當(dāng)歸補(bǔ)血湯對血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及SOD,MDA,GSH-PX的影響摘要目的研究當(dāng)歸補(bǔ)血湯（DGBXT）對VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，以及對抗氧化物質(zhì)SOD和GSH-PX活性，及MDA含量的影響。方法VD大鼠模型，采用Wistar大鼠頸總動脈單側(cè)永久性結(jié)扎法。術(shù)后7天，用Morris水迷宮篩實驗，選出造模成功的40只大鼠，分為模型組、假手術(shù)組、DGBXT中劑量和高劑量組、及

Piracetam組。灌胃給藥30天后，用Morris水迷宮實驗進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力檢測，大腦皮層組織進(jìn)行抗氧化SOD和GSH-PX活性，及MDA含量測定。結(jié)果治療后DGBXT高、中劑量和Piracetam組找到平臺的時間均顯著小于模型組（P＜0.05）。與模型組比較，DGBXT高、中劑量和Piracetam組中MDA含量顯著降低，SOD和GSH-PX活性顯著升高，差別在統(tǒng)計學(xué)上存在意義（P<0.05）。結(jié)論DGBXT可通過提高抗氧化物活性，降低脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)產(chǎn)物，改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，治療血管性癡呆（VD）。關(guān)鍵詞血管性癡呆當(dāng)歸補(bǔ)血湯學(xué)習(xí)記憶SODGSH-PXMDA血管性癡呆（VD）是一種由于缺血性和出血性中風(fēng)，以及慢性低灌注而導(dǎo)致的癡呆。是由腦血管疾病引起的一種學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能障礙[1]。此種疾病使具有認(rèn)知、記憶和行為的大腦功能區(qū)受到損傷。血管性癡呆會影響患者的記憶和空間認(rèn)知能力，進(jìn)而影響患者的生活質(zhì)量。目前已有實驗證明[2]，血管性癡呆的發(fā)病機(jī)制之一與機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。當(dāng)歸補(bǔ)血湯主治血虛發(fā)熱證，還可補(bǔ)氣生血，血管性癡呆多數(shù)表現(xiàn)為血虛氣弱，正是當(dāng)歸補(bǔ)血湯的適應(yīng)證[3]，并且趙歡等通過臨床試驗證明用當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療血管性癡呆優(yōu)于傳統(tǒng)補(bǔ)腎法治療[4]。有研究表明，當(dāng)歸補(bǔ)血湯對血管性癡呆有治療作用，但具體治療機(jī)制并無相關(guān)研究。本文采用改良后的頸總動脈單側(cè)永久性結(jié)扎法來造成大鼠血管性癡呆模型，通過Morris水迷宮實驗及大腦皮層組織內(nèi)抗氧化物質(zhì)及過氧化產(chǎn)物含量和活性的測定，客觀的研究當(dāng)歸補(bǔ)血湯對血管性癡呆的治療機(jī)制，以便為此方的臨床應(yīng)用提供實驗性依據(jù)。儀器和材料分類名稱批號生產(chǎn)廠家當(dāng)歸傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis（Oliv.）Diels的根藥品黃芪豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的根黃河藥市吡拉西坦膠囊190409陜西白鹿制藥股份有限公司丙二醛(MDA）測試盒20200321試劑SOD（超氧化物歧化酶）測試盒20200325南京建成生物工程研究所谷胱甘肽-過氧化物酶（GSH-PX）測試盒20200330儀器Morris水迷宮MT-200成都泰盟科技有限公司酶聯(lián)儀BenchmarkPlus美國伯樂公司動物健康成年雄性Wistar大鼠80只實驗動物使用許可證號：SYXK（甘）2015-0005，實驗動物質(zhì)量合格證許可證號：SCXK（甘）2015-002甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心2.方法2.1藥物制備及給藥當(dāng)歸補(bǔ)血湯水煎液：采用2015版《中華人民共和國藥典》與《內(nèi)外傷辯惑論》確定比例為當(dāng)歸:黃芪=1:5，根據(jù)人與動物體表面積折算給藥量[2]。陽性藥物：吡拉西坦膠囊用蒸餾水配成濃度為0.324g/kg[5]。根據(jù)水迷宮定位航行實驗結(jié)果篩選，造模成功的32只大鼠隨機(jī)分為四組，外加8只假手術(shù)組大鼠，給藥量如下圖所示：組別陽性組中劑量組高劑量組模型組假手術(shù)組劑量（g/kg/d）0.3243654等量生理鹽水等量生理鹽水每天稱重，調(diào)節(jié)給藥量，食水正常，連續(xù)給藥30天。2.2模型制備根據(jù)顧靜[5]等的研究進(jìn)行VD大鼠模型制備：術(shù)前12h禁水食，i.p.5%chloralhydrate麻醉后，腹腔注射2mg/kg的硝普鈉降壓，剃去頸部鼠毛，消毒，打開頸部手術(shù)區(qū)皮膚，分離出兩條頸動脈，同時夾持兩條頸動脈，10分鐘后松開夾持器，10分鐘后再次夾持，反復(fù)三次，最后一次結(jié)扎右側(cè)頸總動脈。假手術(shù)組進(jìn)行創(chuàng)傷性損傷不結(jié)扎頸總動脈，其余步驟同模型組。2.3Morris水迷宮實驗2.3.1模型篩選待術(shù)后8天，傷口愈合，食水正常后開始篩選。實驗前，將四個顏色形狀均不相同的標(biāo)記物分別貼于水迷宮水面以上內(nèi)壁四個象限，平臺在水面2～3厘米以下，水溫控制在18～22℃之間[6]，墨汁染色。實驗時將大鼠分別從非目的區(qū)域頭朝池壁放入，記錄模型大鼠在2分鐘內(nèi)找到平臺的時間，并要求其在平臺上停滯15秒。若大鼠不能在2分鐘內(nèi)找到平臺，引導(dǎo)其找到平臺，并停滯平臺15秒，時間按2分鐘記錄，讓其根據(jù)三個區(qū)域標(biāo)記物進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶，訓(xùn)練結(jié)束后立即取出并擦干，三個區(qū)域步驟相同。記錄找到平臺的時間數(shù)據(jù)，連續(xù)進(jìn)行五天，每天一次。五天試驗結(jié)束后，評價造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：（模型組大鼠找到平臺時間的均值的總和的均值）-（假手術(shù)組大鼠找到平臺時間的均值的總和的均值）/每只大鼠找到平臺的時間的平均值，若比值大于20％則判定為癡呆大鼠，造模成功[7]。2.3.2行為學(xué)檢測連續(xù)給藥30天，將模型組、假手術(shù)組、DGBXT高和中劑量組、以及Piracetam組大鼠再次進(jìn)行Morris水迷宮共三個區(qū)域的定位航行實驗，每天一次，不間斷地進(jìn)行5天，記錄每天各組大鼠找到平臺的時間。3.大腦皮層抗氧化指標(biāo)檢測大鼠i.p.10%chloralhydrate0.3ml/100g麻醉后，大鼠頭部置于冰袋上，取出海馬體將大腦皮層分為4份，分裝于凍存管，立即置于液氮冷凍，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?zhǔn)確稱取大鼠大腦皮層組織，按1：9的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，應(yīng)用酶促反應(yīng)、二硫代二硝基苯甲酸法和硫代巴比妥酸法，根據(jù)試劑盒操作的說明測定超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性，以及丙二醛含量。4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法5.結(jié)果5.1各組大鼠定位航行實驗結(jié)果潛伏期的長短可以非常直接地反映出各組大鼠，學(xué)習(xí)記憶能力的強(qiáng)弱。潛伏期越短說明大鼠學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)。在定位航行1-5d訓(xùn)練實驗中，模型組潛伏期顯著長于假手術(shù)組（P＜0.05）（表1），證明VD模型造模成功；與模型組比較第5d，Piracetam組、DGBXT高和中劑量組潛伏期顯著均低于模型組（P＜0.05或P＜0.01），證明各給藥組大鼠認(rèn)知學(xué)習(xí)記憶能力提高。與Piracetam組比較第5d，模型組與之有顯著性差異（P<0.01），說明陽性藥有治療效果，DGBXT高劑量與之比較潛伏期顯著降低，DGBXT中劑量組與之無統(tǒng)計學(xué)差異，說明療效近似。具體數(shù)據(jù)見表1，各組大鼠第五天實驗時的運動軌跡見圖1。表1Morris水迷宮定位航行找到平臺的時間結(jié)果(x±S，n=8)組別第1天第2天第3天第4天第5天假手術(shù)組13.52±6.11△△12.78±5.10△△14.00±4.06△△9.92±3.87△△8.41±3.15△△#模型組33.33±6.16**##32.24±4.60**##29.44±6.30**##27.89±4.88**##26.02±9.79**##高劑量17.83±5.85△△15.00±6.99△△12.67±7.35△△11.61±6.26△△9.89±8.59△△#中劑量20.83±7.24*##15.63±7.55△△12.52±5.93△△11.10±5.99△△11.83±8.00△△陽性12.13±5.45△△11.74±5.76△△10.00±4.92△△8.48±2.71△△14.00±5.26△△注：與假手術(shù)組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01，與陽性藥比較#P<0.05，##P<0.01假手術(shù)組模型組高劑量組中劑量組陽性組圖1.定位航行第五天各組大鼠運行軌跡圖5.2SOD、MDA和GSH-PX活性檢測與假手術(shù)組比較，模型組丙二醛含量顯著增高133.2%，超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性分別顯著降低8.1%和50.1%（P<0.01），說明VD模型大鼠抗氧化能力降低。與模型組比較，Piracetam組、DGBXT高、中劑量組的丙二醛含量分別下降20.5%、36.5%和38.4%；超氧化物歧化酶活性分別增強(qiáng)10.5%、14.4%和23.9%；超氧化物歧化酶活性分別顯著性增強(qiáng)133.5%、253.6%和169.7%（P<0.01）說明各給藥組均具有抗氧化作用。與Piracetam組比較，DGBXT中、高劑量兩組丙二醛含量降低22.5%和20.1%，超氧化物歧化酶活性增強(qiáng)3.5%和12.1%，谷胱甘肽過氧化物酶活性增強(qiáng)51.5%和15.5%，與之有差別，在統(tǒng)計學(xué)上存在意義（P<0.01），說明中藥療效好于陽性藥物。結(jié)果見表2，變化見圖3.表2當(dāng)歸補(bǔ)血湯對血管癡呆性大鼠腦皮質(zhì)MDA含量、SOD和GSH-Px活性的影響(x±S，n=8)組別劑量（g/Kg）MDA（nmol/mgprot）SOD（U/mgprot）GSH-Px（U/mgprot）假手術(shù)組—3.62±1.30△△##195.60±12.58△56.06±3.52△△##模型組—8.44±0.31**△△##179.70±6.90*##27.96±5.79**##高劑量組545.36±0.54**△△##205.54±17.77△△98.87±5.80**△△##中劑量組365.20±0.69**△△##222.71±15.34**△△##75.40±5.61**△△##陽性組0.3246.71±0.54**△△198.64±18.10△△65.28±4.56**△△注：與假手術(shù)組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01；與陽性藥物組比較#P<0.05，##P<0.016.討論隨著人口老齡化程度逐年加深及血管性疾病發(fā)病率的增高，血管性癡呆(VD)發(fā)病率也隨之升高。加強(qiáng)對VD疾病的深入研究，尋求更好的治療方法和藥物，具有重要的醫(yī)學(xué)影響和社會意義。西醫(yī)相對注重癥狀治療，提高認(rèn)知功能和管理水平，這主要是基于藥物管制。臨床經(jīng)驗表明，在短期內(nèi)取得良好療效是必要的，但是長期使用特別容易產(chǎn)生藥物依賴，病情還易復(fù)發(fā)，藥物產(chǎn)生的毒副作用對患者身體也會有傷害，患者及家屬依從性差，致使大部分患者在治療過程中由于藥物毒副作用而不得不間斷服藥，甚至停藥影響此類疾病的效果[8]。并且研究表明，西藥的單純治療只能使患者臨床癥狀得到改善，并不能使VD疾病得到本質(zhì)上的治療[9]。VD在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中表現(xiàn)特征為癡呆、傻笨和記憶力下降，被稱為“呆病”，屬于腎虛血瘀型疾病，其特點是本虛標(biāo)實，治療上通常注意滋陰養(yǎng)陽、活血化瘀、通絡(luò)解毒。近年來，中醫(yī)藥治療血管性癡呆已取得了一定療效，并逐漸成為了研究的熱點。黃芪具有補(bǔ)氣升陽、益衛(wèi)固表之功效，可以改善血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)，降低血腦屏障損傷程度，增強(qiáng)免疫功能[10]，當(dāng)歸可通過抑制MDA產(chǎn)生，提高GSH-PX的活性等抗氧化作用治療VD疾病[11]。VD疾病發(fā)生過程中，氧化應(yīng)激反應(yīng)起到重要作用[12]。大量氧自由的積累，會使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化加速，致使神經(jīng)元死亡及細(xì)胞膜損傷[13]。超氧化物歧化酶（SOD）在清除體內(nèi)過多的氧自由基方面起著很強(qiáng)的作用。谷胱甘肽通過谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）催化分解為氧化的谷胱甘肽，使毒性過氧化物轉(zhuǎn)化為無毒的羥基化合物，使自由基對組織和細(xì)胞膜的損傷減輕[14，15]。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，是評價氧化應(yīng)激常用指標(biāo)，對體內(nèi)氧自由基（Oxygen

Radical

，ROS）及氧化應(yīng)激（OxidativeStress，OS）程度評價具有非常的重要意義。DGBXT低劑量并未通過預(yù)實驗，故本實驗只采用DGBXT高、中劑量。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，DGBXT高、中劑量組治療后大鼠定位航行找到平臺的時間（潛伏期）顯著降低，丙二醛含量，超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著高于模型組，說明當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療血管性癡呆能夠通過增強(qiáng)SOD和GSH-PX活性，降低丙二醛含量，有效降低氧化應(yīng)激過氧化物丙二醛對腦組織的損傷，使VD大鼠認(rèn)知、學(xué)習(xí)和記憶能力得到改善。為臨床應(yīng)用治療VD疾病，及VD新藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。參考文獻(xiàn)[1]趙見文,王志勇,閆國強(qiáng),等.血管性癡呆中醫(yī)藥實驗研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2015,17(11):128-130.[2]BennyA,ThomasJ.Essential0ilsasTreatmentStrategyforAlzheimer'sDisease:CurrentandFuturePerspectives[J].PlantaMed,2018,85(3):239-248[3]高曉蘭,朱增強(qiáng),陳彥文,等.當(dāng)歸補(bǔ)血湯加味對血管性癡呆大鼠的腦保護(hù)作用研究[J].西部中醫(yī)藥,2013,26(04):22-25.[4]趙歡,楊東東,郭強(qiáng),等.基于“精-血-髓一體論”觀察當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療血管性癡呆臨床研究[J].陜西中醫(yī)2016,37(10):1314-1315.[5]顧靜,李海龍,楊長生,等.血管性癡呆大鼠模型制作方法的改良[J].中國實驗動物學(xué)報,2015,23(06):634-638.[6]趙瑛,高偉瑩,余群星,等.基于Morris水迷宮的小鼠學(xué)習(xí)記憶規(guī)律研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2020,36(02):131-136+141.[7]張杰,馬云枝,沈曉明,等.復(fù)智膠囊對血管性癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力改善的作用機(jī)制[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2014,20(02):128-132.[8]于箏,周東升.補(bǔ)腎益智方聯(lián)合多奈哌齊片治療阿爾茨海默病的療效及對Aβ、GSH-Px、SOD及MDA的影響[J].廣東醫(yī)學(xué),2019,40(12):1798-1802.[9]YokoShigemoto,DaichiSone,NorihideMaikusa,NobuyukiOkamura,ShozoFurumoto,YukitsukaKudo,MasayoOgawa,HarumasaTakano,YumaYokoi,MasuhiroSakata,TadashiTsukamoto,KoichiKato,NorikoSato,HiroshiMatsuda.Associationofdepositionoftauandamyloid‐βproteinswithstructuralconnectivitychangesincognitivelynormalolderadultsandAlzheimer’sdiseasespectrumpatients[J].BrainandBehavior,2018,8(12).[10]AndreaTumminia,FedericaVinciguerra,MiriamParisi,LuciaFrittitta.Type2Diabetes