0512高效液相色譜法高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。注入的供試品溶液，由流動相帶入色譜柱內，供試品溶液中各組分在柱內被分離，并進入檢測器而被檢測，由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號。1.對儀器的一般要求和色譜條件高效液相色譜儀由高壓輸液泵、進樣器、柱溫箱（色譜柱）、檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。色譜柱內徑一般為2.1～4.6mm，填充劑粒徑約為2～10μm。超高效液相色譜儀是耐超高壓、小進樣量、低死體積、高靈敏度檢測的高效液相色譜儀。（1）色譜柱反相色譜柱：以鍵合非極性基團的載體為填充劑填充而成的色譜柱。常見的載體有硅膠、聚合物復合硅膠和聚合物等；常用的填充劑有十八烷基硅烷鍵合硅膠、辛基硅烷鍵合硅膠和苯基硅烷鍵合硅膠等。正相色譜柱：用硅膠或鍵合極性基團的硅膠填充而成的色譜柱。常見的填充劑有硅膠、氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠等。氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠也可用作反相色譜。離子交換色譜柱：用離子交換填充劑填充而成的色譜柱。有陽離子交換色譜柱和陰離子交換色譜柱。手性分離色譜柱：用手性填充劑填充而成的色譜柱。色譜柱的內徑與長度，填充劑的形狀、粒徑與粒徑分布、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、載體表面基團殘留量，填充的致密與均勻程度等均影響色譜柱的性能，應根據(jù)被分離物質的性質來選擇合適的色譜柱。溫度會影響分離效果，品種正文中未指明色譜柱溫度時系指室溫，應注意室溫變化的影響。為改善分離效果可通過適當調整柱溫箱溫度來控制柱溫。殘余硅羥基未封閉的硅膠色譜柱，流動相pH值一般應在2～8之間。烷基硅烷帶有立體側鏈保護或殘余硅羥基已封閉的硅膠、聚合物復合硅膠或聚合物色譜柱可耐受更寬pH值范圍的流動相，可采用pH值小于2或大于8的流動相。（2）檢測器最常用的檢測器為紫外-可見分光檢測器，包括二極管陣列檢測器。其他常見的檢測器有熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、電霧式檢測器、示差折光檢測器、電化學檢測器和質譜檢測器等。紫外-可見分光檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器為選擇性檢測器，其響應值不僅與被測物質的質量有關，還與其結構有關；蒸發(fā)光散射檢測器、電霧式檢測器和示差折光檢測器為通用檢測器，對所有物質均有響應；結構相似的物質在蒸發(fā)光散射檢測器和電霧式檢測器的響應值幾乎僅與被測物質的質量有關。紫外-可見分光檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器和示差折光檢測器的響應值與被測物質的質量在一定范圍內呈線性關系；蒸發(fā)光散射檢測器的響應值與被測物質的質量通常呈指數(shù)關系，一般需經(jīng)對數(shù)轉換；電霧式檢測器的響應值與被測物質的質量通常呈非線性關系，一般需經(jīng)對數(shù)轉換或用二次函數(shù)計算，但在較小質量范圍內可基本呈線性。不同的檢測器，對流動相的要求不同。紫外-可見分光檢測器所用流動相應符合紫外-可見分光光度法（通則0401）項下對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應考慮有機溶劑的截止使用波長。蒸發(fā)光散射檢測器、電霧式檢測器和質譜檢測器不得使用含非揮發(fā)性成分的流動相。（3）流動相反相色譜的流動相常用甲醇-水系統(tǒng)或乙腈-水系統(tǒng)，用紫外末端波長檢測時，宜選用乙腈-水系統(tǒng)。流動相中如需使用緩沖溶液，應盡可能使用低濃度緩沖鹽。用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱時，流動相中有機溶劑一般應不低于5%，否則易導致柱效下降和色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。正相色譜的流動相常用兩種或兩種以上的有機溶劑，如二氯甲烷和正己烷等。流動相泵入液相色譜儀的方式（又稱洗脫方式）可分為兩種：一種是等度洗脫，另一種是梯度洗脫。用梯度洗脫分離時，梯度洗脫程序，包括運行時間和流動相在不同時間的成分比例，通常以表格的形式在品種項下規(guī)定。（4）色譜參數(shù)調整品種正文項下規(guī)定的色譜條件（參數(shù)），除填充劑種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內徑與長度、填充劑粒徑、流動相流速、流動相組分比例、柱溫、進樣量、檢測器靈敏度等，均可適當調整。若需使用小粒徑（約2μm）填充劑和小內徑（約2.1mm）色譜柱或表面多孔填充劑以提高分離度或縮短分析時間，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配。色譜參數(shù)允許調整范圍見表1。表1色譜參數(shù)允許調整范圍參數(shù)變量參數(shù)調整固定相不得改變固定相的理化性質，如填充劑材質、表面修飾及鍵合相均需保持一致填料粒徑（dp），柱長（L）改變色譜柱填充劑粒徑和柱長后，L/dp值應保持不變或在原規(guī)定值的－25%～＋50%范圍內從全多孔填料到表面多孔填料在滿足等度或梯度洗脫要求［如為等度洗脫，當理論板數(shù)（n）在原色譜柱的－25%～＋50%范圍內；如為梯度洗脫，當所有色譜峰（tR/Wh/2）2值在原色譜柱的－25%～＋50%范圍內］時可以調整，且可使用L和dp的其他組合。前提是應滿足系統(tǒng)適用性要求，且已知成分的選擇性和出峰順序不變柱內徑（dc）在填料粒徑和/或柱長沒有變化的情況下，可以調整柱內徑。為避免柱內徑減小可能引起的柱外譜帶展寬，應減小儀器連接死體積、進樣量或檢測池的體積，適當增加采集速率續(xù)表參數(shù)變量參數(shù)調整流速等度洗脫時，在柱尺寸未改變時，允許流速調整±50%。當柱內徑和粒徑改變時，按下式計算并調整流速：F2=變化作上述調整后，允許流速額外變化±50%梯度洗脫時，當柱內徑和粒徑改變時，按下式計算并調整流速：F進樣體積Vinj2尺寸沒有調整，也可調整進樣體積以滿足系統(tǒng)適用性的要求，上述體積調整公式可能不適用于表面多孔（SPP）柱替代全多孔（TPP）柱等度洗脫流動相比例占比小的流動相組分比例可在相對值±30%進行調整，但任何組分比例的變化不能超過絕對值±10%。占比小的流動相組分是指小于或等于（100/n）%比例的組分，n為流動相中含有的組分數(shù)梯度洗脫程序和流動相比例滿足以下條件的情況下，可對流動相的比例和梯度洗脫程序進行適當調整：（1）滿足系統(tǒng)適用性要求；（2）出峰順序不變，分離度和靈敏度滿足要求；（3）流動相的組成和梯度洗脫程序應使第一個峰被充分保留，最后一個峰被完全洗脫。各梯度段梯度時間的調整詳見后文柱溫等度洗脫：除另有規(guī)定外，在原規(guī)定溫度的±10℃范圍內調整梯度洗脫：除另有規(guī)定外，在原規(guī)定溫度的±5℃范圍內調整流動相緩沖液鹽濃度在原規(guī)定值±10%范圍內調整pH值除另有規(guī)定外，流動相中水相pH值在原規(guī)定值±0.2pH范圍內調整檢測波長不允許改變注：F1為調整前原規(guī)定流速；F2為調整后流速；dc1為調整前原規(guī)定色譜柱的內徑；dc2為調整后色譜柱的內徑；dp1為調整前原規(guī)定色譜柱的粒徑；dp2為調整后色譜柱的粒徑；Vinj1為調整前原規(guī)定進樣體積；Vinj2為調整后進樣體積；L1為調整前原規(guī)定色譜柱柱長；L2為調整后色譜柱柱長；tR為峰保留時間；Wh/2為峰半高峰寬?？赏ㄟ^相關軟件計算上表中流速、進樣體積和梯度洗脫程序的調整范圍，并根據(jù)色譜峰分離情況進行微調。調整后，系統(tǒng)適用性應符合要求，且色譜峰出峰順序不變。通常，較小的填充劑粒徑需增加線速度，較大的填充劑粒徑需降低線速度，在按上表調整流速時，要注意儀器的壓力限值。若減小進樣體積，應保證檢測限和峰面積的重復性；若增加進樣體積，應使分離度和線性關系仍滿足要求。對于梯度洗脫，柱尺寸（柱長和柱內徑）改變導致柱體積改變，會影響控制選擇性的梯度洗脫體積?？赏ㄟ^調整梯度洗脫體積使其與柱體積成比例。由于梯度洗脫體積是梯度時間（tG）和流速（F）的乘積，因此需要對每個梯度段的梯度時間進行調整，以保持梯度洗脫體積與柱體積的比值恒定。由原來的梯度時間（tG1）、流速、柱長和柱內徑，按下式計算新的梯度時間（tG2）。t梯度洗脫條件的調整可分步進行：（1）根據(jù)L/dp調整柱長和粒徑；（2）根據(jù)粒徑大小和柱內徑的變化調整流速；（3）根據(jù)柱長、柱內徑和流速的變化，調整每個梯度段的梯度時間。調整梯度洗脫色譜參數(shù)時應比調整等度洗脫色譜參數(shù)時更加謹慎，因為此調整可能會使某些峰位置變化，造成峰識別錯誤，或者與其他峰重疊。如梯度微調后仍不能滿足系統(tǒng)適用性要求，通常應考慮滯留體積的緣故或更換色譜柱。滯留體積（dwellvolume，用D或VD表示），也稱為梯度延遲體積，是指從流動相混合點至柱入口之間的體積。梯度洗脫時，所采用設備的配置可顯著地影響方法所述的分離度、保留時間和相對保留時間。如果發(fā)生這種情況，可歸因于過大的滯留體積。因此，應考慮方法開發(fā)時的系統(tǒng)與實際使用系統(tǒng)之間滯留體積的差異，在開始梯度程序前增加一個等度平衡階段，通過調整等度階段時間來調整梯度時間點，以與所使用的分析設備相適應。如在品種項下給出了方法開發(fā)時所用的滯留體積，則原梯度表中所述的時間點（t，min）可用按下式計算的調整后時間點（tC，min）代替：t式中D為實際使用的分析設備的滯留體積，ml；D0為方法開發(fā)時分析設備的滯留體積，ml；F為流速，ml/min。如驗證證明分析方法應用時不需等度平衡，則可省略這一等度階段。應評價色譜參數(shù)調整對分離和檢測效果的影響，必要時對調整色譜參數(shù)后的方法進行確認。多個參數(shù)的調整將對系統(tǒng)性能產(chǎn)生累積影響，需要作適當?shù)娘L險評估。對于組分或基質特別復雜的體系，如中藥分析方法，進行其色譜參數(shù)調整時應特別謹慎。若調整超出表中規(guī)定的范圍或品種項下規(guī)定的范圍，被認為是對方法的修改，需要進行充分的方法學驗證。當對調整色譜條件后的測定結果產(chǎn)生異議時，應以品種項下規(guī)定的色譜條件的測定結果為準。在品種項下一般不宜指定或推薦色譜柱的品牌，但可規(guī)定色譜柱的填充劑（固定相）種類（如鍵合相，是否改性、封端等）、粒徑、孔徑，色譜柱的柱長和/或柱內徑；當耐用性試驗證明必須使用特定牌號的色譜柱方能滿足分離要求時，可在該品種正文項下注明。（5）溶液制備為減少溶劑峰和色譜峰的畸變，制備供試品溶液和參比物質溶液可用流動相（或梯度起始比例流動相組成）作為溶劑；為提高供試品中待測成分與參比物質的保留時間和峰面積響應的一致性，制備供試品溶液和參比物質溶液的溶劑組成盡可能保持一致。如供試品和/或參比物質在流動相中的溶解性不夠，可先用流動相組成中具溶解能力的某一溶劑或其他適宜溶劑制備供試品或/和參比物質貯備液，再將貯備液用流動相（或梯度起始比例流動相組成）或其他適宜溶劑稀釋到測試的濃度。在測試序列中，應取制備溶液的溶劑和/或稀釋劑進樣以確認其是否對待測物質峰有干擾。對于含量測定，單點對照法定量用供試品溶液與對照品溶液濃度應相同或相近，確保在分析方法線性范圍內，并有足夠的精密度。對于限度檢測，如有關物質檢測，除另有規(guī)定外，供試品溶液濃度應保證能準確檢測限度最低的雜質，對照溶液或對照品溶液濃度應與所關注的限度濃度相當。2.系統(tǒng)適用性試驗色譜系統(tǒng)的適用性試驗參數(shù)通常包括但不限于理論板數(shù)、分離度或峰谷比、靈敏度、拖尾因子和重復性等。按各品種正文項下要求，對色譜系統(tǒng)進行適用性試驗，必要時，可對色譜系統(tǒng)進行適當調整，以符合要求。（1）色譜柱的理論板數(shù)（n）用于評價色譜柱的效能。由于不同物質在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數(shù)作為衡量色譜柱效能的指標時，應指明測定物質，一般為待測物質或內標物質的理論板數(shù)。在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分色譜峰或內標物質色譜峰的保留時間tR和峰寬（W）或半高峰寬（Wh/2），按n=16（tR/W）2或n=5.54（tR/Wh/2）2計算色譜柱的理論板數(shù)。tR、W、Wh/2可用時間或長度計（下同），但應取相同計量單位。（2）分離度（RS）用于評價待測物質與被分離物質之間的分離程度，是衡量色譜系統(tǒng)分離效能的關鍵指標?？梢酝ㄟ^測定待測物質與已知雜質的分離度，也可以通過測定待測物質與某一指標性成分（內標物質或其他難分離物質）的分離度，或將供試品或對照品用適當?shù)姆椒ń到?，通過測定待測物質與某一降解產(chǎn)物的分離度，對色譜系統(tǒng)分離效能進行評價與調整。無論是定性分析還是定量測定，均要求待測物質與內標物質或特定的雜質及其他雜質色譜峰之間有較好的分離度。除另有規(guī)定外，待測物質色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應不小于1.5。分離度的計算公式為：RS=1.18×式中tR2為相鄰兩色譜峰中后一峰的保留時間；tR1為相鄰兩色譜峰中前一峰的保留時間；W1、W2及Wh/2，1、Wh/2，2分別為此相鄰兩色譜峰的峰寬及半高峰寬，見圖1。圖1峰寬與半高峰寬計算示意圖當對測定結果有異議時，色譜柱的理論板數(shù)（n）和分離度（RS）應以半高峰寬（Wh/2）的計算結果為準。（3）峰谷比若待測物質峰與相鄰峰之間未達到基線分離，峰谷比（p/v）可作為系統(tǒng)適用性試驗參數(shù)。圖2為部分分離的兩個色譜峰的示意圖，峰谷比計算公式為：p式中Hp為小峰平行外推基線的高度；Hv為小峰和大峰間曲線最低點平行外推基線的高度。圖2峰谷比值計算示意圖根據(jù)對相鄰峰互相干擾程度的評價和測量準確度的要求，確定峰谷比可接受值，并在品種項下規(guī)定。（4）靈敏度信噪比（S/N）用于定義系統(tǒng)的靈敏度，按下式計算：S/N在使用規(guī)定的參比溶液獲得的色譜圖中，H為從目標峰最大值到基線信號的峰高，基線外延距離至少為目標峰半高峰寬的5倍，見圖3中a所示色譜圖；h為使用空白溶液在參比溶液目標峰至少5倍半高峰寬范圍內觀察到的噪聲幅度，見圖3中b所示色譜圖，如可能，這一范圍應平均分布在目標峰的兩側。圖3信噪比計算示意圖通常，定量限的信噪比應不小于10，檢測限的信噪比應不小于3。系統(tǒng)適用性試驗中可以設置靈敏度試驗溶液來評價色譜系統(tǒng)檢測低含量成分的能力。（5）拖尾因子（T）用于評價色譜峰的對稱性。拖尾因子計算公式為：T式中W0.05h為5%峰高處的峰寬；d1為峰頂在5%峰高處橫坐標平行線的投影點至峰前沿與此平行線交點的距離，見圖4。圖4拖尾因子計算示意圖除另有規(guī)定外，在檢查和含量測定項下，以峰面積作定量參數(shù)時，T值應在0.8～1.8之間；以峰高作定量參數(shù)時，T值應在0.95～1.05之間。以峰面積作定量參數(shù)時，一般的峰拖尾或前伸不會影響峰面積積分，但嚴重拖尾會影響基線和色譜峰起止的判斷和峰面積積分的準確性，此時應在品種正文項下對拖尾因子予以規(guī)定。（6）重復性用于評價色譜系統(tǒng)連續(xù)進樣時響應值的重復性能。除另有規(guī)定外，通常取各品種項下的對照品溶液或其他溶液，重復進樣5次，其峰響應測量值（或內標比值或其校正因子）的相對標準偏差應不大于2.0%，如品種項下規(guī)定相對標準偏差大于2.0%，則以重復進樣6次的數(shù)據(jù)計算。以滿足檢測所需的精密度要求為前提，視進樣溶液的濃度和/或體積、色譜峰響應和分析方法所能達到的精度水平等，對相對標準偏差的要求可適當放寬或收緊，并在品種項下予以規(guī)定。（7）其他參數(shù)保留時間和相對保留時間常用于評價系統(tǒng)適用性，如在品種項下列出但未明確為系統(tǒng)適用性要求，則僅作為一種參考。實驗得到的相對保留時間與品種項下規(guī)定值間的差異應為多少，尚無適用的可接受標準。對于復雜體系，如適用，可在品種項下附對照圖譜，通過供試品圖譜與對照圖譜的比對來評價系統(tǒng)適用性。系統(tǒng)適用性試驗參數(shù)及其可接受標準，應根據(jù)方法開發(fā)、驗證研究，特別是耐用性試驗結果予以確定，并在品種項下進行合理描述。如品種項下描述的系統(tǒng)適用性試驗及其可接受標準與本通則的描述不同，則以品種項下描述為準。除另有規(guī)定外，用于定量分析時，峰響應重復性試驗應滿足本通則的要求。在整個分析過程中，色譜系統(tǒng)應滿足所規(guī)定的系統(tǒng)適用性要求，否則實驗結果將不被接受。3.測定法3.1定性分析常用的定性分析方法主要有但不限于以下方法。（1）利用保留時間定性保留時間（retentiontime，tR）定義為被分離組分從進樣到柱后出現(xiàn)該組分最大響應值時的時間，也即從進樣到出現(xiàn)某組分色譜峰的頂點為止所經(jīng)歷的時間，常以分鐘（min）為時間單位，用于反映被分離的組分在性質上的差異。通常以在相同的色譜條件下待測成分的保留時間與對照品的保留時間是否一致作為待測成分鑒別的依據(jù)。在相同的色譜條件下，待測成分的保留時間與對照品的保留時間應無顯著性差異；兩個保留時間不同的色譜峰歸屬于不同化合物，但兩個保留時間一致的色譜峰有時未必可歸屬為同一化合物，在作未知物定性分析時應特別注意。若改變流動相組成或更換色譜柱的種類，待測成分的保留時間仍與對照品的保留時間一致，可進一步證實待測成分與對照品為同一化合物。當待測成分（保留時間tR，1）無對照品時，可將樣品中的另一成分或在樣品中加入另一成分作為參比物（保留時間tR，2），采用相對保留時間（RRT）作為定性（或定位）的方法。在品種項下，除另有規(guī)定外，相對保留時間通常是指待測成分保留時間相對于主成分保留時間的比值，以未扣除死時間的非調整保留時間按下式計算。RTT若需以扣除死時間的調整保留時間計算，應在品種項下予以注明。（2）利用光譜相似度定性化合物的全波長掃描所得的紫外-可見吸收光譜能夠提供一些有價值的定性信息。待測成分的光譜與對照品的光譜相似程度可用于輔助定性分析。二極管陣列檢測器開啟一定波長范圍的掃描功能時，可以獲得更多的信息，包括色譜信號、時間、波長的三維色譜光譜圖，既可用于輔助鑒別，還可用于峰純度分析。同樣應注意，兩個光譜不同的色譜峰表征了不同化合物，但兩個光譜相似的色譜峰未必可歸屬為同一化合物。（3）利用質譜檢測器提供的質譜信息定性利用質譜檢測器提供的與色譜峰對應化合物的分子質量和結構的信息進行鑒別，相比于僅利用保留時間或保留時間結合光譜相似性進行鑒別，可獲得更多的、更可靠的信息，不僅可用于已知物的鑒別，還可提供未知化合物的結構信息（通則0431）。3.2定量分析（1）內標法按品種正文項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和內標物質，分別配制成溶液，精密量取各適量，混合配制成校正因子測定用的對照品溶液；精密量取適量，進樣，記錄色譜圖。測量對照品和內標物質的峰響應（峰面積或峰高），按下式計算校正因子：校正因子式中AS為內標物質的峰響應；AR為對照品的峰響應；cS為內標物質的濃度；cR為對照品的濃度。再精密量取該品種項下含有內標物質的供試品溶液適量，進樣，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內標物質的峰響應，按下式計算含量：含量式中AX為供試品的峰響應；cX為供試品的濃度；A'S為內標物質的峰響應；c’S為內標物質的濃度；f為內標法校正因子。采用內標法，可避免因樣品前處理和進樣體積誤差對測定結果的影響。（2）外標法按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，精密量取各適量，進樣，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測物質的峰響應（峰面積或峰高），按下式計算含量：含量式中各符號意義同上。（3）加校正因子的對照法測定雜質含量時，可采用加校正因子的對照法，其中取供試品溶液稀釋作為對照溶液并加校正因子的方法通常被稱為加校正因子的主成分自身對照法。這里定義的校正因子是指單位質量參比物質（包括內標）的色譜響應與單位質量待測物的色譜響應的比值，即用參比物質的色譜響應校正待測物質的色譜響應。需作校正計算的雜質，通常以主成分為參比，也可以供試品中存在的已知雜質或加入的另一成分為參比。在建立方法時，按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取待測物對照品和參比物質對照品各適量，配制待測雜質校正因子的溶液，進樣，記錄色譜圖，按下式計算待測雜質的校正因子。校正因子=式中cA為待測物的濃度；AA為待測物的色譜峰響應；cB為參比物質的濃度；AB為參比物質的色譜峰響應。也可精密稱（量）取參比物質對照品和雜質對照品各適量，分別配制成不同濃度的溶液，精密量取各適量，進樣，記錄色譜圖，繪制參比物質濃度和雜質濃度對其峰面積的回歸曲線，以參比物質回歸直線斜率與雜質回歸直線斜率的比計算校正因子。校正因子可直接載入各品種項下，用于校正雜質的實測峰面積，采用相對于參比物質的保留時間定位，其數(shù)值一并載入各品種項下。以主成分作為參比物質測定雜質含量時，按各品種項下規(guī)定的雜質限度，將供試品溶液稀釋成與雜質限度相當?shù)娜芤?，作為對照溶液（或取主成分對照品配制成與雜質限度相當?shù)娜芤海鳛閷φ掌啡芤海?，精密量取適量，進樣，記錄色譜圖。除另有規(guī)定外，通常含量低于0.5%的雜質，峰面積測量值的相對標準偏差（RSD）應小于10%；含量在0.5%～2%的雜質，峰面積測量值的RSD應小于5%；含量大于2%的雜質，峰面積測量值的RSD應小于2%。再精密量取供試品溶液適量，進樣。除另有規(guī)定外，供試品溶液的色譜圖記錄時間，應為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積，分別乘以相應的校正因子后與對照（或對照品）溶液主成分的峰面積比較，計算各雜質含量。加校正因子的對照法不僅可用于雜質測定，也用于多組分中某些組分的含量測定。（4）不加校正因子的對照法測定雜質含量時，若無法獲得待測雜質的校正因子，或校正因子對賦值準確性的影響可以忽略，也可采用不加校正因子的對照法，其中取供試品溶液稀釋作為對照溶液但不加校正因子的方法通常被稱為不加校正因子的主成分自身對照法。同上述（3）法選擇參比物質，配制對照（或對照品）溶液、進樣和計算峰面積的相對標準偏差后，再精密量取供試品溶液適量，進樣。除另有規(guī)定外，供試品溶液的色譜圖記錄時間應為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積并與對照（或對照品）溶液主成分的峰面積比較，依法計算雜質含量。（5）面積歸一化法按各品種項下的規(guī)定，配制供試品溶液，取一定量進樣，記錄色譜圖。測量各色譜峰面積和色譜圖上除溶劑峰、試劑峰、樣品基質帶入峰以外的總色譜峰面積，計算各色譜峰面積占總峰面積的百分率。峰面積歸一化法一般不宜用于微量雜質的檢查。（6）校正曲線法對于復雜藥物體系中的成分和/或待測成分量在較大范圍變化的含量測定，可采用校正曲線法。校正曲線法可分為外標法和內標法。①外標校正曲線法：精密稱取對照品（或工作對照品）適量，或精密量取對照品儲備液適量，配制成不同濃度的系列溶液，精密量取系列溶液各適量，進樣，記錄色譜圖，測量峰響應，用峰響應（或經(jīng)轉換）對濃度繪制校正曲線，通過最小二乘法計算出回歸曲線方程。在相同的色譜條件下，再精密量取供試品溶液適量，進樣，記錄色譜圖，測量供試品溶液中待測成分的峰響應，由待測成分的峰響應（或經(jīng)轉換）和回歸曲線方程確定供試品溶液中待測成分的量。②內