1.2.2微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)高壓蒸汽滅菌液體培養(yǎng)基微生物的基本培養(yǎng)技術(shù)1、實驗室培養(yǎng)微生物條件1）提供微生物生長繁殖所需營養(yǎng)和環(huán)境條件—培養(yǎng)基2）確保其它微生物無法混入—無菌技術(shù)高壓蒸汽滅菌溫故知新：2、培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成:碳源、氮源、水、無機鹽等1）碳源：無機碳源：CO2、CO32-、HCO3-有機碳源：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物2）氮源：無機氮源：NH4＋、NO3-、NH3等有機氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等注：含C、H、O、N的有機物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源3）無機鹽：Ca、K、Mg為大量元素Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素類型適用范圍操作方法消毒滅菌較為溫和理化方法，殺死部分微生物（不包括芽孢、孢子）強烈的理化方法，殺死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法日常生活100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高溫的液體62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min化學(xué)藥劑生物活體、水源等擦拭等,如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源紫外線紫外線照射30min灼燒滅菌接種的金屬工具、接種時用的試管口或瓶口等直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒干熱滅菌耐高溫、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金屬用具等物品放入干熱滅菌箱,160～170℃加熱2～3h濕熱滅菌培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿等,生產(chǎn)和實驗室常用高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi),100kPa,溫度121℃,15～30min無菌的方法：接種室、接種箱，超凈工作臺課題背景自然界中微生物數(shù)量繁多，種類龐雜，要想從中分離出需要的特定微生物并不容易，尤其當(dāng)要分離的微生物在混合菌群中不是優(yōu)勢種群時，更難實現(xiàn)。稀釋涂布平板法呈現(xiàn)的雜菌群那么我們又如何達(dá)成這一目標(biāo)呢？科學(xué)家們應(yīng)用選擇性培養(yǎng)基解決了這一難題。1、科學(xué)實例：尋找耐高溫的DNA聚合酶啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。篩選原因：因為熱泉的高溫條件淘汰了絕大多數(shù)微生物，使耐熱的Taq細(xì)菌保留下來。PCR是一種在體外DNA復(fù)制的技術(shù)，此項技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。1966年，布魯克在美國黃石國家公園的一個熱泉中發(fā)現(xiàn)了耐熱的Taq細(xì)菌，并分離到耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）。耐高溫的酶耐高溫生物體高溫環(huán)境（熱泉、火山口）尋找尋找（一）選擇培養(yǎng)基根據(jù)微生物對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。2.篩選原則耐寒微生物耐熱微生物石油分解菌結(jié)果：培養(yǎng)一定時間后，目的菌數(shù)量上升，再通過稀釋涂布平板等方法對它進(jìn)行純化培養(yǎng)。2、實驗室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，叫做選擇培養(yǎng)基。（一）選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加氨芐青霉素沒有氨芐青霉素抗性的細(xì)菌被淘汰怎樣選擇出抗氨芐青霉素能力的細(xì)菌?舉例1培養(yǎng)基+氨芐青霉素培養(yǎng)基加入青霉素：不加氮源：不加含碳有機物：——分離出酵母菌、霉菌等真菌(青霉素能殺死細(xì)菌、放線菌)——分離出固氮菌

——分離出自養(yǎng)型微生物補充資料1-幾種選擇培養(yǎng)基舉例那么如果讓你分離土壤中分解尿素的細(xì)菌，你應(yīng)該怎么設(shè)計呢？加高濃度食鹽

——金黃色葡萄球菌選擇培養(yǎng)基特殊成分加入某種化學(xué)物質(zhì)目的抑制其他微生物生長，促進(jìn)目的微生物的生長用途舉例鑒別培養(yǎng)基加入某種指示劑發(fā)生特定顏色反應(yīng)分離出特定微生物鑒別不同的微生物用尿素作唯一氮源的培養(yǎng)基來篩選尿素分解菌伊紅—美藍(lán)培養(yǎng)基鑒定大腸桿菌選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基總結(jié)思考-討論選擇培養(yǎng)基配方的設(shè)計尿素的立體結(jié)構(gòu)

尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種重要的氮肥。尿素被土壤中某些細(xì)菌分解成NH3,再被轉(zhuǎn)化為NO3-、NH4+等被植物吸收。這些細(xì)菌之所以能分解尿素，是因為能合成脲酶，來催化尿素分解。討論：1、你如何設(shè)計培養(yǎng)基配方，將土壤稀釋液中能分解尿素的細(xì)菌分離出來？2、該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點和不同點？培養(yǎng)基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g瓊脂20.0g蒸餾水定容到1000mlKH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g瓊脂15.0g蒸餾水定容到1000ml配方一：培養(yǎng)細(xì)菌配方二：培養(yǎng)可以分解尿素的細(xì)菌

補充資料2-普通培養(yǎng)基與選擇培養(yǎng)基的比較1、從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？從用途上屬于哪類培養(yǎng)基？固體培養(yǎng)基配方二是以尿素作唯一氮源的選擇培養(yǎng)基2、KH2PO4和Na2HPO4的作用是：①提供無機鹽；②調(diào)節(jié)pH。（二）微生物的選擇培養(yǎng)如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的細(xì)菌，還需對土壤菌液進(jìn)行稀釋及科學(xué)的微生物數(shù)量測定方法---稀釋涂布平板法。2、實驗的具體操作：

2）土壤取樣從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌1）制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基1、稀釋涂布平板法是將菌液進(jìn)行一系列梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。①鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中②將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成稀釋10倍的土壤菌液。1mL1ⅹ1090mL無菌水1ⅹ1071ⅹ1051ⅹ1061ⅹ1031ⅹ1021ⅹ1041mL1mL1mL1mL6支試管，分別加入9ml無菌水1mL③取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。3.稀釋涂布平板法的操作過程菌液配置⑥取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進(jìn)行涂布。⑦用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使涂布均勻。待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，培養(yǎng)菌液涂布培養(yǎng)基浸灼滴涂各梯度分別涂布3個平板1個不涂布作空白對照放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)1～2d4培養(yǎng)與觀察稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍空白對照恒溫培養(yǎng)箱3.平板劃線法和稀釋涂布平板法的比較(1)單菌落的獲得①利用平板劃線法接種時,單菌落從后劃線的區(qū)域挑取;②利用稀釋涂布平板法接種時,只有合適的稀釋度才能得到單菌落。(2)兩種接種方法的應(yīng)用兩種方法都能將微生物分散到固體培養(yǎng)基表面,以獲得單菌落,達(dá)到分離純化微生物的目的;稀釋涂布平板法還能對微生物進(jìn)行計數(shù),而平板劃線法不能用于微生物的計數(shù)。（三）微生物的數(shù)量測定稀釋涂布平板法除用于分離微生物外，也常用于統(tǒng)計樣品中活菌數(shù)。在稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基上表面生長的一個單菌落來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，可推測出樣品中大約有多少活菌。1、原理：2、計數(shù)原則：一般選擇菌落數(shù)在30—300的平板上進(jìn)行計數(shù)。1.間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）

—稀釋涂布平板法注意事項①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30—300的平板上進(jìn)行計數(shù)。②為增強實驗說服力與準(zhǔn)確性，以減少偶然因素對實驗結(jié)果的影響。設(shè)計實驗時，需要涂布至少三個平板作為重復(fù)組。③統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。④統(tǒng)計的結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)；⑤恰當(dāng)?shù)南♂尪?、涂布是否均勻是成功統(tǒng)計菌落數(shù)目的關(guān)鍵。⑥分析實驗結(jié)果時，要考慮重復(fù)組結(jié)果是否接近，如果相差太大，意味著操作有誤，需重新實驗。因為當(dāng)兩個或多個細(xì)胞連在一起時，繁殖后形成的還是一個菌落提示：若平板上菌落數(shù)過多，說明稀釋度過低，菌體的密度大，就會出現(xiàn)更多的兩個或兩個以上的菌體形成的菌落，結(jié)果不準(zhǔn)確，且計數(shù)較困難。若平板上菌落數(shù)過少，菌落形成的偶然性大，結(jié)果也不準(zhǔn)確。實例分析1：3、計算：每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×MC代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106

的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每g樣品中的菌落數(shù)是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1mL)()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B

兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。1、甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230。

2、乙同學(xué)在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為21、

212、256，該同學(xué)以這三個平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計結(jié)果。

你認(rèn)為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題，錯在哪？

甲：沒有重復(fù)實驗（至少涂布3個平板）

乙：其中一個平板計數(shù)結(jié)果與其他兩個相差太大，操作過程可能出現(xiàn)了錯誤。實例分析2：這種方法是利用特定細(xì)菌計數(shù)板或血細(xì)胞計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)＝每小格平均細(xì)菌數(shù)×400×10000×稀釋倍數(shù)缺點：不能區(qū)分死菌與活菌（數(shù)值偏大）不適于對運動細(xì)菌的計數(shù)需要相對高的細(xì)菌濃度；個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；2.顯微鏡直接計數(shù)—計數(shù)板計數(shù)法項目直接計數(shù)法間接計數(shù)法(稀釋涂布平板法)原理利用特定的細(xì)菌計數(shù)板或血細(xì)胞計數(shù)板,在顯微鏡下觀察計數(shù),計算一定體積的樣品中微生物的數(shù)量當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時,培養(yǎng)基表面生長的一個單菌落,來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù),就能推測出樣品中大約含有多少活菌主要用具顯微鏡、細(xì)菌計數(shù)板或血細(xì)胞計數(shù)板培養(yǎng)基計數(shù)數(shù)據(jù)菌體本身培養(yǎng)基上菌落數(shù)優(yōu)點計數(shù)方便、操作簡單計數(shù)的是活菌缺點死菌、活菌都計算在內(nèi)操作較復(fù)雜,有一定誤差計算公式每毫升原液含菌數(shù)＝每小格平均菌體數(shù)×400×10000×稀釋倍數(shù)每毫升原液含菌數(shù)＝培養(yǎng)基上平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)÷涂布液體積歸納提升:統(tǒng)計菌落數(shù)目的方法微生物生長量的測定有計數(shù)法、重量法、生理指標(biāo)法等方法,但是一般使用計數(shù)法,計數(shù)法可分為直接計數(shù)法和間接計數(shù)法。二者的比較如下表所示。思考-討論土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計數(shù)尿素的立體結(jié)構(gòu)1)課題目的1、從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌

2、統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌2)研究思路土壤取樣制備培養(yǎng)基樣品稀釋與取樣涂布微生物的培養(yǎng)與觀察1、土壤取樣1）取樣的位置：

細(xì)菌適宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長，絕大多數(shù)的細(xì)菌分布距地表3～8cm的土壤層。2）取樣要求：先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。

取土樣時用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。2、制備培養(yǎng)基準(zhǔn)備選擇培養(yǎng)基（以尿素為唯一氮源）和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。每個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基，1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基以及各一個空白對照。

在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目，應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基。用以分離并計數(shù)能分解尿素的細(xì)菌用以判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用用以驗證培養(yǎng)基中是否含有雜菌3、樣品的稀釋測土壤中細(xì)菌數(shù)量，一般選用1x104

、1x105

和1x106倍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)。由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個比較寬的范圍，將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養(yǎng)，以保證能從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計數(shù)

不同微生物在土壤中含量不同，分離不同的微生物采用不同的稀釋度，以保證獲得菌落數(shù)在30～300之間，適于計數(shù)的平板。測細(xì)菌數(shù)：一般用104、105、106稀釋液測放線菌：一般用103、104、105稀釋液測真菌數(shù)：一般用102、103、104稀釋液4、微生物的培養(yǎng)與觀察②在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。③一般來說，在相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等。①培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。

細(xì)菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d

放線菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d

霉菌：25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。

3)操作提示2）無菌操作3）做好標(biāo)記

本實驗使用的平板和試管比較多，為避免混淆，使用前要做好標(biāo)記4）制定計劃對于耗時較長的生物實驗，要事先規(guī)劃時間，以便提高工作效率，在操作時更加有條不紊1）不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。a、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。b、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入

錐形瓶中，塞好棉塞。c、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。4)結(jié)果分析與評價（一）培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落

空白對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。（三）在以尿素作為唯一氮源的培養(yǎng)基中分離出的微生物都是能分解尿素的嗎？

（二）樣品的稀釋操作是否成功？如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30～300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計數(shù)。不一定。因為有些微生物可以利用其他微生物的代謝產(chǎn)物進(jìn)行生長繁殖。CO(NH2)2+H2O脲酶CO2+2NH3補充拓展：脲酶陰性脲酶陽性土壤中分解尿素的細(xì)菌的鑒定在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果pH升高，指示劑將變紅，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。（四）在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的實驗時，A同學(xué)從對應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落，分析其原因。原因：（1）土樣不同（2）培養(yǎng)基污染或操作失誤小結(jié)：通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實驗。如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。特別提醒

實驗設(shè)計原則(1)設(shè)立重復(fù)組:統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)時,要至少涂布3個平板作重復(fù)組,以增強實驗結(jié)果的說服力與準(zhǔn)確性。(2)設(shè)立兩種對照組:①判斷選擇培養(yǎng)基中是否有雜菌污染,需同時將未接種的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);②判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用,需同時設(shè)立牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進(jìn)行接種后培養(yǎng),觀察兩種培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目,進(jìn)行對比得出結(jié)論。探究點一探究點二2.土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)結(jié)果分析與評價

內(nèi)

容現(xiàn)

象結(jié)

論有無污染的判斷對照的培養(yǎng)基中無菌落生長未被雜菌污染培養(yǎng)物中菌落數(shù)偏高培養(yǎng)物中混入其他氮源菌落形態(tài)多樣,菌落數(shù)偏高被雜菌污染選擇培養(yǎng)基的篩選作用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目大于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目選擇培養(yǎng)基具篩選作用樣品的稀釋操作得到2個或2個以上菌落數(shù)目為30~300的平板操作成功重復(fù)組的結(jié)果若選取同一種土樣,統(tǒng)計結(jié)果應(yīng)接近課堂小結(jié)微生物的數(shù)量測定選擇培養(yǎng)基的作用微生物選擇培養(yǎng)獲取純培養(yǎng)物的方法-稀釋涂布平板法微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)選擇培養(yǎng)基微生物的選擇培養(yǎng)科學(xué)實例篩選原則選擇培養(yǎng)基的概念及舉例稀釋涂布平板法的操作過程間接計數(shù)法—稀釋涂布平板法直接計數(shù)—計數(shù)板計數(shù)法土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)培養(yǎng)基的制備實驗設(shè)計（1）土壤取樣（2）樣品的稀釋（3）稀釋涂布平板法接種（4）微生物的培養(yǎng)與觀察實驗設(shè)計不同菌落的顏色與形狀3.用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用,需要設(shè)置的對照是(

)A.未接種的選擇培養(yǎng)基B.未接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基C.相同條件下接種了的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基D.相同條件下接種了的選擇培養(yǎng)基答案C解析

將菌液稀釋相同的倍數(shù)并接種,相同培養(yǎng)條件下牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目,因此,應(yīng)選擇接種了的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對照。對照實驗遵循單一變量原則,所以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基要與選擇培養(yǎng)基在相同條件下接種、培養(yǎng)。2.分離土