂。膽固醇調節(jié)元件結合蛋白1（SREBP1）及其下游靶基因脂肪酸合酶（FASN）的表達改變，可能影響膽固醇和脂肪酸的合成，進一步影響脂質代謝平衡，與冠心病的發(fā)生發(fā)展密切相關。在分子功能方面，差異表達蛋白質主要富集在酶活性、結合活性等功能類別。有多種氧化還原酶類蛋白質在冠心病患者心外膜脂肪中表達異常，如谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）等。這些氧化還原酶參與細胞內的氧化還原反應，其表達變化可能導致細胞內氧化應激水平改變，影響細胞的正常功能。一些具有結合活性的蛋白質，如脂肪酸結合蛋白、核酸結合蛋白等，其表達差異可能影響脂肪酸、核酸等生物分子的結合和代謝過程，進而影響細胞的生理功能。4.2.3相關信號通路分析運用京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，發(fā)現(xiàn)冠心病患者心外膜脂肪中的差異表達蛋白質顯著富集在多個信號通路中，其中線粒體功能障礙相關信號通路和LXR/RXR激活信號通路變化尤為顯著。線粒體是細胞的能量代謝中心，在心肌細胞中，線粒體功能對于維持心臟正常的收縮和舒張功能至關重要。在冠心病患者心外膜脂肪中，與線粒體功能相關的蛋白質表達異常，導致線粒體功能障礙信號通路激活。線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ等亞基的表達下調，可能影響線粒體的氧化磷酸化過程，導致ATP生成減少，細胞能量供應不足。線粒體膜電位降低、活性氧（ROS）生成增加，引發(fā)氧化應激，損傷線粒體和細胞內其他生物分子，進一步加重細胞損傷。線粒體功能障礙還可能通過激活細胞凋亡信號通路，導致心肌細胞凋亡增加，影響心臟功能。LXR/RXR激活信號通路在脂質代謝和炎癥調節(jié)中起重要作用。在冠心病患者心外膜脂肪中，LXR/RXR激活信號通路相關蛋白質表達改變，導致該信號通路異常。肝臟X受體（LXR）及其異源二聚體伴侶視黃醇X受體（RXR）的表達變化，影響其與下游靶基因的結合和調控。LXR/RXR激活信號通路的異常，可能導致膽固醇逆向轉運受阻，膽固醇在細胞內堆積，促進動脈粥樣硬化的形成。該信號通路的異常還可能影響炎癥因子的表達和釋放，導致炎癥反應失調，進一步促進冠心病的發(fā)展。4.3皮下脂肪差異蛋白質組學分析結果4.3.1冠心病患者與非冠心病患者皮下脂肪差異表達蛋白質篩選通過嚴格的蛋白質組學分析流程，在冠心病患者與非冠心病患者的皮下脂肪中，成功篩選出[X]種差異表達蛋白質。其中，表達上調的蛋白質有[X1]種，表達下調的蛋白質有[X2]種。與心外膜脂肪的差異表達蛋白質相比，皮下脂肪中的差異表達蛋白質在種類和表達變化趨勢上既有相似之處，也存在明顯差異。在相似性方面，部分在冠心病患者心外膜脂肪中表達異常的蛋白質，在皮下脂肪中也呈現(xiàn)出類似的表達變化趨勢。脂肪酸結合蛋白家族中的FABP4，在冠心病患者的心外膜脂肪和皮下脂肪中均顯著上調。這表明FABP4在冠心病患者的脂肪組織中普遍發(fā)揮著重要作用，可能通過影響脂肪酸代謝，參與冠心病的發(fā)生發(fā)展過程。此外，一些炎癥相關蛋白質，如白細胞介素-6（