ICS65.150

CCSB52

DB50

重慶市地方標準

DB50/T1606—2024

水生動物細菌性病原鑒定技術規(guī)范

2024-07-08發(fā)布2024-10-08實施

重慶市市場監(jiān)督管理局?發(fā)布

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。

本文件由重慶市水產技術推廣總站提出。

本文件由重慶市農業(yè)農村委員會歸口并組織實施。

本文件起草單位：重慶市水產技術推廣總站、中國水產科學研究院長江水產研究所、西南大學、重

慶市水產學會。

本文件主要起草人：張利平、王波、李虹、梅會清、翟旭亮、周勇、廖雨華、陳潔、馬龍強、馮俊、

薛明洋、薛洋、吳曉清、周春龍、何忠誼、徐鳳、甘婷婷、陳波、劉曉莉、梅建西。

I

水生動物細菌性病原鑒定技術規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了水生動物細菌性病原鑒定的試劑、儀器設備、鑒定方法和無害化處理等技術要求。

本文件適用于水生動物細菌性病原鑒定和相關疫病診斷。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

SC/T7015病死水生動物及病害水生動物產品無害化處理規(guī)范

SC/T7201.1魚類細菌性病檢疫技術規(guī)程第1部分：通用技術

3術語和定義

本文件沒有需要界定的術語和定義。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

PCR：聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction）

dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosideTriphosphate）

TAE：三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽（Tris(hydroxymethyl)aminomethaneAcetateSalt）

EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid）

BHI：腦心浸出液肉湯（BrainHeartInfusionBroth）

BHIA：腦心浸出液瓊脂（BrainHeartInfusionAgar）

DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethypyrocarbonate）

5試劑

實驗用水、TaqDNA聚合酶、dNTP、瓊脂糖、10×PCR緩沖液（含Mg2+，25mmol/L）、核酸染料、

BHI、BHIA。試劑配制見附錄A。實驗用水應符合GB/T6682中一級水的規(guī)定。

6儀器設備

超凈工作臺、生物安全柜、醫(yī)用冰箱、高速離心機（100rpm～20000rpm）、高壓滅菌鍋、PCR儀、

電泳儀、凝膠成像儀、生化培養(yǎng)箱、移液器等。

1

DB50/T1606—2024

7鑒定方法

樣品的制備

7.1.1同一采樣點每尾（只）動物個體視為一個樣本，同一采樣點同一次采集的相似臨床癥狀的樣本

不超過5個。優(yōu)先采集有代表性的樣本，即采集具有明顯臨床癥狀的發(fā)病動物或者離群、獨游、瀕死的

動物。

7.1.2用75%酒精對待檢測水生動物的表面進行擦拭消毒。

7.1.3放置于已消毒解剖盤中，觀察樣品臨床癥狀，若有，則用滅菌接種環(huán)或剪刀挑取部分病灶組織；

若無病變，用滅菌剪刀和鑷子，分別取肝、脾、腎等組織。

平板劃線分離及純化

7.2.1在超凈工作臺或生物安全柜中，用滅菌接種環(huán)蘸取病灶部位或其它組織在BHIA平板（或選擇性

培養(yǎng)基或血平板）上進行三區(qū)劃線，做好編號標記。

7.2.2將劃線好的平板倒置在培養(yǎng)箱中，28℃±2℃培養(yǎng)16h～24h。

7.2.3觀察菌落生長情況，挑取優(yōu)勢單菌落（參見附錄B圖B.1），在超凈工作臺或生物安全柜中用

無菌接種環(huán)挑取單菌落到裝有無菌BHI增菌液（或已知的適宜培養(yǎng)基）的離心管中（一個單菌落對應

一個離心管），做好編號標記。挑取的不是單菌落，可稀釋后重復劃線純化。

7.2.4將挑取的單菌落放置在培養(yǎng)箱中，28℃±2℃培養(yǎng)16h～24h，觀察菌液狀態(tài)，若渾濁，則

于4℃保存待檢。

核酸模板制備

7.3.1吸取300μL的單菌落增菌液于無菌離心管中，12000rpm/min離心2min，棄上清。

7.3.2加入300μL的雙蒸水，洗脫，12000rpm/min離心2min；重復一次，棄上清。

7.3.3離心管中加入300μL的雙蒸水，100℃金屬浴（或水浴）10min，取出后馬上放入冰中冷卻，

等冷卻后4℃、12000r離心10min，吸取上清液作為核酸模板，放至無菌的離心管中冷藏備用；也

可使用同等抽提效果的商品化試劑盒或其它方法抽提DNA。

PCR檢測

7.4.116SrDNA的通用引物

上游引物27-F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物1492-R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

7.4.2反應體系

表1PCR反應體系

反應試劑加樣體積

10×PCR緩沖液（含Mg2+）5μL

dNTP1μL

上游引物1μL

下游引物1μL

TaqDNA聚合酶0.5μL

模板2.5μL

2

DB50/T1606—2024

表1PCR反應體系（續(xù)）

反應試劑加樣體積

雙蒸水或DEPC水39μL

總體積50μL

7.4.3反應條件

94℃預變性3min，94℃30s；55℃30s；72℃70s；擴增32個循環(huán)；72℃10min，最

后4℃保溫。

7.4.4瓊脂糖電泳

用1×TAE電泳緩沖液配置1.5%的瓊脂糖凝膠。將5μL樣品和1μL6×上樣緩沖液混勻后加入樣品

孔，在電泳時設立核酸標準分子量作對照。5V/cm電泳約0.5h，當溴酚藍快到達瓊脂糖凝膠底部時，

停止電泳。將瓊脂糖凝膠浸入核酸染料中進行泡染15min，于TAE緩沖液中脫色15min，將凝膠置于凝

膠成像儀上觀察。

結果判定：陽性對照16SrDNA的擴增產物在1500bp處出現特異性條帶，DNA分子量標準條清楚，陰

性對照和空白對照無特異性條帶，待測樣品出現1500bp的特異性核酸條帶，則可進行基因測序（待測

樣品出現1500bp的特異性核酸條帶參見附錄B圖B.2），否則無效。

7.4.5基因測序

取PCR產物進行基因序列測定，將測序結果與基因Bank中參考序列進行同源性比對。

7.4.6細菌種屬結果的確定

基因Bank進行同源性比對，根據比對結果判定細菌種屬。

8無害化處理

實驗過程中所用的器皿、耗材、及產物均需要經過121℃，15min高壓滅菌后，方可處置。

實驗后水生動物及其組織無害化處理按照SC/T7015規(guī)定執(zhí)行。

9生物安全防護

實驗人員必須穿著合適的實驗服、佩戴好口罩、帽子及一次性手套。進行活體處理或接觸含有微生

物的物品后，要洗手。離開實驗室前要脫掉手套，一次性手套不得清洗和再次使用。如果發(fā)生污染性物

質溢出等事故，應及時向實驗室負責人報告，并記錄經過和處理方案。

禁止在實驗室飲食、吸煙、化妝、儲存食物。非工作人員禁止進入實驗室。

3

DB50/T1606—2024

附錄A

（規(guī)范性）

試劑配制

A.150×TAE電泳緩沖液

2mol/LTris堿242g

1mol/L冰乙酸57.1mL

100mmol/LEDTA200ml的0.5mol/LEDTA（pH8.0）

加水定容至1000mL，室溫貯存。

A.21×TAE電泳緩沖液

加入50×電泳緩沖液20mL并加水定容至1000mL，配置成工作液，室溫貯存。

A.36×上樣緩沖液

蔗糖40g

溴酚藍