免疫功能檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)流程一、免疫功能檢測(cè)概述

免疫功能檢測(cè)是評(píng)估個(gè)體免疫系統(tǒng)健康狀態(tài)的重要手段，通過一系列檢測(cè)項(xiàng)目可以了解免疫細(xì)胞的數(shù)量、活性以及免疫分子的水平，從而判斷是否存在免疫功能異常。以下是免疫功能檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)流程，涵蓋樣本采集、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及結(jié)果解讀等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

二、樣本采集與處理

（一）樣本類型與要求

1.全血樣本：用于檢測(cè)免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)和功能，需使用肝素抗凝劑。

2.血清樣本：用于檢測(cè)免疫球蛋白、細(xì)胞因子等，需使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝或直接采集血清。

3.唾液樣本：適用于某些非侵入性免疫指標(biāo)檢測(cè)，需避免污染。

（二）采集步驟

1.采樣前準(zhǔn)備：

(1)患者需空腹8-12小時(shí)，避免劇烈運(yùn)動(dòng)。

(2)使用無(wú)菌采血管，嚴(yán)格消毒采樣部位。

2.采樣操作：

(1)全血樣本：采用靜脈穿刺法，采集5-10ml血液。

(2)唾液樣本：指導(dǎo)患者自然漱口后，采集2-3ml唾液。

3.樣本保存：

(1)全血樣本：室溫保存30分鐘內(nèi)送檢，或4℃冷藏。

(2)血清樣本：室溫靜置30分鐘分離血清，-20℃冷凍保存。

三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

（一）免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類

1.流式細(xì)胞術(shù)：通過熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等比例和絕對(duì)計(jì)數(shù)。

2.免疫熒光染色：觀察細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)情況。

（二）免疫分子檢測(cè)

1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：檢測(cè)細(xì)胞因子（如IL-4、TNF-α）、免疫球蛋白（IgG、IgA）等。

2.西門子免疫分析儀：自動(dòng)化檢測(cè)多種免疫標(biāo)志物。

（三）功能檢測(cè)

1.淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)：評(píng)估T細(xì)胞增殖能力。

2.細(xì)胞毒性試驗(yàn)：檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷活性。

四、結(jié)果解讀與報(bào)告

（一）參考值范圍

1.免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)：如CD4+/CD8+比值參考范圍0.7-1.3。

2.細(xì)胞因子水平：如IL-10檢測(cè)范圍10-100pg/ml。

（二）異常結(jié)果分析

1.細(xì)胞減少：提示可能存在免疫缺陷，需進(jìn)一步排查。

2.細(xì)胞比例異常：如CD4+/CD8+比值顯著升高，可能關(guān)聯(lián)自身免疫性疾病。

（三）報(bào)告生成

1.提供定量數(shù)據(jù)及與參考范圍的對(duì)比。

2.附帶圖文解析，標(biāo)注關(guān)鍵指標(biāo)變化趨勢(shì)。

五、注意事項(xiàng)

（一）樣本質(zhì)量控制

1.避免溶血或凝固，影響檢測(cè)結(jié)果。

2.樣本采集后需在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成檢測(cè)。

（二）臨床意義

1.結(jié)合患者臨床癥狀綜合判斷。

2.定期復(fù)查以監(jiān)測(cè)免疫狀態(tài)變化。

免疫功能檢測(cè)需嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)流程，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，為臨床診斷提供科學(xué)依據(jù)。

**一、免疫功能檢測(cè)概述**

免疫功能檢測(cè)是評(píng)估個(gè)體免疫系統(tǒng)整體健康狀態(tài)和功能水平的重要手段。它通過體外檢測(cè)血液、組織液或其他生物樣本中的免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、免疫球蛋白等指標(biāo)，從而判斷免疫系統(tǒng)的平衡狀態(tài)，是否存在免疫增強(qiáng)或免疫缺陷。標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)流程是確保結(jié)果準(zhǔn)確可靠、具有臨床指導(dǎo)意義的基礎(chǔ)。本流程涵蓋了從樣本準(zhǔn)備到結(jié)果解讀的全過程，旨在為臨床醫(yī)生提供系統(tǒng)性、規(guī)范化的檢測(cè)指導(dǎo)。

**二、樣本采集與處理**

（一）樣本類型與要求

1.**全血樣本**：主要用于流式細(xì)胞術(shù)等檢測(cè)，需要評(píng)估免疫細(xì)胞的數(shù)量、比例和表面標(biāo)志物表達(dá)，以判斷T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等群體的狀態(tài)。要求使用含有肝素鋰（LithiumHeparin）或肝素鈉（SodiumHeparin）的抗凝劑，以防止血液凝固并維持細(xì)胞活性。肝素濃度通?？刂圃?.1-0.5IU/mL。禁止使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑，因其可能影響某些免疫細(xì)胞（如T細(xì)胞）的表面標(biāo)志物表達(dá)。

**適用項(xiàng)目示例*：外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD3+、CD4+、CD8+、CD19+細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)與百分比；NK細(xì)胞（CD56+）計(jì)數(shù)與百分比；細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)（如CD25、CD45RA等）。

2.**血清樣本**：主要用于檢測(cè)血漿中的免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）、補(bǔ)體成分、細(xì)胞因子（如IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α、IL-10等）以及過敏原特異性抗體等。要求使用不含促凝劑的采血管（如血清分離管SST管或血清管SST管），采集血液后室溫靜置15-30分鐘，待血液完全凝固后，3000-3500rpm離心10-15分鐘，小心分離上層血清，避免紅細(xì)胞污染。分離后的血清建議-20℃或-80℃凍存，以穩(wěn)定待測(cè)分子。

**適用項(xiàng)目示例*：總免疫球蛋白水平（IgG,IgA,IgM）；補(bǔ)體C3、C4水平；多種細(xì)胞因子濃度檢測(cè)；自身抗體（如ANA、ASO）；過敏原特異性IgE檢測(cè)。

3.**血漿樣本**：若需檢測(cè)未結(jié)合或與蛋白結(jié)合不緊密的細(xì)胞因子、小分子介質(zhì)等，可使用含EDTA、檸檬酸鈉或肝素抗凝劑的采血管。EDTA抗凝對(duì)T細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)干擾較小，是流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)合細(xì)胞因子檢測(cè)的常用選擇。采血后需立即顛倒混勻，防止凝血。

**適用項(xiàng)目示例*：可溶性細(xì)胞因子受體檢測(cè)；游離脂肪酸等小分子檢測(cè)。

4.**其他樣本**：根據(jù)特定檢測(cè)需求，可能還需采集組織活檢樣本（用于檢測(cè)局部免疫細(xì)胞浸潤(rùn)）、尿液樣本（檢測(cè)某些免疫分子代謝產(chǎn)物）、腦脊液（檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫狀態(tài)）或唾液樣本（用于檢測(cè)分泌型免疫球蛋白IgA等非侵入性指標(biāo)）。各類樣本的采集方法需遵循相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程（SOP）。

**適用項(xiàng)目示例*：組織病理學(xué)檢查（免疫組化染色檢測(cè)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)）；尿免疫球蛋白檢測(cè)；腦脊液細(xì)胞計(jì)數(shù)、蛋白、免疫球蛋白和細(xì)胞因子檢測(cè)；唾液IgA檢測(cè)。

（二）采集步驟

1.**采樣前準(zhǔn)備**：

*(1)**核對(duì)信息**：確認(rèn)患者身份信息與標(biāo)本標(biāo)簽一致。

*(2)**知情同意**：向患者解釋采樣過程及目的，獲取知情同意。

*(3)**患者狀態(tài)**：確?；颊咛幱谛菹顟B(tài)，避免空腹（除特定項(xiàng)目要求外）、飲酒、劇烈運(yùn)動(dòng)或使用可能影響免疫指標(biāo)的藥物（如激素、免疫抑制劑等）至少24-48小時(shí)。記錄患者當(dāng)前用藥情況。

*(4)**環(huán)境與設(shè)備**：準(zhǔn)備潔凈的采樣環(huán)境，備齊無(wú)菌采血管、采血針、消毒用品（75%酒精、無(wú)菌棉簽）、標(biāo)本袋/試管架、急救用品等。

*(5)**人員準(zhǔn)備**：采樣人員需經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，掌握無(wú)菌操作和應(yīng)急處理知識(shí)。

2.**采樣操作**：

*(1)**消毒**：用75%酒精棉簽按順時(shí)針或逆時(shí)針方向充分消毒穿刺部位（通常為肘正中靜脈、橈動(dòng)脈或足背靜脈），范圍直徑至少5cm。待酒精自然干燥。

*(2)**穿刺**：一手固定患者手臂，另一手持采血針垂直進(jìn)針，見回血后松開止血帶。根據(jù)所需血量選擇合適規(guī)格的采血管，按順序依次插入，確保采血量準(zhǔn)確無(wú)誤。采血過程中避免過度擠壓血管。

*(3)**抗凝/促凝**：根據(jù)所需樣本類型，及時(shí)更換或確認(rèn)采血管已正確安裝。采集全血樣本時(shí)，需確?？鼓齽┡c血液充分混勻（如采血后立即顛倒混勻5-10次）。

*(4)**采血量**：各項(xiàng)目所需血量不同，通常全血樣本需5-10mL，血清/血漿樣本需根據(jù)抗凝劑類型和檢測(cè)需求決定（如流式細(xì)胞術(shù)通常需要5-10mL全血用于單個(gè)或多個(gè)管染色，血清分離管通常采2-3mL血）。

*(5)**止血與按壓**：采血完畢后，用無(wú)菌棉簽按壓穿刺點(diǎn)至少3-5分鐘，避免形成血腫。不要揉搓穿刺點(diǎn)。

*(6)**標(biāo)記與轉(zhuǎn)運(yùn)**：立即在標(biāo)本標(biāo)簽上清晰注明患者信息、采樣時(shí)間、采樣人員等信息。將標(biāo)本放入符合要求的標(biāo)本袋或試管架，盡快送至實(shí)驗(yàn)室，避免長(zhǎng)時(shí)間室溫暴露或劇烈搖晃。全血樣本需在規(guī)定時(shí)間內(nèi)（通常為4小時(shí)內(nèi)）完成分離或直接檢測(cè)。

3.**樣本保存與運(yùn)輸**：

*(1)**全血樣本**：如需分離血清或血漿，應(yīng)置于室溫（15-25℃）靜置30分鐘（血清）或立即放入冰桶/冷藏箱（4℃）保存，并盡快完成離心。流式細(xì)胞術(shù)所需的全血樣本，若不能立即檢測(cè)，需在4℃保存，并盡量在24小時(shí)內(nèi)完成染色和上機(jī)檢測(cè)，以減少細(xì)胞活力變化和細(xì)胞凋亡對(duì)結(jié)果的影響。

*(2)**血清/血漿樣本**：分離后應(yīng)立即蓋緊管蓋，避免蒸發(fā)。建議-20℃冷凍保存。若樣本量較大或檢測(cè)項(xiàng)目較多，可分裝后凍存，避免反復(fù)凍融。凍存前需記錄凍存條件。某些對(duì)溫度敏感的細(xì)胞因子等，建議-80℃保存以獲得更穩(wěn)定的結(jié)果。

*(3)**運(yùn)輸要求**：使用帶冰袋或保溫箱運(yùn)輸冷藏/冷凍樣本，確保在運(yùn)輸過程中溫度達(dá)標(biāo)。記錄運(yùn)輸時(shí)間和溫度變化情況。

**三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法**

（一）免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類

1.**流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry）**：

*(1)**原理**：利用熒光標(biāo)記的抗細(xì)胞表面抗體（單克隆抗體）或核酸染料，結(jié)合激光激發(fā)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞水平分析，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)參數(shù)（如細(xì)胞數(shù)量、前向散射（FSC）光散度、側(cè)向散射（SSC）光散度、多個(gè)熒光通道信號(hào)強(qiáng)度）。

*(2)**操作步驟**：

a.**樣本處理**：若使用新鮮全血，需根據(jù)抗體組合和細(xì)胞數(shù)量調(diào)整稀釋倍數(shù)。若使用凍存樣本，需在37℃水浴解凍，用含特定濃度血清（如1-5%）的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗1-2次，去除凍存液。

b.**細(xì)胞染色**：在冰浴條件下，將細(xì)胞重懸于冰凍緩沖液（含血清）中，按順序加入不同熒光標(biāo)記的抗體，避光孵育（通常15-30分鐘）。可設(shè)置同型對(duì)照抗體（未標(biāo)記抗體）用于陰性對(duì)照，校正非特異性結(jié)合。

c.**固定與permeabilization（如需）**：對(duì)于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核標(biāo)志物（如細(xì)胞因子、凋亡相關(guān)蛋白），需加入固定液和通透劑（如paraformaldehyde,saponin）。

d.**細(xì)胞因子/核酸染色（如需）**：在固定通透后，加入熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體或核酸染料（如PI,7-AAD）。

e.**上機(jī)檢測(cè)**：將染色好的細(xì)胞懸液上流式細(xì)胞儀，設(shè)置合適的門控區(qū)域（GatingStrategy）以排除細(xì)胞碎片、死細(xì)胞等干擾，采集數(shù)據(jù)。

*(3)**數(shù)據(jù)分析**：使用專用軟件（如FCSExpress,FlowJo）對(duì)采集到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算各免疫細(xì)胞亞群的絕對(duì)計(jì)數(shù)（需結(jié)合樣本稀釋倍數(shù)和儀器設(shè)定的細(xì)胞數(shù)/FL1-H）和百分比?？衫L制直方圖、散點(diǎn)圖、餅圖等進(jìn)行可視化展示。

**關(guān)鍵指標(biāo)示例*：CD3+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)（參考范圍：成人約（0.8-1.7）×10^9/L）；CD4+T輔助細(xì)胞百分比與絕對(duì)計(jì)數(shù)；CD8+T細(xì)胞毒性細(xì)胞百分比與絕對(duì)計(jì)數(shù)；CD19+B淋巴細(xì)胞百分比與絕對(duì)計(jì)數(shù)；NK細(xì)胞（CD56+）百分比與絕對(duì)計(jì)數(shù)；B細(xì)胞亞群（如CD27+記憶B細(xì)胞）分析。

2.**免疫熒光染色（ImmunofluorescenceStaining）**：

*(1)**原理**：主要用于組織切片或細(xì)胞爬片，通過熒光標(biāo)記的抗體檢測(cè)細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)特定抗原的存在和定位。

*(2)**操作步驟**：

a.**樣本制備**：制備組織石蠟切片或細(xì)胞爬片。

b.**脫蠟與復(fù)水**：石蠟切片需經(jīng)過脫蠟至水的過程。

c.**抗原修復(fù)**：使用特定緩沖液（如EDTA,Tris-EDTA）在特定溫度（如37℃或60℃）下處理樣本，以暴露抗原表位。

d.**封閉**：用含血清或BSA的封閉液處理樣本，阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。

e.**一抗孵育**：加入特異性針對(duì)目標(biāo)抗原的單克隆抗體，4℃過夜孵育。

f.**清洗**：用PBS或TBS洗滌樣本，去除未結(jié)合的一抗。

g.**二抗孵育**：加入與一抗宿主物種匹配、且標(biāo)記有熒光素（如AlexaFluor,Cy3,Cy5）的二抗，37℃孵育1小時(shí)。

h.**清洗**：再次洗滌樣本。

i.**封片**：滴加含有DAPI（用于核染色，使細(xì)胞核呈藍(lán)紫色）和抗熒光淬滅劑的封片劑，封片。

j.**觀察與成像**：使用熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察，通過特定濾光片采集不同熒光通道的圖像。

*(3)**結(jié)果判讀**：根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)度和細(xì)胞定位，判斷目標(biāo)抗原的表達(dá)情況?？墒褂脠D像分析軟件進(jìn)行定量分析（如平均熒光強(qiáng)度MFI）。

**應(yīng)用示例*：檢測(cè)組織中的CD3+T細(xì)胞浸潤(rùn)；檢測(cè)B細(xì)胞在淋巴結(jié)微環(huán)境的分布；檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子（如IFN-γ）的表達(dá)。

（二）免疫分子檢測(cè)

1.**酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA）**：

*(1)**原理**：基于抗原抗體特異性結(jié)合和酶促顯色反應(yīng)的固相免疫分析法。將已知抗原或抗體包被在微孔板表面，洗滌后加入待測(cè)樣本，若存在目標(biāo)分子則與之結(jié)合。再加入酶標(biāo)記的抗體（雙抗法）或酶標(biāo)記的抗原（單抗法），洗滌后加入底物，酶催化底物產(chǎn)生顏色變化，通過酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量。

*(2)**操作步驟**：

a.**包被**：將包被液（含包被抗原或抗體）加入微孔板，4℃過夜包被。

b.**洗滌**：用洗滌液（如PBST）洗滌微孔板，去除未結(jié)合物。

c.**封閉**：加入封閉液（含BSA或血清），室溫孵育1-2小時(shí)，封閉非特異性位點(diǎn)。

d.**洗滌**：再次洗滌。

e.**加樣**：加入待測(cè)樣本（血漿、血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清等），設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔?？稍O(shè)復(fù)孔以提高準(zhǔn)確性。

f.**孵育**：室溫孵育1-2小時(shí)，或4℃過夜。

g.**洗滌**：洗滌微孔板。

h.**加酶標(biāo)物**：加入酶標(biāo)記的抗體或抗原，室溫孵育1小時(shí)。

i.**洗滌**：洗滌微孔板。

j.**加底物**：加入顯色底物（如TMB、ABTS），避光孵育15-30分鐘。

k.**終止**：加入終止液（如H2SO4），終止酶促反應(yīng)。

l.**檢測(cè)**：立即使用酶標(biāo)儀在指定波長(zhǎng)（如450nm）測(cè)定吸光度值。

*(3)**數(shù)據(jù)分析**：使用標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對(duì)應(yīng)濃度，或使用軟件進(jìn)行回歸分析計(jì)算樣本濃度。需進(jìn)行質(zhì)控（如空白孔、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照）。

**常見檢測(cè)項(xiàng)目示例*：血清總IgG、IgA、IgM水平；補(bǔ)體C3、C4水平；多種細(xì)胞因子（IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、TNF-α等）；過敏原特異性IgE水平；自身抗體（如類風(fēng)濕因子RF、抗CCP抗體等，雖常稱抗體，但檢測(cè)原理常為ELISA）。

2.**化學(xué)發(fā)光免疫分析（ChemiluminescenceImmunoassay,CLIA）**：

*(1)**原理**：利用酶標(biāo)記的抗體/抗原與待測(cè)物結(jié)合后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在酶的催化下產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)，通過化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)光強(qiáng)度，進(jìn)行定量分析。信號(hào)強(qiáng)度與待測(cè)物濃度成正比。

*(2)**操作步驟**：基本流程與ELISA相似（包被、封閉、加樣本、孵育、洗滌），但后續(xù)步驟不同：

a.**加酶標(biāo)物**：加入酶標(biāo)記的抗體或抗原。

b.**洗滌**。

c.**加底物**：加入化學(xué)發(fā)光底物（如魯米諾類底物）。

d.**檢測(cè)**：立即使用化學(xué)發(fā)光儀在規(guī)定時(shí)間內(nèi)（通常幾分鐘到十幾分鐘）檢測(cè)并記錄峰值或積分光強(qiáng)度。

*(3)**數(shù)據(jù)分析**：使用標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本光強(qiáng)度值計(jì)算濃度。CLIA靈敏度高，線性范圍寬，讀數(shù)速度快，是目前許多高端免疫檢測(cè)平臺(tái)的主流技術(shù)。

**應(yīng)用示例*：同ELISA，尤其在需要更高靈敏度（如超敏CRP、某些腫瘤標(biāo)志物）或更快速出結(jié)果的場(chǎng)合。

3.**西門子免疫分析儀（或其他自動(dòng)化免疫分析儀）**：

*(1)**原理**：通常是時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRFIA）或化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）技術(shù)平臺(tái)，通過自動(dòng)化樣品處理、試劑添加、孵育、洗滌和檢測(cè)過程，實(shí)現(xiàn)多種免疫分子的自動(dòng)定量檢測(cè)。

*(2)**操作步驟**：

a.**樣品準(zhǔn)備**：將血清、血漿或尿液樣本按要求稀釋（如果需要），混勻，置于樣品架。

b.**上機(jī)**：將樣品架放入儀器，設(shè)置檢測(cè)項(xiàng)目、樣本信息、質(zhì)控品信息等。

c.**自動(dòng)運(yùn)行**：儀器根據(jù)預(yù)設(shè)程序自動(dòng)完成樣品稀釋、試劑分配、孵育、洗滌、熒光/化學(xué)發(fā)光信號(hào)檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理。

d.**結(jié)果報(bào)告**：儀器自動(dòng)計(jì)算結(jié)果并生成檢測(cè)報(bào)告。

*(3)**優(yōu)勢(shì)**：提高檢測(cè)效率，減少人為誤差，可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。需定期進(jìn)行儀器校準(zhǔn)、質(zhì)控品檢測(cè)和功能驗(yàn)證，確保結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

**檢測(cè)項(xiàng)目示例*：與上述ELISA/CLIA類似，可涵蓋細(xì)胞因子、免疫球蛋白、補(bǔ)體、炎癥標(biāo)志物等多種指標(biāo)。

（三）功能檢測(cè)

1.**淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)（LymphocyteProliferationTest）**：

*(1)**原理**：T淋巴細(xì)胞在受到有絲分裂原（如植物血凝素PHA）或特異性抗原（如病毒抗原、腫瘤細(xì)胞）刺激后，會(huì)進(jìn)入細(xì)胞周期，進(jìn)行DNA合成，導(dǎo)致細(xì)胞體積增大和核糖體數(shù)量增加，從而使得細(xì)胞在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中前向散射（FSC）值升高。通過測(cè)量刺激組與對(duì)照組（未刺激組）FSC值的差異，可以評(píng)估T細(xì)胞的增殖活性。

*(2)**操作步驟**：

a.**樣本處理**：分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），通常使用密度梯度離心法（如Ficoll-Hypaque）。

b.**接種與刺激**：將PBMCs重懸于含特定濃度血清的完全培養(yǎng)基中，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。設(shè)立空白孔（僅培養(yǎng)基，用于背景校正）、PHA刺激孔（作為非特異性刺激對(duì)照）和/或特異性抗原刺激孔（如結(jié)核分枝桿菌純蛋白衍生物PPD、特定腫瘤相關(guān)抗原肽）。同時(shí)設(shè)未刺激對(duì)照組。

c.**孵育**：在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48-72小時(shí)（PHA刺激通常48小時(shí)，特異性抗原刺激可能需要更長(zhǎng)時(shí)間）。

d.**細(xì)胞染色**：培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，用特定緩沖液洗滌，重懸后加入能反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的熒光染料，最常用的是膜聯(lián)蛋白V（AnnexinV）結(jié)合/PI染色法。AnnexinV識(shí)別細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻，PI染料進(jìn)入細(xì)胞核。增殖細(xì)胞通常會(huì)經(jīng)歷G1期到S期的轉(zhuǎn)變，核DNA含量增加，對(duì)PI的攝取能力增強(qiáng)。

e.**上機(jī)檢測(cè)**：使用流式細(xì)胞儀，通過設(shè)門區(qū)（如活細(xì)胞區(qū)R1，排除死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞）和檢測(cè)FL1-H（AnnexinV）和FL2-H（PI）通道，分析細(xì)胞群體變化。

*(3)**結(jié)果判讀**：比較刺激組與未刺激對(duì)照組在FL2-H（PI）維度上的平均熒光強(qiáng)度（MFI）差異。MFI升高表明細(xì)胞增殖增強(qiáng)。也可繪制細(xì)胞圖譜，觀察細(xì)胞從活細(xì)胞（AnnexinV陰性，PI陰性）向晚期內(nèi)化細(xì)胞（AnnexinV陽(yáng)性，PI陰性）再到死細(xì)胞（AnnexinV陽(yáng)性，PI陽(yáng)性）的轉(zhuǎn)變過程。

**臨床意義示例*：評(píng)估細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，用于診斷某些免疫缺陷病；監(jiān)測(cè)移植排斥反應(yīng)；評(píng)價(jià)疫苗免疫原性。

2.**細(xì)胞毒性試驗(yàn)（CytotoxicityAssay）**：

*(1)**原理**：檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞（如NK細(xì)胞、活化的T細(xì)胞）殺傷靶細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞）的能力。常用的方法是基于靶細(xì)胞裂解后釋放細(xì)胞內(nèi)容物，使熒光染料（如MTT、XTT、AlamarBlue）還原成水溶性的形式（Formazan結(jié)晶），通過測(cè)定結(jié)晶的吸光度值反映細(xì)胞損傷程度。或檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞表面釋放顆粒酶（如GranzymeB）導(dǎo)致靶細(xì)胞DNA降解（如TUNEL法）。

*(2)**操作步驟（以MTT法為例）**：

a.**細(xì)胞準(zhǔn)備**：分離效應(yīng)細(xì)胞（如NK細(xì)胞）和靶細(xì)胞（如K562腫瘤細(xì)胞），調(diào)整細(xì)胞濃度至適宜范圍。

b.**混合培養(yǎng)**：將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按不同效靶比（如10:1,20:1,50:1）混合，置于96孔板中培養(yǎng)。

c.**設(shè)置對(duì)照**：設(shè)立僅靶細(xì)胞的孔（靶細(xì)胞自發(fā)裂解對(duì)照）、僅效應(yīng)細(xì)胞的孔（效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)代謝對(duì)照）和僅培養(yǎng)基的孔（背景對(duì)照）。

d.**孵育**：在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4-6小時(shí)（MTT法）或18-24小時(shí)（XTT法）。

e.**加MTT**：每孔加入MTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4小時(shí)（XTT法為3-4小時(shí)）。

f.**終止與溶解**：小心吸棄上清液，每孔加入DMSO（DimethylSulfoxide）100-200μL，震蕩或溫和吹打使Formazan結(jié)晶完全溶解。

g.**檢測(cè)**：使用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（使用參考波長(zhǎng)如630nm或650nm校正背景）。

*(3)**結(jié)果判讀**：計(jì)算殺傷率=[(靶細(xì)胞對(duì)照組吸光度-效應(yīng)細(xì)胞組吸光度)/靶細(xì)胞對(duì)照組吸光度]×100%。繪制殺傷率與效靶比的關(guān)系曲線，計(jì)算半數(shù)殺傷濃度（EC50）。

**臨床意義示例*：評(píng)價(jià)NK細(xì)胞功能；監(jiān)測(cè)腫瘤患者免疫治療效果；篩選具有細(xì)胞毒活性的免疫細(xì)胞或藥物。

3.**遲發(fā)型超敏反應(yīng)（Delayed-TypeHypersensitivity,DTH）皮膚試驗(yàn)**：

*(1)**原理**：檢測(cè)T細(xì)胞介導(dǎo)的IV型（遲發(fā)型）超敏反應(yīng)。當(dāng)機(jī)體預(yù)先接觸過某種抗原（如結(jié)核菌素、純蛋白衍生物PPD），其體內(nèi)會(huì)存在對(duì)該抗原特異性的致敏T細(xì)胞。再次接觸該抗原時(shí)，致敏T細(xì)胞被激活，釋放細(xì)胞因子（如IL-2、IFN-γ），導(dǎo)致巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、單核細(xì)胞聚集和浸潤(rùn)，并在局部引起以單核細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的炎癥反應(yīng)和滲出，表現(xiàn)為皮膚紅腫硬結(jié)。

*(2)**操作步驟**：

a.**皮試前評(píng)估**：詢問患者過敏史、用藥史，檢查皮膚有無(wú)皮疹、破損。告知皮試過程和可能出現(xiàn)的反應(yīng)。

b.**選擇部位**：通常選擇前臂內(nèi)側(cè)或上臂。

c.**制備皮內(nèi)注射液**：使用標(biāo)準(zhǔn)化的皮試抗原（如PPD溶液，含5IU/mL結(jié)核菌素純蛋白衍生物），用無(wú)菌生理鹽水按需稀釋至適宜濃度（如0.1mL含0.05mL原液）。

d.**注射**：用75%酒精消毒皮膚，待干。用皮內(nèi)注射針進(jìn)行皮內(nèi)注射，使形成直徑約6mm的皮丘。每側(cè)注射0.1mL。

e.**標(biāo)記與觀察**：注射后立即標(biāo)記注射部位。囑患者避免按壓，4-6小時(shí)內(nèi)避免接觸水。

f.**讀數(shù)**：皮試后48-72小時(shí)（通常48-60小時(shí)）觀察并記錄結(jié)果。

*(3)**結(jié)果判讀**：根據(jù)紅暈和硬結(jié)的大小進(jìn)行評(píng)分（如0=無(wú)反應(yīng)；1=<5mm紅暈，無(wú)硬結(jié)；2=5-9mm紅暈，硬結(jié)<5mm；3=≥10mm紅暈，硬結(jié)≥5mm；4=紅暈和硬結(jié)均>10mm，或出現(xiàn)水皰、壞死）。陽(yáng)性反應(yīng)通常指硬結(jié)直徑≥5mm。需同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（注射生理鹽水）和陽(yáng)性對(duì)照（注射標(biāo)準(zhǔn)PPD溶液）。

**臨床意義示例*：輔助診斷結(jié)核感染；評(píng)估細(xì)胞免疫功能（DTH陽(yáng)性通常提示細(xì)胞免疫尚可）。

**四、結(jié)果解讀與報(bào)告**

（一）參考值范圍

免疫檢測(cè)項(xiàng)目的參考值通?；诮】党赡耆巳旱臋z測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)得出，但會(huì)因年齡、性別、種族、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法、儀器、試劑等因素存在差異。因此，結(jié)果解讀必須結(jié)合實(shí)驗(yàn)室提供的具體參考范圍。以下為部分指標(biāo)的示例參考范圍（請(qǐng)注意，這些僅為示例，實(shí)際范圍請(qǐng)以本實(shí)驗(yàn)室提供的為準(zhǔn)）：

1.**免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)**：

*外周血白細(xì)胞：成人（4.0-10.0）×10^9/L

*淋巴細(xì)胞：成人（1.0-3.0）×10^9/L

*淋巴細(xì)胞亞群：CD4+T細(xì)胞百分比（成人約20%-60%），CD8+T細(xì)胞百分比（成人約15%-50%），CD4+/CD8+比值（成人約0.7-1.3）

*NK細(xì)胞百分比（成人約5%-15%）

*B細(xì)胞百分比（成人約8%-20%）

2.**免疫球蛋白**：

*IgG：成人（7.0-16.0）g/L

*IgA：成人（0.7-4.0）g/L

*IgM：成人（0.4-2.5）g/L

3.**補(bǔ)體**：

*C3：成人（0.9-1.8）g/L

*C4：成人（0.1-0.4）g/L

4.**細(xì)胞因子**（示例濃度，單位通常為pg/mL或ng/L）：

*TNF-α：resting<10pg/mL,stimulated(PHA)可升高

*IL-2：resting<5pg/mL,stimulated(PHA)顯著升高

*IL-4：resting<5pg/mL,stimulated(PHA)可升高

*IL-10：resting<15pg/mL,stimulated(PHA)可升高

*IFN-γ：resting<5pg/mL,stimulated(PHA)顯著升高

5.**遲發(fā)型超敏反應(yīng)（DTH）**：

*PPD皮試硬結(jié)直徑≥5mm為陽(yáng)性（成人）

（二）異常結(jié)果分析

免疫檢測(cè)結(jié)果超出參考范圍，需要結(jié)合患者的臨床癥狀、病史和其他檢查結(jié)果進(jìn)行綜合分析，判斷其臨床意義。常見異常情況及其可能原因包括：

1.**細(xì)胞減少**：

*T細(xì)胞減少（尤其是CD4+細(xì)胞）：

*(1)免疫缺陷?。ㄈ绨滩IV感染晚期、選擇性IgA缺乏癥等）。

*(2)免疫抑制治療（如長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素、化療藥物）。

*(3)某些感染（如病毒感染、結(jié)核病）。

*(4)藥物引起的免疫抑制。

*B細(xì)胞減少：

*(1)免疫缺陷?。ㄈ鏧連鎖低丙種球蛋白血癥）。

*(2)慢性感染或炎癥。

*(3)某些自身免疫病。

*NK細(xì)胞減少：

*(1)免疫缺陷?。ㄈ缏灶w粒缺乏癥）。

*(2)免疫抑制狀態(tài)。

*(3)某些病毒感染。

2.**細(xì)胞比例異常**：

*CD4+/CD8+比值顯著升高：

*(1)可能提示自身免疫性疾?。ㄈ珙愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征）。

*(2)也可見于某些感染（如EB病毒感染）。

*(3)需結(jié)合其他指標(biāo)綜合判斷。

*Treg細(xì)胞（調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）比例或功能異常（可通過特定方法檢測(cè)）：

*(1)可能與自身免疫病活動(dòng)度相關(guān)。

*(2)與腫瘤免疫逃逸有關(guān)。

3.**免疫球蛋白異常**：

*總IgG、IgA、IgM水平顯著升高（高球蛋白血癥）：

*(1)多發(fā)性骨髓瘤（單克隆丙種球蛋白血癥）。

*(2)慢性感染（如慢性乙肝、結(jié)核?。?/p>

*(3)某些自身免疫病。

*總IgG、IgA、IgM水平顯著降低（低球蛋白血癥）：

*(1)選擇性IgA缺乏癥。

*(2)免疫缺陷病。

*(3)慢性耗竭狀態(tài)（如長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素）。

*(4)肝病。

4.**細(xì)胞因子水平異常**：

*Th1型細(xì)胞因子（如IFN-γ、TNF-α）升高：

*(1)接觸性皮炎、銀屑病等Th1型超敏反應(yīng)或炎癥。

*(2)慢性感染（如結(jié)核病、病毒感染）。

*Th2型細(xì)胞因子（如IL-4、IL-5、IL-13）升高：

*(1)I型超敏反應(yīng)（過敏性疾病，如哮喘、過敏性鼻炎）。

*(2)某些寄生蟲感染。

*抗炎細(xì)胞因子（如IL-10）升高：

*(1)機(jī)體對(duì)過度炎癥的調(diào)節(jié)反應(yīng)。

*(2)某些腫瘤或慢性炎癥狀態(tài)。

5.**DTH試驗(yàn)陽(yáng)性/陰性**：

*陽(yáng)性：通常提示存在對(duì)結(jié)核菌的感染，或細(xì)胞免疫功能尚可。需結(jié)合PPD強(qiáng)度、感染史、其他免疫指標(biāo)判斷。

*陰性：不能完全排除結(jié)核感染（尤其在免疫抑制狀態(tài)下），但可能提示細(xì)胞免疫功能低下。

（三）報(bào)告生成

免疫檢測(cè)報(bào)告應(yīng)包含以下核心信息：

1.**患者基本信息**：姓名、性別、年齡、住院號(hào)/門診號(hào)、采樣日期、采樣時(shí)間。

2.**樣本信息**：樣本類型（全血、血清等）、樣本量、標(biāo)本編號(hào)。

3.**檢測(cè)項(xiàng)目**：列出所有檢測(cè)的項(xiàng)目名稱。

4.**檢測(cè)結(jié)果**：以列表形式清晰展示每個(gè)項(xiàng)目的具體測(cè)定值，單位明確。

5.**參考范圍**：為每個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目提供本實(shí)驗(yàn)室的參考值范圍，并注明檢測(cè)方法。

6.**質(zhì)控信息**：報(bào)告應(yīng)包含當(dāng)天的室內(nèi)質(zhì)控（IQC）結(jié)果（如質(zhì)控品濃度、標(biāo)準(zhǔn)差、CV），以及室間質(zhì)量評(píng)價(jià)（EQA）結(jié)果（如有）。所有質(zhì)控結(jié)果應(yīng)在控內(nèi)。

7.**異常結(jié)果提示**：對(duì)超出參考范圍的結(jié)果進(jìn)行高亮或標(biāo)注，可提供簡(jiǎn)單的臨床意義說(shuō)明（如“提示細(xì)胞免疫功能可能低下”）。

8.**報(bào)告日期與簽發(fā)人**：注明報(bào)告完成日期和檢驗(yàn)醫(yī)師簽名。

9.**圖文解析（可選）**：對(duì)于復(fù)雜的檢測(cè)項(xiàng)目（如流式細(xì)胞術(shù)多參數(shù)分析、細(xì)胞因子譜），可附上簡(jiǎn)明的圖表（如散點(diǎn)圖、柱狀圖、熱圖）輔助結(jié)果解讀。

10.**注意事項(xiàng)**：說(shuō)明結(jié)果解讀需結(jié)合臨床，部分指標(biāo)可能受多種因素影響。

**五、注意事項(xiàng)**

（一）樣本質(zhì)量控制

1.**抗凝劑選擇**：嚴(yán)格遵守不同檢測(cè)項(xiàng)目對(duì)抗凝劑的要求，避免交叉污染。EDTA抗凝劑可能影響某些細(xì)胞因子和細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物的檢測(cè)，需特別注意。

2.**樣本處理**：全血樣本需在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成分離，避免長(zhǎng)時(shí)間室溫暴露導(dǎo)致細(xì)胞活性改變或溶血。血清/血漿樣本避免反復(fù)凍融。

3.**運(yùn)輸條件**：冷藏/冷凍樣本需全程維持規(guī)定溫度，防止降解。記錄運(yùn)輸過程中的溫度變化。

4.**及時(shí)檢測(cè)**：新鮮樣本（尤其是全血樣本用于流式染色）應(yīng)盡快檢測(cè)，減少細(xì)胞活力變化和細(xì)胞凋亡對(duì)結(jié)果的影響。對(duì)于需要凍存的樣本，應(yīng)在凍存前確認(rèn)無(wú)溶血和脂血干擾。

5.**室內(nèi)質(zhì)控（IQC）**：每次檢測(cè)均需使用至少2個(gè)水平的質(zhì)控品，確保檢測(cè)系統(tǒng)在控。質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)需進(jìn)行趨勢(shì)分析，及時(shí)發(fā)現(xiàn)潛在問題。

6.**室間質(zhì)量評(píng)價(jià)（EQA）**：定期參加國(guó)家或地區(qū)組織的EQA計(jì)劃，確保實(shí)驗(yàn)室結(jié)果與同行結(jié)果具有可比性。

（二）臨床意義

1.**綜合判斷**：免疫功能檢測(cè)結(jié)果是診斷和評(píng)估疾病的重要依據(jù)，但必須結(jié)合患者的臨床癥狀、體征、病史和其他輔助檢查結(jié)果進(jìn)行綜合分析，不能僅憑單一指標(biāo)下結(jié)論。

2.**動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)**：免疫功能狀態(tài)可能隨疾病進(jìn)程或治療變化而動(dòng)態(tài)改變，對(duì)于需要長(zhǎng)期隨訪的患者（如慢性疾病患者、免疫抑制治療患者），應(yīng)定期復(fù)查。

3.**個(gè)體化差異**：不同個(gè)體（年齡、性別、種族）的免疫功能存在差異，解讀結(jié)果時(shí)應(yīng)考慮這些因素。

4.**避免干擾**：告知臨床醫(yī)生患者近期是否使用過可能影響免疫指標(biāo)的藥物（如激素、免疫抑制劑、抗病毒藥物等），以便更好地解讀結(jié)果。

免疫功能檢測(cè)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診斷中的重要組成部分，通過標(biāo)準(zhǔn)化的流程和科學(xué)的解讀，可以為臨床提供寶貴的免疫學(xué)信息，助力疾病的診斷、治療監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估。

一、免疫功能檢測(cè)概述

免疫功能檢測(cè)是評(píng)估個(gè)體免疫系統(tǒng)健康狀態(tài)的重要手段，通過一系列檢測(cè)項(xiàng)目可以了解免疫細(xì)胞的數(shù)量、活性以及免疫分子的水平，從而判斷是否存在免疫功能異常。以下是免疫功能檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)流程，涵蓋樣本采集、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及結(jié)果解讀等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

二、樣本采集與處理

（一）樣本類型與要求

1.全血樣本：用于檢測(cè)免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)和功能，需使用肝素抗凝劑。

2.血清樣本：用于檢測(cè)免疫球蛋白、細(xì)胞因子等，需使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝或直接采集血清。

3.唾液樣本：適用于某些非侵入性免疫指標(biāo)檢測(cè)，需避免污染。

（二）采集步驟

1.采樣前準(zhǔn)備：

(1)患者需空腹8-12小時(shí)，避免劇烈運(yùn)動(dòng)。

(2)使用無(wú)菌采血管，嚴(yán)格消毒采樣部位。

2.采樣操作：

(1)全血樣本：采用靜脈穿刺法，采集5-10ml血液。

(2)唾液樣本：指導(dǎo)患者自然漱口后，采集2-3ml唾液。

3.樣本保存：

(1)全血樣本：室溫保存30分鐘內(nèi)送檢，或4℃冷藏。

(2)血清樣本：室溫靜置30分鐘分離血清，-20℃冷凍保存。

三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

（一）免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類

1.流式細(xì)胞術(shù)：通過熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等比例和絕對(duì)計(jì)數(shù)。

2.免疫熒光染色：觀察細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)情況。

（二）免疫分子檢測(cè)

1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：檢測(cè)細(xì)胞因子（如IL-4、TNF-α）、免疫球蛋白（IgG、IgA）等。

2.西門子免疫分析儀：自動(dòng)化檢測(cè)多種免疫標(biāo)志物。

（三）功能檢測(cè)

1.淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)：評(píng)估T細(xì)胞增殖能力。

2.細(xì)胞毒性試驗(yàn)：檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷活性。

四、結(jié)果解讀與報(bào)告

（一）參考值范圍

1.免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)：如CD4+/CD8+比值參考范圍0.7-1.3。

2.細(xì)胞因子水平：如IL-10檢測(cè)范圍10-100pg/ml。

（二）異常結(jié)果分析

1.細(xì)胞減少：提示可能存在免疫缺陷，需進(jìn)一步排查。

2.細(xì)胞比例異常：如CD4+/CD8+比值顯著升高，可能關(guān)聯(lián)自身免疫性疾病。

（三）報(bào)告生成

1.提供定量數(shù)據(jù)及與參考范圍的對(duì)比。

2.附帶圖文解析，標(biāo)注關(guān)鍵指標(biāo)變化趨勢(shì)。

五、注意事項(xiàng)

（一）樣本質(zhì)量控制

1.避免溶血或凝固，影響檢測(cè)結(jié)果。

2.樣本采集后需在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成檢測(cè)。

（二）臨床意義

1.結(jié)合患者臨床癥狀綜合判斷。

2.定期復(fù)查以監(jiān)測(cè)免疫狀態(tài)變化。

免疫功能檢測(cè)需嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)流程，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，為臨床診斷提供科學(xué)依據(jù)。

**一、免疫功能檢測(cè)概述**

免疫功能檢測(cè)是評(píng)估個(gè)體免疫系統(tǒng)整體健康狀態(tài)和功能水平的重要手段。它通過體外檢測(cè)血液、組織液或其他生物樣本中的免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、免疫球蛋白等指標(biāo)，從而判斷免疫系統(tǒng)的平衡狀態(tài)，是否存在免疫增強(qiáng)或免疫缺陷。標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)流程是確保結(jié)果準(zhǔn)確可靠、具有臨床指導(dǎo)意義的基礎(chǔ)。本流程涵蓋了從樣本準(zhǔn)備到結(jié)果解讀的全過程，旨在為臨床醫(yī)生提供系統(tǒng)性、規(guī)范化的檢測(cè)指導(dǎo)。

**二、樣本采集與處理**

（一）樣本類型與要求

1.**全血樣本**：主要用于流式細(xì)胞術(shù)等檢測(cè)，需要評(píng)估免疫細(xì)胞的數(shù)量、比例和表面標(biāo)志物表達(dá)，以判斷T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等群體的狀態(tài)。要求使用含有肝素鋰（LithiumHeparin）或肝素鈉（SodiumHeparin）的抗凝劑，以防止血液凝固并維持細(xì)胞活性。肝素濃度通?？刂圃?.1-0.5IU/mL。禁止使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑，因其可能影響某些免疫細(xì)胞（如T細(xì)胞）的表面標(biāo)志物表達(dá)。

**適用項(xiàng)目示例*：外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD3+、CD4+、CD8+、CD19+細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)與百分比；NK細(xì)胞（CD56+）計(jì)數(shù)與百分比；細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)（如CD25、CD45RA等）。

2.**血清樣本**：主要用于檢測(cè)血漿中的免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）、補(bǔ)體成分、細(xì)胞因子（如IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α、IL-10等）以及過敏原特異性抗體等。要求使用不含促凝劑的采血管（如血清分離管SST管或血清管SST管），采集血液后室溫靜置15-30分鐘，待血液完全凝固后，3000-3500rpm離心10-15分鐘，小心分離上層血清，避免紅細(xì)胞污染。分離后的血清建議-20℃或-80℃凍存，以穩(wěn)定待測(cè)分子。

**適用項(xiàng)目示例*：總免疫球蛋白水平（IgG,IgA,IgM）；補(bǔ)體C3、C4水平；多種細(xì)胞因子濃度檢測(cè)；自身抗體（如ANA、ASO）；過敏原特異性IgE檢測(cè)。

3.**血漿樣本**：若需檢測(cè)未結(jié)合或與蛋白結(jié)合不緊密的細(xì)胞因子、小分子介質(zhì)等，可使用含EDTA、檸檬酸鈉或肝素抗凝劑的采血管。EDTA抗凝對(duì)T細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)干擾較小，是流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)合細(xì)胞因子檢測(cè)的常用選擇。采血后需立即顛倒混勻，防止凝血。

**適用項(xiàng)目示例*：可溶性細(xì)胞因子受體檢測(cè)；游離脂肪酸等小分子檢測(cè)。

4.**其他樣本**：根據(jù)特定檢測(cè)需求，可能還需采集組織活檢樣本（用于檢測(cè)局部免疫細(xì)胞浸潤(rùn)）、尿液樣本（檢測(cè)某些免疫分子代謝產(chǎn)物）、腦脊液（檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫狀態(tài)）或唾液樣本（用于檢測(cè)分泌型免疫球蛋白IgA等非侵入性指標(biāo)）。各類樣本的采集方法需遵循相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程（SOP）。

**適用項(xiàng)目示例*：組織病理學(xué)檢查（免疫組化染色檢測(cè)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)）；尿免疫球蛋白檢測(cè)；腦脊液細(xì)胞計(jì)數(shù)、蛋白、免疫球蛋白和細(xì)胞因子檢測(cè)；唾液IgA檢測(cè)。

（二）采集步驟

1.**采樣前準(zhǔn)備**：

*(1)**核對(duì)信息**：確認(rèn)患者身份信息與標(biāo)本標(biāo)簽一致。

*(2)**知情同意**：向患者解釋采樣過程及目的，獲取知情同意。

*(3)**患者狀態(tài)**：確?；颊咛幱谛菹顟B(tài)，避免空腹（除特定項(xiàng)目要求外）、飲酒、劇烈運(yùn)動(dòng)或使用可能影響免疫指標(biāo)的藥物（如激素、免疫抑制劑等）至少24-48小時(shí)。記錄患者當(dāng)前用藥情況。

*(4)**環(huán)境與設(shè)備**：準(zhǔn)備潔凈的采樣環(huán)境，備齊無(wú)菌采血管、采血針、消毒用品（75%酒精、無(wú)菌棉簽）、標(biāo)本袋/試管架、急救用品等。

*(5)**人員準(zhǔn)備**：采樣人員需經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，掌握無(wú)菌操作和應(yīng)急處理知識(shí)。

2.**采樣操作**：

*(1)**消毒**：用75%酒精棉簽按順時(shí)針或逆時(shí)針方向充分消毒穿刺部位（通常為肘正中靜脈、橈動(dòng)脈或足背靜脈），范圍直徑至少5cm。待酒精自然干燥。

*(2)**穿刺**：一手固定患者手臂，另一手持采血針垂直進(jìn)針，見回血后松開止血帶。根據(jù)所需血量選擇合適規(guī)格的采血管，按順序依次插入，確保采血量準(zhǔn)確無(wú)誤。采血過程中避免過度擠壓血管。

*(3)**抗凝/促凝**：根據(jù)所需樣本類型，及時(shí)更換或確認(rèn)采血管已正確安裝。采集全血樣本時(shí)，需確?？鼓齽┡c血液充分混勻（如采血后立即顛倒混勻5-10次）。

*(4)**采血量**：各項(xiàng)目所需血量不同，通常全血樣本需5-10mL，血清/血漿樣本需根據(jù)抗凝劑類型和檢測(cè)需求決定（如流式細(xì)胞術(shù)通常需要5-10mL全血用于單個(gè)或多個(gè)管染色，血清分離管通常采2-3mL血）。

*(5)**止血與按壓**：采血完畢后，用無(wú)菌棉簽按壓穿刺點(diǎn)至少3-5分鐘，避免形成血腫。不要揉搓穿刺點(diǎn)。

*(6)**標(biāo)記與轉(zhuǎn)運(yùn)**：立即在標(biāo)本標(biāo)簽上清晰注明患者信息、采樣時(shí)間、采樣人員等信息。將標(biāo)本放入符合要求的標(biāo)本袋或試管架，盡快送至實(shí)驗(yàn)室，避免長(zhǎng)時(shí)間室溫暴露或劇烈搖晃。全血樣本需在規(guī)定時(shí)間內(nèi)（通常為4小時(shí)內(nèi)）完成分離或直接檢測(cè)。

3.**樣本保存與運(yùn)輸**：

*(1)**全血樣本**：如需分離血清或血漿，應(yīng)置于室溫（15-25℃）靜置30分鐘（血清）或立即放入冰桶/冷藏箱（4℃）保存，并盡快完成離心。流式細(xì)胞術(shù)所需的全血樣本，若不能立即檢測(cè)，需在4℃保存，并盡量在24小時(shí)內(nèi)完成染色和上機(jī)檢測(cè)，以減少細(xì)胞活力變化和細(xì)胞凋亡對(duì)結(jié)果的影響。

*(2)**血清/血漿樣本**：分離后應(yīng)立即蓋緊管蓋，避免蒸發(fā)。建議-20℃冷凍保存。若樣本量較大或檢測(cè)項(xiàng)目較多，可分裝后凍存，避免反復(fù)凍融。凍存前需記錄凍存條件。某些對(duì)溫度敏感的細(xì)胞因子等，建議-80℃保存以獲得更穩(wěn)定的結(jié)果。

*(3)**運(yùn)輸要求**：使用帶冰袋或保溫箱運(yùn)輸冷藏/冷凍樣本，確保在運(yùn)輸過程中溫度達(dá)標(biāo)。記錄運(yùn)輸時(shí)間和溫度變化情況。

**三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法**

（一）免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類

1.**流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry）**：

*(1)**原理**：利用熒光標(biāo)記的抗細(xì)胞表面抗體（單克隆抗體）或核酸染料，結(jié)合激光激發(fā)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞水平分析，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)參數(shù)（如細(xì)胞數(shù)量、前向散射（FSC）光散度、側(cè)向散射（SSC）光散度、多個(gè)熒光通道信號(hào)強(qiáng)度）。

*(2)**操作步驟**：

a.**樣本處理**：若使用新鮮全血，需根據(jù)抗體組合和細(xì)胞數(shù)量調(diào)整稀釋倍數(shù)。若使用凍存樣本，需在37℃水浴解凍，用含特定濃度血清（如1-5%）的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗1-2次，去除凍存液。

b.**細(xì)胞染色**：在冰浴條件下，將細(xì)胞重懸于冰凍緩沖液（含血清）中，按順序加入不同熒光標(biāo)記的抗體，避光孵育（通常15-30分鐘）?？稍O(shè)置同型對(duì)照抗體（未標(biāo)記抗體）用于陰性對(duì)照，校正非特異性結(jié)合。

c.**固定與permeabilization（如需）**：對(duì)于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核標(biāo)志物（如細(xì)胞因子、凋亡相關(guān)蛋白），需加入固定液和通透劑（如paraformaldehyde,saponin）。

d.**細(xì)胞因子/核酸染色（如需）**：在固定通透后，加入熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體或核酸染料（如PI,7-AAD）。

e.**上機(jī)檢測(cè)**：將染色好的細(xì)胞懸液上流式細(xì)胞儀，設(shè)置合適的門控區(qū)域（GatingStrategy）以排除細(xì)胞碎片、死細(xì)胞等干擾，采集數(shù)據(jù)。

*(3)**數(shù)據(jù)分析**：使用專用軟件（如FCSExpress,FlowJo）對(duì)采集到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算各免疫細(xì)胞亞群的絕對(duì)計(jì)數(shù)（需結(jié)合樣本稀釋倍數(shù)和儀器設(shè)定的細(xì)胞數(shù)/FL1-H）和百分比。可繪制直方圖、散點(diǎn)圖、餅圖等進(jìn)行可視化展示。

**關(guān)鍵指標(biāo)示例*：CD3+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)（參考范圍：成人約（0.8-1.7）×10^9/L）；CD4+T輔助細(xì)胞百分比與絕對(duì)計(jì)數(shù)；CD8+T細(xì)胞毒性細(xì)胞百分比與絕對(duì)計(jì)數(shù)；CD19+B淋巴細(xì)胞百分比與絕對(duì)計(jì)數(shù)；NK細(xì)胞（CD56+）百分比與絕對(duì)計(jì)數(shù)；B細(xì)胞亞群（如CD27+記憶B細(xì)胞）分析。

2.**免疫熒光染色（ImmunofluorescenceStaining）**：

*(1)**原理**：主要用于組織切片或細(xì)胞爬片，通過熒光標(biāo)記的抗體檢測(cè)細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)特定抗原的存在和定位。

*(2)**操作步驟**：

a.**樣本制備**：制備組織石蠟切片或細(xì)胞爬片。

b.**脫蠟與復(fù)水**：石蠟切片需經(jīng)過脫蠟至水的過程。

c.**抗原修復(fù)**：使用特定緩沖液（如EDTA,Tris-EDTA）在特定溫度（如37℃或60℃）下處理樣本，以暴露抗原表位。

d.**封閉**：用含血清或BSA的封閉液處理樣本，阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。

e.**一抗孵育**：加入特異性針對(duì)目標(biāo)抗原的單克隆抗體，4℃過夜孵育。

f.**清洗**：用PBS或TBS洗滌樣本，去除未結(jié)合的一抗。

g.**二抗孵育**：加入與一抗宿主物種匹配、且標(biāo)記有熒光素（如AlexaFluor,Cy3,Cy5）的二抗，37℃孵育1小時(shí)。

h.**清洗**：再次洗滌樣本。

i.**封片**：滴加含有DAPI（用于核染色，使細(xì)胞核呈藍(lán)紫色）和抗熒光淬滅劑的封片劑，封片。

j.**觀察與成像**：使用熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察，通過特定濾光片采集不同熒光通道的圖像。

*(3)**結(jié)果判讀**：根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)度和細(xì)胞定位，判斷目標(biāo)抗原的表達(dá)情況。可使用圖像分析軟件進(jìn)行定量分析（如平均熒光強(qiáng)度MFI）。

**應(yīng)用示例*：檢測(cè)組織中的CD3+T細(xì)胞浸潤(rùn)；檢測(cè)B細(xì)胞在淋巴結(jié)微環(huán)境的分布；檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子（如IFN-γ）的表達(dá)。

（二）免疫分子檢測(cè)

1.**酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA）**：

*(1)**原理**：基于抗原抗體特異性結(jié)合和酶促顯色反應(yīng)的固相免疫分析法。將已知抗原或抗體包被在微孔板表面，洗滌后加入待測(cè)樣本，若存在目標(biāo)分子則與之結(jié)合。再加入酶標(biāo)記的抗體（雙抗法）或酶標(biāo)記的抗原（單抗法），洗滌后加入底物，酶催化底物產(chǎn)生顏色變化，通過酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量。

*(2)**操作步驟**：

a.**包被**：將包被液（含包被抗原或抗體）加入微孔板，4℃過夜包被。

b.**洗滌**：用洗滌液（如PBST）洗滌微孔板，去除未結(jié)合物。

c.**封閉**：加入封閉液（含BSA或血清），室溫孵育1-2小時(shí)，封閉非特異性位點(diǎn)。

d.**洗滌**：再次洗滌。

e.**加樣**：加入待測(cè)樣本（血漿、血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清等），設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔?？稍O(shè)復(fù)孔以提高準(zhǔn)確性。

f.**孵育**：室溫孵育1-2小時(shí)，或4℃過夜。

g.**洗滌**：洗滌微孔板。

h.**加酶標(biāo)物**：加入酶標(biāo)記的抗體或抗原，室溫孵育1小時(shí)。

i.**洗滌**：洗滌微孔板。

j.**加底物**：加入顯色底物（如TMB、ABTS），避光孵育15-30分鐘。

k.**終止**：加入終止液（如H2SO4），終止酶促反應(yīng)。

l.**檢測(cè)**：立即使用酶標(biāo)儀在指定波長(zhǎng)（如450nm）測(cè)定吸光度值。

*(3)**數(shù)據(jù)分析**：使用標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對(duì)應(yīng)濃度，或使用軟件進(jìn)行回歸分析計(jì)算樣本濃度。需進(jìn)行質(zhì)控（如空白孔、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照）。

**常見檢測(cè)項(xiàng)目示例*：血清總IgG、IgA、IgM水平；補(bǔ)體C3、C4水平；多種細(xì)胞因子（IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、TNF-α等）；過敏原特異性IgE水平；自身抗體（如類風(fēng)濕因子RF、抗CCP抗體等，雖常稱抗體，但檢測(cè)原理常為ELISA）。

2.**化學(xué)發(fā)光免疫分析（ChemiluminescenceImmunoassay,CLIA）**：

*(1)**原理**：利用酶標(biāo)記的抗體/抗原與待測(cè)物結(jié)合后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在酶的催化下產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)，通過化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)光強(qiáng)度，進(jìn)行定量分析。信號(hào)強(qiáng)度與待測(cè)物濃度成正比。

*(2)**操作步驟**：基本流程與ELISA相似（包被、封閉、加樣本、孵育、洗滌），但后續(xù)步驟不同：

a.**加酶標(biāo)物**：加入酶標(biāo)記的抗體或抗原。

b.**洗滌**。

c.**加底物**：加入化學(xué)發(fā)光底物（如魯米諾類底物）。

d.**檢測(cè)**：立即使用化學(xué)發(fā)光儀在規(guī)定時(shí)間內(nèi)（通常幾分鐘到十幾分鐘）檢測(cè)并記錄峰值或積分光強(qiáng)度。

*(3)**數(shù)據(jù)分析**：使用標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本光強(qiáng)度值計(jì)算濃度。CLIA靈敏度高，線性范圍寬，讀數(shù)速度快，是目前許多高端免疫檢測(cè)平臺(tái)的主流技術(shù)。

**應(yīng)用示例*：同ELISA，尤其在需要更高靈敏度（如超敏CRP、某些腫瘤標(biāo)志物）或更快速出結(jié)果的場(chǎng)合。

3.**西門子免疫分析儀（或其他自動(dòng)化免疫分析儀）**：

*(1)**原理**：通常是時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRFIA）或化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）技術(shù)平臺(tái)，通過自動(dòng)化樣品處理、試劑添加、孵育、洗滌和檢測(cè)過程，實(shí)現(xiàn)多種免疫分子的自動(dòng)定量檢測(cè)。

*(2)**操作步驟**：

a.**樣品準(zhǔn)備**：將血清、血漿或尿液樣本按要求稀釋（如果需要），混勻，置于樣品架。

b.**上機(jī)**：將樣品架放入儀器，設(shè)置檢測(cè)項(xiàng)目、樣本信息、質(zhì)控品信息等。

c.**自動(dòng)運(yùn)行**：儀器根據(jù)預(yù)設(shè)程序自動(dòng)完成樣品稀釋、試劑分配、孵育、洗滌、熒光/化學(xué)發(fā)光信號(hào)檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理。

d.**結(jié)果報(bào)告**：儀器自動(dòng)計(jì)算結(jié)果并生成檢測(cè)報(bào)告。

*(3)**優(yōu)勢(shì)**：提高檢測(cè)效率，減少人為誤差，可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。需定期進(jìn)行儀器校準(zhǔn)、質(zhì)控品檢測(cè)和功能驗(yàn)證，確保結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

**檢測(cè)項(xiàng)目示例*：與上述ELISA/CLIA類似，可涵蓋細(xì)胞因子、免疫球蛋白、補(bǔ)體、炎癥標(biāo)志物等多種指標(biāo)。

（三）功能檢測(cè)

1.**淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)（LymphocyteProliferationTest）**：

*(1)**原理**：T淋巴細(xì)胞在受到有絲分裂原（如植物血凝素PHA）或特異性抗原（如病毒抗原、腫瘤細(xì)胞）刺激后，會(huì)進(jìn)入細(xì)胞周期，進(jìn)行DNA合成，導(dǎo)致細(xì)胞體積增大和核糖體數(shù)量增加，從而使得細(xì)胞在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中前向散射（FSC）值升高。通過測(cè)量刺激組與對(duì)照組（未刺激組）FSC值的差異，可以評(píng)估T細(xì)胞的增殖活性。

*(2)**操作步驟**：

a.**樣本處理**：分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），通常使用密度梯度離心法（如Ficoll-Hypaque）。

b.**接種與刺激**：將PBMCs重懸于含特定濃度血清的完全培養(yǎng)基中，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。設(shè)立空白孔（僅培養(yǎng)基，用于背景校正）、PHA刺激孔（作為非特異性刺激對(duì)照）和/或特異性抗原刺激孔（如結(jié)核分枝桿菌純蛋白衍生物PPD、特定腫瘤相關(guān)抗原肽）。同時(shí)設(shè)未刺激對(duì)照組。

c.**孵育**：在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48-72小時(shí)（PHA刺激通常48小時(shí)，特異性抗原刺激可能需要更長(zhǎng)時(shí)間）。

d.**細(xì)胞染色**：培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，用特定緩沖液洗滌，重懸后加入能反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的熒光染料，最常用的是膜聯(lián)蛋白V（AnnexinV）結(jié)合/PI染色法。AnnexinV識(shí)別細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻，PI染料進(jìn)入細(xì)胞核。增殖細(xì)胞通常會(huì)經(jīng)歷G1期到S期的轉(zhuǎn)變，核DNA含量增加，對(duì)PI的攝取能力增強(qiáng)。

e.**上機(jī)檢測(cè)**：使用流式細(xì)胞儀，通過設(shè)門區(qū)（如活細(xì)胞區(qū)R1，排除死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞）和檢測(cè)FL1-H（AnnexinV）和FL2-H（PI）通道，分析細(xì)胞群體變化。

*(3)**結(jié)果判讀**：比較刺激組與未刺激對(duì)照組在FL2-H（PI）維度上的平均熒光強(qiáng)度（MFI）差異。MFI升高表明細(xì)胞增殖增強(qiáng)。也可繪制細(xì)胞圖譜，觀察細(xì)胞從活細(xì)胞（AnnexinV陰性，PI陰性）向晚期內(nèi)化細(xì)胞（AnnexinV陽(yáng)性，PI陰性）再到死細(xì)胞（AnnexinV陽(yáng)性，PI陽(yáng)性）的轉(zhuǎn)變過程。

**臨床意義示例*：評(píng)估細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，用于診斷某些免疫缺陷病；監(jiān)測(cè)移植排斥反應(yīng)；評(píng)價(jià)疫苗免疫原性。

2.**細(xì)胞毒性試驗(yàn)（CytotoxicityAssay）**：

*(1)**原理**：檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞（如NK細(xì)胞、活化的T細(xì)胞）殺傷靶細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞）的能力。常用的方法是基于靶細(xì)胞裂解后釋放細(xì)胞內(nèi)容物，使熒光染料（如MTT、XTT、AlamarBlue）還原成水溶性的形式（Formazan結(jié)晶），通過測(cè)定結(jié)晶的吸光度值反映細(xì)胞損傷程度。或檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞表面釋放顆粒酶（如GranzymeB）導(dǎo)致靶細(xì)胞DNA降解（如TUNEL法）。

*(2)**操作步驟（以MTT法為例）**：

a.**細(xì)胞準(zhǔn)備**：分離效應(yīng)細(xì)胞（如NK細(xì)胞）和靶細(xì)胞（如K562腫瘤細(xì)胞），調(diào)整細(xì)胞濃度至適宜范圍。

b.**混合培養(yǎng)**：將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按不同效靶比（如10:1,20:1,50:1）混合，置于96孔板中培養(yǎng)。

c.**設(shè)置對(duì)照**：設(shè)立僅靶細(xì)胞的孔（靶細(xì)胞自發(fā)裂解對(duì)照）、僅效應(yīng)細(xì)胞的孔（效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)代謝對(duì)照）和僅培養(yǎng)基的孔（背景對(duì)照）。

d.**孵育**：在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4-6小時(shí)（MTT法）或18-24小時(shí)（XTT法）。

e.**加MTT**：每孔加入MTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4小時(shí)（XTT法為3-4小時(shí)）。

f.**終止與溶解**：小心吸棄上清液，每孔加入DMSO（DimethylSulfoxide）100-200μL，震蕩或溫和吹打使Formazan結(jié)晶完全溶解。

g.**檢測(cè)**：使用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（使用參考波長(zhǎng)如630nm或650nm校正背景）。

*(3)**結(jié)果判讀**：計(jì)算殺傷率=[(靶細(xì)胞對(duì)照組吸光度-效應(yīng)細(xì)胞組吸光度)/靶細(xì)胞對(duì)照組吸光度]×100%。繪制殺傷率與效靶比的關(guān)系曲線，計(jì)算半數(shù)殺傷濃度（EC50）。

**臨床意義示例*：評(píng)價(jià)NK細(xì)胞功能；監(jiān)測(cè)腫瘤患者免疫治療效果；篩選具有細(xì)胞毒活性的免疫細(xì)胞或藥物。

3.**遲發(fā)型超敏反應(yīng)（Delayed-TypeHypersensitivity,DTH）皮膚試驗(yàn)**：

*(1)**原理**：檢測(cè)T細(xì)胞介導(dǎo)的IV型（遲發(fā)型）超敏反應(yīng)。當(dāng)機(jī)體預(yù)先接觸過某種抗原（如結(jié)核菌素、純蛋白衍生物PPD），其體內(nèi)會(huì)存在對(duì)該抗原特異性的致敏T細(xì)胞。再次接觸該抗原時(shí)，致敏T細(xì)胞被激活，釋放細(xì)胞因子（如IL-2、IFN-γ），導(dǎo)致巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、單核細(xì)胞聚集和浸潤(rùn)，并在局部引起以單核細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的炎癥反應(yīng)和滲出，表現(xiàn)為皮膚紅腫硬結(jié)。

*(2)**操作步驟**：

a.**皮試前評(píng)估**：詢問患者過敏史、用藥史，檢查皮膚有無(wú)皮疹、破損。告知皮試過程和可能出現(xiàn)的反應(yīng)。

b.**選擇部位**：通常選擇前臂內(nèi)側(cè)或上臂。

c.**制備皮內(nèi)注射液**：使用標(biāo)準(zhǔn)化的皮試抗原（如PPD溶液，含5IU/mL結(jié)核菌素純蛋白衍生物），用無(wú)菌生理鹽水按需稀釋至適宜濃度（如0.1mL含0.05mL原液）。

d.**注射**：用75%酒精消毒皮膚，待干。用皮內(nèi)注射針進(jìn)行皮內(nèi)注射，使形成直徑約6mm的皮丘。每側(cè)注射0.1mL。

e.**標(biāo)記與觀察**：注射后立即標(biāo)記注射部位。囑患者避免按壓，4-6小時(shí)內(nèi)避免接觸水。

f.**讀數(shù)**：皮試后48-72小時(shí)（通常48-60小時(shí)）觀察并記錄結(jié)果。

*(3)**結(jié)果判讀**：根據(jù)紅暈和硬結(jié)的大小進(jìn)行評(píng)分（如0=無(wú)反應(yīng)；1=<5mm紅暈，無(wú)硬結(jié)；2=5-9mm紅暈，硬結(jié)<5mm；3=≥10mm紅暈，硬結(jié)≥5mm；4=紅暈和硬結(jié)均>10mm，或出現(xiàn)水皰、壞死）。陽(yáng)性反應(yīng)通常指硬結(jié)直徑≥5mm。需同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（注射生理鹽水）和陽(yáng)性對(duì)照（注射標(biāo)準(zhǔn)PPD溶液）。

**臨床意義示例*：輔助診斷結(jié)核感染；評(píng)估細(xì)胞免疫功能（DTH陽(yáng)性通常提示細(xì)胞免疫尚可）。

**四、結(jié)果解讀與報(bào)告**

（一）參考值范圍

免疫檢測(cè)項(xiàng)目的參考值通常基于健康成年人群的檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)得出，但會(huì)因年齡、性別、種族、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法、儀器、試劑等因素存在差異。因此，結(jié)果解讀必須結(jié)合實(shí)驗(yàn)室提供的具體參考范圍。以下為部分指標(biāo)的示例參考范圍（請(qǐng)注意，這些僅為示例，實(shí)際范圍請(qǐng)以本實(shí)驗(yàn)室提供的為準(zhǔn)）：

1.**免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)**：

*外周血白細(xì)胞：成人（4.0-10.0）×10^9/L

*淋巴細(xì)胞：成人（1.0-3.0）×10^9/L

*淋巴細(xì)胞亞群：CD4+T細(xì)胞百分比（成人約20%-60%），CD8+T細(xì)胞百分比（成人約15%-50%），CD4+/CD8+比值（成人約0.7-1.3）

*NK細(xì)胞百分比（成人約5%-15%）

*B細(xì)胞百分比（成人約8%-20%）

2.**免疫球蛋白**：

*IgG：成人（7.0-16.0）g/L

*IgA：成人（0.7-4.0）g/L

*IgM：成人（0.4-2.5）g/L

3.**補(bǔ)體**：

*C3：成人（0.9-1.8）g/L

*C4：成人（0.1-0.4）g/L

4.**細(xì)胞因子**（示例濃度，單位通常為pg/mL或ng/L）：

*TNF-α：resting<10pg/mL,stimulated(PHA)可升高

*IL-2：resting<5pg/mL,stimulated(PHA)顯著升高

*IL-4：resting<5pg/mL,stimulated(PHA)可升高

*IL-10：resting<15pg/mL,stimulated(PHA)可升高

*IFN-γ：