第2章

細胞工程2第2節(jié)動物細胞工程一

動物細胞培養(yǎng)學(xué)習目標理解動物細胞培養(yǎng)的條件并構(gòu)建動物細胞培養(yǎng)的流程圖（科學(xué)探究）0102說明干細胞的種類和應(yīng)用（科學(xué)思維）首例胚胎移植成功首創(chuàng)動物組織體外培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)哺乳動物精子獲能現(xiàn)象體細胞核移植成功試管家兔誕生創(chuàng)立單克隆抗體技術(shù)胚胎分割移植成功分離和培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞克隆羊多莉誕生獲得誘導(dǎo)多能干細胞單細胞基因組測序進行遺傳病篩查的試管嬰兒誕生我國科學(xué)家首次培育了體細胞克隆猴1890年1907年1951年1958年1959年1975年1978年1981年1996年2006年2014年2017年動物細胞工程的發(fā)展歷程從社會中來在治療大面積燒傷時，通常采用的方法是取燒傷病人的健康皮膚進行自體移植。但對這樣的病人來說，自體健康皮膚非常有限，使用他人皮膚來源又不足，而且會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。那么，怎樣才能獲得大量的自體健康皮膚？能不能用自體皮膚的單個細胞培養(yǎng)出可供移植的皮膚？異體皮膚移植異體皮膚移植通過細胞培養(yǎng)構(gòu)建的人造皮膚可以從病人身上取少量、健康的皮膚在體外進行培養(yǎng)、擴增。目前，科學(xué)家還在研究對皮膚干細胞進行培養(yǎng)，已獲得適合在臨床上使用的人造皮膚課前導(dǎo)入植物細胞工程植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物體細胞雜交技術(shù)動物細胞工程動物細胞培養(yǎng)動物細胞融合動物細胞核移植基礎(chǔ)一、動物細胞培養(yǎng)的條件1、概念：從動物體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個細胞，然后在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下，讓這些細胞生長和增殖的技術(shù)。2、目的：獲得細胞或細胞產(chǎn)物；不能獲得完整動物個體。3、原理：細胞增殖（有絲分裂）那么，動物細胞的培養(yǎng)需要哪些條件呢？動物體組織單個細胞細胞生長和增殖取出分散適宜條件一、動物細胞培養(yǎng)的條件8糖類、氨基酸、無機鹽、維生素…無菌、無毒的環(huán)境適宜的溫度、pH和滲透壓適宜的氣體環(huán)境體內(nèi)：充足的營養(yǎng)、穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境將細胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)按種類和所需量嚴格配制而成的培養(yǎng)基含人類未知、細胞生長增殖所必需的物質(zhì)，滿足細胞對未知營養(yǎng)成分的需求。培養(yǎng)基的構(gòu)成：合成培養(yǎng)基+血清等天然成分一般用液體培養(yǎng)基，也稱為培養(yǎng)液一、動物細胞培養(yǎng)的條件9糖類、氨基酸、無機鹽、維生素…無菌、無毒的環(huán)境適宜的溫度、pH和滲透壓適宜的氣體環(huán)境①培養(yǎng)液、培養(yǎng)用具：滅菌處理；②無菌操作；③適量添加抗生素定期更換培養(yǎng)液，以便清除代謝物。①適宜的溫度：哺乳動物細胞培養(yǎng)的溫度多以_______________為宜；②適宜的pH：多數(shù)動物細胞生存的適宜pH為______________；

③適宜的滲透壓：________________________________維持細胞正常的形態(tài)和功能。36.5±0.5℃7.2-7.4選擇抗生素要注意種類和劑量,以保證抗生素對培養(yǎng)的細胞無害。一、動物細胞培養(yǎng)的條件10糖類、氨基酸、無機鹽、維生素…無菌、無毒的環(huán)境適宜的溫度、pH和滲透壓適宜的氣體環(huán)境維持培養(yǎng)液的pH95%空氣+5%CO2的CO2培養(yǎng)箱O2：細胞代謝所必需CO2培養(yǎng)箱松蓋培養(yǎng)瓶培養(yǎng)皿注意說明動物和人體的免疫系統(tǒng)可抵御各種微生物對機體的入侵，因此體內(nèi)細胞生活的內(nèi)環(huán)境幾乎是無菌、無毒的。而離體培養(yǎng)的細胞對微生物和有毒物質(zhì)的防御能力極低，所以其培養(yǎng)環(huán)境中一旦有細菌、真菌或病毒等微生物的污染，培養(yǎng)的細胞就會死亡。二、動物細胞培養(yǎng)的過程懸浮培養(yǎng)的細胞:直接用離心法收集貼壁細胞:用胰蛋白酶處理分散成單個細胞，用離心法收集取動物組織機械法化學(xué)法：胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理分散成單個細胞解決懸浮生長貼壁生長(大多數(shù)）細胞密度過大、有害代謝物積累、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等接觸抑制傳代培養(yǎng)制成細胞懸液原代培養(yǎng)分瓶培養(yǎng)加培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞分裂受阻②制成細胞懸液，分瓶培養(yǎng)①收集細胞二、動物細胞培養(yǎng)的過程“細胞增殖到互相接觸的時候，糖蛋白識別了這種信息，就會使細胞停止繼續(xù)繁殖，出現(xiàn)接觸抑制的現(xiàn)象”試結(jié)合上述解釋，舉例說明哪種細胞無接觸抑制現(xiàn)象形成一層細胞可形成多層細胞癌細胞細胞膜表面糖蛋白減少，條件適宜可以無限增殖下去癌細胞細胞膜表面糖蛋白減少，黏著性降低，適宜條件可無限增殖二、動物細胞培養(yǎng)的過程幼嫩的，分化程度低的細胞分裂能力強，更易培養(yǎng)。結(jié)合上圖思考思考1.幼嫩動物的細胞與老齡動物的細胞比較，分化程度低的細胞與分化程度高的細胞比較，那些細胞更易于培養(yǎng)？為什么？思考2.常用胰蛋白酶分散細胞，這說明細胞間的物質(zhì)主要是什么成分？用胃蛋白酶行嗎？主要是蛋白質(zhì)胃蛋白酶的適宜pH約為2，當pH大于6時，就失活，多數(shù)動物細胞培養(yǎng)的適宜pH為7.2～7.4，胃蛋白酶在此環(huán)境中無活性，所以不行。二、動物細胞培養(yǎng)的過程結(jié)合上圖思考思考3.為什么要將動物組織分散成單個細胞培養(yǎng)？①細胞和細胞靠在一起彼此限制了生長和繁殖。②使細胞與培養(yǎng)液充分接觸，一方面保證細胞所需氧氣和營養(yǎng)的供應(yīng)，另一方面保證細胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的及時排出。③使得在細胞水平操作的其他技術(shù)得以實現(xiàn)。思考4.實驗過程中，胰蛋白酶處理時間過長，會出現(xiàn)什么結(jié)果？細胞膜的成分中也有蛋白質(zhì)，胰蛋白酶不僅能分解細胞間的蛋白質(zhì)，長時間作用還會分解膜蛋白，對細胞造成損傷。因此，胰蛋白酶處理的時間不能太長。二、動物細胞培養(yǎng)的過程思路：區(qū)分兩種“培養(yǎng)”的關(guān)鍵是看用胰蛋白酶處理的對象和是否分瓶。分瓶前，第一次用胰蛋白酶對動物組織進行處理，使其分散成單個細胞后進行培養(yǎng)，為原代培養(yǎng)。第二次用胰蛋白酶使其從瓶壁上脫離下來，然后分瓶后繼續(xù)培養(yǎng)，為傳代培養(yǎng)。第二次第一次思考5.如何區(qū)分原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)？傳代培養(yǎng)不會一直進行，傳代到50代后，有部分細胞遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，具有癌變特點注意：二、動物細胞培養(yǎng)的過程思考6.動物細胞培養(yǎng)與植物組織培養(yǎng)有什么相同和不同之處？拓展延伸動物細胞培養(yǎng)和植物組織培養(yǎng)的比較植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)原理培養(yǎng)前處理取材培養(yǎng)基的物理性質(zhì)培養(yǎng)基的成分特有成分植物細胞的全能性細胞增殖需離體用機械法或胰蛋白酶、膠原蛋白酶將組織細胞分散開離體植物器官、組織、細胞動物胚胎或幼齡動物的組織、器官固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基(又稱培養(yǎng)液)有機營養(yǎng)成分無機營養(yǎng)成分植物激素糖類、氨基酸、無機鹽、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)及一些天然成分如血清植物激素血清拓展延伸動物細胞培養(yǎng)和植物組織培養(yǎng)的比較特殊環(huán)境條件結(jié)果是否體現(xiàn)細胞的全能性過程相同點再分化需光氣體環(huán)境一般獲得新的植株獲得大量細胞是否外植體脫分化愈傷組織再分化根、芽幼苗完整植株移栽成活取動物組織制成細胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液進行原代培養(yǎng)分瓶進行傳代培養(yǎng)①培養(yǎng)過程中細胞都進行有絲分裂，不涉及減數(shù)分裂；②均需無菌操作，需要適宜的溫度、pH等條件。三、干細胞培養(yǎng)及其應(yīng)用1.干細胞：干細胞培養(yǎng)60天后的迷你器官群干細胞治療老年癡呆動物和人體內(nèi)仍保留著少數(shù)具有分裂和分化能力的細胞。三、干細胞培養(yǎng)及其應(yīng)用1.干細胞：存在：早期胚胎、骨髓和臍帶血等多種組織和器官中種類：胚胎干細胞（ES細胞）、成體干細胞動物和人體內(nèi)仍保留著少數(shù)具有分裂和分化能力的細胞。三、干細胞培養(yǎng)及其應(yīng)用①胚胎干細胞（embryonicstemcel，簡稱ES細胞）a.分布：存在于早期胚胎中b.特點：具有分化為成年動物體內(nèi)的任何一種類型的細胞，并進一步形成機體的所有組織和器官甚至個體的潛能。c.實例：ES細胞在體外分化成心肌細胞、神經(jīng)元細胞和造血干細胞等電鏡下的胚胎干細胞（照片經(jīng)后期人工上色處理，放大約1500倍）d.局限性：必須從胚胎中獲取，涉及倫理問題；因而限制了在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。三、干細胞培養(yǎng)及其應(yīng)用②成體干細胞a.分布：存在于成體組織或器官內(nèi)中b.特點：骨髓中的造血干細胞、神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)干細胞、睪丸中的精原干細胞等；c.實例：一般認為，成體干細胞具有組織特異性，只能分化成特定的細胞或組織，不具有發(fā)育成完整個體的能力d.應(yīng)用實例：造血干細胞→神經(jīng)干細胞→治療白血病及一些惡性腫瘤放療或化療后引起的造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)功能障礙等疾病治療神經(jīng)組織損傷和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病（如帕金森病、阿爾茨海默病等）治療細胞損傷造成的疾病三、干細胞培養(yǎng)及其應(yīng)用③誘導(dǎo)多能干細胞a.概念：通過體外誘導(dǎo)小鼠成纖維細胞得到的類似胚胎干細胞的一種細胞b.制備方法：①將特定基因或特定蛋白導(dǎo)入細胞（成纖維細胞、已分化的T細胞、B細胞）；②用小分子化合物誘導(dǎo)形成c.優(yōu)點：①誘導(dǎo)過程無須破壞胚胎；②iPS細胞可以來源于病人自身的體細胞，將它移植回病人體內(nèi)后，理論上可以避免免疫排斥反應(yīng)。d.應(yīng)用：可治療鐮狀細胞貧血癥；在治療阿爾茲海默病、心血管疾病等領(lǐng)域的研究也取得了新進展移植取成纖維細胞等iPS細胞轉(zhuǎn)入相關(guān)因子細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化分化胰島細胞神經(jīng)元血細胞腸上皮細胞心肌細胞肝細胞病人iPS細胞用于治療人類疾病示意圖三、干細胞培養(yǎng)及其應(yīng)用iPS細胞的應(yīng)用前景：體外誘導(dǎo)小鼠成纖維細胞誘導(dǎo)多能干細胞（iPS細胞）多種體細胞臨床治療人類疾病如：白血病、帕金森病、阿爾茲海默病等定向誘導(dǎo)分化課堂小測1.如圖為動物細胞培養(yǎng)的基本過程示意圖。下列相關(guān)敘述錯誤的是()A.容器甲中放入的一般是健康幼齡動物的組織，原因是其細胞分裂能力強B.圖中丙和丁分別表示的是原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，其培養(yǎng)原理相同C.制備乙可用胰蛋白酶處理，且處理時間越長越好D.動物細胞培養(yǎng)需要提供O2和CO2等氣體環(huán)境，CO2的主要作用是維持培養(yǎng)液的pH解析：幼齡動物的細胞增殖能力強，有絲分裂旺盛，易于培養(yǎng)，A正確；圖中丙和丁分別表示的是原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，其培養(yǎng)原理都是細胞增殖，B正確；制備乙可用胰蛋白酶處理，但是處理時間要適當，不是越長越好，C錯誤；動物細胞培養(yǎng)需要提供95%的空氣和5%的CO2等氣體環(huán)境，其中氧氣的作用是動物細胞有氧呼吸需要消耗的，而CO2的主要作用是維持培養(yǎng)液的pH，D正確。C課堂小測2.實驗小鼠皮膚細胞進行貼壁生長培養(yǎng)的基本過程如圖所示。下列敘述不正確的是()實驗小鼠

皮膚組織

皮膚細胞

原代培養(yǎng)

傳代培養(yǎng)A.甲過程需要在無菌條件下進行B.乙過程需要將獲得的皮膚組織分散成單個細胞C.原代培養(yǎng)時可能出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象D.丁過程可以直接離心來進行傳代培養(yǎng)D解析：離體動物細胞培養(yǎng)需要無菌無毒的環(huán)境，需要對實驗小鼠進行消毒處理，A正確；乙表示用胰蛋白酶處理皮膚組織，使其分散成單個皮膚細胞，獲得單細胞懸液后再進行細胞培養(yǎng)，B正確；丙表示原代培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)貼壁生長和接觸抑制現(xiàn)象，此后用胰蛋白酶處理后獲得單細胞懸液，再進行傳代培養(yǎng)，C正確；丁是傳代培養(yǎng)過程，小鼠皮膚細胞進行貼壁生長，因而不能直接離心進行傳代培養(yǎng)，D錯誤。課堂小測3.科學(xué)家通過體外誘導(dǎo)小鼠成纖維細胞獲得誘導(dǎo)多能干細胞（iPS細胞），iPS細胞能分化為胰島B細胞等多種組織細胞，可用于糖尿病的治療等。下列有關(guān)敘述正確的是()A.iPS細胞存在于早期胚胎、外周血和臍帶血中B.獲得iPS細胞的過程中，細胞的遺傳物質(zhì)一