大腸桿菌發(fā)酵提取法生產(chǎn)門冬酰胺酶《生物制藥工藝》主講人：方緒鳳導(dǎo)入湖北生物科技職業(yè)學(xué)院

大腸桿菌門冬酰胺酶對治療白血病有顯著療效。門冬酰胺酶L-天門冬酰胺酶天門冬酰胺酶左旋門冬酰胺酶愛施巴湖北生物科技職業(yè)學(xué)院作用機制：藥用L-天冬酰胺酶L-天冬酰胺門冬酰胺酶水解L-天冬氨酸NH3＋

L-天冬酰胺酶在血液中特異性的催化天冬酰胺水解形成L-天冬氨酸和氨，而天冬酰胺是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)及增殖生長所必需的氨基酸。正常細(xì)胞有自身合成天冬酰胺的功能，而急性白血病等腫瘤細(xì)胞則無此功能，因而當(dāng)外來天冬酰胺酶使天冬酰胺急劇缺失時，腫瘤細(xì)胞因既不能從血中取得足夠天冬酰胺，亦不能自身合成，使其蛋白質(zhì)合成受阻，增值受抑制，細(xì)胞大量死亡。因此臨床上用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病，是第一種用于治療癌癥的酶。

編號：EC3.5.1.1。存在于細(xì)菌中的一種水解酶，能特異水解天冬酰胺的酰胺鍵。大腸桿菌能產(chǎn)生兩種L-天冬酰胺酶，即L-天冬酰胺酶Ι和II，其中L-天冬酰胺酶II的抗癌活性較強。湖北生物科技職業(yè)學(xué)院理化性質(zhì)：L-天冬酰胺酶（L-Asparaginase）

呈白色粉末狀，微有濕性，溶于水，不溶于丙酮、氯仿、乙醚及甲醇。其20%水溶液，室溫貯存7d，5℃保存14d，均不減少酶的活力。干品50℃，15min酶活力降低30%；60℃，1h內(nèi)失活。最適pH為8.5，最適溫度為37℃。湖北生物科技職業(yè)學(xué)院理化性質(zhì)：L-天冬酰胺酶湖北生物科技職業(yè)學(xué)院制備方法：L-天冬酰胺酶大腸桿菌菌種活化及擴大培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)提取、沉淀及熱處理精制、凍干湖北生物科技職業(yè)學(xué)院制備步驟：第一步菌種活化及擴大培養(yǎng)菌種活化擴大培養(yǎng)湖北生物科技職業(yè)學(xué)院制備步驟：第二步發(fā)酵罐培養(yǎng)玉米漿培養(yǎng)基+大腸桿菌8%接種量37℃，通氣攪拌，培養(yǎng)6-8h離心分離發(fā)酵液得菌體加2倍量丙酮攪拌，壓濾，濾餅過篩自然風(fēng)干成菌體干粉湖北生物科技職業(yè)學(xué)院制備步驟：第三步提取、沉淀、熱處理菌體干粉+0.01MpH8硼酸緩沖液37℃攪拌1.5h降溫至30℃加入5M醋酸調(diào)節(jié)pH至4.2-4.4壓濾湖北生物科技職業(yè)學(xué)院制備步驟：第三步提取、沉淀、熱處理靜置4h過濾濾液[沉淀]2倍體積丙酮粗酶[攪拌，離心]0.3%甘氨酸pH8.8上清液[熱處理]甘氨酸60℃，30min酶溶液湖北生物科技職業(yè)學(xué)院制備步驟：第四步精制、凍干[精制]聚乙二醇不同pH處理無熱原酶液[凍干]無菌包裝天冬酰胺酶凍干制劑酶溶液湖北生物科技職業(yè)學(xué)院制備方法：

L-天冬酰胺酶提取工藝流程圖pH4.2~4.4大腸桿菌[菌種培養(yǎng)]肉湯培養(yǎng)基37℃，24h肉湯菌種[種子培養(yǎng)]玉米漿37℃，4~8h種子液[發(fā)酵]玉米漿37℃，6~8h發(fā)酵液[壓濾、風(fēng)干]丙酮干菌體[提取]硼酸緩沖液pH8.3，37℃提取液[沉淀]乙酸粗酶[熱處理]甘氨酸60℃，30min酶溶液[精制]聚乙二醇不同pH處理無熱原酶液[凍干]無菌包裝天冬酰胺酶凍干制劑湖北生物科技職業(yè)學(xué)院提取原理：

蛋白質(zhì)沉淀法丙酮pH4.2~4.4聚乙二醇加熱60℃30min等電點沉淀高分子聚合物沉淀熱變性有機溶劑沉淀湖北生物科技職業(yè)學(xué)院培門冬酶（Pegaspargase）湖北生物科技職業(yè)學(xué)院聚乙二醇在藥物制劑中的應(yīng)用湖北生物科技職業(yè)學(xué)院聚乙二醇在藥物制劑中的應(yīng)用聚乙二醇會通過一些化學(xué)反應(yīng)與蛋白質(zhì)和多肽類藥物相連，這個過程被稱作聚乙二醇化(PEGylation)體積增大，不易被腎臟過濾覆蓋保護(hù)層，防止被酶解水溶性大大增加有助于藥物更好地在體內(nèi)發(fā)揮作用湖北生物科技職業(yè)學(xué)院小結(jié)：大腸桿菌發(fā)酵提取法大腸桿菌菌種活化及擴大培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)提取、沉淀及熱處理精制、凍干湖北生物科技職業(yè)學(xué)院展望：L-天冬酰胺酶其他生產(chǎn)工藝歐文菌發(fā)酵提取法