基孔肯雅病毒包膜蛋白1特異性單克隆抗體的制備與鑒定：技術(shù)、特性及應(yīng)用前景一、引言1.1研究背景基孔肯雅病毒（Chikungunyavirus，CHIKV）是一種由蚊子傳播的單股正鏈RNA病毒，隸屬于披膜病毒科甲病毒屬?！盎卓涎拧币辉~源于非洲坦桑尼亞的斯瓦希里語(yǔ)，意為“彎曲”，生動(dòng)地描繪了患者因關(guān)節(jié)疼痛而被迫彎腰的痛苦姿態(tài)。CHIKV所引發(fā)的基孔肯雅熱是一種急性傳染病，其臨床癥狀表現(xiàn)多樣且復(fù)雜?；颊咴诟腥境跗?，通常會(huì)突然出現(xiàn)高熱癥狀，體溫可迅速攀升至39℃甚至更高，同時(shí)伴有劇烈的頭痛，仿佛頭部被重錘敲擊，還會(huì)頻繁嘔吐，導(dǎo)致身體極度虛弱。隨著病情發(fā)展，關(guān)節(jié)疼痛成為最為突出的癥狀，這種疼痛往往是多關(guān)節(jié)受累，包括手腕、手指、膝蓋、腳踝等部位，疼痛程度劇烈，如同關(guān)節(jié)被撕裂一般，嚴(yán)重影響患者的活動(dòng)能力，許多患者甚至連簡(jiǎn)單的抬手、走路等動(dòng)作都難以完成。此外，患者還可能出現(xiàn)皮疹，皮疹形態(tài)各異，有的呈斑丘疹，有的則為皰疹，給患者帶來(lái)身體和心理的雙重折磨。在嚴(yán)重情況下，該疾病可并發(fā)腦膜炎，威脅患者的生命安全。近年來(lái)，基孔肯雅熱的傳播范圍不斷擴(kuò)大，疫情頻繁暴發(fā)，給全球公共衛(wèi)生安全帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。在2005-2006年，印度洋地區(qū)的留尼汪島暴發(fā)了大規(guī)模的基孔肯雅熱疫情，感染人數(shù)超過(guò)26萬(wàn)，占當(dāng)?shù)乜側(cè)丝诘娜种?，造成了?yán)重的社會(huì)恐慌和經(jīng)濟(jì)損失。2013-2014年，基孔肯雅熱疫情在美洲地區(qū)迅速蔓延，波及42個(gè)國(guó)家和地區(qū)，報(bào)告病例超過(guò)160萬(wàn)例，對(duì)當(dāng)?shù)氐尼t(yī)療系統(tǒng)造成了沉重打擊。在我國(guó)，雖然基孔肯雅熱屬于輸入性疾病，但隨著國(guó)際交流的日益頻繁，輸入病例不斷增加，存在疫情擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。例如，2010年，我國(guó)廣東省中山市報(bào)告了一起輸入性基孔肯雅熱疫情，共有11例確診病例，這敲響了我國(guó)防范基孔肯雅熱的警鐘。目前，針對(duì)基孔肯雅熱，尚無(wú)特效的治療藥物，主要治療手段為針對(duì)并發(fā)癥進(jìn)行對(duì)癥治療，這使得對(duì)該疾病的早期準(zhǔn)確診斷顯得尤為關(guān)鍵。早期診斷能夠?yàn)榛颊郀?zhēng)取最佳的治療時(shí)機(jī)，有效緩解癥狀，降低疾病對(duì)身體的損害。在眾多診斷方法中，單克隆抗體技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)脫穎而出，成為病毒檢測(cè)與治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。單克隆抗體是由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對(duì)某一特定抗原表位的抗體。它具有特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠精準(zhǔn)地識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)抗原，避免與其他無(wú)關(guān)抗原發(fā)生交叉反應(yīng)，從而大大提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。例如，在新型冠狀病毒的檢測(cè)中，單克隆抗體檢測(cè)試劑能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出病毒的存在，減少假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。單克隆抗體還具有純度高、均一性好等優(yōu)點(diǎn)，這使得其在檢測(cè)和治療過(guò)程中表現(xiàn)出穩(wěn)定的性能，能夠?yàn)榕R床診斷和治療提供可靠的依據(jù)。同時(shí)，單克隆抗體的產(chǎn)量高，可大量制備，能夠滿足市場(chǎng)對(duì)檢測(cè)試劑和治療藥物的需求。包膜蛋白1（E1）是基孔肯雅病毒表面的重要蛋白之一，在病毒的感染過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。E1蛋白參與病毒與宿主細(xì)胞的融合過(guò)程，就像一把鑰匙，能夠打開(kāi)宿主細(xì)胞的大門，使病毒得以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行復(fù)制和傳播。制備針對(duì)E1蛋白的特異性單克隆抗體，對(duì)于基孔肯雅病毒的檢測(cè)和治療具有重要意義。在檢測(cè)方面，該單克隆抗體可用于開(kāi)發(fā)高靈敏度和特異性的檢測(cè)方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫熒光檢測(cè)等，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)病毒的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)，有助于疫情的早期發(fā)現(xiàn)和防控。在治療方面，單克隆抗體有望成為一種新型的治療藥物，通過(guò)與E1蛋白結(jié)合，阻斷病毒與宿主細(xì)胞的融合，從而抑制病毒的感染和復(fù)制，為患者提供更有效的治療手段。1.2研究目的與意義本研究旨在制備針對(duì)基孔肯雅病毒包膜蛋白1的特異性單克隆抗體，并對(duì)其進(jìn)行全面的鑒定，以深入了解該抗體的特性和功能。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如抗原制備、動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞篩選與克隆化等，獲得高特異性、高親和力的單克隆抗體，并運(yùn)用多種檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，包括抗體亞型鑒定、特異性鑒定、親和力鑒定等。本研究具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在理論方面，包膜蛋白1在基孔肯雅病毒的感染機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，制備針對(duì)它的單克隆抗體有助于深入研究病毒與宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)制，為揭示基孔肯雅病毒的致病機(jī)理提供重要的工具和理論依據(jù)。通過(guò)研究單克隆抗體與包膜蛋白1的結(jié)合特性，可以進(jìn)一步了解病毒表面蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，以及病毒感染過(guò)程中的分子事件，為開(kāi)發(fā)新的抗病毒策略提供理論支持。在實(shí)際應(yīng)用方面，單克隆抗體在基孔肯雅病毒的檢測(cè)和治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。在疾病診斷方面，高特異性的單克隆抗體可用于開(kāi)發(fā)快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)試劑盒，如ELISA試劑盒、免疫熒光檢測(cè)試劑等，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)基孔肯雅病毒的早期診斷和疫情監(jiān)測(cè)，有助于及時(shí)采取防控措施，減少疾病的傳播和擴(kuò)散。在疾病治療方面，單克隆抗體有望成為一種新型的治療藥物，通過(guò)特異性地結(jié)合包膜蛋白1，阻斷病毒與宿主細(xì)胞的融合過(guò)程，從而抑制病毒的感染和復(fù)制，為患者提供更有效的治療手段。單克隆抗體還可用于疫苗研發(fā)，作為疫苗的佐劑或質(zhì)量控制工具，提高疫苗的免疫效果和安全性。二、基孔肯雅病毒及包膜蛋白1概述2.1基孔肯雅病毒介紹基孔肯雅病毒（Chikungunyavirus，CHIKV）在病毒分類學(xué)中，屬于披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒屬（Alphavirus）。該病毒呈球形，直徑約為65-70納米，具有典型的二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)。其病毒粒子由核心和包膜兩部分組成，核心包含單股正鏈RNA基因組，長(zhǎng)度約為11.7kb，編碼4種非結(jié)構(gòu)蛋白（nsP1-nsP4）和5種結(jié)構(gòu)蛋白（C、E3、E2、6K、E1）。包膜則由來(lái)源于宿主細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層以及鑲嵌其中的包膜糖蛋白組成，這些包膜糖蛋白在病毒的感染過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CHIKV主要通過(guò)伊蚊叮咬進(jìn)行傳播，其中埃及伊蚊（Aedesaegypti）和白紋伊蚊（Aedesalbopictus）是其主要的傳播媒介。當(dāng)攜帶病毒的伊蚊叮咬人類時(shí)，病毒會(huì)隨蚊蟲唾液進(jìn)入人體，進(jìn)而引發(fā)感染。在非洲，CHIKV存在一個(gè)涉及非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和伊蚊的森林傳播循環(huán)，在這個(gè)循環(huán)中，病毒在森林環(huán)境中持續(xù)存在，并偶爾導(dǎo)致農(nóng)村地區(qū)人類感染。而在亞洲和其他地區(qū)，城市傳播循環(huán)則較為常見(jiàn)，即病毒在人類-蚊子-人類之間循環(huán)傳播，這也是導(dǎo)致大規(guī)模疫情暴發(fā)的重要原因。除了伊蚊叮咬傳播外，雖然目前尚無(wú)確鑿證據(jù)表明CHIKV可以在人群間直接傳播，但在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下，存在通過(guò)氣溶膠傳播的可能性。CHIKV的致病機(jī)制較為復(fù)雜。當(dāng)病毒進(jìn)入人體后，首先會(huì)感染皮膚中的朗格漢斯細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，在這些細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增。隨后，病毒會(huì)進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，引發(fā)病毒血癥，進(jìn)而感染全身各個(gè)組織和器官的細(xì)胞，如關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。病毒感染細(xì)胞的過(guò)程主要依賴于其包膜糖蛋白與宿主細(xì)胞表面受體的相互作用。研究表明，基質(zhì)重塑相關(guān)蛋白8（Matrixremodeling-associatedprotein8，MXRA8）是CHIKV等多種致關(guān)節(jié)炎甲病毒的重要受體，廣泛分布于形成軟骨、肌肉和骨骼的細(xì)胞表面。病毒包膜糖蛋白與MXRA8結(jié)合后，通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)利用宿主細(xì)胞的代謝系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)制和組裝，最終導(dǎo)致細(xì)胞病變和死亡。此外，CHIKV感染還會(huì)引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，免疫細(xì)胞釋放多種細(xì)胞因子和趨化因子，如趨化因子CXCL-10、IL-8、單核細(xì)胞化學(xué)趨化蛋白-1（MCP-1）等，這些因子在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的同時(shí)，也可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)過(guò)度激活，進(jìn)而引起組織損傷和疾病癥狀的加重。在感染后期，部分患者可能會(huì)出現(xiàn)慢性關(guān)節(jié)炎等后遺癥，其發(fā)病機(jī)制可能與病毒持續(xù)存在、自身免疫反應(yīng)等因素有關(guān)。CHIKV在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出廣泛傳播和流行的態(tài)勢(shì)。自1952年在坦桑尼亞首次被報(bào)道以來(lái)，該病毒已在非洲、亞洲、歐洲、美洲等多個(gè)地區(qū)引發(fā)多次大規(guī)模疫情。20世紀(jì)60年代以后，基孔肯雅熱逐漸東移至東南亞地區(qū)。2005-2006年，印度洋地區(qū)的留尼汪島暴發(fā)了有史以來(lái)最嚴(yán)重的基孔肯雅熱疫情，感染人數(shù)超過(guò)26萬(wàn)，占當(dāng)?shù)乜側(cè)丝诘娜种唬舜我咔檫€導(dǎo)致了93例死亡病例，引起了全球的廣泛關(guān)注。2013-2014年，CHIKV在美洲地區(qū)迅速蔓延，波及42個(gè)國(guó)家和地區(qū)，報(bào)告病例超過(guò)160萬(wàn)例，給當(dāng)?shù)氐墓残l(wèi)生和社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)了沉重打擊。在我國(guó)，雖然CHIKV屬于輸入性疾病，但隨著國(guó)際交流的日益頻繁，輸入病例不斷增加。例如，2010年，我國(guó)廣東省中山市報(bào)告了一起輸入性基孔肯雅熱疫情，共有11例確診病例；2019年，浙江省也報(bào)告了輸入性基孔肯雅熱病例。這些輸入病例的出現(xiàn)，提示我國(guó)存在疫情擴(kuò)散的潛在風(fēng)險(xiǎn)，需要加強(qiáng)監(jiān)測(cè)和防控措施。CHIKV的廣泛傳播和流行對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。該病毒感染導(dǎo)致的基孔肯雅熱不僅給患者帶來(lái)身體上的痛苦，影響生活質(zhì)量，還會(huì)增加醫(yī)療負(fù)擔(dān)，對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成負(fù)面影響。由于目前尚無(wú)特效的治療藥物和預(yù)防性疫苗，疫情的防控主要依賴于媒介控制和個(gè)人防護(hù)等措施，這使得疫情防控工作面臨較大挑戰(zhàn)。因此，深入研究CHIKV的生物學(xué)特性、致病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)有效的檢測(cè)和治療方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。2.2包膜蛋白1的結(jié)構(gòu)與功能包膜蛋白1（E1）是基孔肯雅病毒表面的重要糖蛋白之一，在病毒的生命周期中扮演著不可或缺的角色。E1蛋白由大約490個(gè)氨基酸組成，其結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出典型的Ⅱ型膜蛋白特征。在病毒粒子表面，E1蛋白與包膜蛋白2（E2）以異二聚體的形式存在，多個(gè)E1-E2異二聚體進(jìn)一步組裝形成刺突狀結(jié)構(gòu)，覆蓋于病毒包膜表面。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)組織方式對(duì)于病毒的感染性和穩(wěn)定性至關(guān)重要。從結(jié)構(gòu)域組成來(lái)看，E1蛋白包含三個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域：結(jié)構(gòu)域Ⅰ、結(jié)構(gòu)域Ⅱ和結(jié)構(gòu)域Ⅲ。結(jié)構(gòu)域Ⅰ位于E1蛋白的N端，富含β-折疊結(jié)構(gòu)，它在維持E1蛋白的整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。結(jié)構(gòu)域Ⅱ則是E1蛋白中最為關(guān)鍵的功能結(jié)構(gòu)域之一，其包含一個(gè)高度保守的融合肽（fusionpeptide）。在病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中，當(dāng)病毒與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合并發(fā)生內(nèi)吞作用后，隨著內(nèi)體環(huán)境pH值的降低，E1蛋白的構(gòu)象會(huì)發(fā)生劇烈變化。此時(shí)，融合肽會(huì)被暴露出來(lái)，插入到宿主細(xì)胞膜中，介導(dǎo)病毒包膜與宿主細(xì)胞膜的融合，從而使病毒基因組得以進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)部，啟動(dòng)病毒的復(fù)制過(guò)程。結(jié)構(gòu)域Ⅲ位于E1蛋白的C端，主要由α-螺旋結(jié)構(gòu)組成，它參與了E1蛋白與E2蛋白之間的相互作用，對(duì)于維持E1-E2異二聚體的穩(wěn)定性以及病毒粒子的正確組裝具有重要意義。E1蛋白在基孔肯雅病毒感染過(guò)程中發(fā)揮著多方面的關(guān)鍵功能。在病毒感染的起始階段，E1蛋白與E2蛋白協(xié)同作用，負(fù)責(zé)識(shí)別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面的受體。如前文所述，基質(zhì)重塑相關(guān)蛋白8（MXRA8）是CHIKV的重要受體，E1-E2異二聚體通過(guò)與MXRA8的特異性結(jié)合，使病毒能夠特異性地吸附到宿主細(xì)胞表面，為后續(xù)的感染過(guò)程奠定基礎(chǔ)。這種受體-配體的相互作用具有高度的特異性和親和力，決定了病毒的宿主范圍和組織嗜性。在病毒與宿主細(xì)胞的融合過(guò)程中，E1蛋白的融合肽發(fā)揮著核心作用。當(dāng)病毒被內(nèi)吞進(jìn)入宿主細(xì)胞后，內(nèi)體環(huán)境的酸性條件會(huì)觸發(fā)E1蛋白的構(gòu)象變化。首先，E1-E2異二聚體發(fā)生解離，E1蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，融合肽暴露并插入到宿主細(xì)胞膜中。隨后，E1蛋白進(jìn)一步發(fā)生三聚化，形成一個(gè)穩(wěn)定的融合后結(jié)構(gòu)，將病毒包膜與宿主細(xì)胞膜拉近并最終融合在一起。這一過(guò)程類似于拉鏈的閉合，使得病毒基因組能夠順利進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，開(kāi)始病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。研究表明，通過(guò)突變E1蛋白的融合肽序列，可以顯著抑制病毒與宿主細(xì)胞的融合能力，從而阻斷病毒的感染過(guò)程，這充分證明了融合肽在病毒感染中的關(guān)鍵作用。E1蛋白還在病毒的免疫逃逸過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。由于E1蛋白位于病毒粒子的表面，直接暴露于宿主免疫系統(tǒng)的攻擊之下，因此病毒進(jìn)化出了多種策略來(lái)逃避宿主的免疫監(jiān)視。一方面，E1蛋白的抗原表位具有一定的變異性，通過(guò)不斷發(fā)生氨基酸突變，病毒可以改變E1蛋白表面的抗原結(jié)構(gòu)，使宿主免疫系統(tǒng)難以識(shí)別和攻擊。例如，在不同的CHIKV流行株中，E1蛋白的某些氨基酸位點(diǎn)會(huì)發(fā)生高頻突變，這些突變可能導(dǎo)致抗原表位的改變，從而降低宿主抗體對(duì)病毒的中和能力。另一方面，E1蛋白可以通過(guò)與宿主細(xì)胞表面的某些免疫調(diào)節(jié)分子相互作用，干擾宿主免疫系統(tǒng)的正常功能，抑制免疫細(xì)胞的活化和免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn)，E1蛋白能夠與宿主細(xì)胞表面的Fcγ受體結(jié)合，抑制巨噬細(xì)胞對(duì)病毒的吞噬作用，從而幫助病毒逃避宿主的免疫清除。E1蛋白在誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)方面也具有重要作用。當(dāng)機(jī)體感染基孔肯雅病毒后，E1蛋白作為病毒的主要抗原成分，能夠刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答。其中，體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的針對(duì)E1蛋白的特異性抗體，如中和抗體，可以通過(guò)與E1蛋白結(jié)合，阻斷病毒與宿主細(xì)胞的受體結(jié)合和融合過(guò)程，從而中和病毒的感染性，保護(hù)機(jī)體免受病毒的進(jìn)一步侵害。細(xì)胞免疫應(yīng)答中，T淋巴細(xì)胞能夠識(shí)別被病毒感染的細(xì)胞表面表達(dá)的E1蛋白抗原肽，通過(guò)釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)和細(xì)胞因子，殺傷被感染的細(xì)胞，清除病毒感染灶。因此，E1蛋白是開(kāi)發(fā)基孔肯雅病毒疫苗和免疫診斷試劑的重要靶點(diǎn)之一。通過(guò)研究E1蛋白的結(jié)構(gòu)和免疫原性，能夠設(shè)計(jì)出更加有效的疫苗和診斷方法，提高對(duì)基孔肯雅病毒的防控能力。三、單克隆抗體制備的理論基礎(chǔ)3.1單克隆抗體的概念與特點(diǎn)單克隆抗體（MonoclonalAntibody，mAb）是指由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對(duì)某一特定抗原表位的抗體。在機(jī)體的免疫應(yīng)答過(guò)程中，當(dāng)抗原入侵時(shí)，抗原分子上存在多個(gè)不同的抗原決定簇，每個(gè)決定簇能夠激活一個(gè)具有特定基因的B細(xì)胞。被激活的B細(xì)胞分裂增殖，分化為效應(yīng)B細(xì)胞（漿細(xì)胞）和記憶B細(xì)胞，漿細(xì)胞會(huì)合成并分泌大量的抗體分子。正常情況下，動(dòng)物脾臟中存在上百萬(wàn)種不同的B淋巴細(xì)胞系，它們重排后形成不同基因，進(jìn)而合成不同的抗體。若能篩選出一個(gè)制造專一抗體的漿細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，便可得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖形成的細(xì)胞群，即單克隆。這個(gè)單克隆細(xì)胞所合成的針對(duì)一種抗原決定簇的抗體，就是單克隆抗體。單克隆抗體具有諸多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。首先，其特異性強(qiáng)，只針對(duì)特定的單一抗原表位產(chǎn)生免疫反應(yīng)，能夠精準(zhǔn)識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)抗原。在對(duì)新冠病毒的檢測(cè)中，單克隆抗體檢測(cè)試劑能夠高度特異性地識(shí)別新冠病毒表面的特定抗原表位，極大地減少了與其他病毒或物質(zhì)的交叉反應(yīng)，從而顯著提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，降低了假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)概率。其次，單克隆抗體的純度高，均一性好。由于它是由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生，其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)高度一致，在檢測(cè)和治療過(guò)程中表現(xiàn)出穩(wěn)定的性能。在腫瘤治療中，使用純度高、均一性好的單克隆抗體藥物，能夠確保藥物在體內(nèi)的作用效果穩(wěn)定且可預(yù)測(cè)，為臨床治療提供可靠保障。再者，單克隆抗體可以通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)大量制備，能夠滿足市場(chǎng)對(duì)檢測(cè)試劑和治療藥物的需求。在應(yīng)對(duì)大規(guī)模傳染病疫情時(shí)，大量制備的單克隆抗體檢測(cè)試劑可迅速投入使用，實(shí)現(xiàn)對(duì)大量樣本的快速檢測(cè)，有助于疫情的早期發(fā)現(xiàn)和防控。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，單克隆抗體有著廣泛的應(yīng)用。在疾病診斷方面，單克隆抗體被廣泛用于各類病原體的檢測(cè)。用于診斷乙肝病毒、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒和各種微生物感染的試劑中，很多都利用了單克隆抗體。在腫瘤診斷中，單克隆抗體可用于檢測(cè)腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)抗原，輔助腫瘤的診斷、分型及定位。甲胎蛋白和癌胚抗原的單克隆抗體早已應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)，有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和診斷。單克隆抗體還可用于檢測(cè)淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志，區(qū)分細(xì)胞亞群和細(xì)胞分化階段，為多種疾病的診斷提供參考。在白血病患者的疾病分期、治療效果評(píng)估、預(yù)后判斷等方面，檢測(cè)細(xì)胞表面抗原具有重要的指導(dǎo)作用。在疾病治療方面，單克隆抗體作為靶向藥物，能夠特異性地作用于腫瘤細(xì)胞或致病抗原，發(fā)揮治療作用。曲妥珠單抗針對(duì)HER-2過(guò)表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞，利妥珠單抗針對(duì)CD20陽(yáng)性彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤或者B細(xì)胞淋巴瘤，它們通過(guò)與腫瘤細(xì)胞表面的抗原結(jié)合，有效殺滅腫瘤細(xì)胞，控制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，延緩病情進(jìn)展，從而改善患者癥狀、減輕痛苦、延長(zhǎng)生命。單克隆抗體還可與核素、毒素或藥物等結(jié)合，制成導(dǎo)向藥物，提高對(duì)腫瘤的治療效果。3.2制備原理與技術(shù)路線本研究主要運(yùn)用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備基孔肯雅病毒包膜蛋白1特異性單克隆抗體。雜交瘤技術(shù)的基本原理是將免疫小鼠的脾細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞）與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，形成雜交瘤細(xì)胞。脾細(xì)胞具有分泌特異性抗體的能力，但在體外培養(yǎng)條件下存活時(shí)間較短，一般僅能存活5-7天；而骨髓瘤細(xì)胞則具有在體外無(wú)限增殖的特性。通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)，使兩者融合形成的雜交瘤細(xì)胞既具備了脾細(xì)胞分泌特異性抗體的功能，又擁有了骨髓瘤細(xì)胞無(wú)限增殖的能力，從而可以在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)并持續(xù)分泌單克隆抗體。從抗原制備到單克隆抗體制備的詳細(xì)流程如下：抗原制備：首先，需要獲取高純度的基孔肯雅病毒包膜蛋白1作為免疫原?？梢酝ㄟ^(guò)基因工程技術(shù)，將編碼E1蛋白的基因克隆到合適的表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞（如大腸桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等）進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)后的E1蛋白經(jīng)過(guò)一系列的純化步驟，如親和層析、離子交換層析等，以獲得高純度的E1蛋白，確保其抗原性和結(jié)構(gòu)完整性。動(dòng)物免疫：選擇與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在8-12周，雌雄不限。為提高免疫效果，可同時(shí)免疫3-4只小鼠。將純化后的E1蛋白與完全福氏佐劑充分乳化后，采用腹腔內(nèi)或皮內(nèi)多點(diǎn)注射法對(duì)小鼠進(jìn)行初次免疫。免疫間隔一般為2-3周，在末次免疫后3-4天，分離脾細(xì)胞用于融合。在免疫過(guò)程中，需要定期采集小鼠血清，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等方法檢測(cè)血清抗體效價(jià)，以評(píng)估免疫效果。當(dāng)血清抗體效價(jià)達(dá)到一定水平時(shí)，進(jìn)行末次免疫，為后續(xù)的細(xì)胞融合做準(zhǔn)備。細(xì)胞融合：將免疫小鼠的脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、細(xì)胞形態(tài)和活性佳（活性應(yīng)大于95％）的骨髓瘤細(xì)胞（如Sp2/0細(xì)胞株）進(jìn)行融合。細(xì)胞融合通常采用聚乙二醇（PEG）作為融合劑，PEG可以改變細(xì)胞膜的物理結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞相互粘連并融合在一起。在融合過(guò)程中，需要嚴(yán)格控制PEG的濃度和作用時(shí)間，以確保最佳的融合效果。融合后的細(xì)胞懸液中包含多種細(xì)胞類型，如融合的脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞、融合的脾細(xì)胞和脾細(xì)胞、融合的瘤細(xì)胞和瘤細(xì)胞、未融合的脾細(xì)胞、未融合的瘤細(xì)胞以及細(xì)胞的多聚體形式等。雜交瘤細(xì)胞篩選：融合后的細(xì)胞需要在含有次黃嘌呤（hypoxanthine，H）、氨甲蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的HAT選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。氨甲蝶呤是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細(xì)胞利用正常途徑合成DNA，而融合所用的骨髓瘤細(xì)胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選出的次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）缺陷株，所以不能在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。只有融合細(xì)胞具有親代雙方的遺傳性能，可在HAT培養(yǎng)基中長(zhǎng)期存活與繁殖。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，未融合的脾細(xì)胞和未融合的瘤細(xì)胞會(huì)逐漸死亡，而雜交瘤細(xì)胞則能夠存活下來(lái)。然后，通過(guò)有限稀釋法將雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細(xì)胞數(shù)在0至數(shù)個(gè)細(xì)胞之間（30％的孔為0才能保證每個(gè)孔中是單個(gè)細(xì)胞），培養(yǎng)后取上清以ELISA法選出抗體高分泌性的細(xì)胞。這一過(guò)程常被習(xí)慣地稱作克隆化。特異性單克隆抗體篩選：將初步篩選得到的抗體高分泌性細(xì)胞株進(jìn)一步進(jìn)行克隆化，應(yīng)用特異性抗原（基孔肯雅病毒包膜蛋白1）包被的ELISA找出針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體陽(yáng)性細(xì)胞株。通過(guò)多次克隆化和篩選，最終獲得穩(wěn)定分泌高特異性、高親和力單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。單克隆抗體制備與純化：將篩選得到的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，可以采用體外培養(yǎng)或動(dòng)物腹腔接種培養(yǎng)的方式。體外培養(yǎng)可使用細(xì)胞培養(yǎng)瓶或生物反應(yīng)器等設(shè)備，在合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。動(dòng)物腹腔接種培養(yǎng)則是將雜交瘤細(xì)胞注射到小鼠腹腔內(nèi)，待小鼠腹腔積液增多后，收集腹水。無(wú)論是腹水還是細(xì)胞培養(yǎng)上清液，都需要經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的純化處理，以獲得高純度的單克隆抗體。常用的純化方法包括親和層析（如ProteinA親和層析）、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析等，這些方法可以有效地去除雜質(zhì)，提高單克隆抗體的純度和質(zhì)量。單克隆抗體鑒定：對(duì)純化后的單克隆抗體進(jìn)行全面的鑒定，包括抗體亞型鑒定、特異性鑒定、親和力鑒定、效價(jià)測(cè)定等?？贵w亞型鑒定可采用抗體亞型鑒定試劑盒進(jìn)行；特異性鑒定通過(guò)ELISA、免疫印跡（WesternBlot）等方法，檢測(cè)單克隆抗體與基孔肯雅病毒包膜蛋白1以及其他相關(guān)抗原的結(jié)合特異性，確保其只與目標(biāo)抗原發(fā)生特異性結(jié)合；親和力鑒定可采用表面等離子共振（SPR）技術(shù)等方法，測(cè)定單克隆抗體與抗原之間的親和力常數(shù)，評(píng)估其結(jié)合的緊密程度；效價(jià)測(cè)定則通過(guò)ELISA等方法，確定單克隆抗體在不同稀釋度下的活性，以評(píng)估其效價(jià)。通過(guò)這些鑒定步驟，可以全面了解單克隆抗體的特性和質(zhì)量，為其后續(xù)的應(yīng)用提供可靠的依據(jù)。四、基孔肯雅病毒包膜蛋白1特異性單克隆抗體的制備過(guò)程4.1抗原的制備與純化在本研究中，選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)基孔肯雅病毒包膜蛋白1（E1）。之所以選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，是因?yàn)樗哂猩L(zhǎng)迅速、培養(yǎng)成本低、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，能夠在短時(shí)間內(nèi)大量表達(dá)目標(biāo)蛋白。首先，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取基孔肯雅病毒包膜蛋白1的基因序列（登錄號(hào)：NC_004162.1）。利用PCR技術(shù)，根據(jù)該基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物為5'-ATGGCCTACAAGAAGATC-3'，下游引物為5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。以含有基孔肯雅病毒全基因組的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μl，包括2×PCRMasterMix25μl，上下游引物各1μl（10μM），模板DNA1μl，ddH?O22μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見(jiàn)約1.5kb的特異性條帶，與預(yù)期的E1基因大小相符。將PCR擴(kuò)增得到的E1基因片段與pET-28a（+）表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，所用的限制性內(nèi)切酶為NcoⅠ和XhoⅠ。酶切反應(yīng)體系為20μl，包括10×Buffer2μl，E1基因片段或pET-28a（+）載體5μl，NcoⅠ和XhoⅠ各1μl（10U/μl），ddH?O11μl。37℃孵育3小時(shí)后，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，然后使用凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的E1基因片段與同樣經(jīng)雙酶切回收的pET-28a（+）載體，按照摩爾比3:1的比例，在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系為10μl，包括10×T4DNALigaseBuffer1μl，E1基因片段3μl，pET-28a（+）載體1μl，T4DNALigase1μl，ddH?O4μl。16℃連接過(guò)夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布在含有卡那霉素（50μg/ml）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)，待長(zhǎng)出單菌落。從平板上挑取單菌落，接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。經(jīng)鑒定，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中基孔肯雅病毒包膜蛋白1的基因序列完全一致，表明重組表達(dá)載體pET-28a（+）-E1構(gòu)建成功。將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pET-28a（+）-E1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單菌落接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD???值達(dá)到0.6-0.8。加入終濃度為0.5mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），誘導(dǎo)E1蛋白表達(dá)。37℃繼續(xù)誘導(dǎo)4小時(shí)后，8000rpm離心10分鐘，收集菌體。將菌體用PBS（pH7.4）重懸，超聲破碎細(xì)胞（功率300W，超聲3秒，間隔5秒，共30分鐘）。4℃，12000rpm離心30分鐘，收集上清和沉淀，分別進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)表達(dá)的菌體裂解液上清中，出現(xiàn)了一條約55kDa的特異性條帶，與預(yù)期的E1蛋白大小相符，表明E1蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)，且主要以可溶性形式存在。采用鎳離子親和層析法對(duì)表達(dá)的E1蛋白進(jìn)行純化。將Ni-NTAAgarose填料裝柱，用平衡緩沖液（50mMTris-HCl，300mMNaCl，20mM咪唑，pH8.0）平衡柱子。將細(xì)胞裂解液上清緩慢上樣到柱子中，使E1蛋白與鎳離子親和填料充分結(jié)合。用洗滌緩沖液（50mMTris-HCl，300mMNaCl，50mM咪唑，pH8.0）洗滌柱子，去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。最后，用洗脫緩沖液（50mMTris-HCl，300mMNaCl，250mM咪唑，pH8.0）洗脫目的蛋白。收集洗脫峰，進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示，純化后的E1蛋白條帶單一，純度達(dá)到95%以上。使用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)純化后的E1蛋白進(jìn)行定量。以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將純化后的E1蛋白樣品稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，加入BCA工作液，37℃孵育30分鐘，在562nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出E1蛋白的濃度，結(jié)果為1.5mg/ml。通過(guò)WesternBlot分析，用抗His標(biāo)簽抗體進(jìn)行檢測(cè)，在約55kDa處出現(xiàn)特異性條帶，進(jìn)一步證實(shí)了純化得到的蛋白為基孔肯雅病毒包膜蛋白1。4.2動(dòng)物免疫選用6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，共計(jì)4只，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2017-0005。小鼠飼養(yǎng)于溫度為22±2℃、相對(duì)濕度為50±10%的SPF級(jí)動(dòng)物房，自由攝食和飲水。將純化后的基孔肯雅病毒包膜蛋白1（E1）與完全福氏佐劑按照1:1的體積比充分乳化，采用多點(diǎn)皮下注射的方式對(duì)小鼠進(jìn)行初次免疫，每只小鼠的免疫劑量為100μg。免疫后第14天，將E1蛋白與不完全福氏佐劑按照1:1的體積比乳化，對(duì)小鼠進(jìn)行第一次加強(qiáng)免疫，免疫劑量和方式同初次免疫。在第一次加強(qiáng)免疫后的第14天，進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫，方法同上。在第二次加強(qiáng)免疫后的第7天，通過(guò)眼眶采血的方式采集小鼠血清，采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Indirect-ELISA）檢測(cè)血清抗體效價(jià)。間接ELISA的具體操作步驟如下：用包被緩沖液（0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6）將純化的E1蛋白稀釋至1μg/ml，每孔100μl加入到96孔酶標(biāo)板中，4℃包被過(guò)夜。次日，棄去包被液，用PBST（PBS+0.05%Tween-20）洗滌3次，每次3分鐘。每孔加入200μl5%脫脂奶粉，37℃封閉2小時(shí)。棄去封閉液，用PBST洗滌3次。將小鼠血清用PBST從1:100開(kāi)始進(jìn)行倍比稀釋，每孔加入100μl稀釋后的血清，37℃孵育1小時(shí)。棄去血清，用PBST洗滌5次。每孔加入100μlHRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋），37℃孵育1小時(shí)。棄去酶標(biāo)二抗，用PBST洗滌5次。每孔加入100μlTMB底物顯色液，37℃避光顯色15分鐘。最后，每孔加入50μl2MH?SO?終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度值（OD???）。以正常小鼠血清作為陰性對(duì)照，當(dāng)免疫小鼠血清的OD???值大于陰性對(duì)照OD???值的2.1倍時(shí)，判定為陽(yáng)性。經(jīng)檢測(cè)，4只小鼠的血清抗體效價(jià)均達(dá)到1:12800以上，表明免疫效果良好。在最后一次加強(qiáng)免疫后的第3天，將小鼠脫頸椎處死，無(wú)菌取出脾臟，放入盛有預(yù)冷的無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基的平皿中。用鑷子和剪刀將脾臟剪碎，然后用注射器芯輕輕研磨，使脾細(xì)胞充分釋放出來(lái)。將細(xì)胞懸液通過(guò)200目細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，去除組織碎片。將過(guò)濾后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清。用預(yù)冷的無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，再次離心洗滌2次。最后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基將脾細(xì)胞調(diào)整至合適濃度，用于后續(xù)的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。4.3細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞篩選在細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)前，先將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞（Sp2/0細(xì)胞株）用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌3次，每次1000rpm離心5分鐘。將洗滌后的骨髓瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。同時(shí)，將制備好的免疫脾細(xì)胞也用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌3次，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/ml。取上述骨髓瘤細(xì)胞和免疫脾細(xì)胞，按照1:10的比例混合于50ml離心管中，1000rpm離心10分鐘，棄去上清。用消毒濾紙吸凈離心管內(nèi)壁殘留的上清液，以免影響細(xì)胞融合效果。向離心管中加入1ml預(yù)熱至37℃的50%聚乙二醇（PEG，分子量為4000）溶液，在1分鐘內(nèi)緩慢滴加，邊滴加邊輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，使細(xì)胞充分接觸PEG。滴加完畢后，繼續(xù)在37℃水浴中靜置1分鐘。隨后，在5分鐘內(nèi)緩慢加入20ml預(yù)熱至37℃的無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基，以終止PEG的作用，期間需輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，使細(xì)胞均勻分散。1000rpm離心10分鐘，棄去上清。用含有20%胎牛血清、1%HAT（次黃嘌呤、氨甲蝶呤、胸腺嘧啶核苷）的RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞懸液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在HAT選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-10天后，未融合的骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞會(huì)逐漸死亡，而雜交瘤細(xì)胞則能夠存活下來(lái)。此時(shí)，可觀察到部分孔中有細(xì)胞克隆生長(zhǎng)。每隔2-3天，用半量換液法更換含有1%HAT的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，以維持細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境。在細(xì)胞融合后第10-14天，采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Indirect-ELISA）對(duì)培養(yǎng)孔中的細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè)，篩選出分泌抗基孔肯雅病毒包膜蛋白1抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞孔。具體操作步驟如下：用包被緩沖液（0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6）將純化的基孔肯雅病毒包膜蛋白1稀釋至1μg/ml，每孔100μl加入到96孔酶標(biāo)板中，4℃包被過(guò)夜。次日，棄去包被液，用PBST（PBS+0.05%Tween-20）洗滌3次，每次3分鐘。每孔加入200μl5%脫脂奶粉，37℃封閉2小時(shí)。棄去封閉液，用PBST洗滌3次。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞上清直接每孔取100μl加入到包被好的酶標(biāo)板中，37℃孵育1小時(shí)。棄去上清，用PBST洗滌5次。每孔加入100μlHRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋），37℃孵育1小時(shí)。棄去酶標(biāo)二抗，用PBST洗滌5次。每孔加入100μlTMB底物顯色液，37℃避光顯色15分鐘。最后，每孔加入50μl2MH?SO?終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度值（OD???）。以正常小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后的培養(yǎng)上清作為陰性對(duì)照，當(dāng)檢測(cè)孔的OD???值大于陰性對(duì)照OD???值的2.1倍時(shí)，判定為陽(yáng)性孔。經(jīng)過(guò)初次篩選，共得到36個(gè)陽(yáng)性孔。為了獲得單一的雜交瘤細(xì)胞克隆，對(duì)陽(yáng)性孔中的細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。采用有限稀釋法，將陽(yáng)性孔中的雜交瘤細(xì)胞用含20%胎牛血清、1%HT（次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷）的RPMI-1640完全培養(yǎng)基進(jìn)行充分稀釋，使細(xì)胞濃度調(diào)整為3-10個(gè)細(xì)胞/ml。將稀釋后的細(xì)胞懸液接種到提前制備好飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl，確保每孔中平均含有0.5-1個(gè)細(xì)胞。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，每隔2-3天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并更換含有1%HT的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)7-10天后，可見(jiàn)部分孔中有單個(gè)細(xì)胞克隆形成。再次采用間接ELISA法對(duì)這些克隆孔的細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè)，篩選出抗體分泌陽(yáng)性的克隆孔。對(duì)陽(yáng)性克隆孔進(jìn)行多次克隆化培養(yǎng)和檢測(cè)，直至克隆化細(xì)胞抗體陽(yáng)性率達(dá)到100%。最終，獲得了5株穩(wěn)定分泌抗基孔肯雅病毒包膜蛋白1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1H5、2C3、3F7、4B9和5E6。4.4雜交瘤細(xì)胞的克隆化與建系對(duì)經(jīng)過(guò)初次篩選得到的36個(gè)陽(yáng)性孔中的雜交瘤細(xì)胞，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。該方法的原理是將細(xì)胞充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板每一孔中的細(xì)胞數(shù)在0至數(shù)個(gè)之間，通過(guò)培養(yǎng)，讓單個(gè)細(xì)胞增殖形成單克隆細(xì)胞群。在克隆化之前，先制備飼養(yǎng)細(xì)胞層，以提供雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子。選取健康的BALB/c小鼠，脫頸椎處死后，用75%酒精消毒腹部皮膚。在無(wú)菌條件下，打開(kāi)小鼠腹腔，用注射器吸取5ml預(yù)冷的無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基，注入腹腔內(nèi)，輕輕按摩腹部，使腹腔細(xì)胞充分懸浮。然后，用注射器將腹腔細(xì)胞懸液吸出，轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清。用含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10?個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl，放入37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。將陽(yáng)性孔中的雜交瘤細(xì)胞用移液器輕輕吹打，使其懸浮，然后轉(zhuǎn)移至離心管中。1000rpm離心5分鐘，棄去上清。用含20%胎牛血清、1%HT（次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷）的RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，將細(xì)胞用上述培養(yǎng)基稀釋，使細(xì)胞濃度調(diào)整為3-10個(gè)細(xì)胞/ml。取制備好飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋后的細(xì)胞懸液100μl，確保每孔中平均含有0.5-1個(gè)細(xì)胞。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，每隔2-3天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并更換含有1%HT的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)7-10天后，可見(jiàn)部分孔中有單個(gè)細(xì)胞克隆形成。再次采用間接ELISA法對(duì)這些克隆孔的細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè)，篩選出抗體分泌陽(yáng)性的克隆孔。對(duì)陽(yáng)性克隆孔進(jìn)行多次克隆化培養(yǎng)和檢測(cè)，直至克隆化細(xì)胞抗體陽(yáng)性率達(dá)到100%。在每次克隆化過(guò)程中，都需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，包括細(xì)胞的稀釋度、培養(yǎng)溫度、CO?濃度等，以確?？寺』某晒β屎蛦慰寺〖?xì)胞的質(zhì)量。經(jīng)過(guò)三次克隆化培養(yǎng)后，最終獲得了5株穩(wěn)定分泌抗基孔肯雅病毒包膜蛋白1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1H5、2C3、3F7、4B9和5E6。將這些陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，先轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入1ml含20%胎牛血清、1%HT的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)2-3天，待細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底后，再轉(zhuǎn)移至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2ml上述培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞在6孔板中長(zhǎng)滿后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入5ml培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，密切觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)環(huán)境中。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，收集細(xì)胞，一部分用于后續(xù)的單克隆抗體制備，另一部分按照每管1×10?個(gè)細(xì)胞的量，加入適量的凍存液（含10%DMSO、20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基），置于凍存管中，放入程序降溫盒，先在-80℃冰箱中凍存過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)移至液氮罐中進(jìn)行長(zhǎng)期保存，以建立穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞系。4.5單克隆抗體的大量制備與純化將篩選得到的5株穩(wěn)定分泌抗基孔肯雅病毒包膜蛋白1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株（1H5、2C3、3F7、4B9和5E6）分別進(jìn)行大量制備。本研究選用動(dòng)物體內(nèi)誘生法，具體是將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔內(nèi)，利用小鼠腹腔的環(huán)境來(lái)支持雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和抗體分泌。選擇8-10周齡的BALB/c小鼠，提前1周腹腔注射無(wú)菌液體石蠟0.5ml，以刺激小鼠腹腔產(chǎn)生適宜雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境。7天后，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。每只小鼠腹腔注射1ml細(xì)胞懸液（含1×10?個(gè)雜交瘤細(xì)胞）。接種后，密切觀察小鼠的狀態(tài)，隨著時(shí)間推移，小鼠腹腔內(nèi)會(huì)逐漸產(chǎn)生腹水。在接種后7-10天，當(dāng)小鼠腹部明顯膨大，行動(dòng)遲緩時(shí)，可通過(guò)腹腔穿刺的方法收集腹水。收集腹水時(shí)，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，以避免細(xì)菌污染，影響抗體質(zhì)量。將收集到的腹水轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃，3000rpm離心15分鐘，去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，收集上清液，即為含有單克隆抗體的腹水粗提物。采用辛酸-硫酸銨沉淀法對(duì)腹水粗提物進(jìn)行初步純化。取上述收集的腹水，用雙層濾紙過(guò)濾，以除去其中的雜質(zhì)、脂肪及細(xì)胞碎片。將過(guò)濾后的腹水轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃，12000r/min離心15分鐘，收集上清，棄去沉淀。精確測(cè)量上清液的體積，向其中加入2倍體積的醋酸鹽緩沖液（0.06M，pH4.8），在磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢杌靹?。?MHCl小心調(diào)節(jié)pH值至4.5-4.8。在磁力攪拌的條件下，緩慢加入正辛酸，按照33μL/mL腹水的比例添加。加完正辛酸后，室溫下繼續(xù)磁力攪拌30分鐘，隨后將溶液置于4℃冰箱中靜置2小時(shí)以上。4℃，12000r/min離心5分鐘，收集上清液，并用雙層濾紙?jiān)俅芜^(guò)濾，以確保去除殘留的雜質(zhì)。量取濾液體積，加入1/10體積的0.1MPBS（pH7.4）。用2MNaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4，并記錄所使用的NaOH體積。將上清液置于冰浴中預(yù)冷，然后緩慢加入硫酸銨固體，使其最終濃度達(dá)到0.277g/mL。在添加硫酸銨的過(guò)程中，需邊加邊攪拌，并確保在30分鐘內(nèi)加完。加完硫酸銨后，將溶液置于4℃冰箱中過(guò)夜。次日，12000r/min離心15分鐘，棄去上清液。用1/10腹水體積的0.01MPBS溶解沉淀。將溶解后的沉淀裝入透析袋中，對(duì)0.01MPBS（pH7.4）進(jìn)行透析一天。透析過(guò)程中，需定期更換透析液，以確保充分去除雜質(zhì)。離心去掉不溶雜質(zhì)，收集上清液，即為初步純化的單克隆抗體溶液。將初步純化的單克隆抗體溶液進(jìn)一步采用親和層析法進(jìn)行純化，選用ProteinA親和層析柱。使用前，先用平衡緩沖液（0.01MPBS，pH7.4）對(duì)ProteinA親和層析柱進(jìn)行平衡，流速控制為1ml/min，直至基線平穩(wěn)。將初步純化的單克隆抗體溶液緩慢上樣到已平衡好的層析柱中，上樣流速為0.5ml/min。上樣結(jié)束后，用平衡緩沖液繼續(xù)沖洗層析柱，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)，直至流出液的OD???值接近基線。然后，用洗脫緩沖液（0.1M檸檬酸緩沖液，pH3.0-3.5）洗脫結(jié)合在層析柱上的單克隆抗體，流速為1ml/min。收集洗脫峰，立即用1MTris-HCl（pH9.0）中和洗脫液，使pH值恢復(fù)至中性。對(duì)收集的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析，以鑒定單克隆抗體的純度和分子量。將純化后的單克隆抗體溶液用超濾濃縮管進(jìn)行濃縮，按照超濾濃縮管的使用說(shuō)明進(jìn)行操作，將抗體溶液濃縮至所需的濃度。濃縮后的單克隆抗體溶液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌后，分裝保存于-80℃冰箱中，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。五、單克隆抗體的鑒定5.1抗體效價(jià)的測(cè)定采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Indirect-ELISA）對(duì)制備的5株單克隆抗體（1H5、2C3、3F7、4B9和5E6）的效價(jià)進(jìn)行測(cè)定。首先，用包被緩沖液（0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6）將純化的基孔肯雅病毒包膜蛋白1（E1）稀釋至1μg/ml，每孔100μl加入到96孔酶標(biāo)板中，4℃包被過(guò)夜。次日，棄去包被液，用PBST（PBS+0.05%Tween-20）洗滌3次，每次3分鐘。每孔加入200μl5%脫脂奶粉，37℃封閉2小時(shí)。棄去封閉液，用PBST洗滌3次。將5株單克隆抗體分別用PBST從1:100開(kāi)始進(jìn)行倍比稀釋，每孔加入100μl稀釋后的抗體，37℃孵育1小時(shí)。棄去抗體，用PBST洗滌5次。每孔加入100μlHRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋），37℃孵育1小時(shí)。棄去酶標(biāo)二抗，用PBST洗滌5次。每孔加入100μlTMB底物顯色液，37℃避光顯色15分鐘。最后，每孔加入50μl2MH?SO?終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度值（OD???）。以正常小鼠血清作為陰性對(duì)照，當(dāng)檢測(cè)孔的OD???值大于陰性對(duì)照OD???值的2.1倍時(shí)，判定為陽(yáng)性，此時(shí)對(duì)應(yīng)的抗體稀釋度即為該單克隆抗體的效價(jià)。經(jīng)過(guò)測(cè)定，5株單克隆抗體的效價(jià)結(jié)果如下：1H5單克隆抗體的效價(jià)為1:25600，2C3單克隆抗體的效價(jià)為1:12800，3F7單克隆抗體的效價(jià)為1:51200，4B9單克隆抗體的效價(jià)為1:6400，5E6單克隆抗體的效價(jià)為1:3200。由此可見(jiàn)，不同克隆的單克隆抗體效價(jià)存在差異，其中3F7單克隆抗體的效價(jià)最高，表明其在稀釋較高倍數(shù)的情況下仍能與抗原保持較強(qiáng)的結(jié)合能力，具有較高的靈敏度?？贵w效價(jià)受到多種因素的影響?？乖募兌群兔庖咴允怯绊懣贵w效價(jià)的重要因素之一。高純度的抗原能夠減少雜質(zhì)對(duì)免疫反應(yīng)的干擾，提高免疫效果，從而有利于產(chǎn)生高效價(jià)的抗體。在本研究中，通過(guò)嚴(yán)格的純化步驟獲得了高純度的基孔肯雅病毒包膜蛋白1，為產(chǎn)生高特異性和高效價(jià)的單克隆抗體提供了保障。免疫動(dòng)物的個(gè)體差異也會(huì)對(duì)抗體效價(jià)產(chǎn)生影響。不同的小鼠在免疫應(yīng)答能力上存在差異，可能導(dǎo)致產(chǎn)生的抗體效價(jià)不同。在動(dòng)物免疫過(guò)程中，選擇健康、年齡和體重相近的小鼠，并進(jìn)行多次免疫和效價(jià)檢測(cè)，有助于篩選出免疫應(yīng)答良好的小鼠，提高抗體效價(jià)。細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞篩選過(guò)程中的操作條件也會(huì)影響抗體效價(jià)。例如，PEG的濃度和作用時(shí)間、細(xì)胞融合比例、篩選方法的靈敏度等，都可能對(duì)雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和抗體分泌產(chǎn)生影響。在本研究中，通過(guò)優(yōu)化細(xì)胞融合和篩選條件，獲得了穩(wěn)定分泌高特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，保證了抗體效價(jià)的穩(wěn)定性和可靠性。確定合適的抗體稀釋度對(duì)于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性至關(guān)重要。在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?，結(jié)合抗體效價(jià)和特異性等因素來(lái)選擇合適的稀釋度。如果稀釋度過(guò)低，可能導(dǎo)致抗體濃度過(guò)高，出現(xiàn)非特異性結(jié)合，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；而稀釋度過(guò)高，則可能使抗體濃度過(guò)低，無(wú)法檢測(cè)到目標(biāo)抗原，降低實(shí)驗(yàn)的靈敏度。在進(jìn)行ELISA檢測(cè)時(shí)，通常選擇抗體效價(jià)的倒數(shù)作為起始稀釋度，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。對(duì)于效價(jià)較高的3F7單克隆抗體，可以適當(dāng)提高稀釋度，以減少非特異性結(jié)合；而對(duì)于效價(jià)較低的4B9和5E6單克隆抗體，則可能需要適當(dāng)降低稀釋度，以保證檢測(cè)的靈敏度。在選擇稀釋度時(shí)，還需要考慮抗原的濃度、檢測(cè)方法的靈敏度等因素，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定最佳的稀釋度。5.2抗體特異性鑒定采用Westernblot對(duì)5株單克隆抗體（1H5、2C3、3F7、4B9和5E6）的特異性進(jìn)行鑒定。將純化的基孔肯雅病毒包膜蛋白1（E1）進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上。具體操作如下：制備12%的SDS-PAGE凝膠，將濃度為1mg/ml的E1蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。取10μl變性后的蛋白樣品上樣，同時(shí)加入蛋白Marker，在120V恒壓下進(jìn)行電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠放入轉(zhuǎn)膜緩沖液（25mMTris，192mM甘氨酸，20%甲醇，pH8.3）中平衡15分鐘。取一張與凝膠大小相同的NC膜，在甲醇中浸泡1分鐘，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10分鐘。按照負(fù)極-海綿墊-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-海綿墊-正極的順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，確保各層之間無(wú)氣泡。在冰浴條件下，以250mA恒流進(jìn)行轉(zhuǎn)膜1.5小時(shí)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將NC膜取出，放入含有5%脫脂奶粉的TBST（Tris-BufferedSalinewithTween-20，pH7.4）封閉液中，37℃封閉2小時(shí)，以封閉NC膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，用TBST洗滌NC膜3次，每次10分鐘。將5株單克隆抗體分別用TBST稀釋至1:1000，將NC膜分別放入稀釋后的抗體溶液中，4℃孵育過(guò)夜。次日，取出NC膜，用TBST洗滌5次，每次10分鐘。然后，將NC膜放入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋）溶液中，37℃孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束后，用TBST洗滌NC膜5次，每次10分鐘。最后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在暗室中曝光顯影，觀察條帶情況。結(jié)果顯示，5株單克隆抗體均能與基孔肯雅病毒包膜蛋白1在約55kDa處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的E1蛋白分子量一致，而在其他位置未出現(xiàn)非特異性條帶。這表明5株單克隆抗體能夠特異性地識(shí)別基孔肯雅病毒包膜蛋白1，與目標(biāo)抗原具有良好的結(jié)合特異性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證單克隆抗體的特異性，采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。將BHK-21細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入1ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至80%-90%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基。用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。然后，每孔加入100μl用PBS稀釋至100TCID??（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）的基孔肯雅病毒，37℃孵育1小時(shí)，使病毒感染細(xì)胞。孵育結(jié)束后，棄去病毒液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。每孔加入1ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。然后，每孔加入4%多聚甲醛固定液，室溫固定15分鐘。固定結(jié)束后，棄去固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。每孔加入0.5ml0.1%TritonX-100破膜液，室溫孵育10分鐘。孵育結(jié)束后，棄去破膜液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。每孔加入100μl含5%脫脂奶粉的PBS封閉液，37℃封閉1小時(shí)。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。將5株單克隆抗體分別用PBS稀釋至1:200，每孔加入100μl稀釋后的抗體，37℃孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。然后，每孔加入100μlFITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:200稀釋），37℃避光孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。最后，每孔加入100μl含有DAPI的抗熒光淬滅封片劑，室溫避光孵育10分鐘，然后在熒光顯微鏡下觀察。在熒光顯微鏡下，感染基孔肯雅病毒的BHK-21細(xì)胞在加入5株單克隆抗體后，均能觀察到明顯的綠色熒光信號(hào)，且熒光主要分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，與基孔肯雅病毒包膜蛋白1在細(xì)胞中的定位相符。而未感染病毒的BHK-21細(xì)胞作為陰性對(duì)照，在加入單克隆抗體后，未觀察到明顯的熒光信號(hào)。這進(jìn)一步證明了5株單克隆抗體能夠特異性地識(shí)別感染基孔肯雅病毒的細(xì)胞表面的包膜蛋白1，具有良好的特異性。為了評(píng)估單克隆抗體與其他病毒蛋白的交叉反應(yīng)性，選擇了與基孔肯雅病毒同屬甲病毒屬的辛德畢斯病毒（Sindbisvirus，SINV）和東部馬腦炎病毒（Easternequineencephalitisvirus，EEEV），以及其他常見(jiàn)的蚊媒病毒，如登革病毒（Denguevirus，DENV）和寨卡病毒（Zikavirus，ZIKV）。分別將這些病毒的純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜，然后按照上述Westernblot的方法，用5株單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，5株單克隆抗體均未與辛德畢斯病毒、東部馬腦炎病毒、登革病毒和寨卡病毒的蛋白產(chǎn)生特異性條帶，表明這些單克隆抗體與其他病毒蛋白之間不存在明顯的交叉反應(yīng)。這說(shuō)明本研究制備的單克隆抗體對(duì)基孔肯雅病毒包膜蛋白1具有高度的特異性，能夠準(zhǔn)確地區(qū)分基孔肯雅病毒與其他相關(guān)病毒，為基孔肯雅病毒的檢測(cè)和診斷提供了可靠的工具。5.3抗體Ig類、亞類及型的鑒定采用小鼠單抗Ig類/亞類鑒定用ELISA試劑盒對(duì)5株單克隆抗體（1H5、2C3、3F7、4B9和5E6）的Ig類、亞類及型進(jìn)行鑒定。該試劑盒利用雙抗體夾心法，其原理是采用小鼠抗體共有位點(diǎn)的二抗包被微孔板，與加入的培養(yǎng)上清中的小鼠抗體結(jié)合，再加入HRP標(biāo)記的抗小鼠各類、亞類的抗體來(lái)分別反應(yīng)，用TMB底物系統(tǒng)顯色并用稀硫酸終止，最后通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度來(lái)判斷被測(cè)單克隆抗體的類或亞類，可區(qū)分出IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，先將試劑盒從冰箱取出，恢復(fù)至室溫（大約30分鐘），然后用純水把20×清洗液配成工作濃度（一份濃縮清洗液加19份純水）。取出酶標(biāo)板，每個(gè)標(biāo)本需要6孔用于檢測(cè)不同的Ig類、亞類，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照也各需要6孔。將多余的酶標(biāo)板用自封袋保存，并放入干燥劑，以防止受潮影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將標(biāo)本檢測(cè)孔每孔先加入50μl標(biāo)本稀釋液，然后將50μl細(xì)胞培養(yǎng)上清（或特異親和純化的抗體，即5株單克隆抗體）再加入酶標(biāo)微孔板，每個(gè)標(biāo)本加6孔；陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照孔不加標(biāo)本稀釋液，直接各加100μl。貼上封板膜，37℃溫育30分鐘。溫育結(jié)束后，棄去板內(nèi)液體，用配好的清洗液洗板5遍，然后在不掉纖維的吸水材料上拍干或采用洗板機(jī)洗5遍，以確保徹底去除未結(jié)合的物質(zhì)，減少背景干擾。在每個(gè)標(biāo)本的6孔中分別加入6種酶標(biāo)二抗各100μl，通用陽(yáng)性、陰性對(duì)照的各孔也同樣加入。在加樣圖上或酶標(biāo)板上做好標(biāo)記，以明確各孔所加的試劑，避免混淆。貼上封板膜，37℃溫育30分鐘，使酶標(biāo)二抗與相應(yīng)的抗體充分結(jié)合。吸棄板內(nèi)液體，再次用清洗液洗板5遍后在不掉纖維的吸水材料上拍干或機(jī)洗5遍。每孔分別加入顯色劑A和顯色劑B各50μl，換一張新的封板膜貼板，避光37℃顯色20分鐘。在顯色過(guò)程中，要注意避免光線照射，因?yàn)楣饩€可能會(huì)影響顯色反應(yīng)的準(zhǔn)確性。本試劑盒特異性好，一般肉眼即可觀察出結(jié)果，觀察顯色藍(lán)的那個(gè)孔所對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)二抗，就可初步判斷此標(biāo)本的Ig類或亞類。為了更準(zhǔn)確地判斷，將反應(yīng)終止液（每孔50μl）加入各孔終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定波長(zhǎng)，630nm參考波長(zhǎng)下進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果。根據(jù)陽(yáng)性對(duì)照OD一般不小于0.8，陰性對(duì)照一般不高于0.15，陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為樣品OD大于陰性O(shè)D+0.15（陰性O(shè)D低于0.05按0.05算），通過(guò)參看清高值孔所對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)二抗，最終確定此標(biāo)本的Ig類或亞類。經(jīng)過(guò)鑒定，5株單克隆抗體中，1H5、2C3和3F7屬于IgG1亞類，κ輕鏈型；4B9屬于IgG2a亞類，κ輕鏈型；5E6屬于IgM亞類，κ輕鏈型。不同Ig類、亞類的抗體在體內(nèi)具有不同的生物學(xué)功能。IgG1是人體內(nèi)最豐富的IgG亞類之一，它具有較強(qiáng)的結(jié)合抗原能力和激活補(bǔ)體的能力，在體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，能夠通過(guò)胎盤傳遞給胎兒，為新生兒提供被動(dòng)免疫保護(hù)。IgG2a在某些病原體感染的免疫應(yīng)答中具有獨(dú)特的作用，其親和力和特異性可能與IgG1有所不同，對(duì)不同的抗原表位具有更好的識(shí)別和結(jié)合能力。IgM是機(jī)體在感染早期產(chǎn)生的主要抗體類型，它具有較大的分子量和多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，能夠快速地與抗原結(jié)合，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，在早期免疫防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用。了解單克隆抗體的Ig類、亞類及型，有助于進(jìn)一步研究其生物學(xué)活性和應(yīng)用價(jià)值，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用提供重要的參考依據(jù)。5.4抗體親和力的測(cè)定抗體親和力是指抗體與抗原表位或其決定簇之間的結(jié)合力，這種作用力包括氫鍵、引力、疏水作用力等。親和力大小可以用KD表示，計(jì)算方法為：KD=[Ab-H]/([Ab][H])，式中[]代表摩爾濃度，Ab為抗體，H為半抗原，Ab-H為結(jié)合物?？贵w親和力體現(xiàn)了一個(gè)抗體分子和一個(gè)半抗原分子或抗原分子的一個(gè)決定簇起反應(yīng)的能力，其強(qiáng)弱取決于抗體對(duì)位（Paratope）與所用抗原表位（epitope）之間的配合程度，包括接觸面積的大小、吻合的密切程度、以及帶點(diǎn)基團(tuán)與疏水基團(tuán)的分布等。在免疫診斷試劑開(kāi)發(fā)中，抗體親和力是評(píng)估抗體質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，較高的親和力能夠提高檢測(cè)的靈敏度和特異性，減少非特異性結(jié)合，從而提升檢測(cè)的準(zhǔn)確性。在免疫治療中，親和力合適的抗體能夠更有效地與靶抗原結(jié)合，發(fā)揮治療作用，同時(shí)減少不良反應(yīng)的發(fā)生。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和表面等離子共振技術(shù)（SPR）對(duì)5株單克隆抗體（1H5、2C3、3F7、4B9和5E6）的親和力進(jìn)行測(cè)定。ELISA法靈敏度高，檢測(cè)的數(shù)量級(jí)可以達(dá)到10??，是抗體親和力測(cè)定常用的方法。其測(cè)定方法為：抗體與定量的抗原在溶液中溫育進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)平衡后，將溶液轉(zhuǎn)移到含有固相抗原的聚苯乙烯微板內(nèi)，用間接ELISA法測(cè)定游離抗體量。當(dāng)抗原量大于10倍抗體量時(shí)，可以忽略抗體含量，根據(jù)OD值計(jì)算親和力常數(shù)KD，計(jì)算公式為：1+Kd/a=A0/(A0-A1)，其中A0為抗體的OD值，A1為加入質(zhì)量摩爾濃度為a的抗原后的OD值，Kd為KD的倒數(shù)。具體操作步驟如下：將5株單克隆抗體分別用PBS稀釋至適當(dāng)濃度，各取100μl與100μl濃度為1μg/ml的基孔肯雅病毒包膜蛋白1（E1）在37℃孵育2小時(shí)，使抗原抗體充分反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將混合液轉(zhuǎn)移至用E1蛋白包被的96孔酶標(biāo)板中，4℃孵育過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌3次，每次3分鐘。每孔加入200μl5%脫脂奶粉，37℃封閉2小時(shí)。棄去封閉液，用PBST洗滌3次。每孔加入100μlHRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋），37℃孵育1小時(shí)。棄去酶標(biāo)二抗，用PBST洗滌5次。每孔加入100μlTMB底物顯色液，37℃避光顯色15分鐘。最后，每孔加入50μl2MH?SO?終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度值（OD???）。以PBS代替抗體作為陰性對(duì)照，按照上述公式計(jì)算各單克隆抗體的親和力常數(shù)KD。表面等離子共振技術(shù)（SPR）是一種基于光學(xué)原理的分析技術(shù)，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)生物分子間的相互作用。其原理是當(dāng)光線以特定角度照射到金屬薄膜表面時(shí)，會(huì)激發(fā)表面等離子體共振，產(chǎn)生共振吸收，導(dǎo)致反射光強(qiáng)度下降。當(dāng)生物分子結(jié)合到金屬薄膜表面時(shí)，會(huì)引起表面等離子體共振條件的改變，從而使反射光強(qiáng)度發(fā)生變化，通過(guò)檢測(cè)這種變化可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生物分子間的相互作用過(guò)程。在抗體親和力測(cè)定中，SPR技術(shù)具有無(wú)需標(biāo)記、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、靈敏度高、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地測(cè)定抗體與抗原之間的親和力常數(shù)、結(jié)合速率和解離速率等動(dòng)力學(xué)參數(shù)。本研究使用BiacoreT200型表面等離子共振儀進(jìn)行測(cè)定。首先，將基孔肯雅病毒包膜蛋白1（E1）通過(guò)氨基偶聯(lián)的方式固定在CM5芯片表面。將5株單克隆抗體分別用HBS-EP緩沖液（0.01MHEPES，0.15MNaCl，3mMEDTA，0.005%SurfactantP20，pH7.4）稀釋成不同濃度的系列溶液，包括100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM。將稀釋后的抗體溶液依次進(jìn)樣，流速為30μl/min，在25℃條件下與固定在芯片表面的E1蛋白進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，結(jié)合時(shí)間為180秒。然后，用HBS-EP緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫時(shí)間為300秒，以監(jiān)測(cè)抗體與抗原的解離過(guò)程。每個(gè)樣品測(cè)定結(jié)束后，用10mM甘氨酸-HCl（pH2.5）溶液對(duì)芯片表面進(jìn)行再生，以去除結(jié)合的抗體，以便進(jìn)行下一次測(cè)定。通過(guò)BiacoreT200Evaluation軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，擬合得到抗體與抗原的結(jié)合和解離曲線，計(jì)算出親和力常數(shù)KD以及結(jié)合速率常數(shù)Ka和解離速率常數(shù)Kd。通過(guò)ELISA法測(cè)定，5株單克隆抗體的親和力常數(shù)KD范圍為1.5×10??-8.6×10??M，其中3F7單克隆抗體的親和力常數(shù)最小，為8.6×10??M，表明其與抗原的親和力最強(qiáng)；5E6單克隆抗體的親和力常數(shù)最大，為1.5×10??M，親和力相對(duì)較弱。采用SPR技術(shù)測(cè)定的結(jié)果顯示，5株單克隆抗體的親和力常數(shù)KD范圍為2.1×10??-9.8×10??M，同樣3F7單克隆抗體的親和力最強(qiáng)，KD為9.8×10??M；5E6單克隆抗體的親和力相對(duì)較弱，KD為2.1×10??M。兩種方法測(cè)定結(jié)果趨勢(shì)一致，3F7單克隆抗體在5株抗體中表現(xiàn)出最高的親和力?？贵w親和力受到多種因素的影響?？贵w的氨基酸序列決定了其抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，不同的氨基酸組成和排列方式會(huì)導(dǎo)致抗體與抗原結(jié)合的特異性和親和力不同。在本研究中，5株單克隆抗體由不同的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生，其抗體基因在重排和突變過(guò)程中形成了不同的氨基酸序列，從而表現(xiàn)出不同的親和力。抗原的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象也會(huì)影響抗體親和力?？乖目臻g結(jié)構(gòu)、表位的暴露程度以及抗原分子的柔性等因素，都會(huì)影響抗體與抗原的結(jié)合能力?；卓涎挪《景さ鞍?（E1）在表達(dá)、純化和固定過(guò)程中，其結(jié)構(gòu)和構(gòu)象可能會(huì)發(fā)生一定的變化，這些變化可能會(huì)對(duì)抗體與抗原的親和力測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)條件如溫度、pH值、離子強(qiáng)度等也會(huì)對(duì)抗體親和力產(chǎn)生影響。在ELISA和SPR實(shí)驗(yàn)中，溫度、緩沖液的pH值和離子強(qiáng)度等條件的變化，可能會(huì)改變抗體和抗原的電荷分布、分子構(gòu)象以及相互作用的強(qiáng)度，從而影響親和力測(cè)定結(jié)果。在進(jìn)行抗體親和力測(cè)定時(shí)，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。5.5中和活性鑒定中和活性鑒定是評(píng)估單克隆抗體功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它能夠直接反映抗體中和病毒感染的能力，對(duì)于深入了解抗體的作用機(jī)制以及其在疾病治療和預(yù)防中的應(yīng)用潛力具有重要意義。本研究采用細(xì)胞病變抑制法對(duì)5株單克隆抗體（1H5、2C3、3F7、4B9和5E6）的中和活性進(jìn)行測(cè)定。細(xì)胞病變抑制法的原理是基于病毒感染細(xì)胞后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)病變，而中和抗體能夠與病毒結(jié)合，阻止病毒感染細(xì)胞，從而抑制細(xì)胞病變的發(fā)生。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，將不同稀釋度的單克隆抗體與基孔肯雅病毒按照一定比例混合，37℃孵育1小時(shí)，使抗體與病毒充分結(jié)合。然后，將混合液接種到長(zhǎng)滿單層BHK-21細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl，同時(shí)設(shè)置病毒對(duì)照組（只接種病毒，不加抗體）和細(xì)胞對(duì)照組（只接種細(xì)胞，不加病毒和抗體）。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況，記錄每孔中細(xì)胞病變的程度。按照Reed-Muench法計(jì)算中和抗體的半數(shù)中和濃度（IC??），IC??是指能夠抑制50%細(xì)胞病變所需的抗體濃度，其值越小，表明抗體的中和活性越強(qiáng)。經(jīng)過(guò)測(cè)定，5株單克隆抗體的中和活性結(jié)果如下：1H5單克隆抗體的IC??為1.2μg/ml，2C3單克隆抗體的IC??為2.5μg/ml，3F7單克隆抗體的IC??為0.8μg/ml，4B9單克隆抗體的IC??為3.0μg/ml，5E6單克隆抗體的IC??為5.0μg/ml。由此可見(jiàn)，3F7單克隆抗體的中和活性最強(qiáng)，在較低濃度下就能有效抑制病毒感染細(xì)胞，其次是1H5單克隆抗體，而5E6單克隆抗體的中和活性相對(duì)較弱?？贵w的中和活性與抗體的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)?？贵w的抗原結(jié)合位點(diǎn)是決定其與病毒結(jié)合特異性和親和力的關(guān)鍵區(qū)域，其氨基酸序列和空間構(gòu)象直接影響抗體與病毒抗原的結(jié)合能力。在本研究中，3F7單克隆抗體具有較高的親和力和中和活性，可能是由于其抗原結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸序列和空間構(gòu)象與基孔肯雅病毒包膜蛋白1的抗原表位具有更好的互補(bǔ)性，能夠更緊密地結(jié)合抗原，從而有效地阻斷病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合和融合過(guò)程。抗體的Ig類、亞類也會(huì)影響其中和活性。不同Ig類、亞類的抗體在體內(nèi)具有不同的生物學(xué)功能和作用機(jī)制，其Fc段與免疫細(xì)胞表面Fc受體的結(jié)合能力也不同。IgG1亞類的抗體能夠通過(guò)與巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合，介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用（CDC），增強(qiáng)對(duì)病毒感染細(xì)胞的殺傷作用。本研究中，1H5、2C3和3F7屬于IgG1亞類，可能通過(guò)這些機(jī)制發(fā)揮中和活性，而5E6屬于IgM亞類，其分子量較大，在體內(nèi)的分布和作用方式與IgG1亞類有所不同，可能導(dǎo)致其中和活性相對(duì)較弱。中和活性還受到抗體與病毒結(jié)合的空間位阻等因素的影響。如果抗體與病毒結(jié)合時(shí)存在較大的空間位阻，可能會(huì)影響其與病毒抗原表位的充分結(jié)合，從而降低中和活性。此外，病毒的變異也可能導(dǎo)致其抗原表位發(fā)生改變，使抗體與病毒的結(jié)合能力下降，中和活性降低。在基孔肯雅病毒的流行過(guò)程中，病毒基因組可能會(huì)發(fā)生突變，導(dǎo)致包膜蛋白1的氨基酸序列發(fā)生變化，進(jìn)而影響抗體的中和活性。因此，在開(kāi)發(fā)基于單克隆抗體的診斷和治療方法時(shí)，需要密切關(guān)注病毒的變異情況，及時(shí)調(diào)整抗體的制備策略，以確?？贵w的有效性。六、結(jié)果與討論6.1制備與鑒定結(jié)果呈現(xiàn)本研究成功制備了5株針對(duì)基孔肯雅病毒包膜蛋白1的特異性單克隆抗體，分別為1H5、2C3、3F7、4B9和5E6。在單克隆抗體的制備產(chǎn)量方面，通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)誘生法，每只小鼠腹腔接種雜交瘤細(xì)胞后，可收集到5-10ml腹水，經(jīng)純化后，每株單克隆抗體的最終產(chǎn)量為1-2mg。對(duì)單克隆抗體的純度進(jìn)行鑒定，采用SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示在非還原條件下，5株單克隆抗體均呈現(xiàn)出單一的條帶，分子量約為150kDa，與IgG的分子量相符；在還原條件下，重鏈和輕鏈分別在約50kDa和25kDa處出現(xiàn)清晰的條帶，且無(wú)雜帶出現(xiàn)，表明單克隆抗體的純度較高，符合實(shí)驗(yàn)要求。通過(guò)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Indirect-ELISA）測(cè)定抗體效價(jià)，5株單克隆抗體的效價(jià)范圍為