免疫學(xué)抗體實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程###一、概述

免疫學(xué)抗體實(shí)驗(yàn)是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中常用的技術(shù)手段，主要用于檢測、分離或純化特定抗原或抗體。本規(guī)程旨在提供標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作流程，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)操作包括抗體制備、純化、滴度測定、WesternBlotting、ELISA等核心步驟。

###二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

在進(jìn)行抗體實(shí)驗(yàn)前，需確保所有設(shè)備和試劑準(zhǔn)備齊全，并符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

####（一）試劑與材料

1.抗體（一抗、二抗等）

2.磷酸緩沖鹽溶液（PBS）

3.Tris-HCl緩沖液

4.乙二胺四乙酸（EDTA）

5.甘油

6.SDS凝膠電泳試劑

7.蛋白質(zhì)Marker

8.化學(xué)發(fā)光底物（如ECL）

9.封閉液和封閉劑（如BSA、脫脂奶粉）

10.酶標(biāo)板

####（二）儀器設(shè)備

1.超凈工作臺

2.低溫離心機(jī)

3.酶標(biāo)儀

4.電泳儀

5.熒光顯微鏡

6.pH計

####（三）實(shí)驗(yàn)環(huán)境

1.保持實(shí)驗(yàn)區(qū)域清潔，避免污染。

2.所有操作需在無菌條件下進(jìn)行。

3.試劑需提前平衡至室溫。

###三、抗體制備與純化

抗體制備包括樣品采集、提取和純化等步驟。

####（一）樣品采集

1.根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適生物樣本（如血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)液）。

2.樣本采集后立即處理，避免降解。

####（二）抗體提取

1.離心樣本，去除細(xì)胞碎片。

2.使用適當(dāng)溶劑（如PBS或緩沖液）洗滌樣本。

3.通過蛋白質(zhì)A/G磁珠或親和層析柱富集抗體。

####（三）抗體純化

1.**親和層析純化**：

(1)將含抗體的樣品上樣至層析柱。

(2)用緩沖液洗脫非特異性結(jié)合蛋白。

(3)用低濃度緩沖液（如低鹽PBS）洗脫目標(biāo)抗體。

2.**離子交換層析**：

(1)調(diào)整抗體pH值至適合離子交換的范圍內(nèi)。

(2)上樣至層析柱，用梯度洗脫分離抗體。

###四、抗體滴度測定

抗體滴度測定用于確定抗體的工作濃度。

####（一）間接ELISA法

1.**包被**：

(1)將抗原包被于酶標(biāo)板，4℃過夜。

(2)洗滌酶標(biāo)板，去除未結(jié)合抗原。

2.**封閉**：

(1)加入封閉液，37℃封閉1小時。

(2)洗滌酶標(biāo)板。

3.**加樣**：

(1)加入不同濃度的抗體，37℃孵育1小時。

(2)洗滌酶標(biāo)板。

4.**顯色**：

(1)加入二抗，37℃孵育1小時。

(2)加入TMB底物，酶標(biāo)儀檢測吸光度值（OD值）。

5.**計算滴度**：

(1)以O(shè)D值達(dá)到1.0時的抗體濃度為工作濃度。

####（二）WesternBlotting法

1.**制備SDS凝膠**：

(1)稱取凝膠粉，加入去離子水配制。

(2)調(diào)整pH值，澆注凝膠。

2.**電泳**：

(1)將樣品上樣至凝膠，通電電泳。

(2)觀察條帶分離情況。

3.**轉(zhuǎn)膜**：

(1)將凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜。

(2)檢查轉(zhuǎn)膜效果。

4.**封閉**：

(1)加入封閉液，室溫封閉1小時。

(2)洗膜。

5.**孵育一抗**：

(1)加入稀釋后的一抗，4℃過夜。

(2)洗膜。

6.**孵育二抗**：

(1)加入稀釋后的二抗，室溫孵育1小時。

(2)洗膜。

7.**顯影**：

(1)加入化學(xué)發(fā)光底物，曝光成像。

(2)計算抗體工作濃度。

###五、注意事項(xiàng)

1.所有試劑需現(xiàn)配現(xiàn)用或按說明書保存。

2.操作過程中避免交叉污染，建議使用一次性吸頭和槍頭。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，設(shè)備需徹底清潔和消毒。

4.數(shù)據(jù)記錄需完整，包括實(shí)驗(yàn)條件、試劑濃度、結(jié)果等。

###六、結(jié)果分析

1.**ELISA法**：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算抗體效價（單位/mL）。

2.**WesternBlotting法**：根據(jù)條帶亮度評估抗體特異性。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果需與預(yù)期對比，若不符合預(yù)期需重新優(yōu)化條件。

###七、附錄

1.常用抗體儲存條件：-20℃避光保存。

2.常用緩沖液配方表。

3.儀器操作手冊鏈接（如有）。

###一、概述（擴(kuò)寫）

免疫學(xué)抗體實(shí)驗(yàn)是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中常用的技術(shù)手段，主要用于檢測、分離或純化特定抗原或抗體。本規(guī)程旨在提供標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作流程，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)操作包括抗體制備、純化、滴度測定、WesternBlotting、ELISA等核心步驟。本規(guī)程詳細(xì)闡述了每個步驟的具體操作方法、所需試劑與材料、儀器設(shè)備、關(guān)鍵參數(shù)及注意事項(xiàng)，以指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)人員規(guī)范操作。通過遵循本規(guī)程，可以有效減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高抗體實(shí)驗(yàn)的成功率?？贵w作為免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵分子，在疾病診斷、藥物研發(fā)、細(xì)胞功能研究等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值。因此，掌握規(guī)范的抗體實(shí)驗(yàn)操作至關(guān)重要。

###二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（擴(kuò)寫）

在進(jìn)行抗體實(shí)驗(yàn)前，需確保所有設(shè)備和試劑準(zhǔn)備齊全，并符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。充分的準(zhǔn)備是保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的基礎(chǔ)。

####（一）試劑與材料（擴(kuò)寫）

1.**抗體**：

(1)**一抗**：即直接針對目標(biāo)抗原的抗體，可以是多克隆抗體或單克隆抗體。需確認(rèn)抗體的宿主來源（如兔抗人、鼠抗鼠）和特異性信息（如靶標(biāo)氨基酸序列、免疫原）。

(2)**二抗**：即能與第一抗體結(jié)合的抗體，用于放大信號。常見類型包括羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG等，需根據(jù)一抗的宿主來源選擇。二抗需標(biāo)記酶（如辣根過氧化物酶HRP、堿性磷酸酶AP）或熒光基團(tuán)（如異硫氰酸熒光素FITC、藻紅蛋白PE）。

(3)**抗體檢測用抗體**：如需在WesternBlotting或流式細(xì)胞術(shù)中使用抗體，需提前確認(rèn)其性能指標(biāo)（如克隆性、交叉反應(yīng)性）。

2.**緩沖液**：

(1)**磷酸緩沖鹽溶液（PBS）**：常用pH7.4PBS，需使用無離子水配制，并經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。用于洗滌、稀釋和封閉。

(2)**Tris-HCl緩沖液**：常用pH7.5-8.0Tris-HCl，同樣需過濾除菌，用于某些酶促反應(yīng)或電泳緩沖液。

(3)**含EDTA的緩沖液**：用于螯合金屬離子，防止某些酶的活性，或在特定層析過程中使用。

3.**電泳與轉(zhuǎn)膜相關(guān)試劑**：

(1)**SDS凝膠電泳試劑**：包括凝膠粉（丙烯酰胺和交聯(lián)劑）、分離膠和濃縮膠配方、電泳緩沖液（含甘氨酸和Tris）。需精確稱量并按順序加入，避免產(chǎn)生氣泡。

(2)**蛋白質(zhì)Marker**：用于判斷蛋白質(zhì)分子量大小，選擇合適范圍的Marker（如5-200kDa）。

(3)**轉(zhuǎn)膜膜**：PVDF膜或NC膜，需預(yù)處理（如PVDF膜用甲醇激活）以提高結(jié)合效率。

(4)**轉(zhuǎn)膜緩沖液**：含甘氨酸、Tris和SDS的溶液，SDS需在轉(zhuǎn)膜前去除以防止條帶彌散。

4.**封閉液和封閉劑**：

(1)**封閉液**：常用含0.05%吐溫-20的PBS或TBS，用于洗滌。

(2)**封閉劑**：

-**牛血清白蛋白（BSA）**：濃度通常為1%-5%，非特異性結(jié)合能力強(qiáng)。

-**脫脂奶粉（如脫脂奶粉粉）**：濃度通常為5%-10%，成本較低，封閉效果良好。

-**酪蛋白**：可作為替代封閉劑，濃度類似BSA。

5.**其他試劑**：

(1)**甘油**：用于WesternBlotting結(jié)果固定時增加膜密度。

(2)**化學(xué)發(fā)光底物（如ECL）**：用于WesternBlotting信號檢測，需新鮮配制或分裝保存。

(3)**酶標(biāo)板**：用于ELISA實(shí)驗(yàn)，需使用可密封的板封膜。

(4)**TMB底物**：用于ELISA化學(xué)發(fā)光檢測，需避光保存。

6.**保存液**：

(1)**抗體保存液**：常用含0.01%NaN3的PBS或含穩(wěn)定劑（如蔗糖、甘露醇）的溶液，用于長期保存抗體（-20℃或-80℃）。

(2)**封閉液/洗滌液保存液**：含防腐劑（如NaN3）的緩沖液，用于長期保存封閉液或洗滌液。

####（二）儀器設(shè)備（擴(kuò)寫）

1.**超凈工作臺**：用于無菌操作，需定期進(jìn)行空間滅菌（如紫外燈照射、過氧化氫等離子體）。操作前需啟動凈化系統(tǒng)，確認(rèn)風(fēng)速和過濾效果。

2.**低溫離心機(jī)**：用于樣品分離，需根據(jù)轉(zhuǎn)速選擇合適的離心管和轉(zhuǎn)子。常用轉(zhuǎn)速范圍及對應(yīng)的離心力（相對離心力RCF）需明確。

3.**酶標(biāo)儀**：用于ELISA信號定量，需定期校準(zhǔn)，確保讀數(shù)準(zhǔn)確。常用波長范圍（如450nm、600nm濾光片）。

4.**電泳儀**：用于SDS，需配備電壓調(diào)節(jié)器，避免電壓過高導(dǎo)致凝膠過熱或樣品降解。

5.**電轉(zhuǎn)移槽（濕轉(zhuǎn)/半干轉(zhuǎn)）**：用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜，濕轉(zhuǎn)需確保電泳緩沖液足量且電導(dǎo)率合適（使用電導(dǎo)率儀檢測）。

6.**熒光顯微鏡**：用于觀察熒光標(biāo)記的樣品，需配備相應(yīng)波長的濾光片組。

7.**pH計**：用于精確測量緩沖液pH值，校準(zhǔn)周期需符合實(shí)驗(yàn)室要求。

8.**水浴鍋/恒溫?fù)u床**：用于抗體孵育等步驟，需設(shè)置并驗(yàn)證溫度控制精度。

9.**磁力攪拌器/渦旋混合器**：用于試劑混勻，選擇合適的攪拌強(qiáng)度，避免產(chǎn)生氣泡或剪切樣品。

10.**移液器**：需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的量程和精度，使用前需校準(zhǔn)，并采用正確的操作手法（如設(shè)置刻度、垂直吸放液）。

####（三）實(shí)驗(yàn)環(huán)境（擴(kuò)寫）

1.**環(huán)境清潔**：實(shí)驗(yàn)區(qū)域需每日清潔消毒，操作臺面使用70%-75%乙醇擦拭。

2.**無菌操作**：所有涉及抗體提取、純化的步驟需在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，操作前需穿戴潔凈工作服、口罩和手套。

3.**試劑平衡**：所有試劑（特別是緩沖液、抗體）需在實(shí)驗(yàn)前平衡至室溫（除非有特殊說明），避免溫差導(dǎo)致沉淀或濃度變化。

4.**光照保護(hù)**：對光敏感的試劑（如某些酶、熒光染料）需使用棕色瓶儲存，并在避光條件下操作。

5.**溫度控制**：需根據(jù)試劑要求將樣品、試劑和儀器設(shè)備置于合適的環(huán)境中（如4℃冰箱、-20℃/-80℃冰箱、水浴鍋等），并定期檢查溫度記錄。

###三、抗體制備與純化（擴(kuò)寫）

抗體制備包括樣品采集、提取和純化等步驟。根據(jù)來源不同，抗體制備方法有所差異，需根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計選擇合適的方法。

####（一）樣品采集（擴(kuò)寫）

1.**生物樣本選擇**：

(1)**血清/血漿**：通常用于多克隆抗體的制備，采集后需靜置、離心分離，去除細(xì)胞碎片。血漿（抗凝后）也可使用，但需注意抗凝劑可能干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(2)**細(xì)胞培養(yǎng)上清**：對于表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞，收集培養(yǎng)上清可用于抗體提取。需在細(xì)胞生長旺盛期收獲上清，并過濾除菌（0.22μm濾膜）。

(3)**組織樣本**：動物或植物組織可用于提取天然抗體，需快速解剖、冰凍保存。提取前需用預(yù)冷PBS沖洗組織，去除血液。

2.**樣本處理**：

(1)**血清/血漿**：4℃離心（3000-5000rpm，10分鐘），取上清。若抗體濃度高，可考慮直接使用；若濃度低，需進(jìn)一步純化。

(2)**細(xì)胞上清**：直接過濾除菌，即可用于部分純化步驟（如親和層析）。

(3)**組織樣本**：

-**勻漿**：使用冰浴預(yù)冷的勻漿器（如Dounce勻漿器）或機(jī)械破碎設(shè)備（如超聲波破碎儀）進(jìn)行組織勻漿，加入冰冷的緩沖液（如PBS或裂解緩沖液）助裂解。

-**離心**：4℃離心（4000-8000rpm，20分鐘），取上清。若仍有沉淀，需重新勻漿并離心。

####（二）抗體提?。〝U(kuò)寫）

1.**直接提取（適用于高濃度樣品）**：

(1)將處理好的樣品上樣至預(yù)先平衡好的親和層析柱（如蛋白A/G磁珠或?qū)游鼋橘|(zhì)）。平衡柱時需使用低離子強(qiáng)度的緩沖液（如低鹽PBS）。

(2)讓樣品緩慢流過層析柱，抗體會特異性結(jié)合到層析介質(zhì)上。未結(jié)合物質(zhì)隨緩沖液流出。

(3)用低鹽緩沖液洗滌層析柱，去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。

2.**粗提（適用于低濃度樣品）**：

(1)**鹽析**：向樣品中逐漸加入硫酸銨或氯化鈉，使抗體沉淀。需逐步增加鹽濃度，并在每次加鹽后離心收集沉淀。通過梯度鹽析可分離不同類型的抗體。

(2)**有機(jī)溶劑沉淀**：加入預(yù)冷乙醇或異丙醇（如乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)30%-50%），4℃孵育過夜，離心收集沉淀。需注意有機(jī)溶劑的終濃度不能過高，以免破壞抗體結(jié)構(gòu)。

####（三）抗體純化（擴(kuò)寫）

1.**親和層析純化（最常用）**：

(1)**柱平衡**：

-將層析介質(zhì)（如蛋白A/G磁珠或預(yù)裝柱）用平衡緩沖液（如含0.05MTris-HClpH7.5,0.5MNaCl,0.05%NaN3的緩沖液）洗滌至基線穩(wěn)定。

-若為磁珠，需在磁力吸附后用少量平衡緩沖液潤洗。

(2)**上樣**：

-將粗提的抗體樣品（稀釋至適當(dāng)濃度，避免過高濃度導(dǎo)致堵塞）緩慢上樣至平衡好的層析柱。上樣體積通常不超過柱體積的10%-20%。

-若樣品體積大，可分批次上樣，每次上樣后需重新平衡柱。

(3)**洗滌**：

-用低鹽平衡緩沖液（如0.05MTris-HClpH7.5,0.05%NaN3）洗滌柱子2-3次，流速不宜過快，以充分去除非特異性結(jié)合物質(zhì)。監(jiān)測流出液OD280值，確保無蛋白流出。

(4)**洗脫**：

-**低pH洗脫**：將pH值調(diào)至抗體等電點(diǎn)附近（如用含0.1M甘氨酸pH2.5-3.0的緩沖液），抗體會從介質(zhì)上解離下來。收集洗脫液，流速不宜過快。

-**高鹽洗脫**：逐步提高緩沖液中的鹽濃度（如用含1MNaCl的平衡緩沖液），抗體會因鹽濃度梯度解離。

-**咪唑洗脫（蛋白A/G磁珠）**：加入咪唑溶液（如0.1-1.0M咪唑），咪唑會競爭結(jié)合抗原，使抗體釋放。需監(jiān)測洗脫液OD280值，收集主峰。

(5)**收集與儲存**：

-將洗脫液通過0.22μm濾膜過濾除菌，分裝后于-20℃或-80℃保存。每支抗體需標(biāo)注濃度、純度、制備日期等信息。

2.**離子交換層析**：

(1)**柱平衡**：使用與離子交換基團(tuán)類型（陽離子或陰離子）相反電荷的緩沖液平衡層析柱。例如，對于陽離子交換介質(zhì)，使用低鹽緩沖液（如20mMTris-HClpH7.5）。

(2)**上樣**：將樣品上樣至平衡好的柱子，上樣體積和流速同親和層析。

(3)**洗滌**：用平衡緩沖液洗滌柱子，去除未結(jié)合物質(zhì)。

(4)**梯度洗脫**：

-**陽離子交換**：逐漸增加緩沖液中的鹽濃度（如從0M到1MNaCl），帶正電荷的抗體會隨鹽濃度升高而先后解離。

-**陰離子交換**：逐漸降低緩沖液pH值或增加鹽濃度，帶負(fù)電荷的抗體會解離。

-收集各組分，通過OD280檢測主峰，并可通過蛋白印跡（Blot）檢測目標(biāo)抗體。

(5)**收集與儲存**：同親和層析。

###四、抗體滴度測定（擴(kuò)寫）

抗體滴度測定用于確定抗體的工作濃度，是保證實(shí)驗(yàn)效果的關(guān)鍵步驟。常用方法包括間接ELISA法和WesternBlotting法。

####（一）間接ELISA法（擴(kuò)寫）

1.**包被**：

(1)**試劑準(zhǔn)備**：

-包被緩沖液：常用pH9.6碳酸鹽緩沖液（含0.05MNa2CO3,0.02MNaHCO3,0.05%NaN3）。

-封閉緩沖液：常用含5%脫脂奶粉或BSA的PBS-T（含0.05%吐溫-20）。

-二抗及底物：根據(jù)一抗類型選擇合適的HRP或AP標(biāo)記二抗，及對應(yīng)的TMB或ECL底物。

(2)**包被操作**：

-將稀釋后的一抗（如用包被緩沖液稀釋至1-10μg/mL）加入已預(yù)處理的酶標(biāo)板孔中（每孔100-200μL），4℃過夜包被。

-若抗體在室溫下包被效果更好，可改為室溫孵育2-4小時。

-包被后用包被緩沖液洗滌板孔3次，每次洗滌后需吸干或拍干（避免殘留水分影響后續(xù)步驟）。

2.**封閉**：

(1)**試劑準(zhǔn)備**：封閉緩沖液。

(2)**封閉操作**：

-加入封閉緩沖液（每孔200-300μL），室溫孵育1-2小時，或4℃過夜。封閉作用是阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。

-封閉后用封閉緩沖液洗滌板孔3-4次。

3.**加樣**：

(1)**試劑準(zhǔn)備**：用封閉緩沖液或PBS將二抗稀釋至適當(dāng)濃度（通常為1:1000-1:5000，需預(yù)先優(yōu)化）。

(2)**加樣操作**：

-加入稀釋后的二抗（每孔100-200μL），室溫孵育1小時。

-若抗體在室溫下孵育效果更好，可改為4℃孵育過夜。

-孵育后用洗滌緩沖液（如PBS-T）洗滌板孔5次。

4.**顯色**：

(1)**TMB顯色**：

-加入TMB底物工作液（按說明書比例新鮮混合H2O2和TMB溶液），避光室溫孵育10-30分鐘。

-觀察顏色變化（藍(lán)→黃），顏色深淺與抗體濃度成正比。

-加入終止液（如2MH2SO4，每孔50-100μL），終止反應(yīng)，顏色由黃變紅。

(2)**ECL顯色**：

-加入ECL底物（每孔100-200μL），避光室溫孵育5-15分鐘。

-立即使用酶標(biāo)儀或化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測信號強(qiáng)度。

5.**結(jié)果計算**：

(1)**繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線**：以不同稀釋倍數(shù)的抗體樣品的OD值（TMB法）或相對光單位（RLU，ECL法）為縱坐標(biāo)，抗體稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)**確定工作濃度**：選擇能使OD值在酶標(biāo)儀檢測線性范圍內(nèi)（如0.1-1.0）的抗體稀釋倍數(shù)，計算原抗體溶液的濃度（如ng/mL或μg/mL）。工作濃度通常選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率較大的稀釋度，以提高檢測靈敏度。

####（二）WesternBlotting法（擴(kuò)寫）

1.**樣品制備與電泳**：

(1)**樣品收集與變性**：收集細(xì)胞或組織樣品，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液（含β-巰基乙醇或DTT），100℃煮沸5分鐘使蛋白質(zhì)變性。

(2)**上樣與電泳**：

-將樣品與上樣緩沖液混合均勻，加入LoadingBuffer（如甘油、溴酚藍(lán)），上樣至SDS凝膠（根據(jù)蛋白分子量選擇凝膠濃度，如12%-20%）。

-連接電泳儀，設(shè)置電壓（預(yù)電泳濃縮膠80V，分離膠120V），進(jìn)行電泳。觀察溴酚藍(lán)遷移情況，確保電泳時間合適。

3.**轉(zhuǎn)膜**：

(1)**轉(zhuǎn)膜準(zhǔn)備**：

-將PVDF膜或NC膜用甲醇浸泡1分鐘，再用含0.05%SDS的轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡15分鐘（PVDF膜預(yù)處理）。

-將膜置于轉(zhuǎn)膜裝置中，順序?yàn)椋簽V紙（濕）→PVDF膜（有標(biāo)記面朝下）→硫酸氨基甲酯墊（可選）→濾紙（濕）。

(2)**轉(zhuǎn)膜操作**：

-加入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液，確保膜和墊圈完全浸沒。

-連接電泳儀，設(shè)置參數(shù)（如12V，1-2小時），進(jìn)行半干或濕轉(zhuǎn)。濕轉(zhuǎn)時需確保緩沖液足量且電導(dǎo)率合適（>0.4mS/cm）。

-轉(zhuǎn)膜后用轉(zhuǎn)膜緩沖液漂洗膜，用筆標(biāo)記膜面。

4.**封閉**：

(1)**封閉緩沖液**：常用含5%脫脂奶粉或BSA的TBST（含0.05%吐溫-20）。

(2)**封閉操作**：

-將膜置于封閉緩沖液中，室溫孵育1-2小時，或4℃過夜。封閉作用是阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。

-封閉后用TBST洗滌膜3-4次，每次5-10分鐘。

5.**孵育一抗**：

(1)**一抗稀釋**：根據(jù)抗體說明書和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用封閉緩沖液稀釋一抗至合適濃度（如1:1000-1:5000）。

(2)**孵育操作**：

-將膜置于含一抗的封閉緩沖液中，4℃孵育過夜，或室溫孵育1-2小時（需預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳條件）。

-孵育后用TBST洗滌膜3-4次，每次5-10分鐘。

6.**孵育二抗**：

(1)**二抗稀釋**：根據(jù)一抗類型和說明書，用封閉緩沖液稀釋HRP或AP標(biāo)記的二抗至合適濃度（如1:5000-1:10000）。

(2)**孵育操作**：

-將膜置于含二抗的TBST緩沖液中，室溫孵育1小時，或4℃孵育過夜。

-孵育后用TBST洗滌膜3-4次，每次5-10分鐘。

7.**顯影**：

(1)**HRP標(biāo)記二抗**：

-加入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL或LumiGLO），避光孵育1-5分鐘。

-立即使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測信號，或按需曝光X光片。

(2)**AP標(biāo)記二抗**：

-加入顯色液（如5-Bromo-4-Chloro-3-IndolylPhosphate,BCIP/NBT），室溫避光孵育10-30分鐘。

-觀察顏色變化（藍(lán)紫色），顏色深淺與抗體濃度成正比。

8.**結(jié)果分析**：

(1)**條帶強(qiáng)度**：通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)獲取圖像，或用ImageJ等軟件分析條帶灰度值。

(2)**滴度確定**：選擇信號清晰、背景干擾小的條帶，計算不同稀釋度抗體對應(yīng)的信號強(qiáng)度。選擇能使信號強(qiáng)度達(dá)到特定閾值（如背景的2-3倍）的抗體稀釋倍數(shù)，即為工作濃度。

###五、注意事項(xiàng)（擴(kuò)寫）

1.**試劑質(zhì)量**：所有抗體和試劑需從可靠供應(yīng)商購買，并檢查保質(zhì)期。使用前需核對儲存條件，確保未變質(zhì)。

2.**無菌操作**：所有涉及抗體提取、純化的步驟需在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，避免微生物污染。使用無菌吸頭、槍頭和耗材。

3.**溫度控制**：嚴(yán)格按規(guī)程控制各步驟的溫度，特別是抗體孵育、電泳和轉(zhuǎn)膜等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。使用水浴鍋或恒溫?fù)u床時需驗(yàn)證溫度準(zhǔn)確性。

4.**抗體稀釋**：稀釋抗體時需使用精確的移液器，并確?；靹?。抗體工作濃度需通過預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，避免過高或過低導(dǎo)致信號飽和或檢測不到。

5.**緩沖液平衡**：所有緩沖液需在使用前平衡至室溫，特別是用于層析和包被的緩沖液。避免溫差導(dǎo)致沉淀或濃度變化。

6.**酶標(biāo)板處理**：ELISA實(shí)驗(yàn)中，酶標(biāo)板需用封膜膜封口，避免蒸發(fā)導(dǎo)致結(jié)果偏差。洗滌時需充分吸干或拍干，避免殘留水分。

7.**化學(xué)發(fā)光底物**：ECL底物需新鮮配制或分裝保存，避免反復(fù)凍融。檢測時需在信號衰減前完成，并使用一次性墊圈防止污染。

8.**安全防護(hù)**：操作中需佩戴手套、護(hù)目鏡，避免試劑接觸皮膚和眼睛。處理有毒試劑（如甲醛、甲醇）需在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。

9.**結(jié)果驗(yàn)證**：抗體滴度確定后，需在正式實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證其效果，確?？贵w性能符合要求?？赏ㄟ^重復(fù)實(shí)驗(yàn)或與其他抗體比較來確認(rèn)。

10.**記錄完整**：詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)條件、試劑濃度、操作步驟和結(jié)果，便于結(jié)果分析和問題排查。

###六、結(jié)果分析（擴(kuò)寫）

1.**間接ELISA法**：

(1)**標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制**：以抗體稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，OD值（或RLU）為縱坐標(biāo)，繪制線性回歸曲線。計算曲線斜率和R2值，評估線性關(guān)系。

(2)**工作濃度確定**：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求（如檢測靈敏度、線性范圍）選擇合適的抗體工作濃度。通常選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率較大的稀釋度，以提高檢測靈敏度。

(3)**結(jié)果判斷**：若OD值在酶標(biāo)儀檢測線性范圍內(nèi)，則可據(jù)此計算抗體濃度。若OD值過高或過低，需重新優(yōu)化抗體稀釋倍數(shù)或檢測條件。

2.**WesternBlotting法**：

(1)**條帶分析**：通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)獲取圖像，或用ImageJ等軟件進(jìn)行定量分析。重點(diǎn)關(guān)注目標(biāo)蛋白條帶的強(qiáng)度和特異性。

(2)**信號強(qiáng)度**：使用軟件測量條帶灰度值，或通過densitometry進(jìn)行定量。比較不同實(shí)驗(yàn)組或稀釋度下的信號強(qiáng)度，評估抗體效果。

(3)**特異性驗(yàn)證**：通過以下方法驗(yàn)證抗體特異性：

-**陰性對照**：設(shè)置不加一抗或用非特異性抗體孵育的對照，確保信號來自目標(biāo)蛋白。

-**蛋白印跡（Blot）**：在相同的凝膠上加載已知蛋白Marker或?qū)φ盏鞍?，確保抗體識別特異性目標(biāo)。

-**抗體競爭實(shí)驗(yàn)**：用過量純化的目標(biāo)抗原預(yù)孵育一抗，若信號減弱或消失，證明抗體特異性。

(4)**滴度確定**：選擇信號清晰、背景干擾小的條帶，計算不同稀釋度抗體對應(yīng)的信號強(qiáng)度。選擇能使信號強(qiáng)度達(dá)到特定閾值（如背景的2-3倍）的抗體稀釋倍數(shù)，即為工作濃度。

###七、附錄（擴(kuò)寫）

1.**常用抗體儲存條件**：

-**即用型抗體**：4℃保存，使用前無需稀釋（如ELISA二抗）。

-**預(yù)稀釋抗體**：4℃保存，使用前按說明書稀釋至工作濃度。

-**原液抗體**：

-**未標(biāo)記抗體**：-20℃或-80℃保存。含NaN3（0.01%-0.05%）可抑制細(xì)菌生長。

-**HRP/AP標(biāo)記抗體**：-20℃或-80℃保存。含穩(wěn)定劑（如甘油、蔗糖）和NaN3。

-**抗體工作液**：含NaN3的封閉液或PBS，-20℃或-80℃保存，可分裝凍存。

2.**常用緩沖液配方表**：

|緩沖液名稱|配方（1L）|pH值|用途|

|||||

|**PBS(pH7.4)**|NaCl137mM,KCl2.7mM,Na2HPO410mM,KH2PO41.4mM|7.4|包被、洗滌、封閉|

|**TBS(pH7.6)**|Tris50mM,NaCl150mM|7.6|洗滌、封閉|

|**2×SDS上樣緩沖液**|Tris-HCl0.6M(pH6.8),SDS2%,甘油20%,BromophenolBlue0.01%,DTT0.025M|6.8|WesternBlotting上樣|

|**轉(zhuǎn)膜緩沖液**|Tris25mM,Glycine192mM,SDS0.1%|8.3|WesternBlotting轉(zhuǎn)膜|

|**封閉緩沖液**|TBST或PBS-T+5%脫脂奶粉或BSA|7.4-7.6|WesternBlotting封閉|

|**ELISA洗滌緩沖液**|PBS-T(含0.05%吐溫-20)|7.4|ELISA洗滌|

|**ECL底物工作液**|H2O2和TMB溶液按說明書比例混合（新鮮配制）|-|WesternBlotting顯影|

3.**儀器操作手冊鏈接（示例）**：

-**酶標(biāo)儀**：[BrandAELISAReaderManual](/manual/A)

-**電泳儀**：[BrandBSDSSystemManual](/manual/B)

-**化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)**：[BrandCImagingSystemManual](/manual/C)

4.**抗體性能指標(biāo)**：

-**特異性**：通過WesternBlotting或ELISA檢測，確?？贵w僅識別目標(biāo)抗原，無交叉反應(yīng)?？赏ㄟ^競爭實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

-**效價**：指能產(chǎn)生特定信號所需的最低抗體濃度，通常以ng/mL或μg/mL表示。可通過ELISA或WesternBlotting測定。

-**純度**：通常通過SDS或蛋白印跡檢測，高純度抗體（>90%）適用于敏感檢測。

-**宿主來源**：如兔、鼠、羊等，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計選擇合適的抗體。

（注：以上鏈接為示例，實(shí)際使用時需替換為真實(shí)鏈接或刪除）

###一、概述

免疫學(xué)抗體實(shí)驗(yàn)是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中常用的技術(shù)手段，主要用于檢測、分離或純化特定抗原或抗體。本規(guī)程旨在提供標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作流程，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)操作包括抗體制備、純化、滴度測定、WesternBlotting、ELISA等核心步驟。

###二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

在進(jìn)行抗體實(shí)驗(yàn)前，需確保所有設(shè)備和試劑準(zhǔn)備齊全，并符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

####（一）試劑與材料

1.抗體（一抗、二抗等）

2.磷酸緩沖鹽溶液（PBS）

3.Tris-HCl緩沖液

4.乙二胺四乙酸（EDTA）

5.甘油

6.SDS凝膠電泳試劑

7.蛋白質(zhì)Marker

8.化學(xué)發(fā)光底物（如ECL）

9.封閉液和封閉劑（如BSA、脫脂奶粉）

10.酶標(biāo)板

####（二）儀器設(shè)備

1.超凈工作臺

2.低溫離心機(jī)

3.酶標(biāo)儀

4.電泳儀

5.熒光顯微鏡

6.pH計

####（三）實(shí)驗(yàn)環(huán)境

1.保持實(shí)驗(yàn)區(qū)域清潔，避免污染。

2.所有操作需在無菌條件下進(jìn)行。

3.試劑需提前平衡至室溫。

###三、抗體制備與純化

抗體制備包括樣品采集、提取和純化等步驟。

####（一）樣品采集

1.根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適生物樣本（如血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)液）。

2.樣本采集后立即處理，避免降解。

####（二）抗體提取

1.離心樣本，去除細(xì)胞碎片。

2.使用適當(dāng)溶劑（如PBS或緩沖液）洗滌樣本。

3.通過蛋白質(zhì)A/G磁珠或親和層析柱富集抗體。

####（三）抗體純化

1.**親和層析純化**：

(1)將含抗體的樣品上樣至層析柱。

(2)用緩沖液洗脫非特異性結(jié)合蛋白。

(3)用低濃度緩沖液（如低鹽PBS）洗脫目標(biāo)抗體。

2.**離子交換層析**：

(1)調(diào)整抗體pH值至適合離子交換的范圍內(nèi)。

(2)上樣至層析柱，用梯度洗脫分離抗體。

###四、抗體滴度測定

抗體滴度測定用于確定抗體的工作濃度。

####（一）間接ELISA法

1.**包被**：

(1)將抗原包被于酶標(biāo)板，4℃過夜。

(2)洗滌酶標(biāo)板，去除未結(jié)合抗原。

2.**封閉**：

(1)加入封閉液，37℃封閉1小時。

(2)洗滌酶標(biāo)板。

3.**加樣**：

(1)加入不同濃度的抗體，37℃孵育1小時。

(2)洗滌酶標(biāo)板。

4.**顯色**：

(1)加入二抗，37℃孵育1小時。

(2)加入TMB底物，酶標(biāo)儀檢測吸光度值（OD值）。

5.**計算滴度**：

(1)以O(shè)D值達(dá)到1.0時的抗體濃度為工作濃度。

####（二）WesternBlotting法

1.**制備SDS凝膠**：

(1)稱取凝膠粉，加入去離子水配制。

(2)調(diào)整pH值，澆注凝膠。

2.**電泳**：

(1)將樣品上樣至凝膠，通電電泳。

(2)觀察條帶分離情況。

3.**轉(zhuǎn)膜**：

(1)將凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜。

(2)檢查轉(zhuǎn)膜效果。

4.**封閉**：

(1)加入封閉液，室溫封閉1小時。

(2)洗膜。

5.**孵育一抗**：

(1)加入稀釋后的一抗，4℃過夜。

(2)洗膜。

6.**孵育二抗**：

(1)加入稀釋后的二抗，室溫孵育1小時。

(2)洗膜。

7.**顯影**：

(1)加入化學(xué)發(fā)光底物，曝光成像。

(2)計算抗體工作濃度。

###五、注意事項(xiàng)

1.所有試劑需現(xiàn)配現(xiàn)用或按說明書保存。

2.操作過程中避免交叉污染，建議使用一次性吸頭和槍頭。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，設(shè)備需徹底清潔和消毒。

4.數(shù)據(jù)記錄需完整，包括實(shí)驗(yàn)條件、試劑濃度、結(jié)果等。

###六、結(jié)果分析

1.**ELISA法**：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算抗體效價（單位/mL）。

2.**WesternBlotting法**：根據(jù)條帶亮度評估抗體特異性。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果需與預(yù)期對比，若不符合預(yù)期需重新優(yōu)化條件。

###七、附錄

1.常用抗體儲存條件：-20℃避光保存。

2.常用緩沖液配方表。

3.儀器操作手冊鏈接（如有）。

###一、概述（擴(kuò)寫）

免疫學(xué)抗體實(shí)驗(yàn)是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中常用的技術(shù)手段，主要用于檢測、分離或純化特定抗原或抗體。本規(guī)程旨在提供標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作流程，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)操作包括抗體制備、純化、滴度測定、WesternBlotting、ELISA等核心步驟。本規(guī)程詳細(xì)闡述了每個步驟的具體操作方法、所需試劑與材料、儀器設(shè)備、關(guān)鍵參數(shù)及注意事項(xiàng)，以指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)人員規(guī)范操作。通過遵循本規(guī)程，可以有效減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高抗體實(shí)驗(yàn)的成功率。抗體作為免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵分子，在疾病診斷、藥物研發(fā)、細(xì)胞功能研究等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值。因此，掌握規(guī)范的抗體實(shí)驗(yàn)操作至關(guān)重要。

###二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（擴(kuò)寫）

在進(jìn)行抗體實(shí)驗(yàn)前，需確保所有設(shè)備和試劑準(zhǔn)備齊全，并符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。充分的準(zhǔn)備是保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的基礎(chǔ)。

####（一）試劑與材料（擴(kuò)寫）

1.**抗體**：

(1)**一抗**：即直接針對目標(biāo)抗原的抗體，可以是多克隆抗體或單克隆抗體。需確認(rèn)抗體的宿主來源（如兔抗人、鼠抗鼠）和特異性信息（如靶標(biāo)氨基酸序列、免疫原）。

(2)**二抗**：即能與第一抗體結(jié)合的抗體，用于放大信號。常見類型包括羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG等，需根據(jù)一抗的宿主來源選擇。二抗需標(biāo)記酶（如辣根過氧化物酶HRP、堿性磷酸酶AP）或熒光基團(tuán)（如異硫氰酸熒光素FITC、藻紅蛋白PE）。

(3)**抗體檢測用抗體**：如需在WesternBlotting或流式細(xì)胞術(shù)中使用抗體，需提前確認(rèn)其性能指標(biāo)（如克隆性、交叉反應(yīng)性）。

2.**緩沖液**：

(1)**磷酸緩沖鹽溶液（PBS）**：常用pH7.4PBS，需使用無離子水配制，并經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。用于洗滌、稀釋和封閉。

(2)**Tris-HCl緩沖液**：常用pH7.5-8.0Tris-HCl，同樣需過濾除菌，用于某些酶促反應(yīng)或電泳緩沖液。

(3)**含EDTA的緩沖液**：用于螯合金屬離子，防止某些酶的活性，或在特定層析過程中使用。

3.**電泳與轉(zhuǎn)膜相關(guān)試劑**：

(1)**SDS凝膠電泳試劑**：包括凝膠粉（丙烯酰胺和交聯(lián)劑）、分離膠和濃縮膠配方、電泳緩沖液（含甘氨酸和Tris）。需精確稱量并按順序加入，避免產(chǎn)生氣泡。

(2)**蛋白質(zhì)Marker**：用于判斷蛋白質(zhì)分子量大小，選擇合適范圍的Marker（如5-200kDa）。

(3)**轉(zhuǎn)膜膜**：PVDF膜或NC膜，需預(yù)處理（如PVDF膜用甲醇激活）以提高結(jié)合效率。

(4)**轉(zhuǎn)膜緩沖液**：含甘氨酸、Tris和SDS的溶液，SDS需在轉(zhuǎn)膜前去除以防止條帶彌散。

4.**封閉液和封閉劑**：

(1)**封閉液**：常用含0.05%吐溫-20的PBS或TBS，用于洗滌。

(2)**封閉劑**：

-**牛血清白蛋白（BSA）**：濃度通常為1%-5%，非特異性結(jié)合能力強(qiáng)。

-**脫脂奶粉（如脫脂奶粉粉）**：濃度通常為5%-10%，成本較低，封閉效果良好。

-**酪蛋白**：可作為替代封閉劑，濃度類似BSA。

5.**其他試劑**：

(1)**甘油**：用于WesternBlotting結(jié)果固定時增加膜密度。

(2)**化學(xué)發(fā)光底物（如ECL）**：用于WesternBlotting信號檢測，需新鮮配制或分裝保存。

(3)**酶標(biāo)板**：用于ELISA實(shí)驗(yàn)，需使用可密封的板封膜。

(4)**TMB底物**：用于ELISA化學(xué)發(fā)光檢測，需避光保存。

6.**保存液**：

(1)**抗體保存液**：常用含0.01%NaN3的PBS或含穩(wěn)定劑（如蔗糖、甘露醇）的溶液，用于長期保存抗體（-20℃或-80℃）。

(2)**封閉液/洗滌液保存液**：含防腐劑（如NaN3）的緩沖液，用于長期保存封閉液或洗滌液。

####（二）儀器設(shè)備（擴(kuò)寫）

1.**超凈工作臺**：用于無菌操作，需定期進(jìn)行空間滅菌（如紫外燈照射、過氧化氫等離子體）。操作前需啟動凈化系統(tǒng)，確認(rèn)風(fēng)速和過濾效果。

2.**低溫離心機(jī)**：用于樣品分離，需根據(jù)轉(zhuǎn)速選擇合適的離心管和轉(zhuǎn)子。常用轉(zhuǎn)速范圍及對應(yīng)的離心力（相對離心力RCF）需明確。

3.**酶標(biāo)儀**：用于ELISA信號定量，需定期校準(zhǔn)，確保讀數(shù)準(zhǔn)確。常用波長范圍（如450nm、600nm濾光片）。

4.**電泳儀**：用于SDS，需配備電壓調(diào)節(jié)器，避免電壓過高導(dǎo)致凝膠過熱或樣品降解。

5.**電轉(zhuǎn)移槽（濕轉(zhuǎn)/半干轉(zhuǎn)）**：用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜，濕轉(zhuǎn)需確保電泳緩沖液足量且電導(dǎo)率合適（使用電導(dǎo)率儀檢測）。

6.**熒光顯微鏡**：用于觀察熒光標(biāo)記的樣品，需配備相應(yīng)波長的濾光片組。

7.**pH計**：用于精確測量緩沖液pH值，校準(zhǔn)周期需符合實(shí)驗(yàn)室要求。

8.**水浴鍋/恒溫?fù)u床**：用于抗體孵育等步驟，需設(shè)置并驗(yàn)證溫度控制精度。

9.**磁力攪拌器/渦旋混合器**：用于試劑混勻，選擇合適的攪拌強(qiáng)度，避免產(chǎn)生氣泡或剪切樣品。

10.**移液器**：需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的量程和精度，使用前需校準(zhǔn)，并采用正確的操作手法（如設(shè)置刻度、垂直吸放液）。

####（三）實(shí)驗(yàn)環(huán)境（擴(kuò)寫）

1.**環(huán)境清潔**：實(shí)驗(yàn)區(qū)域需每日清潔消毒，操作臺面使用70%-75%乙醇擦拭。

2.**無菌操作**：所有涉及抗體提取、純化的步驟需在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，操作前需穿戴潔凈工作服、口罩和手套。

3.**試劑平衡**：所有試劑（特別是緩沖液、抗體）需在實(shí)驗(yàn)前平衡至室溫（除非有特殊說明），避免溫差導(dǎo)致沉淀或濃度變化。

4.**光照保護(hù)**：對光敏感的試劑（如某些酶、熒光染料）需使用棕色瓶儲存，并在避光條件下操作。

5.**溫度控制**：需根據(jù)試劑要求將樣品、試劑和儀器設(shè)備置于合適的環(huán)境中（如4℃冰箱、-20℃/-80℃冰箱、水浴鍋等），并定期檢查溫度記錄。

###三、抗體制備與純化（擴(kuò)寫）

抗體制備包括樣品采集、提取和純化等步驟。根據(jù)來源不同，抗體制備方法有所差異，需根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計選擇合適的方法。

####（一）樣品采集（擴(kuò)寫）

1.**生物樣本選擇**：

(1)**血清/血漿**：通常用于多克隆抗體的制備，采集后需靜置、離心分離，去除細(xì)胞碎片。血漿（抗凝后）也可使用，但需注意抗凝劑可能干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(2)**細(xì)胞培養(yǎng)上清**：對于表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞，收集培養(yǎng)上清可用于抗體提取。需在細(xì)胞生長旺盛期收獲上清，并過濾除菌（0.22μm濾膜）。

(3)**組織樣本**：動物或植物組織可用于提取天然抗體，需快速解剖、冰凍保存。提取前需用預(yù)冷PBS沖洗組織，去除血液。

2.**樣本處理**：

(1)**血清/血漿**：4℃離心（3000-5000rpm，10分鐘），取上清。若抗體濃度高，可考慮直接使用；若濃度低，需進(jìn)一步純化。

(2)**細(xì)胞上清**：直接過濾除菌，即可用于部分純化步驟（如親和層析）。

(3)**組織樣本**：

-**勻漿**：使用冰浴預(yù)冷的勻漿器（如Dounce勻漿器）或機(jī)械破碎設(shè)備（如超聲波破碎儀）進(jìn)行組織勻漿，加入冰冷的緩沖液（如PBS或裂解緩沖液）助裂解。

-**離心**：4℃離心（4000-8000rpm，20分鐘），取上清。若仍有沉淀，需重新勻漿并離心。

####（二）抗體提?。〝U(kuò)寫）

1.**直接提取（適用于高濃度樣品）**：

(1)將處理好的樣品上樣至預(yù)先平衡好的親和層析柱（如蛋白A/G磁珠或?qū)游鼋橘|(zhì)）。平衡柱時需使用低離子強(qiáng)度的緩沖液（如低鹽PBS）。

(2)讓樣品緩慢流過層析柱，抗體會特異性結(jié)合到層析介質(zhì)上。未結(jié)合物質(zhì)隨緩沖液流出。

(3)用低鹽緩沖液洗滌層析柱，去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。

2.**粗提（適用于低濃度樣品）**：

(1)**鹽析**：向樣品中逐漸加入硫酸銨或氯化鈉，使抗體沉淀。需逐步增加鹽濃度，并在每次加鹽后離心收集沉淀。通過梯度鹽析可分離不同類型的抗體。

(2)**有機(jī)溶劑沉淀**：加入預(yù)冷乙醇或異丙醇（如乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)30%-50%），4℃孵育過夜，離心收集沉淀。需注意有機(jī)溶劑的終濃度不能過高，以免破壞抗體結(jié)構(gòu)。

####（三）抗體純化（擴(kuò)寫）

1.**親和層析純化（最常用）**：

(1)**柱平衡**：

-將層析介質(zhì)（如蛋白A/G磁珠或預(yù)裝柱）用平衡緩沖液（如含0.05MTris-HClpH7.5,0.5MNaCl,0.05%NaN3的緩沖液）洗滌至基線穩(wěn)定。

-若為磁珠，需在磁力吸附后用少量平衡緩沖液潤洗。

(2)**上樣**：

-將粗提的抗體樣品（稀釋至適當(dāng)濃度，避免過高濃度導(dǎo)致堵塞）緩慢上樣至平衡好的層析柱。上樣體積通常不超過柱體積的10%-20%。

-若樣品體積大，可分批次上樣，每次上樣后需重新平衡柱。

(3)**洗滌**：

-用低鹽平衡緩沖液（如0.05MTris-HClpH7.5,0.05%NaN3）洗滌柱子2-3次，流速不宜過快，以充分去除非特異性結(jié)合物質(zhì)。監(jiān)測流出液OD280值，確保無蛋白流出。

(4)**洗脫**：

-**低pH洗脫**：將pH值調(diào)至抗體等電點(diǎn)附近（如用含0.1M甘氨酸pH2.5-3.0的緩沖液），抗體會從介質(zhì)上解離下來。收集洗脫液，流速不宜過快。

-**高鹽洗脫**：逐步提高緩沖液中的鹽濃度（如用含1MNaCl的平衡緩沖液），抗體會因鹽濃度梯度解離。

-**咪唑洗脫（蛋白A/G磁珠）**：加入咪唑溶液（如0.1-1.0M咪唑），咪唑會競爭結(jié)合抗原，使抗體釋放。需監(jiān)測洗脫液OD280值，收集主峰。

(5)**收集與儲存**：

-將洗脫液通過0.22μm濾膜過濾除菌，分裝后于-20℃或-80℃保存。每支抗體需標(biāo)注濃度、純度、制備日期等信息。

2.**離子交換層析**：

(1)**柱平衡**：使用與離子交換基團(tuán)類型（陽離子或陰離子）相反電荷的緩沖液平衡層析柱。例如，對于陽離子交換介質(zhì)，使用低鹽緩沖液（如20mMTris-HClpH7.5）。

(2)**上樣**：將樣品上樣至平衡好的柱子，上樣體積和流速同親和層析。

(3)**洗滌**：用平衡緩沖液洗滌柱子，去除未結(jié)合物質(zhì)。

(4)**梯度洗脫**：

-**陽離子交換**：逐漸增加緩沖液中的鹽濃度（如從0M到1MNaCl），帶正電荷的抗體會隨鹽濃度升高而先后解離。

-**陰離子交換**：逐漸降低緩沖液pH值或增加鹽濃度，帶負(fù)電荷的抗體會解離。

-收集各組分，通過OD280檢測主峰，并可通過蛋白印跡（Blot）檢測目標(biāo)抗體。

(5)**收集與儲存**：同親和層析。

###四、抗體滴度測定（擴(kuò)寫）

抗體滴度測定用于確定抗體的工作濃度，是保證實(shí)驗(yàn)效果的關(guān)鍵步驟。常用方法包括間接ELISA法和WesternBlotting法。

####（一）間接ELISA法（擴(kuò)寫）

1.**包被**：

(1)**試劑準(zhǔn)備**：

-包被緩沖液：常用pH9.6碳酸鹽緩沖液（含0.05MNa2CO3,0.02MNaHCO3,0.05%NaN3）。

-封閉緩沖液：常用含5%脫脂奶粉或BSA的PBS-T（含0.05%吐溫-20）。

-二抗及底物：根據(jù)一抗類型選擇合適的HRP或AP標(biāo)記二抗，及對應(yīng)的TMB或ECL底物。

(2)**包被操作**：

-將稀釋后的一抗（如用包被緩沖液稀釋至1-10μg/mL）加入已預(yù)處理的酶標(biāo)板孔中（每孔100-200μL），4℃過夜包被。

-若抗體在室溫下包被效果更好，可改為室溫孵育2-4小時。

-包被后用包被緩沖液洗滌板孔3次，每次洗滌后需吸干或拍干（避免殘留水分影響后續(xù)步驟）。

2.**封閉**：

(1)**試劑準(zhǔn)備**：封閉緩沖液。

(2)**封閉操作**：

-加入封閉緩沖液（每孔200-300μL），室溫孵育1-2小時，或4℃過夜。封閉作用是阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。

-封閉后用封閉緩沖液洗滌板孔3-4次。

3.**加樣**：

(1)**試劑準(zhǔn)備**：用封閉緩沖液或PBS將二抗稀釋至適當(dāng)濃度（通常為1:1000-1:5000，需預(yù)先優(yōu)化）。

(2)**加樣操作**：

-加入稀釋后的二抗（每孔100-200μL），室溫孵育1小時。

-若抗體在室溫下孵育效果更好，可改為4℃孵育過夜。

-孵育后用洗滌緩沖液（如PBS-T）洗滌板孔5次。

4.**顯色**：

(1)**TMB顯色**：

-加入TMB底物工作液（按說明書比例新鮮混合H2O2和TMB溶液），避光室溫孵育10-30分鐘。

-觀察顏色變化（藍(lán)→黃），顏色深淺與抗體濃度成正比。

-加入終止液（如2MH2SO4，每孔50-100μL），終止反應(yīng)，顏色由黃變紅。

(2)**ECL顯色**：

-加入ECL底物（每孔100-200μL），避光室溫孵育5-15分鐘。

-立即使用酶標(biāo)儀或化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測信號強(qiáng)度。

5.**結(jié)果計算**：

(1)**繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線**：以不同稀釋倍數(shù)的抗體樣品的OD值（TMB法）或相對光單位（RLU，ECL法）為縱坐標(biāo)，抗體稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)**確定工作濃度**：選擇能使OD值在酶標(biāo)儀檢測線性范圍內(nèi)（如0.1-1.0）的抗體稀釋倍數(shù)，計算原抗體溶液的濃度（如ng/mL或μg/mL）。工作濃度通常選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率較大的稀釋度，以提高檢測靈敏度。

####（二）WesternBlotting法（擴(kuò)寫）

1.**樣品制備與電泳**：

(1)**樣品收集與變性**：收集細(xì)胞或組織樣品，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液（含β-巰基乙醇或DTT），100℃煮沸5分鐘使蛋白質(zhì)變性。

(2)**上樣與電泳**：

-將樣品與上樣緩沖液混合均勻，加入LoadingBuffer（如甘油、溴酚藍(lán)），上樣至SDS凝膠（根據(jù)蛋白分子量選擇凝膠濃度，如12%-20%）。

-連接電泳儀，設(shè)置電壓（預(yù)電泳濃縮膠80V，分離膠120V），進(jìn)行電泳。觀察溴酚藍(lán)遷移情況，確保電泳時間合適。

3.**轉(zhuǎn)膜**：

(1)**轉(zhuǎn)膜準(zhǔn)備**：

-將PVDF膜或NC膜用甲醇浸泡1分鐘，再用含0.05%SDS的轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡15分鐘（PVDF膜預(yù)處理）。

-將膜置于轉(zhuǎn)膜裝置中，順序?yàn)椋簽V紙（濕）→PVDF膜（有標(biāo)記面朝下）→硫酸氨基甲酯墊（可選）→濾紙（濕）。

(2)**轉(zhuǎn)膜操作**：

-加入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液，確保膜和墊圈完全浸沒。

-連接電泳儀，設(shè)置參數(shù)（如12V，1-2小時），進(jìn)行半干或濕轉(zhuǎn)。濕轉(zhuǎn)時需確保緩沖液足量且電導(dǎo)率合適（>0.4mS/cm）。

-轉(zhuǎn)膜后用轉(zhuǎn)膜緩沖液漂洗膜，用筆標(biāo)記膜面。

4.**封閉**：

(1)**封閉緩沖液**：常用含5%脫脂奶粉或BSA的TBST（含0.05%吐溫-20）。

(2)**封閉操作**：

-將膜置于封閉緩沖液中，室溫孵育1-2小時，或4℃過夜。封閉作用是阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。

-封閉后用TBST洗滌膜3-4次，每次5-10分鐘。

5.**孵育一抗**：

(1)**一抗稀釋**：根據(jù)抗體說明書和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用封閉緩沖液稀釋一抗至合適濃度（如1:1000-1:5000）。

(2)**孵育操作**：

-將膜置于含一抗的封閉緩沖液中，4℃孵育過夜，或室溫孵育1-2小時（需預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳條件）。

-孵育后用TBST洗滌膜3-4次，每次5-10分鐘。

6.**孵育二抗**：

(1)**二抗稀釋**：根據(jù)一抗類型和說明書，用封閉緩沖液稀釋HRP或AP標(biāo)記的二抗至合適濃度（如1:5000-1:10000）。

(2)**孵育操作**：

-將膜置于含二抗的TBST緩沖液中，室溫孵育1小時，或4℃孵育過夜。

-孵育后用TBST洗滌膜3-4次，每次5-10分鐘。

7.**顯影**：

(1)**HRP標(biāo)記二抗**：

-加入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL或LumiGLO），避光孵育1-5分鐘。

-立即使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測信號，或按需曝光X光片。

(2)**AP標(biāo)記二抗**：

-加入顯色液（如5-Bromo-4-Chloro-3-IndolylPhosphate,BCIP/NBT），室溫避光孵育10-30分鐘。

-觀察顏色變化（藍(lán)紫色），顏色深淺與抗體濃度成正比。

8.**結(jié)果分析**：

(1)**條帶強(qiáng)度**：通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)獲取圖像，或用ImageJ等軟件分析條帶灰度值。

(2)**滴度確定**：選擇信號清晰、背景干擾小的條帶，計算不同稀釋度抗體對應(yīng)的信號強(qiáng)度。選擇能使信號強(qiáng)度達(dá)到特定閾值（如背景的2-3倍）的抗體稀釋倍數(shù)，即為工作濃度。

###五、注意事項(xiàng)（擴(kuò)寫）

1.**試劑質(zhì)量**：所有抗體和試劑需從可靠供應(yīng)商購買，并檢查保質(zhì)期。使用前需核對儲存條件，確保未變質(zhì)。

2.**無菌操作**：所有涉及抗體提取、純化的步驟需在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，避免微生物污染。使用無菌吸頭、槍頭和耗材。

3.**溫度控制**：嚴(yán)格按規(guī)程控制各步驟的溫度，特別是抗體孵育、電泳和轉(zhuǎn)膜等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。使用水浴鍋或恒溫?fù)u床時需驗(yàn)證溫度準(zhǔn)確性。

4.**抗體稀釋**：稀釋抗體時需使用精確的移液器，并確?；靹颉？贵w工作濃度需通過預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，避免過高或過低導(dǎo)致信號飽和或檢測不到。

5.**緩沖液平衡**：所有緩沖液需在使用前平衡至室溫，特別是用于層析和包被的緩沖液。避免溫差導(dǎo)致沉淀或濃度變化。

6.**酶標(biāo)板處理**：ELISA實(shí)驗(yàn)中，酶標(biāo)板需用封膜膜封口，避免蒸發(fā)導(dǎo)致結(jié)果偏差。洗滌時需充分吸干或拍干，避免殘留水分。

7.**化學(xué)發(fā)光底物**：ECL底物需新鮮配制或分裝保存，避免反復(fù)凍融。檢測時需在信號衰減前完成，并使用一次性墊圈防止污染。

8.**安全防護(hù)**：操作中需佩戴手套、護(hù)目鏡，避免試劑接觸皮膚和眼睛。處理有毒試劑（如甲醛、甲醇）需在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。

9.**結(jié)果驗(yàn)證**：抗體滴度確定后，需在正式實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證其效果，確?？贵w性能符合要求?？赏ㄟ^重復(fù)實(shí)驗(yàn)或與其他抗體比較來確認(rèn)。

10.**記錄完整**：詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)條件、試劑濃度、操作步驟和結(jié)果，便于結(jié)果分析和問題排查。

###六、結(jié)果分析（擴(kuò)寫）

1.**間接ELISA法**：

(1)**標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制**：以抗體稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，OD值（或RLU）為縱坐標(biāo)，繪制線性回歸曲線。計算曲線斜率和