天府肉鴨α干擾素原核表達(dá)及抗病毒活性的深度解析與應(yīng)用探索一、引言1.1研究背景干擾素（Interferon，IFN）是一類由脊椎動(dòng)物細(xì)胞在病毒或其他干擾素誘生劑刺激下產(chǎn)生的具有廣泛生物學(xué)活性的糖蛋白。自1957年Isaacs和Lindenmann在研究流感病毒干擾現(xiàn)象時(shí)首次發(fā)現(xiàn)干擾素以來，其在抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等方面的重要作用逐漸被揭示。干擾素根據(jù)其結(jié)構(gòu)和受體特異性可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中干擾素α屬于Ⅰ型干擾素，是最早被發(fā)現(xiàn)且研究最為廣泛的一類干擾素分子。干擾素α具有廣譜的抗病毒活性，它可以通過與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)多種抗病毒蛋白的表達(dá)，從而抑制病毒的復(fù)制和傳播。同時(shí)，干擾素α還能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，增強(qiáng)免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和T淋巴細(xì)胞的活性，促進(jìn)抗原呈遞和抗體產(chǎn)生，在機(jī)體的抗病毒免疫防御中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在臨床上，干擾素α已被廣泛應(yīng)用于多種病毒感染性疾病和腫瘤的治療，如乙型肝炎、丙型肝炎、毛細(xì)胞白血病、黑色素瘤等，取得了顯著的治療效果。近年來，隨著人們生活水平的提高和消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變，對(duì)鴨肉、鴨蛋等鴨產(chǎn)品的需求不斷增加，推動(dòng)了肉鴨養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展。中國(guó)作為世界上最大的肉鴨養(yǎng)殖國(guó)，肉鴨年出欄量已超過40億只，肉鴨產(chǎn)業(yè)在我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占據(jù)著重要地位。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和養(yǎng)殖密度的增加，肉鴨養(yǎng)殖過程中面臨著越來越嚴(yán)重的疫病威脅。病毒感染是導(dǎo)致肉鴨發(fā)病和死亡的重要原因之一，常見的肉鴨病毒性疾病包括禽流感、鴨瘟、鴨病毒性肝炎、鴨圓環(huán)病毒病、鴨黃病毒病等。這些病毒感染不僅會(huì)導(dǎo)致肉鴨生長(zhǎng)發(fā)育受阻、生產(chǎn)性能下降，還會(huì)引起較高的死亡率，給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。例如，鴨病毒性肝炎對(duì)雛鴨的致死率高達(dá)90%以上，禽流感一旦發(fā)生，可能給整個(gè)鴨群帶來毀滅性打擊。此外，病毒感染還可能導(dǎo)致鴨產(chǎn)品質(zhì)量下降，影響消費(fèi)者的健康和市場(chǎng)信心，對(duì)肉鴨養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重挑戰(zhàn)。目前，對(duì)于肉鴨病毒感染的防控主要依賴于疫苗接種和藥物治療。然而，傳統(tǒng)的疫苗存在著免疫效果不穩(wěn)定、免疫保護(hù)期短、對(duì)新出現(xiàn)的病毒變異株效果不佳等問題。同時(shí)，長(zhǎng)期使用抗生素等藥物進(jìn)行治療，不僅容易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，還會(huì)造成藥物殘留，對(duì)食品安全和環(huán)境安全帶來潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，尋找一種高效、安全、綠色的抗病毒方法，對(duì)于肉鴨養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。干擾素作為一種天然的抗病毒物質(zhì)，具有廣譜、高效、低毒等優(yōu)點(diǎn)，為肉鴨病毒感染的防控提供了新的思路和方法。研究表明，鴨干擾素α對(duì)多種鴨源病毒具有明顯的抑制作用，能夠有效地提高鴨的抗病毒能力。然而，目前關(guān)于鴨干擾素α的研究主要集中在基因克隆、表達(dá)和抗病毒活性的初步測(cè)定等方面，對(duì)于天府肉鴨α干擾素的原核表達(dá)及抗病毒活性的深入研究還相對(duì)較少。天府肉鴨是我國(guó)自主培育的優(yōu)良肉鴨品種，具有生長(zhǎng)速度快、飼料轉(zhuǎn)化率高、肉質(zhì)鮮美等特點(diǎn)，在我國(guó)肉鴨養(yǎng)殖中廣泛推廣應(yīng)用。開展天府肉鴨α干擾素的原核表達(dá)及抗病毒活性研究，對(duì)于揭示天府肉鴨的抗病毒免疫機(jī)制，開發(fā)新型的抗病毒制劑，提高天府肉鴨的抗病能力和養(yǎng)殖效益，具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1干擾素概述干擾素最早由Isaacs和Lindenmann在1957年發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)他們觀察到流感病毒感染的雞胚絨毛尿囊膜細(xì)胞能產(chǎn)生一種可抑制病毒繁殖的物質(zhì)，將其命名為干擾素。此后，干擾素的研究不斷深入，其分類也逐漸明晰。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和受體特異性，干擾素主要分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型干擾素包括IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω等多個(gè)亞型，其中IFN-α是最早被發(fā)現(xiàn)且研究最為廣泛的亞型之一。Ⅱ型干擾素主要是IFN-γ，由活化的T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生，具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能。Ⅲ型干擾素包括IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3和IFN-λ4，其生物學(xué)功能與Ⅰ型干擾素類似，但受體表達(dá)具有組織特異性。干擾素的抗病毒機(jī)制十分復(fù)雜，主要通過與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的JAK-STAT信號(hào)通路，誘導(dǎo)一系列干擾素刺激基因（ISGs）的表達(dá)。這些ISGs編碼產(chǎn)生多種抗病毒蛋白，如蛋白激酶R（PKR）、2',5'-寡腺苷酸合成酶（2-5OAS）、Mx蛋白等。PKR可磷酸化真核起始因子2α（eIF2α），抑制病毒蛋白質(zhì)的合成；2-5OAS能夠激活核糖核酸酶L（RNaseL），降解病毒RNA；Mx蛋白則通過與病毒核衣殼蛋白結(jié)合，抑制病毒的組裝和釋放。此外，干擾素還能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性，增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒免疫反應(yīng)。例如，IFN-γ可激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷病毒感染細(xì)胞的能力；IFN-α和IFN-β能促進(jìn)NK細(xì)胞的活化，使其對(duì)病毒感染細(xì)胞的殺傷活性增強(qiáng)。1.2.2動(dòng)物干擾素的研究進(jìn)展動(dòng)物干擾素的研究始于20世紀(jì)70年代，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，多種動(dòng)物干擾素基因相繼被克隆和表達(dá)。在家禽方面，雞干擾素α的研究較為深入。1994年，雞IFN-α基因被首次克隆成功。此后，研究人員對(duì)雞IFN-α的原核表達(dá)、真核表達(dá)及其抗病毒活性進(jìn)行了大量研究。例如，有研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了雞IFN-α蛋白，并證明其對(duì)雞新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒等具有顯著的抑制作用。在鴨干擾素α的研究方面，2002年，國(guó)外學(xué)者首次克隆了鴨IFN-α基因。國(guó)內(nèi)學(xué)者也隨后開展了相關(guān)研究，王瓊等（2010）成功克隆了家鴨IFN-α基因，并對(duì)其進(jìn)行了初步表達(dá)研究。在哺乳動(dòng)物方面，豬干擾素α、牛干擾素α、羊干擾素α等也都有相關(guān)研究報(bào)道。豬干擾素α在抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒等方面具有重要作用。牛干擾素α可用于治療奶牛的乳房炎、子宮內(nèi)膜炎等疾病。羊干擾素α對(duì)羊痘病毒、口蹄疫病毒等具有一定的抑制作用。此外，犬干擾素α、貓干擾素α等寵物干擾素的研究也逐漸受到關(guān)注。犬干擾素α可用于治療犬瘟熱、犬細(xì)小病毒病等疾病。1.2.3鴨干擾素α的原核表達(dá)研究原核表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單、成本低、表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，是目前生產(chǎn)重組蛋白的常用方法之一。在鴨干擾素α的原核表達(dá)研究中，通常選用大腸桿菌作為表達(dá)宿主。龔永強(qiáng)（2011）根據(jù)課題組克隆、構(gòu)建的PBV220-IFN（ORF）序列，利用primer5.0設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出鴨α-干擾素成熟蛋白基因并克隆到PMD18-T載體，測(cè)序鑒定后將其連接到原核表達(dá)載體pET32a+，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得高效表達(dá)。表達(dá)的重組蛋白分子量大小約37KDa，以包涵體形式存在，占菌體總蛋白的30%。重組蛋白經(jīng)鎳金屬螯合介質(zhì)填料（Ni-MIAC）后得到純化。利用稀釋復(fù)性和柱上復(fù)性兩種方法對(duì)包涵體進(jìn)行復(fù)性，以在DEF上抗VSV的生物學(xué)活性效價(jià)檢測(cè)其效價(jià)。稀釋復(fù)性中，通過添加L-Arg使鴨α-干擾素成熟蛋白得到初步復(fù)性，表現(xiàn)出800U/mg的抗VSV活性，對(duì)柱上復(fù)性的鴨α-干擾素成熟蛋白，得到比活力為12800U/mg的DuIFN-α成熟蛋白。然而，原核表達(dá)過程中也存在一些問題，如重組蛋白易形成包涵體，復(fù)性過程復(fù)雜，且復(fù)性后的蛋白活性可能受到影響。此外，不同的表達(dá)載體和宿主菌對(duì)鴨干擾素α的表達(dá)量和活性也有較大影響。因此，優(yōu)化原核表達(dá)條件，提高重組鴨干擾素α的表達(dá)量和活性，是目前研究的重點(diǎn)之一。1.2.4鴨干擾素α的抗病毒活性研究鴨干擾素α具有廣譜的抗病毒活性，對(duì)多種鴨源病毒都有抑制作用。在鴨瘟病毒（DPV）感染方面，龔永強(qiáng)等（2011）利用定量PCR的方法對(duì)受30U（15U/ml）DuIFN-α成熟蛋白保護(hù)的鴨胚層纖維細(xì)胞（DEF）中的DPV強(qiáng)毒進(jìn)行抗病毒活性檢測(cè)。結(jié)果顯示，在DPV感染后15h內(nèi)，重組鴨α-IFN抗DPV組的病毒核酸拷貝數(shù)與不加鴨α-IFN的陽(yáng)性對(duì)照組之間差異不顯著（P>0.05）；從23h開始鴨α-IFN保護(hù)組的核酸拷貝數(shù)低于陽(yáng)性對(duì)照組并在感染后47h-55h其拷貝數(shù)差異達(dá)到最大，差異顯著（P<0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組的DPV拷貝數(shù)相比，鴨α-IFN保護(hù)組在55h時(shí)能減少病毒108.83個(gè)核酸拷貝數(shù)，相對(duì)抑制率為80%。表明重組鴨α-IFN能明顯抑制對(duì)數(shù)期的DPV復(fù)制，具有進(jìn)一步臨床應(yīng)用的潛力。在鴨病毒性肝炎病毒（DHAV）感染方面，有研究表明鴨干擾素α能夠抑制DHAV在鴨胚肝細(xì)胞中的復(fù)制，提高細(xì)胞的存活率。在禽流感病毒（AIV）感染方面，鴨干擾素α也能對(duì)其產(chǎn)生一定的抑制作用，降低病毒的滴度。然而，目前對(duì)于鴨干擾素α抗病毒活性的作用機(jī)制研究還不夠深入，其在體內(nèi)的抗病毒效果和安全性評(píng)價(jià)也有待進(jìn)一步加強(qiáng)。1.2.5研究現(xiàn)狀分析綜上所述，國(guó)內(nèi)外在干擾素的研究方面已經(jīng)取得了豐碩的成果，尤其是在動(dòng)物干擾素的基因克隆、表達(dá)和抗病毒活性研究等方面。對(duì)于鴨干擾素α，雖然在原核表達(dá)和抗病毒活性研究上已經(jīng)有了一定的進(jìn)展，但仍存在一些不足之處。在原核表達(dá)方面，如何提高重組鴨干擾素α的表達(dá)量和活性，簡(jiǎn)化復(fù)性過程，降低生產(chǎn)成本，是亟待解決的問題。在抗病毒活性研究方面，對(duì)于鴨干擾素α的作用機(jī)制研究還不夠深入，缺乏系統(tǒng)性的研究。此外，目前對(duì)于天府肉鴨α干擾素的研究還相對(duì)較少，針對(duì)天府肉鴨這一特定品種的干擾素原核表達(dá)及抗病毒活性研究還存在空白。開展天府肉鴨α干擾素的原核表達(dá)及抗病毒活性研究，對(duì)于豐富鴨干擾素的研究?jī)?nèi)容，推動(dòng)肉鴨養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。1.3研究目的與意義本研究旨在構(gòu)建天府肉鴨α干擾素的原核表達(dá)系統(tǒng)，通過優(yōu)化表達(dá)條件，高效表達(dá)并純化重組天府肉鴨α干擾素，深入研究其抗病毒活性，為開發(fā)新型的肉鴨抗病毒制劑提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。具體研究目的如下：克隆天府肉鴨α干擾素基因：提取天府肉鴨外周血淋巴細(xì)胞總RNA，通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增α干擾素基因，克隆至原核表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，為后續(xù)的原核表達(dá)奠定基礎(chǔ)。優(yōu)化原核表達(dá)條件：將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株，通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件，如誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等，提高重組天府肉鴨α干擾素的表達(dá)量，并探索其最佳表達(dá)形式，減少包涵體的形成，提高蛋白的可溶性表達(dá)。純化重組天府肉鴨α干擾素：采用合適的蛋白質(zhì)純化方法，如親和層析、離子交換層析等，對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化，獲得高純度的重組天府肉鴨α干擾素，為其抗病毒活性研究和應(yīng)用提供物質(zhì)基礎(chǔ)。研究重組天府肉鴨α干擾素的抗病毒活性：選取常見的鴨源病毒，如鴨瘟病毒、鴨病毒性肝炎病毒、禽流感病毒等，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究重組天府肉鴨α干擾素對(duì)這些病毒的抑制作用，明確其抗病毒活性和作用機(jī)制。本研究的意義主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：理論意義：天府肉鴨作為我國(guó)自主培育的優(yōu)良肉鴨品種，對(duì)其α干擾素的研究有助于深入了解天府肉鴨的抗病毒免疫機(jī)制，豐富禽類干擾素的理論研究?jī)?nèi)容。通過對(duì)天府肉鴨α干擾素基因的克隆、表達(dá)及抗病毒活性的研究，可以揭示其在抗病毒免疫中的作用規(guī)律，為進(jìn)一步研究禽類抗病毒免疫提供新的思路和方法。實(shí)踐意義：目前肉鴨養(yǎng)殖中面臨著嚴(yán)重的病毒感染問題，傳統(tǒng)的防控方法存在諸多局限性。本研究制備的重組天府肉鴨α干擾素具有高效、安全、綠色等優(yōu)點(diǎn)，有望開發(fā)成為新型的肉鴨抗病毒制劑，用于肉鴨病毒感染性疾病的預(yù)防和治療，提高肉鴨的抗病能力和養(yǎng)殖效益，促進(jìn)肉鴨養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。此外，本研究的成果還可以為其他動(dòng)物干擾素的研究和應(yīng)用提供參考，推動(dòng)動(dòng)物疫病防控技術(shù)的進(jìn)步。二、天府肉鴨α干擾素基因的克隆與分析2.1實(shí)驗(yàn)材料與方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取健康的1月齡天府肉鴨10只，購(gòu)自四川某肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)前，將肉鴨在隔離飼養(yǎng)環(huán)境中適應(yīng)1周，確保其健康狀況良好。主要試劑：Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞總RNA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser）和PCR擴(kuò)增試劑盒（TaKaRaExTaq）均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，分別用于逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA和進(jìn)行PCR擴(kuò)增；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ及T4DNA連接酶購(gòu)自NEB公司，用于酶切和連接DNA片段；DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，用于回收和提取DNA；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，用于重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和蛋白表達(dá)；其他常規(guī)試劑如氯仿、異丙醇、乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器：高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf5424R），用于細(xì)胞和菌體的離心分離；PCR儀（Bio-RadT100），用于基因擴(kuò)增；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadGelDocXR+），用于觀察和分析DNA凝膠電泳結(jié)果；恒溫?fù)u床（上海智城ZWYR-2102C），用于細(xì)菌培養(yǎng)；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化SW-CJ-2FD），用于無菌操作；核酸蛋白分析儀（ThermoScientificNanoDrop2000），用于檢測(cè)核酸濃度和純度。引物設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)GenBank中已公布的鴨α干擾素基因序列（登錄號(hào)：[具體登錄號(hào)]），利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物：5'-CCGGAATTCATGAGCGAGACAGAGAAG-3'，下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物：5'-CCGCTCGAGTCAGCAGCTGGTCTGCTG-3'，下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成?？俁NA的提?。簾o菌采集天府肉鴨的外周血2mL，置于含有肝素鈉的抗凝管中，輕輕搖勻。采用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血淋巴細(xì)胞，將分離得到的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入1mLTrizol試劑，充分混勻，室溫靜置5min。加入200μL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃，12000rpm離心15min，吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10min。4℃，12000rpm離心10min，棄上清，沉淀用75%乙醇洗滌2次，每次4℃，7500rpm離心5min。棄上清，室溫晾干沉淀，加入適量的DEPC水溶解RNA。使用核酸蛋白分析儀測(cè)定RNA的濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。cDNA的合成：按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作。取1μg總RNA，加入5×PrimeScriptBuffer2μL，PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ1μL，Random6mers1μL，OligodTPrimer1μL，RNaseFreedH?O補(bǔ)足至10μL。輕柔混勻后，37℃孵育15min，85℃加熱5s終止反應(yīng)，得到的cDNA產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增：以合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25μL）：2×TaKaRaExTaqBuffer12.5μL，dNTPMixture（各2.5mM）2μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，cDNA模板1μL，TaKaRaExTaq酶（5U/μL）0.25μL，ddH?O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察擴(kuò)增條帶。目的基因的克隆與測(cè)序：將PCR擴(kuò)增得到的目的基因片段用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。將回收的目的基因片段與pMD18-T載體在16℃連接過夜，連接體系（10μL）：pMD18-TVector1μL，回收的目的基因片段4μL，SolutionⅠ5μL。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含有氨芐青霉素（Amp，100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。挑取單菌落接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。使用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，用EcoRⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切體系（20μL）：重組質(zhì)粒2μL，10×Buffer2μL，EcoRⅠ1μL，XhoⅠ1μL，ddH?O14μL。37℃酶切2h后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中已公布的鴨α干擾素基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。2.2基因序列測(cè)定與分析結(jié)果通過PCR擴(kuò)增和測(cè)序，成功獲得了天府肉鴨α干擾素基因序列。測(cè)序結(jié)果顯示，該基因全長(zhǎng)為[X]bp，包含一個(gè)完整的開放閱讀框（ORF），編碼[X]個(gè)氨基酸?；蛐蛄械卿浱?hào)為[具體登錄號(hào)]。圖1展示了克隆得到的天府肉鴨α干擾素基因序列。[此處插入天府肉鴨α干擾素基因序列]圖1天府肉鴨α干擾素基因序列對(duì)天府肉鴨α干擾素基因的核苷酸組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其堿基組成具有一定的特點(diǎn)。其中，腺嘌呤（A）占[X]%，胸腺嘧啶（T）占[X]%，鳥嘌呤（G）占[X]%，胞嘧啶（C）占[X]%。GC含量為[X]%，與已報(bào)道的其他鴨品種α干擾素基因的GC含量相近。這種特定的堿基組成可能與基因的穩(wěn)定性、表達(dá)調(diào)控以及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)。將天府肉鴨α干擾素基因序列與GenBank中已公布的其他物種α干擾素基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，結(jié)果表明，天府肉鴨α干擾素基因與家鴨α干擾素基因的同源性最高，達(dá)到[X]%，這與它們同屬鴨科動(dòng)物的分類地位相符。與雞α干擾素基因的同源性為[X]%，與鵝α干擾素基因的同源性為[X]%，表明它們?cè)谶M(jìn)化過程中具有一定的親緣關(guān)系，但也存在一定的差異。而與哺乳動(dòng)物如豬、牛、羊等的α干擾素基因同源性較低，僅為[X]%-[X]%，進(jìn)一步說明了不同物種間α干擾素基因的特異性。圖2為天府肉鴨α干擾素基因與其他部分物種α干擾素基因的同源性比對(duì)結(jié)果。[此處插入基因同源性比對(duì)圖，圖中展示天府肉鴨與家鴨、雞、鵝、豬、牛、羊等物種α干擾素基因的比對(duì)情況，用不同顏色或線條區(qū)分不同物種序列，標(biāo)注同源性百分比]圖2天府肉鴨α干擾素基因與其他部分物種α干擾素基因的同源性比對(duì)利用生物信息學(xué)軟件對(duì)天府肉鴨α干擾素基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。結(jié)果顯示，該蛋白的理論分子量為[X]kDa，等電點(diǎn)（pI）為[X]。在蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中，發(fā)現(xiàn)其包含α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲等結(jié)構(gòu)元件，其中α-螺旋約占[X]%，β-折疊約占[X]%，無規(guī)卷曲約占[X]%。這些二級(jí)結(jié)構(gòu)元件的合理組合對(duì)于維持蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象和生物學(xué)活性具有重要作用。在蛋白質(zhì)的功能預(yù)測(cè)方面，發(fā)現(xiàn)天府肉鴨α干擾素蛋白具有多個(gè)潛在的功能位點(diǎn)，如信號(hào)肽切割位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)等。其中，信號(hào)肽切割位點(diǎn)位于第[X]-[X]位氨基酸之間，提示該蛋白在合成后可能通過信號(hào)肽引導(dǎo)分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用。預(yù)測(cè)存在[X]個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，分別位于第[具體氨基酸位置1]、[具體氨基酸位置2]等位置，糖基化修飾可能影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、活性和免疫原性。此外，還預(yù)測(cè)到多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包括絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)，這些磷酸化修飾可能參與蛋白質(zhì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和功能調(diào)節(jié)過程。通過對(duì)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的同源建模分析，進(jìn)一步了解了其空間結(jié)構(gòu)特征，為深入研究其功能機(jī)制提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。圖3展示了天府肉鴨α干擾素蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果，圖4為其三維結(jié)構(gòu)同源建模圖。[此處插入天府肉鴨α干擾素蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖，以示意圖形式展示α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲的分布情況]圖3天府肉鴨α干擾素蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果[此處插入天府肉鴨α干擾素蛋白三維結(jié)構(gòu)同源建模圖，以立體圖形展示蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象]圖4天府肉鴨α干擾素蛋白三維結(jié)構(gòu)同源建模圖三、原核表達(dá)載體的構(gòu)建與優(yōu)化3.1表達(dá)載體的選擇與構(gòu)建原核表達(dá)載體的選擇是實(shí)現(xiàn)目的基因高效表達(dá)的關(guān)鍵因素之一。在本研究中，我們選用了pET-28a(+)作為原核表達(dá)載體，該載體具有諸多優(yōu)點(diǎn)，使其成為表達(dá)天府肉鴨α干擾素的理想選擇。pET-28a(+)載體含有強(qiáng)T7噬菌體啟動(dòng)子，T7噬菌體啟動(dòng)子具備高度特異性，受控于T7RNA聚合酶，而T7RNA聚合酶的活性遠(yuǎn)超過大腸桿菌聚合酶，這使得與之相連的目的基因能夠?qū)崿F(xiàn)高效轉(zhuǎn)錄，為高表達(dá)量奠定了基礎(chǔ)。載體上帶有卡那霉素抗性基因，在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中，只有成功導(dǎo)入該載體的宿主菌才能存活，便于后續(xù)的篩選工作。同時(shí)，pET-28a(+)載體還設(shè)計(jì)有多個(gè)獨(dú)特的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，如EcoRⅠ、XhoⅠ等，方便目的基因的插入，并且其多克隆位點(diǎn)上存在His標(biāo)簽，目的蛋白表達(dá)后會(huì)與His標(biāo)簽共同表達(dá)為融合蛋白，有利于后續(xù)利用鎳柱進(jìn)行親和層析，實(shí)現(xiàn)蛋白的分離純化及檢測(cè)。構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒的過程如下：首先，將前面克隆得到的天府肉鴨α干擾素基因片段與pET-28a(+)載體分別用EcoRⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切。酶切體系（50μL）：目的基因片段或pET-28a(+)載體10μL，10×Buffer5μL，EcoRⅠ2μL，XhoⅠ2μL，ddH?O補(bǔ)足至50μL。37℃水浴酶切3h，使基因片段和載體在特定的酶切位點(diǎn)處被精準(zhǔn)切斷，形成具有互補(bǔ)粘性末端的DNA片段。酶切完成后，使用DNA凝膠回收試劑盒分別回收酶切后的天府肉鴨α干擾素基因片段和pET-28a(+)載體片段，以去除雜質(zhì)和未酶切的DNA。接著進(jìn)行連接反應(yīng)，將回收的目的基因片段與線性化的pET-28a(+)載體按照摩爾比約為3:1的比例混合，加入T4DNA連接酶進(jìn)行連接。連接體系（20μL）：回收的目的基因片段10μL，線性化的pET-28a(+)載體3μL，10×T4DNALigaseBuffer2μL，T4DNALigase1μL，ddH?O補(bǔ)足至20μL。16℃連接過夜，T4DNA連接酶能夠催化目的基因片段與載體的粘性末端之間形成磷酸二酯鍵，從而將兩者連接起來，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-IFNα。為了鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒是否構(gòu)建成功，采用了多種方法。首先進(jìn)行PCR鑒定，以重組質(zhì)粒為模板，使用擴(kuò)增天府肉鴨α干擾素基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25μL）：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，重組質(zhì)粒模板1μL，ddH?O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，若在預(yù)期大小位置出現(xiàn)特異性條帶，初步表明重組質(zhì)粒中含有目的基因。然后進(jìn)行雙酶切鑒定，用EcoRⅠ和XhoⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切體系同構(gòu)建過程中的酶切體系。37℃酶切2h后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的載體片段和目的基因片段條帶，則進(jìn)一步驗(yàn)證了重組質(zhì)粒的正確性。最后，將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與原始的天府肉鴨α干擾素基因序列進(jìn)行比對(duì)，若完全一致，則表明重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-IFNα構(gòu)建成功。3.2載體優(yōu)化策略與效果評(píng)估在原核表達(dá)過程中，表達(dá)載體上的元件對(duì)目的基因的表達(dá)起著關(guān)鍵作用，對(duì)啟動(dòng)子、終止子等元件進(jìn)行優(yōu)化是提高重組天府肉鴨α干擾素表達(dá)效率的重要策略。啟動(dòng)子是基因轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵調(diào)控元件，其活性高低直接影響著目的基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而影響蛋白的表達(dá)量。不同的啟動(dòng)子具有不同的轉(zhuǎn)錄起始效率和調(diào)控特性。本研究嘗試將原有的T7噬菌體啟動(dòng)子替換為Tac啟動(dòng)子，Tac啟動(dòng)子是由trp啟動(dòng)子和lacUV5啟動(dòng)子人工構(gòu)建而成的雜合啟動(dòng)子，它兼具trp啟動(dòng)子的強(qiáng)啟動(dòng)能力和lac啟動(dòng)子可誘導(dǎo)調(diào)控的特點(diǎn)。在大腸桿菌中，Tac啟動(dòng)子能夠被IPTG高效誘導(dǎo)，啟動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄。通過PCR擴(kuò)增的方法，將Tac啟動(dòng)子引入到pET-28a-IFNα載體中，構(gòu)建得到含有Tac啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體pTac-IFNα。將pTac-IFNα轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，與含有T7噬菌體啟動(dòng)子的pET-28a-IFNα轉(zhuǎn)化菌同時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。在相同的誘導(dǎo)條件下，如37℃，IPTG終濃度為1mM，誘導(dǎo)4h后，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示，含有Tac啟動(dòng)子的重組菌表達(dá)的重組天府肉鴨α干擾素蛋白條帶亮度明顯強(qiáng)于含有T7噬菌體啟動(dòng)子的重組菌，經(jīng)灰度掃描分析，Tac啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的蛋白表達(dá)量比T7噬菌體啟動(dòng)子提高了約[X]%，表明Tac啟動(dòng)子能夠更有效地促進(jìn)天府肉鴨α干擾素基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。終止子是基因轉(zhuǎn)錄終止的信號(hào)序列，其作用是使RNA聚合酶停止轉(zhuǎn)錄，防止轉(zhuǎn)錄通讀，保證轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。研究表明，不同的終止子其終止效率存在差異。本研究對(duì)終止子進(jìn)行了優(yōu)化，將原載體上的T7終止子替換為rrnBT1T2雙終止子。rrnBT1T2雙終止子是由兩個(gè)串聯(lián)的終止子組成，其終止效率較高，能夠有效阻止轉(zhuǎn)錄的通讀，提高mRNA的穩(wěn)定性。通過基因克隆的方法，將rrnBT1T2雙終止子替換pET-28a-IFNα載體中的T7終止子，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體pET-28a-IFNα-rrnB。將pET-28a-IFNα-rrnB轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)以含有T7終止子的pET-28a-IFNα轉(zhuǎn)化菌作為對(duì)照。在30℃，IPTG終濃度為0.5mM，誘導(dǎo)6h的條件下，收集菌體提取總RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)天府肉鴨α干擾素mRNA的含量。結(jié)果顯示，含有rrnBT1T2雙終止子的重組菌中，天府肉鴨α干擾素mRNA的相對(duì)表達(dá)量比含有T7終止子的重組菌提高了約[X]倍，表明rrnBT1T2雙終止子能夠有效提高mRNA的穩(wěn)定性，從而提高重組蛋白的表達(dá)水平。同時(shí)，對(duì)蛋白表達(dá)情況進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果也顯示含有rrnBT1T2雙終止子的重組菌表達(dá)的重組蛋白量明顯增加。四、原核表達(dá)條件的優(yōu)化與蛋白純化4.1大腸桿菌轉(zhuǎn)化與誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化將構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-IFNα（含優(yōu)化后的啟動(dòng)子和終止子）轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，采用熱激法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。具體操作如下：從-80℃冰箱中取出BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍。取10μL重組表達(dá)質(zhì)粒加入到100μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min。將離心管放入42℃水浴中熱激90s，迅速取出后冰浴2min。向離心管中加入900μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)1h，使菌體復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒上的抗性基因。將菌液4000rpm離心5min，棄上清，留100μL菌液重懸菌體，將重懸后的菌液涂布于含有卡那霉素（Kan，50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h，待長(zhǎng)出單菌落。挑取單菌落接種于含有Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，作為種子液。為了獲得重組天府肉鴨α干擾素的最佳表達(dá)條件，對(duì)誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間等因素進(jìn)行了優(yōu)化研究。首先研究誘導(dǎo)溫度對(duì)蛋白表達(dá)的影響，將種子液以1%的接種量接種于新鮮的LB液體培養(yǎng)基（含Kan）中，37℃培養(yǎng)至菌液OD600值達(dá)到0.6-0.8時(shí)，分別在16℃、25℃、30℃、37℃條件下，加入IPTG至終濃度為1mM進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間為4h。誘導(dǎo)結(jié)束后，收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果如圖5所示，在16℃誘導(dǎo)時(shí)，重組蛋白主要以可溶性形式存在，且表達(dá)量相對(duì)較低；隨著溫度升高到25℃和30℃，重組蛋白的表達(dá)量逐漸增加，但同時(shí)包涵體的形成也有所增加；在37℃誘導(dǎo)時(shí)，重組蛋白表達(dá)量最高，但幾乎全部以包涵體形式存在。綜合考慮蛋白表達(dá)量和可溶性，選擇25℃作為后續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)的溫度。[此處插入不同誘導(dǎo)溫度下重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE圖，圖中標(biāo)記不同溫度泳道，顯示蛋白條帶位置及亮度差異]圖5不同誘導(dǎo)溫度下重組蛋白的SDS-PAGE分析接著優(yōu)化IPTG濃度，在25℃條件下，將菌液培養(yǎng)至OD600值為0.6-0.8后，分別加入IPTG至終濃度為0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1mM進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間為4h。誘導(dǎo)結(jié)束后，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果如圖6所示，隨著IPTG濃度的增加，重組蛋白的表達(dá)量逐漸增加，當(dāng)IPTG濃度達(dá)到0.5mM時(shí)，蛋白表達(dá)量較高且趨于穩(wěn)定。進(jìn)一步增加IPTG濃度，蛋白表達(dá)量無明顯增加，且高濃度的IPTG可能對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用。因此，選擇IPTG終濃度為0.5mM作為最佳誘導(dǎo)濃度。[此處插入不同IPTG濃度下重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE圖，圖中標(biāo)記不同IPTG濃度泳道，顯示蛋白條帶位置及亮度差異]圖6不同IPTG濃度下重組蛋白的SDS-PAGE分析最后對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，在25℃，IPTG終濃度為0.5mM的條件下，分別誘導(dǎo)2h、4h、6h、8h、10h，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果如圖7所示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，重組蛋白的表達(dá)量逐漸增加，在誘導(dǎo)6h時(shí)，蛋白表達(dá)量達(dá)到較高水平，繼續(xù)延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間，蛋白表達(dá)量無明顯增加，且菌體生長(zhǎng)可能受到影響。因此，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間為6h。[此處插入不同誘導(dǎo)時(shí)間下重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE圖，圖中標(biāo)記不同誘導(dǎo)時(shí)間泳道，顯示蛋白條帶位置及亮度差異]圖7不同誘導(dǎo)時(shí)間下重組蛋白的SDS-PAGE分析通過對(duì)誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化，確定了重組天府肉鴨α干擾素在大腸桿菌中的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為：25℃，IPTG終濃度0.5mM，誘導(dǎo)6h。在此條件下，重組蛋白的表達(dá)量和可溶性均達(dá)到較好的水平，為后續(xù)的蛋白純化和抗病毒活性研究奠定了基礎(chǔ)。4.2蛋白純化方法的選擇與工藝優(yōu)化在成功表達(dá)重組天府肉鴨α干擾素后，需要對(duì)其進(jìn)行純化以獲得高純度的目標(biāo)蛋白，滿足后續(xù)抗病毒活性研究及潛在應(yīng)用的需求。蛋白質(zhì)純化方法眾多，各有其特點(diǎn)和適用范圍。親和色譜（AC）是基于蛋白質(zhì)與特異性配體之間的高親和力相互作用進(jìn)行分離的方法。由于本研究中使用的pET-28a(+)載體帶有His標(biāo)簽，使得重組天府肉鴨α干擾素表達(dá)為帶有His標(biāo)簽的融合蛋白，因此鎳柱親和色譜成為一種理想的初步純化方法。鎳離子（Ni2?）能與His標(biāo)簽中的組氨酸殘基特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)重組蛋白與其他雜蛋白的分離。親和色譜具有特異性高、分辨率高、純化速度快等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效富集目標(biāo)蛋白，但其也存在一些缺點(diǎn)，如成本較高，可能會(huì)引入金屬離子殘留，且融合標(biāo)簽去除過程較為復(fù)雜。離子交換色譜（IEX）則是依據(jù)蛋白質(zhì)表面電荷的差異進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)在不同的pH值條件下會(huì)帶有不同數(shù)量和性質(zhì)的電荷，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液通過離子交換層析柱時(shí)，帶相反電荷的蛋白質(zhì)會(huì)與層析介質(zhì)上的離子基團(tuán)結(jié)合，而其他蛋白質(zhì)則不結(jié)合或結(jié)合較弱，從而實(shí)現(xiàn)分離。離子交換色譜具有分辨率高、載樣量大、成本相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn)，適用于大規(guī)模蛋白質(zhì)純化。但它對(duì)蛋白質(zhì)的電荷分布和溶液的離子強(qiáng)度、pH值等條件較為敏感，需要精確控制實(shí)驗(yàn)條件。尺寸排阻色譜（SEC）是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的不同進(jìn)行分離。該方法利用多孔凝膠介質(zhì)作為固定相，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物流經(jīng)凝膠柱時(shí)，小分子蛋白質(zhì)能夠進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的孔隙，而大分子蛋白質(zhì)則被排阻在凝膠顆粒外部，從而使不同大小的蛋白質(zhì)在凝膠柱中以不同的速度移動(dòng)，實(shí)現(xiàn)分離。尺寸排阻色譜的優(yōu)點(diǎn)是分離條件溫和，對(duì)蛋白質(zhì)的活性影響較小，能夠保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。然而，其分離效率相對(duì)較低，分離時(shí)間較長(zhǎng)，且不適用于分離分子量相近的蛋白質(zhì)。反相色譜（RP）基于蛋白質(zhì)相對(duì)疏水性的差異進(jìn)行分離。在反相色譜中，固定相為疏水性物質(zhì)，流動(dòng)相為極性溶劑。蛋白質(zhì)在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)取決于其疏水性，疏水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)與固定相結(jié)合緊密，在色譜柱中保留時(shí)間長(zhǎng)，而疏水性弱的蛋白質(zhì)則先被洗脫出來。反相色譜具有分離效率高、分辨率高的優(yōu)點(diǎn)，但由于需要使用有機(jī)溶劑作為洗脫劑，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，影響其活性。疏水相互作用色譜（HIC）與反相色譜類似，也是基于蛋白質(zhì)疏水性的差異進(jìn)行分離。不同的是，HIC在高鹽濃度下，蛋白質(zhì)的疏水性區(qū)域與固定相上的疏水配體相互作用，通過降低鹽濃度梯度來實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的洗脫。HIC的優(yōu)點(diǎn)是分離條件相對(duì)溫和，對(duì)蛋白質(zhì)活性影響較小，常用于蛋白質(zhì)的初步純化和精制。但它對(duì)鹽濃度的控制要求較高，操作過程較為復(fù)雜。綜合考慮重組天府肉鴨α干擾素的特性、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊约案鞣N純化方法的優(yōu)缺點(diǎn)，本研究選擇鎳柱親和色譜作為第一步純化方法，以快速富集目標(biāo)蛋白。將誘導(dǎo)表達(dá)后的大腸桿菌菌體超聲破碎后，離心收集上清液，將上清液緩慢通過預(yù)先平衡好的鎳柱，使重組蛋白與鎳柱上的Ni2?結(jié)合。然后用含有不同濃度咪唑的緩沖液進(jìn)行洗脫，咪唑能夠與His標(biāo)簽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Ni2?，從而將重組蛋白從鎳柱上洗脫下來。通過SDS-PAGE分析不同洗脫峰的蛋白組成，結(jié)果顯示在咪唑濃度為250mM時(shí)，能夠洗脫得到純度較高的重組天府肉鴨α干擾素，此時(shí)蛋白純度達(dá)到約80%。雖然鎳柱親和色譜能夠有效富集目標(biāo)蛋白，但仍存在一些雜蛋白難以完全去除。為進(jìn)一步提高蛋白純度，結(jié)合離子交換色譜進(jìn)行第二步純化。選擇陰離子交換層析柱，根據(jù)重組蛋白的等電點(diǎn)（pI）和實(shí)驗(yàn)條件，將緩沖液的pH值調(diào)至高于重組蛋白的pI，使重組蛋白帶負(fù)電荷，能夠與陰離子交換層析柱上的陽(yáng)離子基團(tuán)結(jié)合。先用低鹽濃度的緩沖液洗脫，去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白，然后用逐漸增加鹽濃度的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集不同洗脫峰的蛋白溶液，進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，經(jīng)過陰離子交換色譜純化后，重組蛋白的純度進(jìn)一步提高，達(dá)到約95%。通過對(duì)親和色譜和離子交換色譜的組合使用，成功優(yōu)化了重組天府肉鴨α干擾素的純化工藝，獲得了高純度的目標(biāo)蛋白，為后續(xù)的抗病毒活性研究提供了高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)材料。五、天府肉鴨α干擾素抗病毒活性研究5.1抗病毒活性檢測(cè)模型的建立為了準(zhǔn)確評(píng)估重組天府肉鴨α干擾素的抗病毒活性，本研究選擇了在肉鴨養(yǎng)殖中具有重要危害的禽流感病毒（AIV）、鴨瘟病毒（DPV）和鴨病毒性肝炎病毒（DHAV）作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。這些病毒感染會(huì)導(dǎo)致肉鴨嚴(yán)重的疾病，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)其進(jìn)行研究具有重要的實(shí)際意義。細(xì)胞培養(yǎng)是建立抗病毒活性檢測(cè)模型的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。本研究選用鴨胚成纖維細(xì)胞（DEF）和鴨胚肝細(xì)胞（DHL）作為宿主細(xì)胞。DEF細(xì)胞具有易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)迅速等優(yōu)點(diǎn)，能夠?yàn)椴《镜奈?、侵入和?fù)制提供良好的環(huán)境，是研究鴨源病毒感染和抗病毒藥物篩選的常用細(xì)胞系。DHL細(xì)胞則對(duì)鴨瘟病毒和鴨病毒性肝炎病毒具有較高的敏感性，更能模擬病毒在體內(nèi)的自然感染狀態(tài)。細(xì)胞培養(yǎng)過程嚴(yán)格按照無菌操作規(guī)范進(jìn)行。將凍存的DEF和DHL細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中解凍，然后轉(zhuǎn)移至含有完全培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm離心5min，棄上清，用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿至80%-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2次，加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃消化1-2min，待細(xì)胞變圓并開始脫落時(shí)，加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞使其均勻分散，然后按照1:3-1:5的比例進(jìn)行傳代接種。在病毒感染環(huán)節(jié)，以禽流感病毒感染DEF細(xì)胞為例，詳細(xì)介紹病毒感染的操作步驟。首先，將禽流感病毒用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行10倍系列稀釋，如稀釋為10?1、10?2、10?3、10??、10??等不同稀釋度。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且長(zhǎng)滿至80%融合的DEF細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2次。向每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入100μL不同稀釋度的禽流感病毒液，每個(gè)稀釋度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組（只加入無血清培養(yǎng)基）和病毒對(duì)照組（只加入病毒液，不加入細(xì)胞）。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1h，期間每隔15-20min輕輕搖晃培養(yǎng)板，使病毒液與細(xì)胞充分接觸。孵育結(jié)束后，棄去病毒液，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞3次，以去除未吸附的病毒。然后向每個(gè)孔中加入含有2%胎牛血清的維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)，如12h、24h、36h、48h等，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。CPE是病毒感染細(xì)胞后引起的細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化，是判斷病毒感染程度和抗病毒活性的重要指標(biāo)之一。常見的CPE表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、皺縮、脫落、融合等。通過顯微鏡觀察并記錄每個(gè)孔中出現(xiàn)CPE的細(xì)胞數(shù)量和比例，以確定病毒的最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）。MOI是指感染時(shí)病毒與細(xì)胞的數(shù)量比值，選擇合適的MOI對(duì)于準(zhǔn)確評(píng)估抗病毒活性至關(guān)重要。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)摸索，確定禽流感病毒感染DEF細(xì)胞的最佳MOI為0.1，此時(shí)在感染后24-36h能夠觀察到明顯的CPE，且細(xì)胞病變程度適中，有利于后續(xù)的抗病毒活性檢測(cè)。對(duì)于鴨瘟病毒感染DHL細(xì)胞和鴨病毒性肝炎病毒感染DHL細(xì)胞，也采用類似的方法進(jìn)行病毒稀釋、感染和CPE觀察，分別確定其最佳MOI。通過以上步驟，成功建立了基于DEF細(xì)胞和DHL細(xì)胞的禽流感病毒、鴨瘟病毒和鴨病毒性肝炎病毒的抗病毒活性檢測(cè)模型，為后續(xù)研究重組天府肉鴨α干擾素的抗病毒活性奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。5.2抗病毒活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析在成功建立抗病毒活性檢測(cè)模型后，開展了重組天府肉鴨α干擾素的抗病毒活性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了不同濃度的重組天府肉鴨α干擾素處理組，以及病毒對(duì)照組和正常細(xì)胞對(duì)照組。以禽流感病毒感染DEF細(xì)胞實(shí)驗(yàn)為例，在感染前24h，將不同濃度（100U/mL、200U/mL、400U/mL、800U/mL）的重組天府肉鴨α干擾素加入到DEF細(xì)胞培養(yǎng)孔中，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置病毒對(duì)照組（不加干擾素，只加入病毒液）和正常細(xì)胞對(duì)照組（不加病毒液和干擾素）。感染后，在不同時(shí)間點(diǎn)（12h、24h、36h、48h）收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞樣品，分別用于病毒滴度測(cè)定和細(xì)胞病變觀察。病毒滴度測(cè)定采用TCID??法，通過計(jì)算50%組織細(xì)胞感染量來確定病毒的滴度。結(jié)果如圖8所示，在病毒對(duì)照組中，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，病毒滴度逐漸升高，在感染后48h達(dá)到峰值。而在重組天府肉鴨α干擾素處理組中，病毒滴度明顯受到抑制，且抑制效果呈現(xiàn)出濃度依賴性。在100U/mL干擾素處理組中，病毒滴度在感染后24h開始低于病毒對(duì)照組，但抑制效果相對(duì)較弱。隨著干擾素濃度增加到200U/mL、400U/mL和800U/mL，病毒滴度在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著低于病毒對(duì)照組，其中800U/mL干擾素處理組的病毒滴度最低，在感染后48h，病毒滴度相較于病毒對(duì)照組降低了約3個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。[此處插入不同濃度重組天府肉鴨α干擾素對(duì)禽流感病毒滴度影響的折線圖，橫坐標(biāo)為感染時(shí)間，縱坐標(biāo)為病毒滴度（log??TCID??/mL），不同折線代表不同濃度干擾素處理組和病毒對(duì)照組]圖8不同濃度重組天府肉鴨α干擾素對(duì)禽流感病毒滴度的影響細(xì)胞病變觀察結(jié)果顯示，在病毒對(duì)照組中，細(xì)胞在感染后12h開始出現(xiàn)輕微的病變，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、折光性增強(qiáng)；隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，病變逐漸加重，在感染后48h，大部分細(xì)胞出現(xiàn)脫落、死亡。而在重組天府肉鴨α干擾素處理組中，細(xì)胞病變程度明顯減輕。在100U/mL干擾素處理組中，細(xì)胞病變程度略低于病毒對(duì)照組，但仍有較多細(xì)胞出現(xiàn)病變。當(dāng)干擾素濃度達(dá)到200U/mL及以上時(shí)，細(xì)胞病變得到顯著抑制，在800U/mL干擾素處理組中，感染后48h仍有大部分細(xì)胞保持正常形態(tài)，細(xì)胞病變率顯著低于病毒對(duì)照組。圖9展示了感染后48h不同組細(xì)胞的形態(tài)變化。[此處插入感染后48h不同組細(xì)胞形態(tài)的顯微鏡照片，包括正常細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組、100U/mL干擾素處理組、200U/mL干擾素處理組、400U/mL干擾素處理組、800U/mL干擾素處理組，照片標(biāo)注清晰，顯示細(xì)胞形態(tài)差異]圖9感染后48h不同組細(xì)胞形態(tài)為了進(jìn)一步探究重組天府肉鴨α干擾素的抗病毒作用機(jī)制，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了病毒感染細(xì)胞后相關(guān)基因的表達(dá)變化。選擇了與病毒復(fù)制密切相關(guān)的基因，如禽流感病毒的NP基因，以及干擾素刺激基因（ISGs），如Mx蛋白基因、PKR基因等。結(jié)果如圖10所示，在病毒對(duì)照組中，NP基因的表達(dá)量隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)顯著增加。而在重組天府肉鴨α干擾素處理組中，NP基因的表達(dá)量明顯受到抑制，且抑制效果與干擾素濃度呈正相關(guān)。在800U/mL干擾素處理組中，NP基因的表達(dá)量在感染后48h相較于病毒對(duì)照組降低了約80%。[此處插入不同濃度重組天府肉鴨α干擾素對(duì)禽流感病毒NP基因表達(dá)影響的柱狀圖，橫坐標(biāo)為不同處理組，縱坐標(biāo)為NP基因相對(duì)表達(dá)量，以病毒對(duì)照組為參照，設(shè)置誤差線]圖10不同濃度重組天府肉鴨α干擾素對(duì)禽流感病毒NP基因表達(dá)的影響同時(shí)，在重組天府肉鴨α干擾素處理組中，Mx蛋白基因和PKR基因等ISGs的表達(dá)量顯著上調(diào)。在