免疫調節(jié)操作規(guī)程一、概述

免疫調節(jié)操作規(guī)程旨在為相關實驗操作提供標準化流程，確保實驗結果的準確性和可重復性。本規(guī)程涵蓋免疫調節(jié)實驗的準備工作、操作步驟、質量控制及廢棄物處理等方面，適用于基礎醫(yī)學、生物技術等領域的研究人員。

二、準備工作

（一）實驗環(huán)境

1.實驗室需保持潔凈，溫濕度控制在20±2℃，相對濕度40%-60%。

2.操作臺面需使用70%酒精消毒，并鋪無菌操作墊。

3.空氣凈化系統(tǒng)運行，維持生物安全柜內氣流穩(wěn)定。

（二）試劑與耗材

1.主要試劑：

-免疫調節(jié)劑（如細胞因子、抗體等），濃度需經驗證（示例：10-100ng/mL）。

-培養(yǎng)基（如DMEM/F12），pH值調至7.2-7.4。

-無菌PBS緩沖液（0.01M，pH7.4）。

2.耗材：

-無菌96孔板、移液器吸頭、細胞計數(shù)板。

-一次性手套、離心管、濾膜（0.22μm）。

（三）儀器設備

1.生物安全柜：需提前開啟30分鐘，檢查紫外燈是否正常。

2.離心機：轉速設定需根據(jù)實驗需求（示例：1000-5000rpm，5-10分鐘）。

3.酶標儀：校準波長范圍（450-600nm）。

三、操作步驟

（一）細胞準備

1.細胞復蘇：

-將凍存細胞置于37℃水浴解凍，迅速加入預溫培養(yǎng)基（37℃，5%CO?）。

-吸取細胞懸液，接種至96孔板（密度示例：1×10?-5×10?cells/well）。

2.細胞培養(yǎng)：

-置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24-48小時至貼壁。

（二）免疫調節(jié)劑處理

1.稀釋試劑：

-使用無菌PBS將免疫調節(jié)劑稀釋至預定濃度（示例：50ng/mL）。

-使用0.22μm濾膜過濾除菌。

2.加藥操作：

-吸取處理液，加入每孔100-200μL（避免氣泡）。

-設置對照組：陰性對照（僅培養(yǎng)基）、陽性對照（已知刺激劑）。

（三）效果評估

1.細胞增殖檢測（MTT法）：

-終止培養(yǎng)，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL）。

-37℃孵育4小時，棄上清，加入DMSO溶解結晶。

-酶標儀測定吸光度值（A?90）。

2.細胞因子檢測（ELISA）：

-嚴格按照試劑盒說明書操作，孵育時間示例：2-4小時。

-使用標準曲線計算濃度（pg/mL）。

四、質量控制

（一）實驗重復性

1.每組設置至少3個復孔，計算變異系數(shù)（CV）應≤10%。

2.若結果偏離，需重新驗證試劑或操作步驟。

（二）陰性對照驗證

1.陰性對照吸光度值應＜0.1（MTT法）。

2.若陽性對照無顯著差異，則實驗無效。

（三）記錄與存檔

1.實驗數(shù)據(jù)需實時記錄，包括時間、試劑批次、操作人。

2.原始數(shù)據(jù)（如酶標儀結果）需保存至少2年。

五、廢棄物處理

（一）生物危害物

1.使用專用銳器盒收集細胞培養(yǎng)液。

2.高壓滅菌（121℃，15分鐘）后，按醫(yī)療廢棄物處理。

（二）化學試劑

1.過濾除菌后的廢液需用酸堿中和（pH6-8）。

2.混合后統(tǒng)一倒入實驗室指定收集桶。

六、注意事項

1.操作過程中需全程佩戴手套，避免污染。

2.重復使用器械需先滅菌（高壓滅菌或UV照射）。

3.實驗結束后，用70%酒精徹底消毒操作臺面及設備表面。

**一、概述**

免疫調節(jié)操作規(guī)程旨在為相關實驗操作提供標準化流程，確保實驗結果的準確性和可重復性。本規(guī)程涵蓋免疫調節(jié)實驗的準備工作、操作步驟、質量控制及廢棄物處理等方面，適用于基礎醫(yī)學、生物技術等領域的研究人員。其核心目標是精確評估特定干預因素（如藥物、生物活性分子、環(huán)境刺激等）對免疫系統(tǒng)功能（如細胞活性、分化、細胞因子分泌等）的影響，從而為理解免疫機制或開發(fā)相關應用提供實驗依據(jù)。本規(guī)程的實施有助于減少操作誤差，提高實驗效率，并確保實驗環(huán)境的安全。

**二、準備工作**

（一）實驗環(huán)境

1.實驗區(qū)域選擇：應選擇潔凈度符合實驗要求的實驗室區(qū)域，優(yōu)先考慮生物安全柜附近或專用潔凈操作臺。

2.環(huán)境控制：確保實驗室溫濕度穩(wěn)定在20±2℃，相對濕度控制在40%-60%，以維持細胞培養(yǎng)和試劑的穩(wěn)定性。定期使用溫濕度計進行監(jiān)測。

3.操作臺面消毒：每次實驗前，使用70%酒精對操作臺面進行徹底擦拭消毒，確保表面無菌。對于高風險操作，可在消毒后鋪設無菌操作墊。

4.空氣凈化：若使用生物安全柜，需提前開啟至少30分鐘，啟動紫外燈進行空氣消毒（實驗過程中避免開啟紫外燈）。確認氣流方向正確且穩(wěn)定，防止交叉污染。

（二）試劑與耗材

1.主要試劑：

*免疫調節(jié)劑：需使用高質量來源的產品，明確儲存條件（如-20℃或-80℃）。使用前根據(jù)實驗設計稀釋至預定工作濃度。例如，若研究細胞因子（如TNF-α）的抑制作用，需準備不同濃度的處理液（如0,10,50,100ng/mL）。

*細胞培養(yǎng)基：選擇適合目標細胞的完全培養(yǎng)基，如DMEM/F12（高糖或低糖）、RPMI-1640等。使用前需用0.22μm濾膜過濾除菌，并調節(jié)pH值至7.2-7.4。需準備預溫至37℃的培養(yǎng)基用于細胞復蘇和接種。

*培養(yǎng)基補充劑：如胎牛血清（FBS）、雙抗（青霉素-鏈霉素）、非必需氨基酸（NEAA）等，均需確認質量合格并按說明書使用。建議使用低內源性的FBS或無FBS培養(yǎng)基進行特定實驗。

*無菌PBS緩沖液（0.01M，pH7.4）：用于細胞洗滌、稀釋等操作。同樣需過濾除菌。

*細胞裂解液：若需進行蛋白檢測，需準備無菌、無蛋白降解活性的裂解液（如RIPA裂解液），可加入PMSF等蛋白酶抑制劑。

2.耗材：

*細胞培養(yǎng)耗材：根據(jù)實驗需求選擇合適的培養(yǎng)容器，如細胞培養(yǎng)板（96孔、24孔、6孔板等）、培養(yǎng)瓶、細胞爬片。確保所有耗材均經過高壓滅菌（121℃，15-20分鐘），且為無菌、無熱原。

*移液工具：使用一次性無菌移液器吸頭，根據(jù)所需體積選擇合適量程的移液器。避免重復使用吸頭。

*細胞計數(shù)工具：準備血球計數(shù)板和蓋玻片，或使用細胞計數(shù)儀，用于計數(shù)細胞密度。

*其他：無菌注射器（若需精確加樣）、離心管（根據(jù)體積選擇）、濾膜（0.22μm，用于除菌）、封口膜、一次性手套、實驗室用紙巾等。

（三）儀器設備

1.生物安全柜/超凈工作臺：除啟動前檢查外，操作過程中需保持內部相對負壓，避免用手直接接觸工作臺內壁。定期進行潔凈度檢測（如沉降菌法）。

2.離心機：使用前確認轉子型號與轉速匹配。根據(jù)實驗需求設定轉速（如用于細胞沉淀，示例：1000-2000rpm，5分鐘；用于大分子離心，示例：4000rpm，10分鐘）。結束后需徹底清潔轉子腔。

3.培養(yǎng)箱：確保溫度和CO?濃度控制器準確，使用前校準。定期檢查溫度分布均勻性（可在箱內放置多個溫度計）。

4.酶標儀/多功能微孔板讀數(shù)儀：用于讀取MTT、ELISA等實驗結果。使用前需用校準品進行波長校準（如450nm,570nm,630nm濾光片），并確認讀數(shù)線性范圍。保持比色皿清潔。

5.超純水系統(tǒng)：用于配制試劑和水溶液，確保水質符合實驗要求（電阻率≥18.2MΩ·cm）。

6.移液器校準儀：定期（如每季度）對常用移液器進行校準，確保加樣體積的準確性。

**三、操作步驟**

（一）細胞準備

1.細胞復蘇：

*（1）解凍：將凍存管（如凍存管）從-80℃或液氮中取出，迅速置于37℃水浴中解凍（示例：1-2分鐘），期間輕柔搖晃使內容物均勻。**注意：避免直接置于冰水浴中**。

*（2）轉移：解凍后，立即在生物安全柜內，將細胞懸液轉移至含有預溫（37℃）培養(yǎng)基的無菌離心管中。

*（3）稀釋與計數(shù)：用培養(yǎng)基將細胞稀釋至適宜的接種密度，使用細胞計數(shù)板或計數(shù)儀計數(shù)活細胞數(shù)（通過臺盼藍染色法或活死染色法區(qū)分活細胞），計算細胞懸液濃度。

2.細胞接種：

*（1）準備培養(yǎng)板：在無菌環(huán)境下（生物安全柜內），將96孔板底部用無菌吸頭吸去多余培養(yǎng)基。

*（2）加樣：根據(jù)目標密度，使用移液器將細胞懸液加入每個孔中（示例：1×10?-5×10?cells/well）。注意加樣速度和體積，避免產生氣泡。

*（3）混勻：將培養(yǎng)板在操作臺上輕輕晃動或用移液器吸頭沿孔壁輕柔吹打幾次，使細胞均勻分布。

*（4）培養(yǎng)：將接種好的培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中，開始細胞貼壁培養(yǎng)。培養(yǎng)時間根據(jù)細胞類型和狀態(tài)調整（示例：貼壁細胞24-48小時）。

（二）免疫調節(jié)劑處理

1.試劑稀釋：

*（1）計算：根據(jù)所需工作濃度、培養(yǎng)基體積和耗材孔數(shù)，精確計算所需免疫調節(jié)劑的體積。

*（2）配制：在無菌環(huán)境下，使用無菌移液器吸取所需體積的免疫調節(jié)劑，加入含有無菌PBS或培養(yǎng)基的無菌容器（如離心管）中，充分混勻。

*（3）除菌：若免疫調節(jié)劑本身未除菌或不確定，需使用0.22μm濾膜進行過濾除菌。注意減少樣品損失。

2.細胞處理：

*（1）換液：待細胞貼壁生長至合適狀態(tài)（如80%-90%匯合度），在生物安全柜內吸棄舊培養(yǎng)基。

*（2）加藥：向每個孔中加入計算好的免疫調節(jié)劑處理液，或加入等體積的陰性對照液（僅培養(yǎng)基）。確保對照組設置齊全，包括：無處理陰性對照、僅含培養(yǎng)基的空白對照、陽性對照（使用已知有生物活性的調節(jié)劑或刺激劑）。

*（3）孵育：將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱，根據(jù)實驗設計設定孵育時間（示例：24-72小時），在此期間模擬特定生理或病理條件。

（三）效果評估

1.細胞增殖檢測（MTT法）：

*（1）終止培養(yǎng)：吸棄孔內培養(yǎng)液，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，預溫至37℃）。

*（2）孵育：將培養(yǎng)板放回37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中，孵育4-6小時（根據(jù)細胞類型和狀態(tài)優(yōu)化）。

*（3）結晶溶解：吸棄MTT溶液，每孔加入100-200μLDMSO（預溫至37℃），使用振蕩器或移液器混勻，使甲臜結晶完全溶解。

*（4）酶標儀檢測：使用酶標儀在490nm波長處測定吸光度值（A?90）。設置空白孔（不含細胞、僅含MTT和DMSO）進行調零。

2.細胞因子檢測（ELISA）：

*（1）板條準備：在生物安全柜內，根據(jù)說明書將ELISA板條從鋁箔袋中取出，置于潔凈的板架上。

*（2）加樣（待測樣本/標準品）：根據(jù)實驗設計，使用移液器將樣本或標準品加入對應孔中，每孔100-200μL。注意避免交叉污染，更換吸頭。

*（3）孵育（第一抗體）：將板條置于37℃孵育1-2小時，或根據(jù)說明書優(yōu)化。

*（4）洗滌：吸棄液體，甩干。使用洗板機或手工方法加入洗滌液（示例：300-500μL/孔），靜置1-2分鐘，甩干。重復洗滌5次。

*（5）加樣（酶標抗體）：棄去洗滌液，加入相應辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗體，每孔100-200μL。37℃孵育1小時。

*（6）洗滌：同步驟（4）。

*（7）加底物：吸棄洗滌液，加入TMB底物溶液，每孔100-200μL。避光孵育15-30分鐘（根據(jù)說明書和顏色變化速度調整）。

*（8）終止反應：每孔加入終止液（如2MH?SO?或HCl），100-200μL，混勻。溶液顏色由藍色變?yōu)辄S色。

*（9）酶標儀檢測：立即使用酶標儀在450nm波長處測定吸光度值（A???）。設置空白孔（不含樣本、僅含所有試劑）進行調零。

*（10）結果計算：根據(jù)標準品濃度和吸光度值，繪制標準曲線，計算樣本中細胞因子的濃度（pg/mL或ng/mL）。

3.流式細胞術分析（若需檢測細胞表面/胞內標志物）：

*（1）細胞固定/透化：收集細胞，根據(jù)需要使用固定液（如4%多聚甲醛）固定，或使用透化劑（如0.1%胰蛋白酶+EDTA）處理，以利于抗體進入胞內。

*（2）洗滌：用PBS洗滌細胞1-2次，去除未結合成分。

*（3）加抗體：加入特異性熒光標記抗體，可同時檢測多個標志物。設置同型對照抗體以排除非特異性結合。37℃孵育30-60分鐘，避光。

*（4）洗滌：同步驟（2）。

*（5）上樣：將細胞懸液上樣至流式細胞儀，設置檢測參數(shù)（如激發(fā)波長、檢測通道）。

*（6）數(shù)據(jù)分析：使用流式細胞術軟件（如FlowJo）對數(shù)據(jù)進行分析，計算門控區(qū)域內的細胞比例、平均熒光強度（MFI）等。

**四、質量控制**

（一）實驗重復性

1.復孔設置：每個實驗組應設置至少3個生物學復孔和3個技術復孔。生物學重復可評估個體差異，技術重復可評估操作誤差。

2.數(shù)據(jù)統(tǒng)計：使用合適的統(tǒng)計學方法（如均值±標準差或標準誤）分析數(shù)據(jù)。計算變異系數(shù)（CV），通常要求CV≤10%，以保證實驗穩(wěn)定性。若CV過高，需分析原因并重做。

3.重復實驗：對于關鍵實驗或結果可疑時，應進行重復實驗以驗證結果的可靠性。

（二）陰性對照驗證

1.基線確定：陰性對照（僅培養(yǎng)基或無免疫調節(jié)劑）的結果應作為實驗的基線。所有實驗組的結果應與陰性對照進行比較。

2.吸光度閾值：設定可接受的陰性對照吸光度閾值。例如，在MTT實驗中，若A???>0.1且呈劑量依賴性變化，則提示實驗存在干擾因素。

3.陽性對照響應：陽性對照應表現(xiàn)出預期的顯著響應（如細胞增殖增加或細胞因子濃度升高）。若陽性對照無響應，表明實驗條件（如細胞狀態(tài)、培養(yǎng)基）存在嚴重問題，所有結果無效。

（三）記錄與存檔

1.實驗記錄本：詳細、實時地記錄每次實驗的所有信息，包括：日期、實驗者、細胞類型及批次、培養(yǎng)基、試劑及批次、實驗設計（分組、濃度）、操作步驟、儀器參數(shù)、觀察到的現(xiàn)象、原始數(shù)據(jù)（吸光度值、計數(shù)結果等）。

2.數(shù)據(jù)電子化：將原始數(shù)據(jù)整理成電子表格（如Excel），計算統(tǒng)計結果，繪制圖表。

3.文件存檔：所有實驗記錄、原始數(shù)據(jù)、分析結果、圖表等應整理歸檔，至少保存2年，以備查閱和審計。命名規(guī)范清晰，便于檢索。

**五、廢棄物處理**

（一）生物危害物

1.細胞培養(yǎng)物：使用后，應視為潛在生物危害物。吸棄培養(yǎng)液后，可向孔內加入適量的70%-75%酒精或含有效氯的消毒液（如次氯酸鈉溶液，按說明書比例稀釋）作用30分鐘以上進行消毒。

2.去除廢液：小心吸除或傾倒廢液至指定的生物危害廢物容器中。

3.清洗與滅菌：使用PBS或去離子水沖洗培養(yǎng)板1-2次，然后進行高壓滅菌（121℃，15-20分鐘）。待壓力降至零后取出。

4.毀損：高壓滅菌后的培養(yǎng)板可按一般醫(yī)療廢物處理，或根據(jù)當?shù)匾?guī)定進行進一步物理或化學滅活。

（二）化學試劑

1.廢棄培養(yǎng)基/溶液：若含有低毒性試劑（如普通培養(yǎng)基、PBS），可經高壓滅菌后，根據(jù)實驗室規(guī)定排放至生活污水管道（確保符合排放標準）。若含有特殊試劑（如某些酶、高濃度鹽），需先評估其性質，可能需要中和或特殊處理。

2.廢棄試劑：如細胞裂解液、固定液、染色劑（若含強酸強堿或重金屬）等，應收集在指定的化學廢棄物容器中。避免不同性質的廢液混合（如酸堿混合會產生大量熱量）。

3.中和（如需）：對于含酸堿的廢液，可在專業(yè)指導下，使用合適的試劑進行中和處理，使pH值達到安全范圍（6-8），并充分混合后統(tǒng)一處理。

4.統(tǒng)一收集：所有化學廢棄物應使用指定的標簽進行標記，并統(tǒng)一收集至實驗室指定的儲存區(qū)域，交由有資質的機構進行最終處理。

**六、注意事項**

1.個人防護：實驗全程必須佩戴一次性無菌手套。根據(jù)操作風險，可佩戴護目鏡或面罩，穿實驗服。避免皮膚直接接觸細胞、培養(yǎng)基和試劑。操作結束后徹底洗手。

2.無菌操作：所有涉及細胞和培養(yǎng)基的操作必須在生物安全柜內進行。使用無菌吸頭、無菌容器和工具。操作臺面保持無菌狀態(tài)，避免說話、咳嗽等產生氣溶膠。

3.交叉污染預防：嚴禁在不同實驗間共用移液器吸頭、培養(yǎng)板等耗材。使用后的吸頭必須立即棄置。不同細胞系或實驗組之間應有物理隔斷（如不同區(qū)域或不同排的培養(yǎng)板）。

4.試劑管理：試劑應儲存于指定位置，按有效期和說明書要求使用。使用前檢查試劑狀態(tài)（如顏色、clarity）。避免光照、高溫或潮濕環(huán)境。剩余試劑妥善標記和儲存。

5.設備維護：定期檢查和維護所有儀器設備，確保其處于良好工作狀態(tài)。如發(fā)現(xiàn)異常，應立即停止使用并報修。

6.實驗結束：實驗結束后，徹底清潔操作臺面、生物安全柜內部、移液器等工具。清洗并晾干或滅菌所有使用過的玻璃器皿。整理實驗記錄和文件。關閉培養(yǎng)箱、酶標儀等設備電源。按照規(guī)定處理廢棄物。

一、概述

免疫調節(jié)操作規(guī)程旨在為相關實驗操作提供標準化流程，確保實驗結果的準確性和可重復性。本規(guī)程涵蓋免疫調節(jié)實驗的準備工作、操作步驟、質量控制及廢棄物處理等方面，適用于基礎醫(yī)學、生物技術等領域的研究人員。

二、準備工作

（一）實驗環(huán)境

1.實驗室需保持潔凈，溫濕度控制在20±2℃，相對濕度40%-60%。

2.操作臺面需使用70%酒精消毒，并鋪無菌操作墊。

3.空氣凈化系統(tǒng)運行，維持生物安全柜內氣流穩(wěn)定。

（二）試劑與耗材

1.主要試劑：

-免疫調節(jié)劑（如細胞因子、抗體等），濃度需經驗證（示例：10-100ng/mL）。

-培養(yǎng)基（如DMEM/F12），pH值調至7.2-7.4。

-無菌PBS緩沖液（0.01M，pH7.4）。

2.耗材：

-無菌96孔板、移液器吸頭、細胞計數(shù)板。

-一次性手套、離心管、濾膜（0.22μm）。

（三）儀器設備

1.生物安全柜：需提前開啟30分鐘，檢查紫外燈是否正常。

2.離心機：轉速設定需根據(jù)實驗需求（示例：1000-5000rpm，5-10分鐘）。

3.酶標儀：校準波長范圍（450-600nm）。

三、操作步驟

（一）細胞準備

1.細胞復蘇：

-將凍存細胞置于37℃水浴解凍，迅速加入預溫培養(yǎng)基（37℃，5%CO?）。

-吸取細胞懸液，接種至96孔板（密度示例：1×10?-5×10?cells/well）。

2.細胞培養(yǎng)：

-置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24-48小時至貼壁。

（二）免疫調節(jié)劑處理

1.稀釋試劑：

-使用無菌PBS將免疫調節(jié)劑稀釋至預定濃度（示例：50ng/mL）。

-使用0.22μm濾膜過濾除菌。

2.加藥操作：

-吸取處理液，加入每孔100-200μL（避免氣泡）。

-設置對照組：陰性對照（僅培養(yǎng)基）、陽性對照（已知刺激劑）。

（三）效果評估

1.細胞增殖檢測（MTT法）：

-終止培養(yǎng)，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL）。

-37℃孵育4小時，棄上清，加入DMSO溶解結晶。

-酶標儀測定吸光度值（A?90）。

2.細胞因子檢測（ELISA）：

-嚴格按照試劑盒說明書操作，孵育時間示例：2-4小時。

-使用標準曲線計算濃度（pg/mL）。

四、質量控制

（一）實驗重復性

1.每組設置至少3個復孔，計算變異系數(shù)（CV）應≤10%。

2.若結果偏離，需重新驗證試劑或操作步驟。

（二）陰性對照驗證

1.陰性對照吸光度值應＜0.1（MTT法）。

2.若陽性對照無顯著差異，則實驗無效。

（三）記錄與存檔

1.實驗數(shù)據(jù)需實時記錄，包括時間、試劑批次、操作人。

2.原始數(shù)據(jù)（如酶標儀結果）需保存至少2年。

五、廢棄物處理

（一）生物危害物

1.使用專用銳器盒收集細胞培養(yǎng)液。

2.高壓滅菌（121℃，15分鐘）后，按醫(yī)療廢棄物處理。

（二）化學試劑

1.過濾除菌后的廢液需用酸堿中和（pH6-8）。

2.混合后統(tǒng)一倒入實驗室指定收集桶。

六、注意事項

1.操作過程中需全程佩戴手套，避免污染。

2.重復使用器械需先滅菌（高壓滅菌或UV照射）。

3.實驗結束后，用70%酒精徹底消毒操作臺面及設備表面。

**一、概述**

免疫調節(jié)操作規(guī)程旨在為相關實驗操作提供標準化流程，確保實驗結果的準確性和可重復性。本規(guī)程涵蓋免疫調節(jié)實驗的準備工作、操作步驟、質量控制及廢棄物處理等方面，適用于基礎醫(yī)學、生物技術等領域的研究人員。其核心目標是精確評估特定干預因素（如藥物、生物活性分子、環(huán)境刺激等）對免疫系統(tǒng)功能（如細胞活性、分化、細胞因子分泌等）的影響，從而為理解免疫機制或開發(fā)相關應用提供實驗依據(jù)。本規(guī)程的實施有助于減少操作誤差，提高實驗效率，并確保實驗環(huán)境的安全。

**二、準備工作**

（一）實驗環(huán)境

1.實驗區(qū)域選擇：應選擇潔凈度符合實驗要求的實驗室區(qū)域，優(yōu)先考慮生物安全柜附近或專用潔凈操作臺。

2.環(huán)境控制：確保實驗室溫濕度穩(wěn)定在20±2℃，相對濕度控制在40%-60%，以維持細胞培養(yǎng)和試劑的穩(wěn)定性。定期使用溫濕度計進行監(jiān)測。

3.操作臺面消毒：每次實驗前，使用70%酒精對操作臺面進行徹底擦拭消毒，確保表面無菌。對于高風險操作，可在消毒后鋪設無菌操作墊。

4.空氣凈化：若使用生物安全柜，需提前開啟至少30分鐘，啟動紫外燈進行空氣消毒（實驗過程中避免開啟紫外燈）。確認氣流方向正確且穩(wěn)定，防止交叉污染。

（二）試劑與耗材

1.主要試劑：

*免疫調節(jié)劑：需使用高質量來源的產品，明確儲存條件（如-20℃或-80℃）。使用前根據(jù)實驗設計稀釋至預定工作濃度。例如，若研究細胞因子（如TNF-α）的抑制作用，需準備不同濃度的處理液（如0,10,50,100ng/mL）。

*細胞培養(yǎng)基：選擇適合目標細胞的完全培養(yǎng)基，如DMEM/F12（高糖或低糖）、RPMI-1640等。使用前需用0.22μm濾膜過濾除菌，并調節(jié)pH值至7.2-7.4。需準備預溫至37℃的培養(yǎng)基用于細胞復蘇和接種。

*培養(yǎng)基補充劑：如胎牛血清（FBS）、雙抗（青霉素-鏈霉素）、非必需氨基酸（NEAA）等，均需確認質量合格并按說明書使用。建議使用低內源性的FBS或無FBS培養(yǎng)基進行特定實驗。

*無菌PBS緩沖液（0.01M，pH7.4）：用于細胞洗滌、稀釋等操作。同樣需過濾除菌。

*細胞裂解液：若需進行蛋白檢測，需準備無菌、無蛋白降解活性的裂解液（如RIPA裂解液），可加入PMSF等蛋白酶抑制劑。

2.耗材：

*細胞培養(yǎng)耗材：根據(jù)實驗需求選擇合適的培養(yǎng)容器，如細胞培養(yǎng)板（96孔、24孔、6孔板等）、培養(yǎng)瓶、細胞爬片。確保所有耗材均經過高壓滅菌（121℃，15-20分鐘），且為無菌、無熱原。

*移液工具：使用一次性無菌移液器吸頭，根據(jù)所需體積選擇合適量程的移液器。避免重復使用吸頭。

*細胞計數(shù)工具：準備血球計數(shù)板和蓋玻片，或使用細胞計數(shù)儀，用于計數(shù)細胞密度。

*其他：無菌注射器（若需精確加樣）、離心管（根據(jù)體積選擇）、濾膜（0.22μm，用于除菌）、封口膜、一次性手套、實驗室用紙巾等。

（三）儀器設備

1.生物安全柜/超凈工作臺：除啟動前檢查外，操作過程中需保持內部相對負壓，避免用手直接接觸工作臺內壁。定期進行潔凈度檢測（如沉降菌法）。

2.離心機：使用前確認轉子型號與轉速匹配。根據(jù)實驗需求設定轉速（如用于細胞沉淀，示例：1000-2000rpm，5分鐘；用于大分子離心，示例：4000rpm，10分鐘）。結束后需徹底清潔轉子腔。

3.培養(yǎng)箱：確保溫度和CO?濃度控制器準確，使用前校準。定期檢查溫度分布均勻性（可在箱內放置多個溫度計）。

4.酶標儀/多功能微孔板讀數(shù)儀：用于讀取MTT、ELISA等實驗結果。使用前需用校準品進行波長校準（如450nm,570nm,630nm濾光片），并確認讀數(shù)線性范圍。保持比色皿清潔。

5.超純水系統(tǒng)：用于配制試劑和水溶液，確保水質符合實驗要求（電阻率≥18.2MΩ·cm）。

6.移液器校準儀：定期（如每季度）對常用移液器進行校準，確保加樣體積的準確性。

**三、操作步驟**

（一）細胞準備

1.細胞復蘇：

*（1）解凍：將凍存管（如凍存管）從-80℃或液氮中取出，迅速置于37℃水浴中解凍（示例：1-2分鐘），期間輕柔搖晃使內容物均勻。**注意：避免直接置于冰水浴中**。

*（2）轉移：解凍后，立即在生物安全柜內，將細胞懸液轉移至含有預溫（37℃）培養(yǎng)基的無菌離心管中。

*（3）稀釋與計數(shù)：用培養(yǎng)基將細胞稀釋至適宜的接種密度，使用細胞計數(shù)板或計數(shù)儀計數(shù)活細胞數(shù)（通過臺盼藍染色法或活死染色法區(qū)分活細胞），計算細胞懸液濃度。

2.細胞接種：

*（1）準備培養(yǎng)板：在無菌環(huán)境下（生物安全柜內），將96孔板底部用無菌吸頭吸去多余培養(yǎng)基。

*（2）加樣：根據(jù)目標密度，使用移液器將細胞懸液加入每個孔中（示例：1×10?-5×10?cells/well）。注意加樣速度和體積，避免產生氣泡。

*（3）混勻：將培養(yǎng)板在操作臺上輕輕晃動或用移液器吸頭沿孔壁輕柔吹打幾次，使細胞均勻分布。

*（4）培養(yǎng)：將接種好的培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中，開始細胞貼壁培養(yǎng)。培養(yǎng)時間根據(jù)細胞類型和狀態(tài)調整（示例：貼壁細胞24-48小時）。

（二）免疫調節(jié)劑處理

1.試劑稀釋：

*（1）計算：根據(jù)所需工作濃度、培養(yǎng)基體積和耗材孔數(shù)，精確計算所需免疫調節(jié)劑的體積。

*（2）配制：在無菌環(huán)境下，使用無菌移液器吸取所需體積的免疫調節(jié)劑，加入含有無菌PBS或培養(yǎng)基的無菌容器（如離心管）中，充分混勻。

*（3）除菌：若免疫調節(jié)劑本身未除菌或不確定，需使用0.22μm濾膜進行過濾除菌。注意減少樣品損失。

2.細胞處理：

*（1）換液：待細胞貼壁生長至合適狀態(tài)（如80%-90%匯合度），在生物安全柜內吸棄舊培養(yǎng)基。

*（2）加藥：向每個孔中加入計算好的免疫調節(jié)劑處理液，或加入等體積的陰性對照液（僅培養(yǎng)基）。確保對照組設置齊全，包括：無處理陰性對照、僅含培養(yǎng)基的空白對照、陽性對照（使用已知有生物活性的調節(jié)劑或刺激劑）。

*（3）孵育：將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱，根據(jù)實驗設計設定孵育時間（示例：24-72小時），在此期間模擬特定生理或病理條件。

（三）效果評估

1.細胞增殖檢測（MTT法）：

*（1）終止培養(yǎng)：吸棄孔內培養(yǎng)液，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，預溫至37℃）。

*（2）孵育：將培養(yǎng)板放回37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中，孵育4-6小時（根據(jù)細胞類型和狀態(tài)優(yōu)化）。

*（3）結晶溶解：吸棄MTT溶液，每孔加入100-200μLDMSO（預溫至37℃），使用振蕩器或移液器混勻，使甲臜結晶完全溶解。

*（4）酶標儀檢測：使用酶標儀在490nm波長處測定吸光度值（A?90）。設置空白孔（不含細胞、僅含MTT和DMSO）進行調零。

2.細胞因子檢測（ELISA）：

*（1）板條準備：在生物安全柜內，根據(jù)說明書將ELISA板條從鋁箔袋中取出，置于潔凈的板架上。

*（2）加樣（待測樣本/標準品）：根據(jù)實驗設計，使用移液器將樣本或標準品加入對應孔中，每孔100-200μL。注意避免交叉污染，更換吸頭。

*（3）孵育（第一抗體）：將板條置于37℃孵育1-2小時，或根據(jù)說明書優(yōu)化。

*（4）洗滌：吸棄液體，甩干。使用洗板機或手工方法加入洗滌液（示例：300-500μL/孔），靜置1-2分鐘，甩干。重復洗滌5次。

*（5）加樣（酶標抗體）：棄去洗滌液，加入相應辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗體，每孔100-200μL。37℃孵育1小時。

*（6）洗滌：同步驟（4）。

*（7）加底物：吸棄洗滌液，加入TMB底物溶液，每孔100-200μL。避光孵育15-30分鐘（根據(jù)說明書和顏色變化速度調整）。

*（8）終止反應：每孔加入終止液（如2MH?SO?或HCl），100-200μL，混勻。溶液顏色由藍色變?yōu)辄S色。

*（9）酶標儀檢測：立即使用酶標儀在450nm波長處測定吸光度值（A???）。設置空白孔（不含樣本、僅含所有試劑）進行調零。

*（10）結果計算：根據(jù)標準品濃度和吸光度值，繪制標準曲線，計算樣本中細胞因子的濃度（pg/mL或ng/mL）。

3.流式細胞術分析（若需檢測細胞表面/胞內標志物）：

*（1）細胞固定/透化：收集細胞，根據(jù)需要使用固定液（如4%多聚甲醛）固定，或使用透化劑（如0.1%胰蛋白酶+EDTA）處理，以利于抗體進入胞內。

*（2）洗滌：用PBS洗滌細胞1-2次，去除未結合成分。

*（3）加抗體：加入特異性熒光標記抗體，可同時檢測多個標志物。設置同型對照抗體以排除非特異性結合。37℃孵育30-60分鐘，避光。

*（4）洗滌：同步驟（2）。

*（5）上樣：將細胞懸液上樣至流式細胞儀，設置檢測參數(shù)（如激發(fā)波長、檢測通道）。

*（6）數(shù)據(jù)分析：使用流式細胞術軟件（如FlowJo）對數(shù)據(jù)進行分析，計算門控區(qū)域內的細胞比例、平均熒光強度（MFI）等。

**四、質量控制**

（一）實驗重復性

1.復孔設置：每個實驗組應設置至少3個生物學復孔和3個技術復孔。生物學重復可評估個體差異，技術重復可評估操作誤差。

2.數(shù)據(jù)統(tǒng)計：使用合適的統(tǒng)計學方法（如均值±標準差或標準誤）分析數(shù)據(jù)。計算變異系數(shù)（CV），通常要求CV≤10%，以保證實驗穩(wěn)定性。若CV過高，需分析原因并重做。

3.重復實驗：對于關鍵實驗或結果可疑時，應進行重復實驗以驗證結果的可靠性。

（二）陰性對照驗證

1.基線確定：陰性對照（僅培養(yǎng)基或無免疫調節(jié)劑）的結果應作為實驗的基線。所有實驗組的結果應與陰性對照進行比較。

2.吸光度閾值：設定可接受的陰性對照吸光度閾值。例如，在MTT實驗中，若A???>0.1且呈劑量依賴性變化，則提示實驗存