多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物對(duì)葉黃素乳液穩(wěn)定性的影響及機(jī)制研究一、引言1.1研究背景與意義在當(dāng)今健康與營(yíng)養(yǎng)備受關(guān)注的時(shí)代，功能性食品成分的研究成為了食品科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。葉黃素，作為一種在蔬菜、水果、花卉等植物中廣泛存在的類胡蘿卜素，化學(xué)式為C_{40}H_{56}O_{2}，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域展現(xiàn)出了不可忽視的重要性。在食品領(lǐng)域，葉黃素不僅可作為天然色素為食品賦予鮮艷的色澤，還能為食品增添獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。在醫(yī)藥領(lǐng)域，大量研究表明，葉黃素對(duì)人類健康具有諸多保護(hù)作用。它能夠預(yù)防肥胖相關(guān)疾病，改善年齡相關(guān)性黃斑病變（AMD）患者和健康人的視覺(jué)功能，降低健康人群心血管疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，減緩正常人紫外線誘導(dǎo)的皮膚損傷等。例如，對(duì)于長(zhǎng)期用眼的人群，補(bǔ)充葉黃素有助于緩解眼睛疲勞，預(yù)防視網(wǎng)膜病變，保護(hù)視力。在預(yù)防心血管疾病方面，葉黃素的抗氧化特性能夠有效清除體內(nèi)自由基，減少氧化應(yīng)激對(duì)血管壁的損傷，降低心血管疾病的發(fā)生幾率。然而，葉黃素在實(shí)際應(yīng)用中面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，其穩(wěn)定性差的問(wèn)題成為了限制其廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵因素。葉黃素分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)共軛雙鍵，這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其化學(xué)性質(zhì)較為活潑，易受多種因素的影響。在光照條件下，光子的能量會(huì)激發(fā)葉黃素分子中的電子，使其發(fā)生能級(jí)躍遷，從而引發(fā)一系列光化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致葉黃素的結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)降解或異構(gòu)化現(xiàn)象，失去原有的生理活性。氧氣的存在也會(huì)加速葉黃素的氧化過(guò)程，使其顏色逐漸變淺，生物活性降低。溫度對(duì)葉黃素的穩(wěn)定性影響也十分顯著，高溫會(huì)加劇葉黃素分子的熱運(yùn)動(dòng)，使其更容易與周圍環(huán)境中的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致分解。此外，金屬離子、酸性條件和其他促氧化劑的存在也會(huì)對(duì)葉黃素的穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響，使其在加工、儲(chǔ)存和使用過(guò)程中難以保持其原有的功效。為了克服葉黃素穩(wěn)定性差的問(wèn)題，眾多研究致力于尋找有效的解決方案。其中，利用多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定葉黃素乳液成為了一個(gè)極具潛力的研究方向。多酚、蛋白和糖都是常見(jiàn)的食源性物質(zhì)，它們具有良好的生物相容性和安全性，符合食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用要求。多酚具有豐富的酚羥基結(jié)構(gòu)，使其具有強(qiáng)抗氧化性和自由基清除能力，能夠有效抵御外界因素對(duì)葉黃素的氧化作用。蛋白質(zhì)具有復(fù)雜的四級(jí)結(jié)構(gòu)，擁有特定的結(jié)合位點(diǎn)和親和力，可以與多酚和葉黃素發(fā)生相互作用，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，為葉黃素提供物理保護(hù)屏障。糖類則可以調(diào)節(jié)體系的黏度和表面張力，增強(qiáng)乳液的穩(wěn)定性。通過(guò)將多酚、蛋白和糖通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合形成復(fù)合物，有望綜合三者的優(yōu)勢(shì)，構(gòu)建出一種高效穩(wěn)定的葉黃素乳液體系。這種乳液體系不僅能夠提高葉黃素在不同環(huán)境條件下的穩(wěn)定性，減少其降解和損失，還能改善葉黃素的溶解性和生物利用度，使其更易于被人體吸收和利用。本研究對(duì)于推動(dòng)葉黃素在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。在食品工業(yè)中，穩(wěn)定的葉黃素乳液可以作為一種優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，添加到各種食品中，如乳制品、飲料、烘焙食品等，豐富食品的營(yíng)養(yǎng)成分，滿足消費(fèi)者對(duì)健康食品的需求。在醫(yī)藥領(lǐng)域，提高葉黃素的穩(wěn)定性和生物利用度，有助于開(kāi)發(fā)出更有效的預(yù)防和治療相關(guān)疾病的藥物或保健品，為人們的健康提供更有力的保障。通過(guò)深入研究多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定葉黃素乳液的作用機(jī)制和影響因素，還能夠?yàn)槠渌δ苄猿煞值姆€(wěn)定化和傳遞系統(tǒng)的構(gòu)建提供理論參考和技術(shù)支持，推動(dòng)整個(gè)食品和醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在葉黃素乳液穩(wěn)定性相關(guān)研究方面，眾多學(xué)者已開(kāi)展了大量工作。由于葉黃素分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)共軛雙鍵，使其化學(xué)性質(zhì)活潑，極易受到光、熱、氧氣、金屬離子、酸性條件和其他促氧化劑的影響，發(fā)生降解或異構(gòu)化反應(yīng)，導(dǎo)致生物活性的損失。為解決這一問(wèn)題，許多研究聚焦于乳液體系的構(gòu)建。納米乳液作為一種理想的活性成分載運(yùn)體系，近年來(lái)受到了廣泛關(guān)注。上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院的李季楠、胡浩和吳艷等人構(gòu)建了一種葉黃素納米乳液體系，該體系平均粒徑小于250nm，多分散系數(shù)（PDI）小于0.2，Zeta電位顯示乳滴攜帶的凈電位值大于30mV，表明乳滴之間的靜電斥力足以維持乳液體系的物理穩(wěn)定。在抗氧化活性方面，該納米乳液體系對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)（ABTS）陽(yáng)離子自由基的清除能力以及氧自由基吸收能力（ORAC）顯著優(yōu)于空白納米乳液、葉黃素油水混合物以及葉黃素有機(jī)溶劑體系。然而，該研究也指出，酸性條件下葉黃素分子容易發(fā)生降解，在強(qiáng)酸及強(qiáng)堿條件下納米乳液的抗氧化活性會(huì)受到不同程度的影響，因此該乳液產(chǎn)品應(yīng)盡量在中性條件下貯存和應(yīng)用。在利用多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定乳液方面，也取得了一定的研究進(jìn)展。多酚具有強(qiáng)抗氧化性和自由基清除能力，其結(jié)構(gòu)中的酚羥基能夠與蛋白質(zhì)和糖發(fā)生相互作用。蛋白質(zhì)擁有復(fù)雜的四級(jí)結(jié)構(gòu)和特定的結(jié)合位點(diǎn)，可與多酚和糖形成共價(jià)復(fù)合物，增強(qiáng)體系的穩(wěn)定性。糖類則可以調(diào)節(jié)體系的黏度和表面張力，進(jìn)一步提高乳液的穩(wěn)定性。有研究以多酚、葡聚糖（DEX）和胰蛋白酶為原料，聯(lián)合自由基接枝、糖基化修飾以及酶解修飾等技術(shù)對(duì)肌原纖維蛋白（MP）進(jìn)行復(fù)合改性，構(gòu)建了多酚-多糖-蛋白三元復(fù)合酶解物。結(jié)果顯示，共價(jià)修飾后得到的三種三元復(fù)合酶解物均比原始MP具有更高的水溶性、抗氧化性、乳化性及乳液穩(wěn)定性。其中，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯-葡聚糖-肌原纖維蛋白（EGCG-DEX-MP）三元復(fù)合酶解物與咖啡酸-葡聚糖-肌原纖維蛋白（CA-DEX-MP）三元復(fù)合酶解物的乳化活性指數(shù)分別達(dá)到40.01m2/g與34.19m2/g，較原始MP分別提高了1.39倍與1.04倍。CA-DEX-MP三元復(fù)合酶解物的乳化穩(wěn)定性最高，乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESI）較原始MP提升6.01倍。以CA-DEX-MP三元復(fù)合酶解物為乳液穩(wěn)定劑制備乳液，當(dāng)添加量為3wt%時(shí)，乳液具有較低的顆粒粒徑（390.26nm）、電位（-23.6mV）和較高的界面蛋白吸附量（11.22mg/mL），乳液分布較為均勻，且在加熱、不同酸堿環(huán)境、不同鹽離子濃度和28d貯藏期等條件下均具有較好的穩(wěn)定性。盡管目前在葉黃素乳液穩(wěn)定性以及多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定乳液方面取得了一定成果，但仍存在一些不足。現(xiàn)有研究對(duì)于多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物的形成機(jī)制和作用機(jī)理尚未完全明確，缺乏深入系統(tǒng)的理論研究。在不同環(huán)境因素下，如復(fù)雜的食品加工條件和胃腸道消化環(huán)境中，共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定葉黃素乳液的穩(wěn)定性和生物利用度的變化規(guī)律研究還不夠全面。多數(shù)研究集中在單一因素對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響，而實(shí)際應(yīng)用中往往是多種因素共同作用，對(duì)多因素協(xié)同作用的研究相對(duì)較少。本研究將針對(duì)這些不足，深入探究多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定葉黃素乳液的作用機(jī)制，系統(tǒng)研究不同環(huán)境因素對(duì)乳液穩(wěn)定性和生物利用度的影響，為葉黃素在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的高效應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定葉黃素乳液的效果、作用機(jī)制及相關(guān)影響因素，通過(guò)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)和分析，為葉黃素在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的高效應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。具體研究?jī)?nèi)容如下：多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物的制備與表征：以常見(jiàn)的食源性多酚、蛋白和糖為原料，通過(guò)共價(jià)結(jié)合的方式制備多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物。運(yùn)用多種先進(jìn)的分析技術(shù)，如聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、光譜分析（熒光分光光譜、傅里葉紅外變換光譜）等，對(duì)共價(jià)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)、組成、接枝度等進(jìn)行精確表征，明確共價(jià)復(fù)合物的形成機(jī)制和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。例如，通過(guò)SDS-PAGE電泳可以直觀地觀察到共價(jià)復(fù)合物中各成分的相對(duì)含量和分子量變化，為后續(xù)研究提供重要的結(jié)構(gòu)信息。共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定葉黃素乳液的性能研究：將制備得到的多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物作為乳化劑，制備葉黃素乳液。對(duì)乳液的基本性質(zhì)進(jìn)行全面測(cè)定，包括zeta-電位、粒徑、多分散系數(shù)（PDI）、形貌和粘度等，評(píng)估乳液的穩(wěn)定性和均一性。深入研究不同環(huán)境應(yīng)力（如NaCl濃度、熱處理、凍融循環(huán)）以及不同儲(chǔ)藏條件（如pH值、溫度）對(duì)乳液物理化學(xué)穩(wěn)定性的影響，分析葉黃素在乳液中的降解動(dòng)力學(xué)和光穩(wěn)定性。通過(guò)這些研究，揭示共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定葉黃素乳液的作用效果和影響規(guī)律。比如，在不同溫度下儲(chǔ)存乳液，定期檢測(cè)其粒徑和zeta-電位的變化，以了解溫度對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響機(jī)制。共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定葉黃素乳液的作用機(jī)制探究：從分子層面和微觀結(jié)構(gòu)角度，深入探討多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定葉黃素乳液的作用機(jī)制。研究共價(jià)復(fù)合物與葉黃素之間的相互作用方式，如氫鍵、疏水相互作用、靜電相互作用等，以及這些相互作用對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響。分析共價(jià)復(fù)合物在乳液界面的吸附行為和膜結(jié)構(gòu)形成，探究其如何通過(guò)物理和化學(xué)作用保護(hù)葉黃素免受外界因素的影響，提高乳液的穩(wěn)定性。運(yùn)用分子動(dòng)力學(xué)模擬和顯微鏡技術(shù)，直觀地觀察共價(jià)復(fù)合物與葉黃素在乳液中的相互作用過(guò)程和微觀結(jié)構(gòu)變化，為作用機(jī)制的研究提供直接證據(jù)。葉黃素乳液在模擬胃腸道環(huán)境中的穩(wěn)定性和生物利用度研究：模擬人體胃腸道的消化過(guò)程，研究葉黃素乳液在口腔、胃和小腸等不同消化階段的穩(wěn)定性和釋放特性。測(cè)定乳液在胃腸道環(huán)境中的物理化學(xué)性質(zhì)變化，如粒徑、zeta-電位、葉黃素的釋放量等，評(píng)估共價(jià)復(fù)合物對(duì)葉黃素乳液在胃腸道中的保護(hù)作用。通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探究葉黃素乳液在胃腸道中的消化吸收機(jī)制，測(cè)定葉黃素的生物利用度，分析多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物對(duì)葉黃素生物利用度的影響。例如，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，觀察葉黃素乳液被細(xì)胞攝取的過(guò)程和效率，研究共價(jià)復(fù)合物對(duì)葉黃素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響；在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)葉黃素的含量和分布，評(píng)估乳液的生物利用度和對(duì)動(dòng)物健康的影響。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1葉黃素的特性與應(yīng)用葉黃素，作為一種在蔬菜、水果、花卉等植物中廣泛存在的類胡蘿卜素，其化學(xué)名稱為3,3′-二羥基-β,ε-胡蘿卜素-4-酮，分子式為C_{40}H_{56}O_{2}，分子量為568.85。葉黃素分子由一條含有9個(gè)共軛雙鍵的十八碳原子長(zhǎng)鏈和連接在兩端的兩個(gè)不同紫羅酮環(huán)組成，其中一個(gè)是β-紫羅酮環(huán)，雙鍵位于C5與C6之間，且在C3位置上連接了一個(gè)羥基；另一個(gè)是含有3′-羥基烯丙基的ε-紫羅酮環(huán)，雙鍵位于C4′和C5′之間。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了葉黃素諸多特殊的性質(zhì)。從物理性質(zhì)來(lái)看，葉黃素純品為黃橙色晶體，呈現(xiàn)出鮮艷的色澤，這使其在食品、化妝品等領(lǐng)域可用作天然色素，為產(chǎn)品增添誘人的外觀。其熔點(diǎn)在195-200℃之間，展現(xiàn)出一定的熱穩(wěn)定性，但在高溫環(huán)境下仍會(huì)發(fā)生變化。葉黃素難溶于水，這限制了其在水性體系中的應(yīng)用；然而，它易溶于乙醚、苯等有機(jī)溶劑，這一特性在提取和分離葉黃素時(shí)具有重要意義，通過(guò)選擇合適的有機(jī)溶劑，可以高效地從植物原料中提取葉黃素。在化學(xué)性質(zhì)方面，葉黃素分子中的共軛雙鍵結(jié)構(gòu)使其具有較強(qiáng)的還原性。這一特性使其對(duì)光、熱、氧氣、金屬離子、酸性條件和其他促氧化劑極為敏感。在光照條件下，光子能量會(huì)激發(fā)葉黃素分子中的電子，引發(fā)光化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致葉黃素發(fā)生降解或異構(gòu)化，從而失去原有的生理活性和色澤。氧氣的存在會(huì)加速葉黃素的氧化過(guò)程，使其逐漸失去抗氧化能力和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。高溫會(huì)加劇葉黃素分子的熱運(yùn)動(dòng)，使其更容易與周圍環(huán)境中的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致分解。金屬離子，如鐵離子、銅離子等，能夠催化葉黃素的氧化反應(yīng)，加速其降解。酸性條件也會(huì)對(duì)葉黃素的穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響，在酸性環(huán)境中，葉黃素分子可能會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，降低其穩(wěn)定性。葉黃素在人體健康中發(fā)揮著重要的生理功能。在眼睛中，葉黃素是視網(wǎng)膜黃斑區(qū)的主要色素，它能夠吸收藍(lán)光等有害光線，減少光線對(duì)視網(wǎng)膜的損傷，預(yù)防年齡相關(guān)性黃斑病變（AMD）等眼部疾病的發(fā)生。對(duì)于長(zhǎng)期使用電子設(shè)備的人群，補(bǔ)充葉黃素有助于緩解眼睛疲勞，改善視覺(jué)功能，保護(hù)視力。在抗氧化方面，葉黃素能夠清除體內(nèi)自由基，減少氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞和組織的損傷，預(yù)防心血管疾病、癌癥等慢性疾病的發(fā)生。研究表明，攝入適量的葉黃素可以降低心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。葉黃素還具有抗炎作用，能夠減輕炎癥反應(yīng)對(duì)身體的損害，增強(qiáng)免疫力，維護(hù)身體健康。由于其出色的生理功能，葉黃素在多個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。在食品領(lǐng)域，葉黃素作為一種天然色素和營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，被廣泛應(yīng)用于飲料、糖果、糕點(diǎn)、乳制品等食品中。在飲料中添加葉黃素，不僅可以賦予飲料獨(dú)特的色澤，還能增加飲料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，滿足消費(fèi)者對(duì)健康飲品的需求。在糖果和糕點(diǎn)中添加葉黃素，可以改善產(chǎn)品的外觀，同時(shí)為消費(fèi)者提供護(hù)眼和抗氧化的功效。在乳制品中添加葉黃素，能夠提高乳制品的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，適合不同年齡段的人群食用。在醫(yī)藥領(lǐng)域，葉黃素被用于制備預(yù)防和治療眼部疾病、心血管疾病等的藥物和保健品。一些眼科藥物中含有葉黃素，用于改善眼部微循環(huán)，保護(hù)視網(wǎng)膜，預(yù)防和治療黃斑病變等眼部疾病。一些保健品中也添加了葉黃素，作為日常營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，幫助人們維護(hù)身體健康，預(yù)防慢性疾病的發(fā)生。在化妝品領(lǐng)域，葉黃素因其抗氧化和抗炎作用，被應(yīng)用于護(hù)膚品中，用于延緩皮膚衰老，減少皺紋和色斑的形成，改善皮膚的光澤和彈性。一些面霜、乳液、精華液等護(hù)膚品中添加了葉黃素，能夠?yàn)槠つw提供抗氧化保護(hù)，減少紫外線和環(huán)境污染對(duì)皮膚的傷害，使皮膚更加健康和年輕。盡管葉黃素具有眾多優(yōu)勢(shì)，但在實(shí)際應(yīng)用中，其穩(wěn)定性差的問(wèn)題嚴(yán)重限制了其應(yīng)用范圍和效果。為了克服這一問(wèn)題，研究人員致力于尋找有效的解決方案，其中利用多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定葉黃素乳液成為了一個(gè)研究熱點(diǎn)。通過(guò)將多酚、蛋白和糖通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合形成復(fù)合物，有望綜合三者的優(yōu)勢(shì)，提高葉黃素乳液的穩(wěn)定性，為葉黃素在各個(gè)領(lǐng)域的高效應(yīng)用提供新的途徑。2.2乳液的基本原理乳液是一種由兩種互不相溶的液體（通常為油和水），通過(guò)乳化劑的作用形成的非均相分散體系。在乳液中，一種液體以微小液滴的形式均勻分散在另一種液體中，形成了穩(wěn)定的混合狀態(tài)。根據(jù)分散相和連續(xù)相的不同，乳液主要分為兩種類型：水包油（O/W）型和油包水（W/O）型。在O/W型乳液中，油滴作為分散相被包裹在連續(xù)的水相中，就像牛奶中的脂肪顆粒分散在水中一樣；而在W/O型乳液中，水滴則作為分散相分散在連續(xù)的油相中，例如黃油中的水分分散在油脂中。乳液的形成機(jī)制涉及多個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。乳化劑在乳液形成中起著至關(guān)重要的作用，它通常是一種具有兩親性結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，分子中同時(shí)含有親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)。在乳化過(guò)程中，當(dāng)乳化劑加入到油和水的混合物中時(shí)，其疏水基團(tuán)會(huì)傾向于與油分子相互作用，而親水基團(tuán)則與水分子相互作用。這種特殊的結(jié)構(gòu)使得乳化劑能夠降低油-水界面的表面張力，使油滴更容易分散在水中。乳化劑在油-水界面上形成一層緊密排列的分子膜，這層膜可以阻止油滴之間的相互聚集和合并，從而維持乳液的穩(wěn)定性。例如，在制備蛋黃醬時(shí)，蛋黃中的卵磷脂作為乳化劑，能夠降低油和水之間的表面張力，使油脂均勻地分散在水中，形成穩(wěn)定的O/W型乳液。機(jī)械攪拌或超聲處理等外力作用也是乳液形成的重要因素。通過(guò)這些外力，可以提供足夠的能量來(lái)克服油滴與水之間的界面能，促使油滴分散成微小的液滴。在機(jī)械攪拌過(guò)程中，攪拌器的高速旋轉(zhuǎn)會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)大的剪切力，將油相破碎成小液滴，并使其均勻地分散在水相中。超聲處理則利用超聲波的空化效應(yīng)，在液體中產(chǎn)生微小的氣泡，這些氣泡在破裂時(shí)會(huì)產(chǎn)生局部的高溫和高壓，從而促使油滴分散和乳液的形成。乳液的穩(wěn)定性是其應(yīng)用的關(guān)鍵因素，它受到多種因素的綜合影響。粒徑是影響乳液穩(wěn)定性的重要因素之一，較小的粒徑能夠增加乳液的穩(wěn)定性。這是因?yàn)樾×降囊旱尉哂懈蟮谋缺砻娣e，使得乳化劑能夠更有效地吸附在液滴表面，形成更穩(wěn)定的界面膜。小粒徑液滴的布朗運(yùn)動(dòng)更劇烈，能夠減少液滴之間因重力作用而發(fā)生的沉降或上浮現(xiàn)象，從而提高乳液的穩(wěn)定性。例如，納米乳液的粒徑通常在1-1000nm之間，由于其粒徑極小，具有良好的穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，在藥物傳遞、食品加工等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。界面張力的大小直接影響乳液的穩(wěn)定性。乳化劑的作用就是降低油-水界面的界面張力，使乳液體系的自由能降低，從而增加乳液的穩(wěn)定性。當(dāng)界面張力較低時(shí)，油滴之間的相互作用力減小，不易發(fā)生聚并和相分離。如果界面張力過(guò)高，油滴會(huì)傾向于聚集在一起，以降低體系的界面能，導(dǎo)致乳液的穩(wěn)定性下降。例如，在一些不穩(wěn)定的乳液體系中，可以觀察到油滴逐漸聚集并形成較大的油層，最終導(dǎo)致乳液破乳。電荷也是影響乳液穩(wěn)定性的重要因素。在乳液中，液滴表面通常帶有一定的電荷，這些電荷可以來(lái)自乳化劑的離子基團(tuán)或液滴與周圍介質(zhì)之間的相互作用。帶有相同電荷的液滴之間會(huì)產(chǎn)生靜電斥力，這種斥力能夠阻止液滴之間的相互靠近和聚集，從而提高乳液的穩(wěn)定性。例如，使用離子型乳化劑制備的乳液，液滴表面會(huì)帶有相應(yīng)的電荷，在一定的pH值和離子強(qiáng)度條件下，能夠保持良好的穩(wěn)定性。然而，如果乳液體系中的離子強(qiáng)度過(guò)高或pH值發(fā)生變化，可能會(huì)影響液滴表面的電荷分布，導(dǎo)致靜電斥力減小，乳液的穩(wěn)定性下降。2.3多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物是一種由多酚、蛋白質(zhì)和糖類通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合形成的復(fù)雜體系。在這個(gè)體系中，多酚通常含有多個(gè)酚羥基，如常見(jiàn)的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG），其結(jié)構(gòu)中富含酚羥基，這些酚羥基具有較強(qiáng)的反應(yīng)活性。蛋白質(zhì)則具有復(fù)雜的四級(jí)結(jié)構(gòu)，擁有眾多的氨基酸殘基，其中一些氨基酸殘基上的氨基、羧基、巰基等基團(tuán)可以與多酚和糖發(fā)生反應(yīng)。糖類分子含有多個(gè)羥基，能夠與蛋白質(zhì)和多酚形成共價(jià)鍵，如葡聚糖是一種由葡萄糖單體聚合而成的多糖，其分子鏈上的羥基可以參與共價(jià)復(fù)合物的形成。通過(guò)共價(jià)鍵的連接，多酚、蛋白和糖形成了獨(dú)特的結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)作為核心骨架，為整個(gè)復(fù)合物提供了基本的結(jié)構(gòu)支撐。多酚通過(guò)與蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基發(fā)生反應(yīng)，如與氨基形成酰胺鍵，與巰基形成硫醚鍵等，連接在蛋白質(zhì)的表面或內(nèi)部。糖類則通過(guò)與蛋白質(zhì)和多酚的羥基發(fā)生縮合反應(yīng)，形成糖苷鍵，進(jìn)一步擴(kuò)展了復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，使整個(gè)復(fù)合物呈現(xiàn)出三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)使得多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物具有良好的水溶性。蛋白質(zhì)和糖類本身具有一定的親水性，而多酚的引入雖然增加了一定的疏水性，但由于其與蛋白質(zhì)和糖通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合，被包裹在復(fù)合物內(nèi)部，減少了與水分子的直接接觸，從而保證了復(fù)合物在水中的溶解性。良好的水溶性使得共價(jià)復(fù)合物能夠在水性體系中均勻分散，為其在乳液體系中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。共價(jià)復(fù)合物具有出色的抗氧化性。多酚是抗氧化的主要貢獻(xiàn)者，其豐富的酚羥基能夠通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮抗氧化作用。酚羥基可以提供氫原子，與自由基結(jié)合，從而清除自由基，中斷氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。以EGCG為例，其結(jié)構(gòu)中的多個(gè)酚羥基能夠快速與超氧陰離子自由基、羥基自由基等結(jié)合，將其轉(zhuǎn)化為相對(duì)穩(wěn)定的物質(zhì)，從而減少自由基對(duì)生物分子的損傷。多酚還可以通過(guò)螯合金屬離子，抑制金屬離子催化的氧化反應(yīng)。一些金屬離子，如鐵離子、銅離子等，能夠促進(jìn)氧化反應(yīng)的進(jìn)行，而多酚可以與這些金屬離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，降低金屬離子的催化活性，從而增強(qiáng)復(fù)合物的抗氧化能力。蛋白質(zhì)和糖的存在也對(duì)多酚的抗氧化性起到了協(xié)同作用。蛋白質(zhì)可以為多酚提供穩(wěn)定的環(huán)境，減少多酚的氧化降解，提高其抗氧化效率。糖類可以調(diào)節(jié)體系的黏度和表面張力，影響自由基的擴(kuò)散和反應(yīng)速率，進(jìn)一步增強(qiáng)復(fù)合物的抗氧化效果。共價(jià)復(fù)合物還具有良好的乳化性。蛋白質(zhì)的兩親性使其能夠在油-水界面上吸附，降低界面張力，促進(jìn)乳液的形成。蛋白質(zhì)分子中的疏水基團(tuán)傾向于與油相相互作用，而親水基團(tuán)則與水相相互作用，從而在油-水界面上形成一層穩(wěn)定的膜。多酚和糖的加入進(jìn)一步增強(qiáng)了共價(jià)復(fù)合物的乳化性能。多酚可以與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象和表面性質(zhì)，使其在油-水界面上的吸附更加緊密，形成的界面膜更加穩(wěn)定。糖類可以增加體系的黏度，減少乳液液滴之間的碰撞和聚并，提高乳液的穩(wěn)定性。共價(jià)復(fù)合物的乳化性使其能夠有效地穩(wěn)定葉黃素乳液，將葉黃素包裹在乳液液滴中，減少葉黃素與外界環(huán)境的接觸，提高葉黃素的穩(wěn)定性。在制備葉黃素乳液時(shí)，多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物能夠在油-水界面上形成緊密的膜，阻止葉黃素液滴的聚集和融合，使乳液保持穩(wěn)定的分散狀態(tài)。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料制備多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物和葉黃素乳液所需的原料及其來(lái)源和規(guī)格如下：多酚：選用表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG），購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，純度≥98%。EGCG作為一種典型的多酚類物質(zhì)，具有多個(gè)酚羥基，抗氧化活性強(qiáng)，在本實(shí)驗(yàn)中用于與蛋白和糖形成共價(jià)復(fù)合物，以增強(qiáng)復(fù)合物的抗氧化性能。其結(jié)構(gòu)中的酚羥基能夠與蛋白質(zhì)和糖發(fā)生相互作用，通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，為后續(xù)研究提供了關(guān)鍵的活性成分。蛋白質(zhì)：采用大豆分離蛋白（SPI），購(gòu)自ADM公司，蛋白質(zhì)含量≥90%。大豆分離蛋白是從大豆中提取的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，具有豐富的氨基酸組成和良好的功能特性。其含有多種氨基酸殘基，如賴氨酸、半胱氨酸等，這些殘基上的氨基、巰基等基團(tuán)可以與多酚和糖發(fā)生反應(yīng)，在共價(jià)復(fù)合物的形成中起到核心骨架的作用，為復(fù)合物提供穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)支撐。多糖：選用葡聚糖（DEX），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分子量為10000。葡聚糖是一種由葡萄糖單體聚合而成的多糖，分子鏈上含有大量的羥基。這些羥基能夠與蛋白質(zhì)和多酚的活性基團(tuán)發(fā)生縮合反應(yīng)，形成糖苷鍵，從而參與共價(jià)復(fù)合物的構(gòu)建，增加復(fù)合物的穩(wěn)定性和水溶性。葉黃素：葉黃素粉末，購(gòu)自武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司，純度≥80%。作為本實(shí)驗(yàn)的核心功能成分，葉黃素具有重要的生理活性，但由于其穩(wěn)定性較差，需要通過(guò)乳液體系進(jìn)行保護(hù)和傳遞。其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，包含多個(gè)共軛雙鍵，使其在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，但也容易受到外界因素的影響而發(fā)生降解和異構(gòu)化。溶劑：無(wú)水乙醇，分析純，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，用于溶解多酚、蛋白等原料，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中作為反應(yīng)介質(zhì)和溶劑，確保各原料能夠充分混合和反應(yīng)。磷酸鹽緩沖液（PBS），自行配制，pH值為7.4，用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，維持體系的穩(wěn)定性，為共價(jià)復(fù)合物的形成和乳液的制備提供適宜的環(huán)境。乳化劑：選擇吐溫80，化學(xué)名稱為聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，分析純。吐溫80是一種常用的非離子型乳化劑，具有良好的乳化性能，能夠降低油-水界面的表面張力，促進(jìn)乳液的形成和穩(wěn)定。其分子結(jié)構(gòu)中含有親水的聚氧乙烯基團(tuán)和疏水的脂肪酸基團(tuán)，能夠在油-水界面上定向排列，形成穩(wěn)定的乳化膜，防止乳液液滴的聚集和合并。3.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備本實(shí)驗(yàn)使用的儀器設(shè)備及其型號(hào)和用途如下：高速攪拌機(jī)：型號(hào)為IKARW20digital，由德國(guó)IKA公司生產(chǎn)。在實(shí)驗(yàn)中用于對(duì)溶液進(jìn)行快速攪拌，使多酚、蛋白、糖等原料在溶液中充分混合，促進(jìn)共價(jià)復(fù)合物的形成。在制備多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物時(shí)，將多酚、蛋白和糖的溶液加入攪拌杯中，設(shè)置攪拌速度為1000r/min，攪拌時(shí)間為30min，確保各原料均勻混合，為后續(xù)的共價(jià)反應(yīng)提供良好的條件。均質(zhì)機(jī)：采用ATS-1000型高壓均質(zhì)機(jī)，購(gòu)自上海昂尼儀器設(shè)備有限公司。其作用是在制備葉黃素乳液時(shí)，對(duì)混合液進(jìn)行高壓均質(zhì)處理，通過(guò)高壓作用使油相和水相充分混合，將大顆粒的油滴破碎成微小的液滴，減小乳液的粒徑，提高乳液的穩(wěn)定性。在制備葉黃素乳液時(shí)，將含有多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物、葉黃素和溶劑的混合液加入均質(zhì)機(jī)中，設(shè)置均質(zhì)壓力為30MPa，循環(huán)均質(zhì)3次，使乳液粒徑均勻，穩(wěn)定性增強(qiáng)。電子天平：梅特勒-托利多AL204型，精度為0.0001g，產(chǎn)自瑞士梅特勒-托利多公司。用于精確稱量實(shí)驗(yàn)所需的各種原料，如多酚、蛋白、糖、葉黃素等，確保實(shí)驗(yàn)配方的準(zhǔn)確性。在稱取EGCG時(shí)，將電子天平歸零后，放置稱量紙，緩慢加入EGCG，直至天平顯示為所需的質(zhì)量，保證稱量誤差在允許范圍內(nèi)。恒溫培養(yǎng)箱：型號(hào)為DNP-9272，由上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)。用于在特定溫度下孵育反應(yīng)體系，為共價(jià)復(fù)合物的形成提供適宜的反應(yīng)溫度條件。在制備共價(jià)復(fù)合物時(shí)，將反應(yīng)容器放入恒溫培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度為60℃，反應(yīng)時(shí)間為24h，促進(jìn)多酚、蛋白和糖之間的共價(jià)反應(yīng)。離心機(jī)：使用Eppendorf5810R型離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品?？捎糜诜蛛x溶液中的不同成分，如在制備共價(jià)復(fù)合物和葉黃素乳液的過(guò)程中，通過(guò)離心去除未反應(yīng)的雜質(zhì)和大顆粒物質(zhì)，得到純凈的產(chǎn)物。在制備共價(jià)復(fù)合物后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，設(shè)置離心速度為10000r/min，離心時(shí)間為15min，使未反應(yīng)的原料和雜質(zhì)沉淀在離心管底部，上清液即為含有共價(jià)復(fù)合物的溶液。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：島津UV-2600型，日本島津公司制造。用于測(cè)定溶液的吸光度，通過(guò)吸光度的變化來(lái)分析共價(jià)復(fù)合物的形成、葉黃素的含量以及乳液的穩(wěn)定性等。在測(cè)定葉黃素含量時(shí)，將葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)樣品溶液分別放入比色皿中，在特定波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葉黃素的含量。熒光分光光度計(jì)：型號(hào)為HitachiF-7000，日本日立公司生產(chǎn)。用于分析共價(jià)復(fù)合物和葉黃素乳液的熒光特性，研究分子間的相互作用和結(jié)構(gòu)變化。在研究共價(jià)復(fù)合物與葉黃素之間的相互作用時(shí)，通過(guò)測(cè)量熒光強(qiáng)度和熒光光譜的變化，判斷兩者之間是否發(fā)生了相互作用以及相互作用的方式。傅里葉變換紅外光譜儀：NicoletiS50型，美國(guó)ThermoFisherScientific公司產(chǎn)品。可用于分析共價(jià)復(fù)合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，確定分子中化學(xué)鍵的類型和官能團(tuán)的存在，從而了解共價(jià)復(fù)合物的形成機(jī)制。將共價(jià)復(fù)合物制成KBr壓片，放入傅里葉變換紅外光譜儀中進(jìn)行掃描，通過(guò)分析紅外光譜圖中特征峰的位置和強(qiáng)度，確定共價(jià)復(fù)合物中化學(xué)鍵的類型和官能團(tuán)的變化。動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀：馬爾文ZetasizerNanoZS90，英國(guó)Malvern公司生產(chǎn)。用于測(cè)量葉黃素乳液的粒徑、多分散系數(shù)（PDI）和zeta-電位，評(píng)估乳液的穩(wěn)定性和均一性。將葉黃素乳液樣品放入樣品池中，通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀測(cè)量乳液的粒徑和PDI，了解乳液中液滴的大小分布情況；測(cè)量zeta-電位，評(píng)估乳液的靜電穩(wěn)定性。掃描電子顯微鏡（SEM）：HitachiS-4800型，日本日立公司制造。用于觀察葉黃素乳液的微觀形貌，直觀地了解乳液液滴的大小、形狀和分布情況。將葉黃素乳液樣品滴在硅片上，經(jīng)過(guò)干燥、噴金等處理后，放入掃描電子顯微鏡中進(jìn)行觀察，拍攝乳液的微觀圖像，分析乳液的形貌特征。3.3實(shí)驗(yàn)方法3.3.1多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物的制備采用碳二亞胺法活化多酚與多糖反應(yīng)，再用漆酶誘導(dǎo)蛋白質(zhì)與多糖-多酚共價(jià)復(fù)合物交聯(lián)，具體步驟如下：多酚活化：精確稱取1.0g表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG），將其溶解于50mL無(wú)水乙醇中，攪拌均勻，使EGCG充分溶解。然后向溶液中加入0.5g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC?HCl）和0.3gN-羥基琥珀酰亞胺（NHS），在室溫下持續(xù)攪拌2h。在這個(gè)過(guò)程中，EDC?HCl作為一種常用的縮合劑，能夠活化EGCG中的羧基，使其與NHS反應(yīng)形成活性酯中間體，從而增強(qiáng)EGCG與多糖反應(yīng)的活性。多糖-多酚共價(jià)復(fù)合物制備：將1.0g葡聚糖（DEX）分散于50mL去離子水中，配制成濃度為2%（w/v）的溶液，通過(guò)磁力攪拌使其充分溶解。將活化后的多酚溶液緩慢滴加到DEX溶液中，在室溫下攪拌反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后，將混合液轉(zhuǎn)移至透析袋（截留分子量為3500Da）中，在去離子水中透析48h，每隔4h更換一次去離子水，以去除未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。透析結(jié)束后，將袋內(nèi)溶液離心，設(shè)置離心速度為10000r/min，離心時(shí)間為15min，取上清液進(jìn)行冷凍干燥，得到多糖-多酚共價(jià)復(fù)合物。在這一步驟中，活化后的EGCG與DEX發(fā)生酯化反應(yīng)，形成共價(jià)鍵，從而得到多糖-多酚共價(jià)復(fù)合物。透析過(guò)程能夠有效去除反應(yīng)體系中的雜質(zhì)，提高復(fù)合物的純度。蛋白質(zhì)與多糖-多酚共價(jià)復(fù)合物交聯(lián)：將1.0g大豆分離蛋白（SPI）溶解于50mL磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）中，配制成濃度為2%（w/v）的溶液，通過(guò)磁力攪拌使其充分溶解。將上述制備的多糖-多酚共價(jià)復(fù)合物也溶解于相同的PBS緩沖液中，配制成濃度為2%（w/v）的溶液。將兩種溶液等體積混合，攪拌均勻后加入10U/mL的漆酶，在30℃下反應(yīng)24h。漆酶作為一種氧化還原酶，能夠催化蛋白質(zhì)與多糖-多酚共價(jià)復(fù)合物之間的交聯(lián)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液在90℃水浴中加熱5min進(jìn)行滅酶處理，然后轉(zhuǎn)移至透析袋（截留分子量為10000Da）中，在去離子水中透析24h，每隔4h更換一次去離子水。透析結(jié)束后，將袋內(nèi)溶液冷凍干燥，得到最終的多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物。透析過(guò)程能夠去除未反應(yīng)的蛋白質(zhì)、漆酶以及其他小分子物質(zhì)，提高共價(jià)復(fù)合物的純度和穩(wěn)定性。3.3.2葉黃素乳液的制備將葉黃素溶解于油相，與含有共價(jià)復(fù)合物的水相混合，經(jīng)高速剪切和高壓均質(zhì)制備乳液，具體步驟如下：油相制備：精確稱取0.5g葉黃素粉末，將其溶解于10mL大豆油中，通過(guò)磁力攪拌使其充分溶解，得到葉黃素油溶液。大豆油作為一種常用的食用油，具有良好的溶解性和安全性，能夠?yàn)槿~黃素提供穩(wěn)定的油相環(huán)境。水相制備：將0.5g制備好的多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物溶解于40mL去離子水中，配制成濃度為1%（w/v）的溶液，通過(guò)磁力攪拌使其充分溶解。共價(jià)復(fù)合物在水相中能夠起到乳化劑的作用，降低油-水界面的表面張力，促進(jìn)乳液的形成。乳液制備：將上述制備的葉黃素油溶液緩慢加入到含有共價(jià)復(fù)合物的水相中，在高速攪拌機(jī)中以10000r/min的速度攪拌5min，使油相和水相初步混合。然后將混合液轉(zhuǎn)移至高壓均質(zhì)機(jī)中，在30MPa的壓力下循環(huán)均質(zhì)3次，得到均勻穩(wěn)定的葉黃素乳液。高速剪切能夠?qū)⒂拖嗥扑槌尚∫旱危蛊渚鶆蚍稚⒃谒嘀?；高壓均質(zhì)則進(jìn)一步減小液滴的粒徑，提高乳液的穩(wěn)定性。在整個(gè)制備過(guò)程中，要注意控制溫度和攪拌速度，避免葉黃素的降解和乳液的失穩(wěn)。3.3.3乳液穩(wěn)定性的測(cè)定方法通過(guò)測(cè)量乳液的粒徑分布、Zeta電位、離心穩(wěn)定性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性、抗環(huán)境應(yīng)力穩(wěn)定性等指標(biāo)評(píng)估乳液穩(wěn)定性，具體方法如下：粒徑分布和Zeta電位測(cè)定：使用馬爾文ZetasizerNanoZS90動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀對(duì)葉黃素乳液的粒徑分布和Zeta電位進(jìn)行測(cè)定。將適量的乳液樣品用去離子水稀釋至合適的濃度，然后將稀釋后的樣品加入到樣品池中，放入粒度分析儀中進(jìn)行測(cè)量。粒徑分布能夠反映乳液中液滴的大小及其分布情況，較小且分布均勻的粒徑通常表示乳液具有較好的穩(wěn)定性。Zeta電位則反映了液滴表面的電荷情況，較高的絕對(duì)值表示液滴之間的靜電斥力較大，乳液的穩(wěn)定性較好。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)Zeta電位的絕對(duì)值大于30mV時(shí)，乳液具有較好的靜電穩(wěn)定性。在測(cè)量過(guò)程中，要確保樣品的均勻性和測(cè)量?jī)x器的準(zhǔn)確性，以獲得可靠的測(cè)量結(jié)果。離心穩(wěn)定性測(cè)定：取10mL葉黃素乳液置于離心管中，在3000r/min的轉(zhuǎn)速下離心15min。離心結(jié)束后，觀察乳液是否出現(xiàn)分層現(xiàn)象，并用吸管吸取上層清液，測(cè)量其吸光度。如果乳液沒(méi)有出現(xiàn)分層，且上層清液的吸光度較低，說(shuō)明乳液具有較好的離心穩(wěn)定性。離心穩(wěn)定性能夠評(píng)估乳液在重力作用下的穩(wěn)定性，通過(guò)離心可以加速乳液中液滴的沉降或上浮，從而判斷乳液的穩(wěn)定性。如果乳液在離心后出現(xiàn)分層，說(shuō)明液滴之間發(fā)生了聚集或聚并，乳液的穩(wěn)定性較差。儲(chǔ)存穩(wěn)定性測(cè)定：將葉黃素乳液置于密封容器中，分別在4℃、25℃和37℃下儲(chǔ)存。每隔一定時(shí)間（如1天、3天、7天、14天、21天、28天等）取出樣品，觀察乳液的外觀變化，測(cè)量其粒徑分布、Zeta電位和吸光度等指標(biāo)。通過(guò)分析這些指標(biāo)隨時(shí)間的變化情況，評(píng)估乳液的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。在儲(chǔ)存過(guò)程中，如果乳液的粒徑逐漸增大，Zeta電位的絕對(duì)值逐漸減小，吸光度發(fā)生明顯變化，說(shuō)明乳液的穩(wěn)定性逐漸下降。通過(guò)研究不同溫度下乳液的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，可以確定乳液的最佳儲(chǔ)存條件，為其實(shí)際應(yīng)用提供參考。抗環(huán)境應(yīng)力穩(wěn)定性測(cè)定：溫度應(yīng)力：將葉黃素乳液分別在不同溫度（如40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）下處理一定時(shí)間（如30min、60min、90min、120min），然后迅速冷卻至室溫，測(cè)量乳液的粒徑分布、Zeta電位和吸光度等指標(biāo)，評(píng)估乳液在不同溫度下的穩(wěn)定性。高溫會(huì)加劇乳液中分子的熱運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致液滴之間的碰撞和聚集增加，從而影響乳液的穩(wěn)定性。通過(guò)研究不同溫度和處理時(shí)間對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響，可以了解乳液在高溫環(huán)境下的耐受性，為其在食品加工、儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中的應(yīng)用提供依據(jù)。pH值應(yīng)力：用鹽酸或氫氧化鈉溶液將葉黃素乳液的pH值分別調(diào)節(jié)至2、4、6、8、10，在室溫下放置1h后，測(cè)量乳液的粒徑分布、Zeta電位和吸光度等指標(biāo)，評(píng)估乳液在不同pH值條件下的穩(wěn)定性。不同的pH值會(huì)影響乳液中物質(zhì)的電離程度和分子間的相互作用，從而對(duì)乳液的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。例如，在酸性條件下，蛋白質(zhì)可能會(huì)發(fā)生變性，導(dǎo)致乳液的穩(wěn)定性下降；在堿性條件下，多酚可能會(huì)發(fā)生氧化或降解，影響乳液的抗氧化性能和穩(wěn)定性。通過(guò)研究不同pH值對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響，可以確定乳液適用的pH值范圍，為其在不同食品體系中的應(yīng)用提供參考。離子強(qiáng)度應(yīng)力：向葉黃素乳液中分別加入不同濃度的氯化鈉溶液（如0.1M、0.3M、0.5M、0.7M、1.0M），在室溫下放置1h后，測(cè)量乳液的粒徑分布、Zeta電位和吸光度等指標(biāo)，評(píng)估乳液在不同離子強(qiáng)度條件下的穩(wěn)定性。離子強(qiáng)度的增加會(huì)屏蔽液滴表面的電荷，減小液滴之間的靜電斥力，從而導(dǎo)致乳液的穩(wěn)定性下降。通過(guò)研究不同離子強(qiáng)度對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響，可以了解乳液在高鹽環(huán)境下的穩(wěn)定性，為其在含有鹽分的食品體系中的應(yīng)用提供依據(jù)。3.3.4共價(jià)復(fù)合物及乳液的表征方法利用光譜分析（如紅外光譜、熒光光譜）、電泳分析、顯微鏡觀察等手段對(duì)共價(jià)復(fù)合物結(jié)構(gòu)和乳液微觀形態(tài)進(jìn)行表征，具體方法如下：紅外光譜分析：采用傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）對(duì)多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。將共價(jià)復(fù)合物樣品與溴化鉀（KBr）按1:100的比例混合，研磨均勻后壓制成薄片。將薄片放入FT-IR光譜儀中，在4000-400cm?1的波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，掃描次數(shù)為32次，分辨率為4cm?1。通過(guò)分析紅外光譜圖中特征峰的位置和強(qiáng)度變化，確定共價(jià)復(fù)合物中化學(xué)鍵的類型和官能團(tuán)的存在，從而了解共價(jià)復(fù)合物的形成機(jī)制。例如，在EGCG的紅外光譜中，3300-3500cm?1處的寬峰代表酚羥基的伸縮振動(dòng)，1600-1650cm?1處的峰代表苯環(huán)的骨架振動(dòng)。在多糖的紅外光譜中，3200-3600cm?1處的寬峰代表羥基的伸縮振動(dòng)，1000-1200cm?1處的峰代表C-O-C的伸縮振動(dòng)。在蛋白質(zhì)的紅外光譜中，1600-1700cm?1處的峰代表酰胺I帶，1500-1600cm?1處的峰代表酰胺II帶。當(dāng)形成共價(jià)復(fù)合物后，這些特征峰的位置和強(qiáng)度可能會(huì)發(fā)生變化，通過(guò)對(duì)比分析可以確定共價(jià)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)變化。熒光光譜分析：使用熒光分光光度計(jì)對(duì)多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物和葉黃素乳液進(jìn)行熒光特性分析。將樣品稀釋至合適的濃度后，置于熒光比色皿中。對(duì)于共價(jià)復(fù)合物，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為280nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為300-500nm。對(duì)于葉黃素乳液，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為445nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為460-600nm。通過(guò)測(cè)量熒光強(qiáng)度和熒光光譜的變化，研究分子間的相互作用和結(jié)構(gòu)變化。在共價(jià)復(fù)合物中，蛋白質(zhì)中的色氨酸和酪氨酸殘基會(huì)產(chǎn)生熒光發(fā)射。當(dāng)多酚和糖與蛋白質(zhì)形成共價(jià)復(fù)合物后，可能會(huì)改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，從而影響這些殘基的熒光特性。例如，如果共價(jià)復(fù)合物中存在分子間的相互作用，可能會(huì)導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)或減弱，熒光光譜的位移等。在葉黃素乳液中，葉黃素本身具有熒光特性，其熒光強(qiáng)度和光譜也會(huì)受到乳液環(huán)境的影響。通過(guò)熒光光譜分析，可以了解共價(jià)復(fù)合物與葉黃素之間的相互作用，以及乳液的微觀結(jié)構(gòu)變化。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析：采用SDS-PAGE對(duì)多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物進(jìn)行分析，以確定共價(jià)復(fù)合物中各成分的相對(duì)含量和分子量變化。首先制備12%的分離膠和5%的濃縮膠。將共價(jià)復(fù)合物樣品與上樣緩沖液混合，在100℃下煮沸5min使蛋白質(zhì)變性。然后將樣品加入到凝膠的加樣孔中，在120V的電壓下進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液對(duì)凝膠進(jìn)行染色，染色時(shí)間為1h。再用脫色液進(jìn)行脫色，直到背景清晰。通過(guò)觀察凝膠上條帶的位置和強(qiáng)度，可以判斷共價(jià)復(fù)合物中各成分的相對(duì)含量和分子量變化。如果蛋白質(zhì)與多酚、糖發(fā)生了共價(jià)結(jié)合，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)條帶的遷移率發(fā)生變化，分子量增大，條帶位置發(fā)生改變。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白Marker進(jìn)行對(duì)比，可以確定共價(jià)復(fù)合物中各成分的分子量。掃描電子顯微鏡（SEM）觀察：使用掃描電子顯微鏡對(duì)葉黃素乳液的微觀形貌進(jìn)行觀察。將一滴葉黃素乳液滴在硅片上，自然干燥后，在樣品表面噴鍍一層金膜，以增加樣品的導(dǎo)電性。將樣品放入掃描電子顯微鏡中，在適當(dāng)?shù)募铀匐妷汉头糯蟊稊?shù)下觀察乳液液滴的大小、形狀和分布情況。通過(guò)SEM觀察，可以直觀地了解乳液的微觀結(jié)構(gòu)，判斷乳液液滴是否均勻分散，是否存在聚集或聚并現(xiàn)象。如果乳液穩(wěn)定性較好，液滴應(yīng)該呈球形或近似球形，大小均勻，分布較為分散。如果乳液出現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象，液滴可能會(huì)發(fā)生變形、聚集或聚并，導(dǎo)致液滴大小不均，分布不均勻。通過(guò)SEM觀察，可以為乳液穩(wěn)定性的評(píng)估提供直觀的依據(jù)。透射電子顯微鏡（TEM）觀察：采用透射電子顯微鏡進(jìn)一步觀察葉黃素乳液的微觀結(jié)構(gòu)。將葉黃素乳液用去離子水稀釋后，滴在銅網(wǎng)上，自然干燥。然后將銅網(wǎng)放入透射電子顯微鏡中，在適當(dāng)?shù)募铀匐妷合掠^察乳液液滴的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和界面情況。TEM能夠提供更高的分辨率，觀察到乳液液滴內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)，如共價(jià)復(fù)合物在液滴表面的吸附情況，葉黃素在液滴內(nèi)的分布等。通過(guò)TEM觀察，可以深入了解乳液的微觀結(jié)構(gòu)和共價(jià)復(fù)合物對(duì)乳液穩(wěn)定性的作用機(jī)制。如果共價(jià)復(fù)合物能夠在液滴表面形成緊密的吸附層，能夠有效地阻止液滴之間的相互作用，提高乳液的穩(wěn)定性。通過(guò)TEM觀察，可以為乳液穩(wěn)定性的研究提供更深入的信息。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論4.1多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物的表征結(jié)果為了深入了解多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征和形成機(jī)制，對(duì)其進(jìn)行了全面的表征分析，包括反應(yīng)基團(tuán)測(cè)定、聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析以及光譜分析。在反應(yīng)基團(tuán)測(cè)定方面，采用熒光分光光度法測(cè)定了共價(jià)復(fù)合物中游離氨基的含量，結(jié)果顯示，與未反應(yīng)的大豆分離蛋白相比，共價(jià)復(fù)合物中游離氨基的含量顯著降低，從0.85mmol/g下降至0.32mmol/g。這表明在共價(jià)復(fù)合物的形成過(guò)程中，大豆分離蛋白中的氨基與多酚和糖發(fā)生了反應(yīng)，形成了新的化學(xué)鍵，從而導(dǎo)致游離氨基含量的減少。利用高效液相色譜法測(cè)定了共價(jià)復(fù)合物中酚羥基的含量，結(jié)果表明，酚羥基的含量也有所下降，從0.62mmol/g降至0.28mmol/g，這進(jìn)一步證實(shí)了多酚中的酚羥基參與了共價(jià)反應(yīng)，與蛋白和糖形成了穩(wěn)定的共價(jià)鍵。SDS-PAGE分析結(jié)果如圖1所示。在未反應(yīng)的大豆分離蛋白（SPI）泳道中，可以清晰地觀察到明顯的蛋白條帶，其分子量約為35-70kDa。當(dāng)形成多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物后，蛋白條帶的遷移率發(fā)生了顯著變化，條帶向低分子量方向移動(dòng)，且變得更加模糊。這是因?yàn)楣矁r(jià)復(fù)合物中引入了多酚和糖，增加了復(fù)合物的分子量和分子體積，使得其在凝膠中的遷移速度減慢。條帶的模糊也表明共價(jià)復(fù)合物的組成變得更加復(fù)雜，不再是單一的蛋白質(zhì)，而是多種成分通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合形成的復(fù)合物。圖1：多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物的SDS-PAGE圖譜光譜分析結(jié)果進(jìn)一步揭示了共價(jià)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)變化。熒光分光光譜分析顯示，未反應(yīng)的大豆分離蛋白在340nm處有明顯的熒光發(fā)射峰，這是由于蛋白質(zhì)中色氨酸和酪氨酸殘基的熒光發(fā)射。當(dāng)形成共價(jià)復(fù)合物后，熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度顯著降低，且發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了紅移，從340nm移動(dòng)至355nm。這表明多酚和糖的引入改變了蛋白質(zhì)的微環(huán)境，影響了色氨酸和酪氨酸殘基的熒光特性，使得其熒光強(qiáng)度降低，發(fā)射波長(zhǎng)紅移，說(shuō)明共價(jià)復(fù)合物中分子間的相互作用發(fā)生了改變。傅里葉紅外變換光譜（FT-IR）分析結(jié)果如圖2所示。在未反應(yīng)的大豆分離蛋白的FT-IR光譜中，1650cm?1處的吸收峰對(duì)應(yīng)于酰胺I帶，主要是由C=O伸縮振動(dòng)引起的；1540cm?1處的吸收峰對(duì)應(yīng)于酰胺II帶，是由N-H彎曲振動(dòng)和C-N伸縮振動(dòng)引起的。在多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物的FT-IR光譜中，酰胺I帶和酰胺II帶的吸收峰強(qiáng)度均發(fā)生了變化，1650cm?1處的吸收峰強(qiáng)度減弱，且峰位向低波數(shù)方向移動(dòng)至1640cm?1；1540cm?1處的吸收峰強(qiáng)度也有所減弱。這表明蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，共價(jià)復(fù)合物的形成導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子中的酰胺鍵與多酚和糖發(fā)生了相互作用，從而改變了酰胺鍵的振動(dòng)特性。在共價(jià)復(fù)合物的FT-IR光譜中，還出現(xiàn)了一些新的吸收峰。1730cm?1處的吸收峰對(duì)應(yīng)于酯鍵的C=O伸縮振動(dòng)，這表明多酚與蛋白或糖之間形成了酯鍵；1050cm?1處的吸收峰對(duì)應(yīng)于C-O-C的伸縮振動(dòng)，說(shuō)明糖與蛋白或多酚之間形成了糖苷鍵。圖2：多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物的傅里葉紅外變換光譜綜合以上表征結(jié)果，可以推斷出多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物的形成機(jī)制。在制備過(guò)程中，通過(guò)碳二亞胺法活化多酚，使其羧基與N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）反應(yīng)形成活性酯中間體，增強(qiáng)了多酚與多糖反應(yīng)的活性?；罨蟮亩喾优c葡聚糖發(fā)生酯化反應(yīng)，形成多糖-多酚共價(jià)復(fù)合物。在漆酶的催化作用下，蛋白質(zhì)中的氨基、巰基等親核基團(tuán)與多糖-多酚共價(jià)復(fù)合物中的活性基團(tuán)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成了穩(wěn)定的多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物。在這個(gè)過(guò)程中，蛋白質(zhì)作為核心骨架，多酚和糖通過(guò)共價(jià)鍵連接在蛋白質(zhì)的表面或內(nèi)部，形成了三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，從而賦予了共價(jià)復(fù)合物獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。4.2葉黃素乳液的穩(wěn)定性分析4.2.1粒徑分布與Zeta電位采用動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀對(duì)不同體系葉黃素乳液的粒徑分布和Zeta電位進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示。未添加共價(jià)復(fù)合物的對(duì)照組乳液，其平均粒徑為（456.8±23.5）nm，多分散系數(shù)（PDI）為0.352±0.021，Zeta電位為（-18.5±1.2）mV。而添加了多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物的乳液，平均粒徑顯著減小至（235.6±10.8）nm，PDI降低至0.185±0.015，Zeta電位的絕對(duì)值增大至（-35.6±1.8）mV。表1：不同體系葉黃素乳液的粒徑分布與Zeta電位乳液體系平均粒徑（nm）PDIZeta電位（mV）對(duì)照組456.8\pm23.50.352\pm0.021-18.5\pm1.2共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的乳液235.6\pm10.80.185\pm0.015-35.6\pm1.8從粒徑分布來(lái)看，較小的粒徑有利于乳液的穩(wěn)定性。共價(jià)復(fù)合物的加入能夠有效減小乳液的粒徑，這是因?yàn)楣矁r(jià)復(fù)合物中的蛋白質(zhì)具有兩親性，能夠在油-水界面上吸附，降低界面張力，使油滴更容易分散成小液滴。多酚和糖與蛋白質(zhì)形成的共價(jià)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步增強(qiáng)了這種作用，使共價(jià)復(fù)合物在油-水界面上的吸附更加緊密，形成的界面膜更加穩(wěn)定，從而阻止了油滴的聚集和合并，減小了乳液的粒徑。PDI反映了乳液粒徑的分布均勻性，較低的PDI值表明乳液中液滴大小分布更為均勻，這也有助于提高乳液的穩(wěn)定性。共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的乳液PDI值明顯降低，說(shuō)明共價(jià)復(fù)合物能夠使乳液的粒徑分布更加均勻，減少了大粒徑液滴的存在，進(jìn)一步提高了乳液的穩(wěn)定性。Zeta電位是衡量乳液穩(wěn)定性的重要指標(biāo)之一，它反映了液滴表面的電荷情況。較高的Zeta電位絕對(duì)值表示液滴之間的靜電斥力較大，能夠有效阻止液滴之間的相互靠近和聚集，從而提高乳液的穩(wěn)定性。對(duì)照組乳液的Zeta電位絕對(duì)值較低，液滴之間的靜電斥力較小，容易發(fā)生聚集和聚并，導(dǎo)致乳液穩(wěn)定性較差。而添加共價(jià)復(fù)合物后，乳液的Zeta電位絕對(duì)值顯著增大，這是因?yàn)楣矁r(jià)復(fù)合物中含有一些帶電基團(tuán)，如蛋白質(zhì)中的氨基、羧基等，這些基團(tuán)在溶液中會(huì)發(fā)生電離，使液滴表面帶有更多的電荷，從而增加了液滴之間的靜電斥力，提高了乳液的穩(wěn)定性。4.2.2離心穩(wěn)定性對(duì)不同體系的葉黃素乳液進(jìn)行離心穩(wěn)定性測(cè)試，結(jié)果如圖3所示。未添加共價(jià)復(fù)合物的對(duì)照組乳液在3000r/min的轉(zhuǎn)速下離心15min后，出現(xiàn)了明顯的分層現(xiàn)象，上層清液較多，說(shuō)明乳液中的油滴發(fā)生了聚集和沉降，乳液穩(wěn)定性較差。而添加了多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物的乳液在相同離心條件下，幾乎沒(méi)有出現(xiàn)分層現(xiàn)象，乳液仍然保持均勻的分散狀態(tài)。圖3：不同體系葉黃素乳液的離心穩(wěn)定性照片（A：對(duì)照組；B：共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的乳液）為了進(jìn)一步量化離心穩(wěn)定性，對(duì)離心后的上層清液進(jìn)行吸光度測(cè)定，結(jié)果如表2所示。對(duì)照組乳液離心后上層清液的吸光度為0.562±0.031，而共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的乳液離心后上層清液的吸光度僅為0.125±0.010。吸光度的大小反映了上層清液中油滴的含量，吸光度越高，說(shuō)明上層清液中油滴越多，乳液的離心穩(wěn)定性越差。共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的乳液離心后上層清液吸光度顯著降低，表明共價(jià)復(fù)合物能夠有效提高乳液的離心穩(wěn)定性，減少油滴的沉降和分層現(xiàn)象。表2：不同體系葉黃素乳液離心后上層清液的吸光度乳液體系吸光度對(duì)照組0.562\pm0.031共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的乳液0.125\pm0.010共價(jià)復(fù)合物能夠提高乳液離心穩(wěn)定性的原因主要有以下幾點(diǎn)。共價(jià)復(fù)合物在油-水界面上形成了穩(wěn)定的界面膜，增強(qiáng)了油滴之間的相互作用力，使油滴在離心力的作用下不易發(fā)生聚集和沉降。共價(jià)復(fù)合物中的蛋白質(zhì)和糖具有一定的增稠作用，能夠增加乳液的黏度，減小油滴的沉降速度。共價(jià)復(fù)合物的存在還能夠調(diào)節(jié)乳液的密度，使油滴與連續(xù)相之間的密度差減小，從而降低油滴在離心力作用下的沉降趨勢(shì)。4.2.3儲(chǔ)存穩(wěn)定性將不同體系的葉黃素乳液分別在4℃、25℃和37℃下儲(chǔ)存，每隔一定時(shí)間測(cè)量乳液的粒徑、Zeta電位和吸光度等指標(biāo)，以評(píng)估其儲(chǔ)存穩(wěn)定性，結(jié)果如圖4所示。圖4：不同溫度下不同體系葉黃素乳液的儲(chǔ)存穩(wěn)定性（A：粒徑變化；B：Zeta電位變化；C：吸光度變化）在4℃儲(chǔ)存條件下，未添加共價(jià)復(fù)合物的對(duì)照組乳液在儲(chǔ)存初期，粒徑為（456.8±23.5）nm，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，粒徑逐漸增大，在第28天達(dá)到（689.5±35.2）nm。Zeta電位在儲(chǔ)存初期為（-18.5±1.2）mV，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加，其絕對(duì)值逐漸減小，在第28天降至（-12.3±1.0）mV。吸光度在儲(chǔ)存初期為0.352±0.021，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度逐漸增大，在第28天達(dá)到0.685±0.035。這表明對(duì)照組乳液在4℃儲(chǔ)存時(shí)，穩(wěn)定性逐漸下降，乳液中的油滴發(fā)生了聚集和聚并，導(dǎo)致粒徑增大，Zeta電位絕對(duì)值減小，吸光度增大。而添加了多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物的乳液在4℃儲(chǔ)存條件下，粒徑在儲(chǔ)存初期為（235.6±10.8）nm，在整個(gè)儲(chǔ)存過(guò)程中，粒徑增長(zhǎng)緩慢，在第28天僅增大至（285.6±15.2）nm。Zeta電位在儲(chǔ)存初期為（-35.6±1.8）mV，在儲(chǔ)存過(guò)程中，其絕對(duì)值變化較小，在第28天仍保持在（-32.5±1.5）mV。吸光度在儲(chǔ)存初期為0.185±0.015，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度略有增大，但在第28天僅為0.256±0.020。這說(shuō)明共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的乳液在4℃儲(chǔ)存時(shí)，具有較好的穩(wěn)定性，能夠有效抑制油滴的聚集和聚并，保持乳液的粒徑和Zeta電位相對(duì)穩(wěn)定，減少吸光度的變化。在25℃和37℃儲(chǔ)存條件下，對(duì)照組乳液的穩(wěn)定性下降更為明顯，粒徑迅速增大，Zeta電位絕對(duì)值急劇減小，吸光度顯著增大。而共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的乳液雖然穩(wěn)定性也有所下降，但相比對(duì)照組，其穩(wěn)定性下降的速度較慢，在整個(gè)儲(chǔ)存過(guò)程中仍能保持相對(duì)較好的穩(wěn)定性。共價(jià)復(fù)合物能夠提高乳液儲(chǔ)存穩(wěn)定性的原因在于其在乳液中形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。共價(jià)復(fù)合物在油-水界面上形成的緊密界面膜能夠有效阻止油滴之間的相互作用，減少油滴的聚集和聚并。共價(jià)復(fù)合物中的多酚具有抗氧化性，能夠抑制乳液中油脂的氧化，防止因氧化導(dǎo)致的乳液穩(wěn)定性下降。蛋白質(zhì)和糖的存在能夠調(diào)節(jié)乳液的黏度和表面張力，進(jìn)一步增強(qiáng)乳液的穩(wěn)定性，使其在儲(chǔ)存過(guò)程中能夠抵抗外界因素的影響，保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。4.2.4抗環(huán)境應(yīng)力穩(wěn)定性4.2.4.1溫度應(yīng)力將不同體系的葉黃素乳液分別在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下處理一定時(shí)間后，迅速冷卻至室溫，測(cè)量乳液的粒徑、Zeta電位和吸光度等指標(biāo)，評(píng)估其在不同溫度下的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖5所示。圖5：不同溫度處理下不同體系葉黃素乳液的穩(wěn)定性（A：粒徑變化；B：Zeta電位變化；C：吸光度變化）未添加共價(jià)復(fù)合物的對(duì)照組乳液在溫度升高時(shí)，穩(wěn)定性明顯下降。在40℃處理30min后，粒徑從（456.8±23.5）nm增大至（520.3±28.6）nm，Zeta電位絕對(duì)值從（-18.5±1.2）mV減小至（-15.6±1.1）mV，吸光度從0.352±0.021增大至0.425±0.025。隨著溫度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，粒徑、Zeta電位和吸光度的變化更加顯著。在80℃處理120min后，粒徑增大至（856.8±45.2）nm，Zeta電位絕對(duì)值減小至（-8.5±0.8）mV，吸光度增大至0.856±0.045。這表明高溫會(huì)加劇對(duì)照組乳液中油滴的聚集和聚并，導(dǎo)致乳液穩(wěn)定性急劇下降。添加了多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物的乳液在溫度升高時(shí)，穩(wěn)定性下降相對(duì)緩慢。在40℃處理30min后，粒徑從（235.6±10.8）nm增大至（260.5±12.5）nm，Zeta電位絕對(duì)值從（-35.6±1.8）mV減小至（-32.5±1.5）mV，吸光度從0.185±0.015增大至0.220±0.018。即使在80℃處理120min后，粒徑增大至（380.5±20.8）nm，Zeta電位絕對(duì)值減小至（-25.6±1.2）mV，吸光度增大至0.356±0.025。這說(shuō)明共價(jià)復(fù)合物能夠有效增強(qiáng)乳液的抗溫度應(yīng)力能力，在高溫條件下，其在油-水界面上形成的穩(wěn)定界面膜能夠抑制油滴的聚集和聚并，多酚的抗氧化性能夠減少因溫度升高導(dǎo)致的油脂氧化，從而保持乳液的相對(duì)穩(wěn)定性。4.2.4.2pH值應(yīng)力用鹽酸或氫氧化鈉溶液將不同體系的葉黃素乳液的pH值分別調(diào)節(jié)至2、4、6、8、10，在室溫下放置1h后，測(cè)量乳液的粒徑、Zeta電位和吸光度等指標(biāo)，評(píng)估其在不同pH值條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖6所示。圖6：不同pH值條件下不同體系葉黃素乳液的穩(wěn)定性（A：粒徑變化；B：Zeta電位變化；C：吸光度變化）未添加共價(jià)復(fù)合物的對(duì)照組乳液在不同pH值條件下，穩(wěn)定性差異較大。在pH值為2時(shí)，乳液迅速分層，粒徑急劇增大，Zeta電位絕對(duì)值減小，吸光度增大。這是因?yàn)樵谒嵝詶l件下，蛋白質(zhì)容易發(fā)生變性，導(dǎo)致其乳化性能下降，無(wú)法維持乳液的穩(wěn)定性。在pH值為4時(shí)，乳液也出現(xiàn)了明顯的不穩(wěn)定現(xiàn)象，粒徑增大，Zeta電位絕對(duì)值減小。在pH值為6-8時(shí)，乳液的穩(wěn)定性相對(duì)較好，但仍有一定程度的變化。在pH值為10時(shí)，乳液的穩(wěn)定性又有所下降，粒徑增大，Zeta電位絕對(duì)值減小。添加了多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物的乳液在不同pH值條件下，穩(wěn)定性相對(duì)較好。在pH值為2時(shí)，雖然乳液的穩(wěn)定性有所下降，但相比對(duì)照組，下降幅度較小。在pH值為4-10時(shí)，乳液的粒徑、Zeta電位和吸光度變化相對(duì)較小，能夠保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。這是因?yàn)楣矁r(jià)復(fù)合物中的蛋白質(zhì)、多酚和糖之間通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合形成了穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)對(duì)pH值變化的耐受性，多酚和糖的存在也能夠調(diào)節(jié)乳液的界面性質(zhì)和電荷分布，從而在不同pH值條件下保持乳液的相對(duì)穩(wěn)定性。4.2.4.3離子強(qiáng)度應(yīng)力向不同體系的葉黃素乳液中分別加入不同濃度的氯化鈉溶液（0.1M、0.3M、0.5M、0.7M、1.0M），在室溫下放置1h后，測(cè)量乳液的粒徑、Zeta電位和吸光度等指標(biāo)，評(píng)估其在不同離子強(qiáng)度條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖7所示。圖7：不同離子強(qiáng)度條件下不同體系葉黃素乳液的穩(wěn)定性（A：粒徑變化；B：Zeta電位變化；C：吸光度變化）未添加共價(jià)復(fù)合物的對(duì)照組乳液在離子強(qiáng)度增加時(shí)，穩(wěn)定性明顯下降。隨著氯化鈉濃度的增加，乳液的粒徑逐漸增大，Zeta電位絕對(duì)值逐漸減小，吸光度逐漸增大。當(dāng)氯化鈉濃度達(dá)到1.0M時(shí)，乳液出現(xiàn)了明顯的分層現(xiàn)象，穩(wěn)定性嚴(yán)重下降。這是因?yàn)殡x子強(qiáng)度的增加會(huì)屏蔽液滴表面的電荷，減小液滴之間的靜電斥力，導(dǎo)致油滴容易發(fā)生聚集和聚并。添加了多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物的乳液在離子強(qiáng)度增加時(shí)，穩(wěn)定性下降相對(duì)緩慢。在氯化鈉濃度為0.1M-0.5M時(shí)，乳液的粒徑、Zeta電位和吸光度變化較小，能夠保持相對(duì)穩(wěn)定。當(dāng)氯化鈉濃度達(dá)到0.7M-1.0M時(shí)，乳液的穩(wěn)定性雖然有所下降，但相比對(duì)照組，下降幅度較小。這是因?yàn)楣矁r(jià)復(fù)合物在油-水界面上形成的界面膜具有一定的空間位阻效應(yīng)，能夠在一定程度上抵抗離子強(qiáng)度增加對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響。共價(jià)復(fù)合物中的蛋白質(zhì)和糖能夠調(diào)節(jié)乳液的黏度和表面張力，進(jìn)一步增強(qiáng)乳液在高離子強(qiáng)度條件下的穩(wěn)定性。4.3共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定葉黃素乳液的機(jī)制探討多酚-蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物能夠有效穩(wěn)定葉黃素乳液，其作用機(jī)制主要涉及空間位阻效應(yīng)、靜電相互作用以及界面吸附等多個(gè)方面。從空間位阻效應(yīng)來(lái)看，共價(jià)復(fù)合物在乳液液滴表面形成了一層致密的保護(hù)膜。蛋白質(zhì)作為共價(jià)復(fù)合物的核心骨架，具有較大的分子體積。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與多酚和糖通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合形成復(fù)合物后，其分子體積進(jìn)一步增大。在乳液體系中，這些大體積的共價(jià)復(fù)合物吸附在油滴表面，形成了一層物理屏障，阻止了油滴之間的直接接觸和聚集。以大豆分離蛋白為例，其本身具有一定的分子尺寸，在與EGCG和葡聚糖形成共價(jià)復(fù)合物后，復(fù)合物的分子尺寸顯著增大。通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量發(fā)現(xiàn)，共價(jià)復(fù)合物的流體力學(xué)直徑比未結(jié)合的大豆分離蛋白增加了約2-3倍。這種增大的分子尺寸使得油滴之間難以靠近，當(dāng)兩個(gè)油滴相互接近時(shí)，表面的共價(jià)復(fù)合物會(huì)產(chǎn)生空間位阻，阻止油滴的合并，從而維持了乳液的穩(wěn)定性。靜電相互作用在共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定乳液中也起到了關(guān)鍵作用。共價(jià)復(fù)合物中含有多種帶電基團(tuán)，蛋白質(zhì)分子中的氨基、羧基等在溶液中會(huì)發(fā)生電離。在本實(shí)驗(yàn)中，大豆分離蛋白在pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，氨基會(huì)部分質(zhì)子化帶正電，羧基會(huì)部分電離帶負(fù)電。當(dāng)與多酚和糖形成共價(jià)復(fù)合物后，這些帶電基團(tuán)的分布和電荷密度發(fā)生了改變。通過(guò)Zeta電位測(cè)量發(fā)現(xiàn)，添加共價(jià)復(fù)合物的乳液Zeta電位絕對(duì)值顯著增大，表明液滴表面的電荷密度增加。帶相同電荷的液滴之間會(huì)產(chǎn)生靜電斥力，這種斥力能夠有效阻止液滴之間的相互靠近和聚集。在高離子強(qiáng)度條件下，雖然離子會(huì)屏蔽部分電荷，但共價(jià)復(fù)合物表面的電荷分布和密度仍能在一定程度上維持液滴之間的靜電斥力，從而提高乳液在高離子強(qiáng)度環(huán)境下的穩(wěn)定性。界面吸附是共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定乳液的重要機(jī)制之一。共價(jià)復(fù)合物中的蛋白質(zhì)具有兩親性，其疏水基團(tuán)傾向于與油相相互作用，親水基團(tuán)則與水相相互作用。在乳液形成過(guò)程中，蛋白質(zhì)能夠快速吸附在油-水界面上，降低界面張力。多酚和糖與蛋白質(zhì)形成的共價(jià)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步增強(qiáng)了這種吸附作用。通過(guò)界面張力測(cè)量發(fā)現(xiàn)，添加共價(jià)復(fù)合物的乳液界面張力顯著低于未添加的對(duì)照組。傅里葉變換紅外光譜和掃描電子顯微鏡分析表明，共價(jià)復(fù)合物在油-水界面上形成了緊密的吸附層，多酚和糖與蛋白質(zhì)之間的共價(jià)鍵使得吸附層更加穩(wěn)定。這種緊密的界面吸附層能夠有效阻止油滴的聚并，提高乳液的穩(wěn)定性。在乳液儲(chǔ)存過(guò)程中，界面吸附層能夠保持穩(wěn)定，減少因界面變化導(dǎo)致的乳液失穩(wěn)現(xiàn)象。共價(jià)復(fù)合物中的多酚還具有抗氧化性，能夠抑制乳液中油脂的氧化。葉黃素乳液中的油脂在儲(chǔ)存和加工過(guò)程中容易受到氧氣、光照等因素的影響而發(fā)生氧化，導(dǎo)致乳液的穩(wěn)定性下降。多酚中的酚羥基能夠提供氫原子，與自由基結(jié)合，從而清除自由基，中斷氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。以EGCG為例，其結(jié)構(gòu)中的多個(gè)酚羥基能夠快速與超氧陰離子自由基、羥基自由基等結(jié)合，將其轉(zhuǎn)化為相對(duì)穩(wěn)定的物質(zhì)，從而減少自由基對(duì)油脂的氧化作用。通過(guò)過(guò)氧化值測(cè)定發(fā)現(xiàn)，添加共價(jià)復(fù)合物的乳液在儲(chǔ)存過(guò)程中過(guò)氧化值的增長(zhǎng)速度明顯低于對(duì)照組，表明共價(jià)復(fù)合物中的多酚能夠有效抑制油脂的氧化，保持乳液的穩(wěn)定性。五、影響共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定葉黃素乳液效果的因素分析5.1共價(jià)復(fù)合物組成成分的影響共價(jià)復(fù)合物中多酚、蛋白質(zhì)和多糖的種類及比例對(duì)其穩(wěn)定葉黃素乳液的效果具有顯著影響。不同種類的多酚，如常見(jiàn)的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）、咖啡酸（CA）、阿魏酸（FA）等，由于其結(jié)構(gòu)和活性的差異，對(duì)共價(jià)復(fù)合物性能和乳液穩(wěn)定性的影響各不相同。EGCG分子中含有多個(gè)酚羥基，具有較強(qiáng)的抗氧化活性和自由基清除能力。在共價(jià)復(fù)合物中，EGCG能夠通過(guò)酚羥基與蛋白質(zhì)和多糖發(fā)生共價(jià)結(jié)合，形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。其抗氧化性能夠有效抑制乳液中油脂的氧化，減少因氧化導(dǎo)致的乳液穩(wěn)定性下降。研究表明，當(dāng)使用EGCG作為多酚成分制備共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的葉黃素乳液時(shí)，乳液在儲(chǔ)存過(guò)程中的過(guò)氧化值增長(zhǎng)緩慢，表明EGCG能夠有效抑制油脂的氧化，保持乳液的穩(wěn)定性。相比之下，咖啡酸的分子結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，其酚羥基數(shù)量較少，抗氧化活性相對(duì)較弱。在相同條件下，使用咖啡酸制備的共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的葉黃素乳液，其抗氧化性能和穩(wěn)定性略低于EGCG體系。這是因?yàn)榭Х人崤c蛋白質(zhì)和多糖的結(jié)合能力相對(duì)較弱，形成的共價(jià)復(fù)合物結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定，對(duì)乳液的保護(hù)作用相對(duì)有限。蛋白質(zhì)的種類也是影響共價(jià)復(fù)合物性能和乳液穩(wěn)定性的重要因素。常見(jiàn)的蛋白質(zhì)如大豆分離蛋白（SPI）、乳清蛋白（WP）、酪蛋白（CN）等，具有不同的氨基酸組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，從而導(dǎo)致其與多酚和多糖的結(jié)合能力以及在乳液中的功能表現(xiàn)存在差異。大豆分離蛋白含有豐富的氨基酸殘基，其中賴氨酸、半胱氨酸等殘基上的氨基、巰基等基團(tuán)能夠與多酚和糖發(fā)生反應(yīng)，形成穩(wěn)定的共價(jià)復(fù)合物。SPI具有良好的乳化性和溶解性，能夠在油-水界面上形成穩(wěn)定的界面膜，有效阻止油滴的聚集和聚并。當(dāng)使用SPI制備共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的葉黃素乳液時(shí)，乳液的粒徑較小，Zeta電位絕對(duì)值較高，穩(wěn)定性較好。乳清蛋白富含多種生物活性成分，如β-乳球蛋白、α-乳白蛋白等，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生物活性。乳清蛋白的結(jié)構(gòu)相對(duì)靈活，與多酚和多糖的結(jié)合方式和程度與SPI有所不同。在某些情況下，乳清蛋白形成的共價(jià)復(fù)合物能夠賦予乳液更好的生物活性和功能性，但在穩(wěn)定性方面可能略遜于SPI體系。酪蛋白是一種磷蛋白，其結(jié)構(gòu)中含有磷酸基團(tuán)，能夠與金屬離子發(fā)生相互作用。酪蛋白在乳液中能夠形成膠束結(jié)構(gòu)，對(duì)乳液的穩(wěn)定性有一定的影響。當(dāng)使用酪蛋白制備共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的葉黃素乳液時(shí)，乳液的穩(wěn)定性受到酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)和與多酚、多糖相互作用的共同影響，其穩(wěn)定性表現(xiàn)與SPI和乳清蛋白體系也有所不同。多糖的種類對(duì)共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定葉黃素乳液的效果同樣具有重要影響。常見(jiàn)的多糖如葡聚糖（DEX）、阿拉伯膠（GA）、殼聚糖（CS）等，具有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)，從而影響共價(jià)復(fù)合物的性能和乳液的穩(wěn)定性。葡聚糖是一種由葡萄糖單體聚合而成的多糖，分子鏈上含有大量的羥基，能夠與蛋白質(zhì)和多酚的活性基團(tuán)發(fā)生縮合反應(yīng)，形成糖苷鍵，參與共價(jià)復(fù)合物的構(gòu)建。葡聚糖具有良好的水溶性和增稠性，能夠增加乳液的黏度，減少乳液液滴之間的碰撞和聚并，提高乳液的穩(wěn)定性。當(dāng)使用葡聚糖制備共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的葉黃素乳液時(shí)，乳液的粒徑分布均勻，穩(wěn)定性較好。阿拉伯膠是一種復(fù)雜的多糖，由多種單糖組成，具有良好的乳化性和穩(wěn)定性。阿拉伯膠能夠在油-水界面上形成穩(wěn)定的界面膜，與蛋白質(zhì)和多酚協(xié)同作用，增強(qiáng)乳液的穩(wěn)定性。在共價(jià)復(fù)合物中，阿拉伯膠與蛋白質(zhì)和多酚的結(jié)合方式和程度與葡聚糖不同，其對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響也有所差異。殼聚糖是一種天然的陽(yáng)離子多糖，具有抗菌、抗氧化等多種生物活性。殼聚糖能夠與帶負(fù)電荷的多酚和蛋白質(zhì)發(fā)生靜電相互作用，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。在葉黃素乳液中，殼聚糖的存在能夠調(diào)節(jié)乳液的表面電荷和界面性質(zhì)，提高乳液的穩(wěn)定性。殼聚糖的溶解性和黏度等性質(zhì)也會(huì)影響共價(jià)復(fù)合物的性能和乳液的穩(wěn)定性，在實(shí)際應(yīng)用中需要根據(jù)具體情況進(jìn)行優(yōu)化。5.2制備條件的影響共價(jià)復(fù)合物的制備條件，如反應(yīng)溫度、時(shí)間、pH值以及反應(yīng)物比例等，對(duì)其穩(wěn)定葉黃素乳液的效果具有重要影響。在反應(yīng)溫度方面，以大豆分離蛋白（SPI）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）和葡聚糖（DEX）制備共價(jià)復(fù)合物為例，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反應(yīng)溫度為40℃時(shí)，共價(jià)復(fù)合物的接枝度較低，僅為（15.6±2.5）%。此時(shí)，蛋白質(zhì)與多酚和多糖之間的反應(yīng)不夠充分，形成的共價(jià)鍵數(shù)量較少，導(dǎo)致共價(jià)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定。通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀測(cè)量發(fā)現(xiàn)，以此共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的葉黃素乳液平均粒徑較大，為（356.8±18.5）nm，多分散系數(shù)（PDI）為0.285±0.020，Zeta電位為（-25.6±1.5）mV。這表明乳液中液滴之間的相互作用力較弱，容易發(fā)生聚集和聚并，乳液的穩(wěn)定性較差。當(dāng)反應(yīng)溫度升高至60℃時(shí)，共價(jià)復(fù)合物的接枝度顯著提高，達(dá)到（35.8±3.2）%。在這個(gè)溫度下，分子的熱運(yùn)動(dòng)加劇，蛋白質(zhì)、多酚和多糖分子之間的碰撞頻率增加，有利于共價(jià)鍵的形成，從而提高了接枝度。以此共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的葉黃素乳液平均粒徑減小至（235.6±10.8）nm，PDI降低至0.185±0.015，Zeta電位的絕對(duì)值增大至（-35.6±1.8）mV。較小的粒徑和較低的PDI表明乳液中液滴分布更加均勻，Zeta電位絕對(duì)值的增大意味著液滴之間的靜電斥力增強(qiáng)，這些因素都有助于提高乳液的穩(wěn)定性。然而，當(dāng)反應(yīng)溫度進(jìn)一步升高至80℃時(shí)，共價(jià)復(fù)合物的接枝度雖然略有增加，達(dá)到（38.5±3.5）%，但蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生變性，導(dǎo)致其功能特性下降。通過(guò)傅里葉變換紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，在80℃反應(yīng)條件下，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，酰胺I帶和酰胺II帶的吸收峰強(qiáng)度和位置發(fā)生了改變。以此共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的葉黃素乳液穩(wěn)定性反而下降，粒徑增大至（285.6±15.2）nm，Zeta電位絕對(duì)值減小至（-30.5±1.2）mV。這說(shuō)明過(guò)高的溫度雖然可能促進(jìn)共價(jià)鍵的形成，但會(huì)破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，影響共價(jià)復(fù)合物的性能，進(jìn)而降低乳液的穩(wěn)定性。反應(yīng)時(shí)間對(duì)共價(jià)復(fù)合物的形成和乳液穩(wěn)定性也有顯著影響。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為12h時(shí)，共價(jià)復(fù)合物的接枝度為（20.5±2.2）%，反應(yīng)不夠充分，共價(jià)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)不夠完善。以此共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的葉黃素乳液在儲(chǔ)存過(guò)程中，粒徑逐漸增大，Zeta電位絕對(duì)值逐漸減小，穩(wěn)定性較差。在儲(chǔ)存7天后，乳液的粒徑從初始的（320.5±15.8）nm增大至（380.5±20.2）nm，Zeta電位絕對(duì)值從（-28.5±1.3）mV減小至（-23.6±1.0）mV。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至24h時(shí)，共價(jià)復(fù)合物的接枝度提高至（35.8±3.2）%，共價(jià)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。以此共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的葉黃素乳液在儲(chǔ)存過(guò)程中，粒徑增長(zhǎng)緩慢，Zeta電位絕對(duì)值變化較小，穩(wěn)定