不同地理種群南荻的遺傳分化研究GENETICDIFFERENTIATIONOFMISCANTHUSLUTARIORIPARIUSACROSSITSDISTRIBUTIONAREAINCHINA目錄TOC\o"1-2"\h\u摘要 4關(guān)鍵詞 41前言 52材料與方法 72.1材料 72.2測量指標與方法 82.3數(shù)據(jù)處理 93結(jié)果與分析 103.1南荻野生居群的型變異及遺傳多樣性分析 103.2南荻野生居群的分子遺傳多樣性分析 113.3南荻居群遺傳多樣性的空間表征 124討論與結(jié)論 14參考文獻 16致謝 17不同地理種群南荻的遺傳分化研究摘要：南荻是中國特有的芒屬植物，了解南荻的遺傳分化程度有助于促進其種質(zhì)資源的開發(fā)利用以及優(yōu)良品種的選育，對解決南荻在邊際土地上的種植生長問題有重要意義。本研究對184份具有代表性的南荻種質(zhì)資源進行遺傳多樣性研究，結(jié)果表明：（1）8種表型性狀（株高，莖粗，節(jié)數(shù)，最大節(jié)長，分枝數(shù)，莖密度，單株干重，干物質(zhì)產(chǎn)量）在居群間均存在極顯著差異（P＜0.01），各性狀在居群間的變異范圍在16.15%～78.98%之間，Shannon’s指數(shù)變化范圍為1.61～1.78。（2）本研究從68條SSR引物中篩選出26條清晰可用于南荻分子遺傳多樣性分析的引物，共擴增出235條帶，平均為9.04條，多態(tài)性比率（PPB）平均為91.06%，多態(tài)性信息含量（PIC）在0.39-0.94之間，平均為0.67，表明南荻有較高的遺傳多樣性。（3）14個居群的多態(tài)性位點百分比（PPL）在49.79%~82.13%，平均69.00%，觀察等位基因數(shù)（Na）平均值為1.9362，有效等位基因數(shù)（Ne）平均值為1.4003；Nei’s基因多樣性指數(shù)平均為0.2462；Shannon’s多樣性信息指數(shù)平均為0.3857。對南荻遺傳多樣性的研究結(jié)果表明，南荻在物種水平上的遺傳多樣性比較豐富。關(guān)鍵詞：南荻；表型性狀；遺傳多樣性；SSR標記；GeneticDifferentiationofMiscanthusLutarioripariusAcrossItsDistributionAreaInChinaAbstract:MiscanthuslutarioripariusisauniqueplantofMiscanthusspp.inChina.UnderstandingthegeneticdifferentiationdegreeofMiscanthuslutarioripariusishelpfultopromotethedevelopmentandutilizationofitsgermplasmresourcesandthebreedingofexcellentvarieties,itisofgreatsignificancetosolvetheproblemofMiscanthuslutarioripariusplantinggrowthonthemarginalland.Inthisstudy,184representativegermplasmresourcesofMiscanthuslutarioripariuswereusedforgeneticdiversityresearch,andtheresultsrevealedthat:(1)Theeightphenotypictraits(plantheight,stemdiameter,pitchnumber,longeststem,branchnumber,shootdensity,dryweightperstem,drymatteryield)areextremelysignificantdifferencesamongthepopulations(P<0.01),andthevariationrangeofeachtraitbetweenthepopulationsisbetween16.15%and78.98%,Shannon'sinformationindexrangesfrom1.61to1.78.(2)Thepresentstudy,26primerswereselectedfrom68SSRprimers,whichcanbeclearlyusedformoleculargeneticdiversityanalysis.Atotalof235bandswereamplified,withanaverageof9.04.Thepercentageofpolymorphicbands(PPB)averaged91.06%,thepolymorphisminformationcontent(PIC)isbetween0.39-0.94,withanaverageof0.67,indicatingthatMiscanthuslutarioripariushasahighergeneticdiversity.(3)Thepercentageofpolymorphicloci(PPL)of14populationsis49.79%~82.13%,withanaverageof69.00%.Theaveragenumberofobservedalleles(Na)is1.9362,andtheaveragenumberofeffectivealleles(Ne)is1.4003;Nei'sgeneindexaveraged0.2462;Shannon'sinformationindexaveraged0.3857.TheresultsofthestudyonthegeneticdiversityofMiscanthuslutarioripariusshowthatthegeneticdiversityatthespecieslevelisrelativelyrich.Keywords:Miscanthuslutarioriparius；Phenotypictraits；geneticdiversity；SSRmarker；1前言南荻（Miscanthuslutarioriparius）隸屬于禾本科（Poaceae）芒屬（Miscanthus），是一類多年生草本植物，具有生物量大、纖維素含量高和適應(yīng)性強等特點，分布廣泛，資源豐富，且植株較高大，生物質(zhì)產(chǎn)量高（33～36t/ha），且品質(zhì)最好。我國是世界芒屬植物資源的分布中心，而南荻是我國特有種，主要分布于長江中下游地區(qū)，在洞庭湖區(qū)的分布面積最大[1-2]。因其C4光合途徑光合效率高，生長快速，產(chǎn)量高而穩(wěn)定，養(yǎng)分需求低，水分利用效率高，抗病性和纖維素含量都高，南荻也被認為是一種具有潛力的新型生態(tài)工業(yè)植物。作為一種新型生態(tài)工業(yè)植物，南荻可以為生物質(zhì)產(chǎn)業(yè)提供原材料和優(yōu)良基因，在工業(yè)應(yīng)用與環(huán)境保護方面也具有重要的作用。在生態(tài)保護上，南荻群落可以改善周邊地區(qū)的環(huán)境氣候，凈化水質(zhì)，維持自然生態(tài)系統(tǒng)的平衡；南荻耐淹、耐瘠薄，對惡劣環(huán)境的抵抗能力強，在河床、灘涂、堤岸、護坡和荒地等裸露地帶栽植，具有固土保水、防止土壤流失等作用[3]。另外，南荻植株可實現(xiàn)礦質(zhì)養(yǎng)分的循環(huán)利用，養(yǎng)分利用率高，對肥料需求量低，植株病蟲害少，且與雜草的競爭力強，無需大量施用化肥與農(nóng)藥[3]，對環(huán)境和人畜的傷害少。在工業(yè)應(yīng)用中，南荻可像其他種類芒草一樣可通過壓縮成型、氣化、燃燒發(fā)電、發(fā)酵生產(chǎn)纖維素乙醇等應(yīng)用于能源領(lǐng)域[4-5]；此外，南荻還是一種優(yōu)質(zhì)的造紙原料；其生物質(zhì)制備的炭孔徑達2～9μm，比表面積達100～200m2·g-1，且內(nèi)表面含有大量的帶電基團，是制備生物炭的首選材料?；谀陷渡锾块_發(fā)出的炭基土壤調(diào)理劑可用于稻田降鎘，且同時添加南荻土壤調(diào)理劑和鎘鈍化劑還可顯著提高水稻產(chǎn)量[6]。由于南荻在肥力條件較好的農(nóng)田中種植時，產(chǎn)量潛力可以充分發(fā)揮，在干旱、鹽堿或貧瘠的邊際土地上種植，其產(chǎn)量水平會明顯受到抑制[7-8]。但是在我國沒有足夠的土地可以用來大規(guī)模種植南荻。而在我國西部和北部主要分布著大約有1.64×108萬hm2的邊際土地，這些土地氣候干旱、環(huán)境惡劣，不適宜種植經(jīng)濟和糧食作物，是南荻大規(guī)模種植的潛在分布區(qū)。因此，在本實驗中，采用SSR分子標記的方法分析不同地理種群南荻的遺傳分化水平，了解各種群之間南荻的親緣關(guān)系，從而進行雜交育種，獲得具有雜種優(yōu)勢的新品種，為選育耐寒耐旱的新品種做材料支撐，依據(jù)不與人爭糧、不與糧爭地的原則，選育出一批能在中國各種不同類型邊際土地種植的芒屬作物新品種或新品系。種質(zhì)資源的遺傳分化程度是遺傳改良與育種的前提。目前有關(guān)于南荻種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究也逐漸開始展開，有肖亮[9]等對五節(jié)芒資源表型性狀的遺傳多樣性進行了研究，結(jié)果顯示中國五節(jié)芒表型性狀的變異系數(shù)為2.80%～73.43%。在田美虹[10]等的研究里，南荻的表型變異系數(shù)為25.46%，僅次于芒（26.16%），該研究對華東植物區(qū)系內(nèi)芒草的表型性狀變異系數(shù)和Shannon’s指數(shù)的結(jié)果表明，該區(qū)系內(nèi)芒和南荻表型性狀的變異幅度較大，遺傳多樣性較豐富，而荻和五節(jié)芒的表型性狀變異幅度較小。楊塞等[11]對30份來自全國各地的南荻的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀研究發(fā)現(xiàn)，其農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀的變異系數(shù)變化范圍為4.15%～75.02%。項偉等[12]對4個植物區(qū)系的南荻的9個表型性狀進行了研究，發(fā)現(xiàn)南荻的表型性狀在區(qū)系間存在顯著差異。郭孟齊[13]等對54個南荻野生居群的8種表型性狀進行了遺傳多樣性的分析，發(fā)現(xiàn)南荻的表型變異主要來自種群內(nèi)。分子標記是種質(zhì)資源評估、遺傳多樣性分析和標記輔助育種的重要工具。SSR又稱微衛(wèi)星DNA，是一種共顯性標記，具有擴增條帶清晰、產(chǎn)物重復性好、多態(tài)性高等優(yōu)點，被認為是遺傳多樣性分析中最好的標記之一。在鐘智林等[14]的研究中運用SSR分子標記的方法，用30對玉米SSR引物對15份中國湖南省的野生芒屬材料進行擴增，結(jié)果表明：30對引物共擴增出159條帶，其中多態(tài)性條帶121個，占76.10%。薛德等[15]所做的研究中，26對引物在53份五節(jié)芒材料中表現(xiàn)出高多態(tài)性，基于SSR分子標記結(jié)果可以看出五節(jié)芒種質(zhì)資源具有豐富的遺多樣性。在張馨芳等[16]利用SSR標記對燕山板栗種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析中，21對引物共檢測到71個等位變異位點,變異范圍為2～6,平均每對SSR引物可檢測到3.38個等位位點;多態(tài)性信息含量為0.6145～0.9723,平均0.8668。以上結(jié)果表明SSR標記在芒屬植物種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析具有很好的可行性。南荻自身具備豐富的遺傳多樣性、自交不親和及種間可雜交等，這為本研究的實施提供了理論基礎(chǔ)。本課題組基于南荻在中國的整個空間分布范圍來研究南荻的遺傳多樣性。通過研究不同地理種群南荻表型的遺傳多樣性及其分子方面的遺傳多樣性空間分布，篩選南荻優(yōu)勢種，獲得抗逆性更強的南荻種群，從而為解決南荻在邊際土地上的種植生長問題提供參考，對南荻野生種質(zhì)資源的育種具有重要意義。2材料與方法2.1材料本研究采用了184種南荻野生種質(zhì)資源用于分析遺傳多樣性，所用植物材料來自于湖南農(nóng)業(yè)大學芒屬植物資源圃（28?11’14.42"N,113?4’7.69"E）。該資源圃自2006年以來，在全國自然化的芒草分布區(qū)內(nèi)調(diào)查收集包括南荻在內(nèi)的芒屬植物野生種質(zhì)資源，并種植在耘園基地（消除環(huán)境因素對南荻表型性狀造成的影響），資源圃內(nèi)種植區(qū)不施用水、肥，以排除人為因素對實驗的影響，每年12月刈割一次。待南荻在資源圃內(nèi)生長穩(wěn)定時，對南荻進行采樣收集。所有這些材料基于三個條件被分為14個居群（圖1）：（1）一個種群內(nèi)收集的所有種質(zhì)的起源點應(yīng)密切相關(guān)；（2）相似的生長條件；（3）沒有自然隔離障礙（例如高山，大河）。圖114個居群的分布區(qū)域Figure1Distributionareaof14populations2.2測量指標與方法2.2.1表型性狀的測量野外采樣時，每個居群內(nèi)選取10個單株進行表型性狀的測量，居群內(nèi)單株采樣距離間隔3m以上，不同居群間相隔20km以上。表型數(shù)據(jù)的測量項目包括：株高，即植株地上部分到花序最高處的距離；節(jié)數(shù)，即植株地上部分到小穗基部的分節(jié)數(shù)；莖密度，即植株每平方米的莖稈數(shù)目；分枝數(shù)，即植株單根莖稈上腋芽發(fā)育形成的分枝數(shù)；單株干重，即植株單根莖稈烘干至恒重的重量；基部直徑，即植株單根莖稈距離地面5cm處的直徑；干物質(zhì)產(chǎn)量，即植株每平米的地上生物質(zhì)總干重；最大節(jié)長，即植株地上部分節(jié)間最長的莖節(jié)長度。2.2.2基因組DNA的提取與PCR擴增DNA的提?。簭拿⒉莘N質(zhì)資源圃中采集184種南荻的幼葉，并保存在-20℃的條件下，采用改良CTAB法[17]提取南荻材料的總基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳分析和分光光度計測定吸光值來分析每個DNA樣品的濃度和純度。根據(jù)樣品在260nm和280nm的讀數(shù)比值可以估計核酸的純度。當OD260/OD280≥1.8時，則可以進行下一步PCR的擴增；如果沒有，則需要重新取樣，直到樣品材料的OD260/OD280≥1.8。將稀釋后的DNA樣品在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，再通過紫外成像系統(tǒng)照相，在照片中比較樣品與標準DNA梯度的亮度，可估算樣品的濃度。另外，可通過觀察電泳跑膠情況，檢查照片中樣品電泳帶有無拖帶現(xiàn)象估計DNA質(zhì)量PCR擴增：SSR-PCR反應(yīng)體系為15μL，含有10×PCRbuffer1.5μL、25mmol/LMgCl21.5μL、Primer1.2μL、10mmol/LdPTPs0.3μL、20ng/μL模板DNA2μL、5U/μLTaq酶0.1μL。以上試劑均購自廣州東盛生物技術(shù)有限公司。PCR反應(yīng)條件為：94℃預變性5min；94℃變性1min，56~64℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸7min[13]。該反應(yīng)在BiometraTgradientPCR儀中進行。在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠上分離PCR產(chǎn)物，銀染顯色后在紫外光下照相。本研究中采用了68對引物進行PCR擴增，這68對引物的效用已經(jīng)在其他不同種芒屬植物中得到評估，只有26對引物（圖2）具有清晰且可重復的條帶，可用來進行遺傳多樣性的分析。將SSR標記清晰可辨的電泳條帶用于統(tǒng)計分析，在相同遷移率上，有擴增帶的賦值為１，無擴增帶的賦值為０，并根據(jù)這些數(shù)據(jù)建立矩陣，用來計算Nei的基因多樣性和Shannon’s多樣性信息指數(shù)。圖226對SSR引物名稱與序列Figure2Nameandsuquenceofthe26SSRprimerpairs2.2.3南荻種質(zhì)資源遺傳多樣性空間分布的可視化根據(jù)已計算出的遺傳多樣性參數(shù)，將南荻種質(zhì)資源遺傳多樣性的空間分布可視化。(1)生成地理參考數(shù)據(jù)：一個種群內(nèi)所有種質(zhì)的起源地均被賦予每個多樣性參數(shù)相同的值；(2)在ArcGIS中將地理參考的遺傳數(shù)據(jù)與地理數(shù)據(jù)一起組織；(3)使用IDW分析遺傳參數(shù)插值以生成遺傳表面圖，將得到的遺傳表面圖覆蓋到南荻的地理分布區(qū)域，以生成南荻地理分布范圍內(nèi)的遺傳變異圖。2.3數(shù)據(jù)處理用SPSS22.0軟件計算試驗數(shù)據(jù)的最大值、最小值、平均值、標準差和變異系數(shù)；采用單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行F值檢驗；采用Shannon’s多樣性指數(shù)（I）來評價南荻各表型性狀的變異程度和遺傳多樣性。根據(jù)已獲得的0-1矩陣，利用GenAlexv6.1軟件計算Nei’s基因多樣性和Shannon’s多樣性信息指數(shù)。通過Excel2013統(tǒng)計SSR擴增的條帶總數(shù)（TNB）和多態(tài)性條帶數(shù)（NPB)，計算多態(tài)性位點百分率（PPB），其中PPB=NPB/TNB。SSR引物多態(tài)性信息含量（PIC）采用POWERMARKERversion3.25軟件計算得出。采用POPGENEversion1.31軟件計算觀察等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei的基因多樣性（H）、Shannon的多樣性信息指數(shù)（I）、多態(tài)性的百分比位點（PPL），通過這五項參數(shù)來評估南荻遺傳多樣性的水平。3結(jié)果與分析3.1南荻野生居群的型變異及遺傳多樣性分析南荻野生居群表型差異性的檢驗結(jié)果表明（表1），所選的8種表型性狀指標在不同居群間均存在極顯著差異（P＜0.01），其在居群間的差異度分別為干物質(zhì)產(chǎn)量（F=78.90）、莖密度（F=31.34）、最大節(jié)長（F=24.05）、單株干重（F=23.31）、株高（F=18.56）、莖粗（F=12.07）、節(jié)數(shù)（F=10.82）、分枝數(shù)（F=5.62）。對不同南荻野生居群表型變異的研究可以發(fā)現(xiàn)，南荻野生居群的表型性狀變異幅度大，遺傳多樣性豐富，8種表型性狀在居群間的變異幅度為17.05%～78.98%，其中單株干重和干物質(zhì)產(chǎn)量在不同居群間的變異幅度最大，其變異系數(shù)分別是78.98%和78.10%；而節(jié)數(shù)在居群間的變異幅度較小，其變異系數(shù)只有17.05%。采用Shannon’s多樣性指數(shù)（H'）來評價南荻各表型性狀在所選居群間的遺傳多樣性，結(jié)果表明8個性狀的遺傳多樣性指數(shù)H'變化范圍為1.61-1.78，其中株高、莖粗和莖密度的H'值最大為1.78，而干物質(zhì)產(chǎn)量的H'值最小為1.61，說明在所選居群間南荻的株高、莖粗和莖密度的遺傳多樣性最為豐富，而南荻的干物質(zhì)產(chǎn)量的遺傳多樣性最低。在野外調(diào)研中也發(fā)現(xiàn)，南荻在各植物區(qū)系內(nèi)分布的生境類型十分豐富，使得南荻具有豐富的基因型差異，進而造成南荻在表型性狀上具有豐富的遺傳多樣性。表1南荻試驗材料的表型性狀Table1ThephenotypictraitsinformationofthetestedM.lutarioripariuspopulations表型性狀最小值最大值平均值標準差變異系數(shù)H’指數(shù)F值P值TratisMinMaxMeanSDCV(%)H’indesFValuePValue株高（cm）Plantheight206.20614.90368.0072.4119.681.7818.56**莖粗（mm）Stemdiameter8.1025.5314.153.3623.771.7812.07**節(jié)數(shù)Pitchnumber15.0041.0028.754.9017.051.7210.82**最大節(jié)長（cm）Longeststem13.3243.3223.9760125.061.7524.05**分枝數(shù)Branchnumber0.0018.004.913.2866.681.765.62**莖密度（個/m2）Shootdensity10.0044.0025.147.4729.701.7831.34**單株干重（g）Dryweightperstem21.80696.57148.96117.6478.981.6723.31**干物質(zhì)產(chǎn)量（kg/m2）Drymatteryield0.4212.123.552.7878.101.6178.90**注：*和**分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著。Notes:*and**indicatesignificantdifferencesat0.05and0.01levels.3.2南荻野生居群的分子遺傳多樣性分析用26對SSR引物對14個居群的184份南荻個體基因組進行PCR擴增。共擴增出235條清晰的帶，每對引物檢測的位點數(shù)介于2~23之間，平均每個引物能擴增出9.04條帶；其中HAU-404擴增的條帶數(shù)最多，共檢測出了23條，HAU-32和HAU-35擴增的條帶數(shù)最少，只有2條。在235個條帶中，其中多態(tài)性條帶數(shù)（NPB）為115條，平均為6.76條；多態(tài)性比率（PPB）范圍為50.00~100%，平均為91.06%；不同SSR引物所顯示的試驗材料的多態(tài)性信息含量（PIC）值范圍為0.39~0.94（表2），平均為0.67，所有SSR引物都為中度多態(tài)引物（PIC>0.25）。結(jié)果表明SSR分子標記在南荻種質(zhì)資源中具有良好的多態(tài)性，可以用這些SSR引物進行南荻不同種質(zhì)間的遺傳多樣性和遺傳分化的研究。表2SSR引物的多態(tài)性Table2ThepolymorphismofSSRprimers引物名稱正向序列(5’-3’)反向序列（5’-3’）TNBNPBbPPBc(%)PICdHUA-456AAGCTGCGAGAGCAAGAGACCAGGTCGCCGTAGGTGTAGT66100.00%0.39HUA-187CCAGACATTCCCCAAACCCTACGTCGGTGTCGTACTGGTTG66100.00%0.64HAU-144TAACTGCAGAAACGGTGGTCAATACTCTTCACGCTCAATAAACCCAGT7685.71%0.59HAU-89CAACAGGGTGAACCCTCTGTACTTAATATGGTGTTGTGATTTGCATCG88100.00%0.71HUA-386CTGTTCCACCACAAGAAGGACCACCGTGGTCTCCGTGTACT7685.71%0.64HAU-384ACAGGACTGCAGTGTCAGGATGGGTTTCTCAAACTCCTTTGG10990.00%0.82HAU-116ATATTCATCGGTTCAACTTCCAGCGCCAGCCTCCCGTAGTC4375.00%0.47HAU-414AACTAATTTGCATGGCAGCATGCGGACAAGCAAGTAGATGTG1111100.00%0.67HAU-281AACAGTCAAGCTCACTTTCCGCCATCCATAAGCTGAAGGAGTGAGG1313100.00%0.89HAU-469TTAATGATGAAGCTGCCTGCCGACTTCGACTACGAATCCTG99100.00%0.85HAU-321AGAGAATCCCCAAGCAAACAAACCTTCATCGGAGCCATGGTGT77100.00%0.61HAU-378CGTGCTACTACTGCTACAAAGCGAAGTCGTTCGTGTCTTCCGAAACT44100.00%0.51HAU-12CACCAACGCCAATTAGCATCCGTGGGCGTGTTCTCCTACTACTCA77100.00%0.65HAU-47TCTCTGACTATTCCACGAGCTCAACTGGTGCGTGCTACAACTGTG111090.90%0.74HAU-32AGAACCTCCCGCTTGACGACACCTCAACCTCGACCTCTGCAT2150.00%0.11HAU-18TTTTTCTTCTCACCATCACCTTCATGGCTTCAAAGAAGAGGAAACATC3266.66%0.50HAU-2ATCTCGTCTACCTAACCCACCCTCCAGGTGAAGAATCTGGTGAGGTC77100.00%0.82HAU-35TGGTTATGTGCATGATTTTTCCTGCATGCGTCTGATCTTCAGAATGTT2123-124100.00%0.36HAU-64GGGACAAAAGAAGAAGCAGAGGAAATGGGACAGAGACAGACAAT10490.00%0.73HAU-193ATATTGTACAGGAGCAGCTGGGACGGAGGTCATGCGTGTAAATAGGTC6135-14083.33%0.73HAU-388GAGAAGACGCAGAACGACATCCAGTTAGGTTCTCGGATGCAG20141-16090.00%0.90HAU-438GCACCTTTCCAGCTATAAGCAACGCGATGTAACTACACCCAC5161-16580.00%0.74MSSR-21TATGGGTGAATGTTGGTTTGCCCGTTTGTGCGAGTGC20166-185100.00%0.90MSSR-17CTATGATGATGGCAACGTCCAAAACAGTGAGGGT18186-203100.00%0.90HAU-119CTTCCCCTCCGCTACTGCTCGTACTTGGTGTTGTCGCTCTTCTTC9204-21288.88%0.69HAU-404GGACACTTGGCAACGAAGCAGCTCAAGGTCGTCTTCTGC23213-23591.30%0.94注：TNP：總條帶數(shù)。NPBb：多態(tài)性條帶數(shù)。PPBc：多態(tài)性比率。PICd：多態(tài)性信息含量。Notes:TNP:totalnumberofbands.NPBb:numberofpolymorphicbands.PPBc:percentageofpolymorphicbands.PICd:polymorphisminformationcontent.3.3南荻居群遺傳多樣性的空間表征本研究通過使用26個微衛(wèi)星標記分析184種南荻樣本的遺傳多樣性（表3），所有樣本來自整個自然分布范圍內(nèi)14個南荻野生居群。結(jié)果表明，不同南荻居群間的遺傳多樣性存在差異，各居群的多態(tài)性位點百分比（PPL）在49.79%~82.13%，平均69.00%，其中Pop7居群的最高，Pop1居群的最低，說明南荻各居群內(nèi)的多態(tài)性較高，居群間的多態(tài)性水平普遍較高，這顯示了不同野生居群南荻的遺傳多樣性豐富。按所檢測到的多態(tài)性位點百分率，14個居群的排序為：Pop7（82.13%）>Pop4（75.32%）>Pop5（73.62%）>Pop3=Pop14=Pop9（73.19%）>Pop13（72.77%）>Pop12（71.49%）>Pop2（71.06%）>Pop8（65.96%）>Pop11（64.26%）>Pop10（61.70%）>Pop6（58.30%）>Pop1（49.79%）。每個居群的觀察等位基因數(shù)（Na）介于1.4979~1.8312之間，平均值為1.9362；有效等位基因數(shù)（Ne）可以反應(yīng)群體遺傳變異的大小，其變化幅度在1.2930~1.4144之間，平均值為1.4003；在14個野生居群中，各居群間的Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）在0.1713~0.2416之間，平均為0.2462；Shannon’s多樣性信息指數(shù)（I）在0.2576~0.3636之間，平均為0.3857，說明南荻具有高水平的遺傳多樣性，這就為南荻新品種或新品系的遺傳育種提供了理論基礎(chǔ)。表3南荻14個種群的遺傳多樣性參數(shù)Table3GeneticdiversityparametersforfourteenpopulationsofMiscanthuslutarioripariusPopulation觀察等位基因數(shù)(Na)有效等位基因數(shù)(Ne)Nei的基因多樣性(H)Shannon的多樣性信息指數(shù)(I)多態(tài)性的百分比位點(PPL)Pop11.49791.29300.17130.257649.79%Pop21.71061.37470.22360.341271.06%Pop31.73191.38570.22660.344573.19%Pop41.75321.36070.2160.332675.32%Pop51.73621.37330.22280.340973.62%Pop61.5831.31880.19080.290258.30%Pop71.82131.37370.22820.354282.13%Pop81.65961.35120.21050.321265.96%Pop91.73191.38860.23080.350773.19%Pop101.6171.34370.20390.309361.70%Pop111.64261.3860.22430.336164.26%Pop121.71491.41440.24160.363671.49%Pop131.72771.38520.22920.349472.77%Pop141.73191.39780.23510.356673.19%平均1.93621.40030.24620.385769.00%了解南荻種群的遺傳多樣性與遺傳改良的潛力，對于南荻育種具有重要意義。在不同的南荻野生種群中，H指數(shù)的變化很大，例如，多樣性最高的種群Pop12（0.2416）比多樣性最低的種群Pop1（0.1713）高40%。對于I指數(shù)也是一樣，Pop12的I指數(shù)（0.3636）比最Pop1的I指數(shù)（0.2576）高41.1%。遺傳多樣性的空間圖顯示，長江下游南荻種群比上游區(qū)域種群的遺傳多樣性更豐富；河南南部居群（圖3中西北綠色部分）的遺傳多樣性最低，其次，是湘南湘江上游居群（Pop6）；從圖中可以看出，Pop11和Pop12所在的江蘇中部和南部是遺傳多樣性最豐富的地區(qū)（H為0.2243-0.2416，I為0.3361-0.3636）；但是，與多樣性最高居群相鄰的安徽東部（Pop10）和中南部（Pop8）居群，具有中等至低的遺傳多樣性（H為0.2039-0.2105，I為0.3093-0.3212），而且，洞庭湖沿海地區(qū)的最大居群（Pop4）的多樣性也僅僅只是中等（H=0.216，I=0.3326）。對南荻不同野生種群的遺傳多樣性研究結(jié)果表明，長江下游的江蘇中部和南部居群的遺傳多樣性比長江上游和中游的湖南、湖北、江西居群的遺傳多樣性要高。圖3南荻居群遺傳分化空間分布圖Figure3SpatialdistributionmapofgeneticdifferentiationofMiscanthuslutarioripariuspopulation4討論與結(jié)論南荻耐旱、耐寒性較差，在邊際土地上的存活率較低，通過分子育種等手段選育耐旱耐寒的新品種有利于南荻種質(zhì)資源的推廣種植。物種在適應(yīng)自然環(huán)境和長期進化的過程中會形成豐富的遺傳多樣性，遺傳多樣性是物種進化潛力的代表。遺傳多樣性分析是充分利用種質(zhì)資源的重要前提，而表型多樣性分析是遺傳多樣性分析中重要的組成部分，其具有操作簡便、成本低和周期短的特點，目前已在多種作物的種質(zhì)資源評價中得到廣泛應(yīng)用。表型是由基因型和環(huán)境共同作用的結(jié)果，因此可以通過分析南荻表型性狀上的變異來研究南荻的遺傳變異程度。對篩選出的184個南荻野生種質(zhì)表型性狀的遺傳多樣性分析表明：8種表型性狀在居群間均存在極顯著差異（P＜0.01），各性狀在居群間的變異范圍為16.15%～78.98%，Shannon’s指數(shù)范圍為1.61～1.78。與其他高大禾草（割手密、斑茅）相比[18-19]，本研究得出的南荻表型變異系數(shù)較大，Shannon’s指數(shù)范圍也較大，這說明所選南荻材料的表型遺傳多樣性較豐富，南荻種內(nèi)存在著豐富的表型變異。物種不同居群間的變異反映了其地理和生殖隔離上的變異，是物種適應(yīng)不同環(huán)境的具體表現(xiàn)[20]。本研究所選取的南荻居群分布在111°～120°E，28°～33°N，分布區(qū)域較大，經(jīng)過長期的自然選擇和進化，各居群間的生境和氣候不盡相同，南荻野生居群間也會產(chǎn)生不同程度的遺傳分化，這就使得南荻各野生居群間的表型性狀存在差異，進而表現(xiàn)出豐富的遺傳變異和遺傳多樣性。南荻在我國分布比較廣，為適應(yīng)不同的自然環(huán)境，呈現(xiàn)出較豐富的遺傳及表型多樣性。本研究采用SSR分子標記技術(shù)對中國范圍內(nèi)南荻種質(zhì)資源的14個南荻野生居群的184份材料的遺傳多樣性和遺傳分化進行分析，結(jié)果表明，在物種水平的多態(tài)性比率（PPB）為0.9106，高于NieGang[21]對芒屬植物芒研究的結(jié)果，其中H為0.2462、I為0.3857，此結(jié)果也大于木蘭科植物厚樸的平均水平（H=0.194，I=0.286）[22]。表明南荻具有較高的遺傳多樣性水平。多態(tài)性信息含量（PIC）在物種水平上為0.67，該結(jié)果表明，SSR引物是高度多態(tài)的且具有信息性。從以上結(jié)果可以看出，SSR標記可作為研究南荻種質(zhì)資源的有效工具，為鑒定南荻種質(zhì)資源、構(gòu)建遺傳圖譜、基因作圖和克隆奠定基礎(chǔ)。種群的遺傳多樣性受許多因素影響，包括育種系統(tǒng)，種群規(guī)模，遺傳漂移，自然選擇，突變率和基因流。洞庭湖地區(qū)是南荻在中國最大、最連續(xù)的分布中心，而在河南、安徽地區(qū)的南荻野生居群的規(guī)模很小，在這些地區(qū)南荻都是呈點狀分布，因為人為的對南荻資源的掠奪性收集以及對其棲息地的破壞，所以只發(fā)現(xiàn)了極少數(shù)的南荻居群。種群的規(guī)模與遺傳多樣性是顯著相關(guān)的，在自然環(huán)境中，較低的種子發(fā)芽率和通過根狀莖的無性繁殖是導致小種群中的遺傳多樣性低的原因，這也就解釋了這些小規(guī)模南荻居群內(nèi)的低遺傳多樣性。洞庭湖地區(qū)有150多萬畝的野生南荻資源，是我國南荻分布的核心區(qū)域，綜合性狀較優(yōu)，同時也是南荻種質(zhì)資源最豐富、最優(yōu)良的區(qū)域。本研究結(jié)果顯示，在南荻分布中心的洞庭湖區(qū)域內(nèi)的居群，其遺傳多樣性比江蘇中部和南部居群內(nèi)的遺傳多樣性低，具有中等至低的遺傳多樣性。這與YangSai[23]等的研究不相符，這可能是因為我們所采集的南荻野生種質(zhì)資源來源更廣泛，在本研究中所使用的分子標記也不同，所產(chǎn)生的試驗結(jié)果也不相同。許多因素都可能導致中等程度的種群分化，包括但不限于花粉和種子轉(zhuǎn)移、育種系統(tǒng)、地理隔離和環(huán)境異質(zhì)性。在本研究中，中等遺傳分化的最合理解釋可能是由于南荻野生居群間的地理隔離。本研究表明南荻種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性與中度的遺傳分化，能夠篩選出應(yīng)用于不同類型邊際土地的優(yōu)良種質(zhì)，該研究根據(jù)多樣性分析的結(jié)果可以為提高育種效率提供遺傳基礎(chǔ)。參考文獻[1]易自力.芒屬能源植物資源的開發(fā)與利用[J].湖南農(nóng)業(yè)大學學報（自然版）,2012,38(5):455-463.[2]錢茱希,薛帥,郭孟奇,等.基于SCoT標記的洞庭湖區(qū)南荻種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究[J].中國草地學報,2018,40(03):14-19+48.[3]黨寧,黃志剛,李合松.纖維型植物南荻的生物學及其應(yīng)用研究進展[J].熱帶亞熱帶植物學報,2012(04):104-110.[4]謝光輝,卓岳,趙亞麗,等.歐美根莖能源植物研究現(xiàn)狀及其在我國北方的資源潛力[J].中國農(nóng)業(yè)大學學報,2008,13(6):11-18.[5]趙春橋,陳敏,范希峰,等.干旱脅迫對芒草生長與生理特性的影響[J].干旱區(qū)資源與環(huán)境,2015,29(11):197-201.[6]廖雄輝,龍琴,王惠群,等.南荻炭與鎘鈍化劑互作對水稻鎘含量和產(chǎn)量的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報,2018,37(09):1818-1826.[7]范希峰,侯新村,武菊英,等.我國北方能源草研究進展及發(fā)展?jié)摿J].中國農(nóng)業(yè)大學學報,2012,17(6):150-158.[8]胡小虎.南荻（Miscanthuslutarioriparius）種質(zhì)資源的收集及遺傳變異研究[D].武漢大學,2017.[9]肖亮,蔣建雄,易自力,等.五節(jié)芒種質(zhì)資源的表型多樣性分析[J].湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版),2013,39(02):150-154.[10]田美虹,郭孟齊,易自力,等.華東植物區(qū)系芒屬植物的表型遺傳多樣性研究[J].湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版),2019,45(4):348-354.[11]楊塞,肖亮,王鉆,易自力.南荻種質(zhì)農(nóng)藝及品質(zhì)性狀主成分聚類分析與綜合評價[J].中國草地學報,2016,38(03):26-33.[12]項偉,易自力,肖亮,等.南荻種質(zhì)資源表型性狀遺傳多樣性[J].草業(yè)科學,2017,34(03):547-555.[13]郭孟齊,肖亮,廖劍鋒,等.南荻野生居群的表型多樣性及土壤養(yǎng)分對其表型的影響[J].西北植物學報,2019,39(10):1868-1880.[14]鐘智林,蔣建雄,楊璐,等.玉米SSR引物在芒屬植物遺傳多樣性分析的應(yīng)用研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2009,9(11):2076-2079+2119.[15]薛德,肖亮,艾辛,等.五節(jié)芒表型性狀和SSR標記遺傳多樣性分析[J].草業(yè)學報,20