大氣壓冷等離子體射流誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制與應(yīng)用研究一、引言1.1研究背景乳腺癌作為全球女性健康的重大威脅，其發(fā)病率在各類癌癥中持續(xù)攀升，已然成為女性群體中最為常見的惡性腫瘤。世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，2020年乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬，首次超越肺癌，躍居全球癌癥發(fā)病首位，而這一數(shù)字還在隨著人口增長(zhǎng)和老齡化趨勢(shì)不斷上升，預(yù)計(jì)到2030年，新確診病例將達(dá)到270萬，死亡人數(shù)亦會(huì)大幅增加。在中國(guó)，乳腺癌同樣呈現(xiàn)出高發(fā)病率的態(tài)勢(shì)，尤其在城市地區(qū)，已位居女性惡性腫瘤發(fā)病率的前列，部分大城市更是居于首位，且發(fā)病年齡相較于西方國(guó)家有年輕化趨勢(shì)，發(fā)病年齡段集中在50歲左右，同時(shí)，我國(guó)一半以上女性為致密型乳腺，這進(jìn)一步增加了乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)以及早期發(fā)現(xiàn)的難度。當(dāng)前，針對(duì)乳腺癌的治療手段主要包括手術(shù)切除、化學(xué)治療、放射治療、內(nèi)分泌治療以及靶向治療等。手術(shù)切除作為主要的治療方式之一，對(duì)于早期乳腺癌患者能夠有效去除腫瘤組織，但存在切除不完全導(dǎo)致復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，且手術(shù)創(chuàng)傷會(huì)對(duì)患者身體和心理造成較大負(fù)擔(dān)?；焺t是通過使用化學(xué)藥物來殺死癌細(xì)胞，但化療藥物缺乏特異性，在攻擊癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，如脫發(fā)、惡心、嘔吐、免疫力下降等，極大地影響患者的生活質(zhì)量。放療利用高能射線照射腫瘤部位，雖然能夠局部控制腫瘤生長(zhǎng)，但也可能引發(fā)周圍正常組織的損傷，帶來放射性炎癥、皮膚損傷等并發(fā)癥。內(nèi)分泌治療和靶向治療雖然具有一定的針對(duì)性，但部分患者會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致治療效果不佳，且這兩種治療方式適用人群有限，并非所有乳腺癌患者都能從中獲益。此外，傳統(tǒng)治療手段還面臨著腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的難題，一旦癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的生存率將顯著降低。面對(duì)傳統(tǒng)乳腺癌治療方法的諸多局限性，尋找更加安全、有效的新型治療手段成為了醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和迫切需求。大氣壓冷等離子體射流作為一種新興的治療技術(shù)，近年來在癌癥治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了獨(dú)特的潛力。等離子體作為物質(zhì)的第四態(tài)，是由自由電子、正負(fù)離子和中性粒子組成的混合物，在電磁場(chǎng)作用下具有優(yōu)異的電導(dǎo)性。其中，大氣壓冷等離子體由于其在大氣壓環(huán)境下即可產(chǎn)生，無需復(fù)雜的真空設(shè)備，且粒子間碰撞頻率高，在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。相關(guān)研究表明，大氣壓冷等離子體射流能夠通過產(chǎn)生活性氧（ROS）和活性氮（RNS）等物質(zhì)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，利用癌細(xì)胞細(xì)胞膜中膽固醇含量低、水通道蛋白水平高的特性，使癌細(xì)胞更易受到攻擊，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。同時(shí)，等離子體產(chǎn)生的紫外線和電磁場(chǎng)還可能直接造成癌細(xì)胞DNA損傷，抑制癌細(xì)胞的增殖。此外，大氣壓冷等離子體射流還具有非侵入性、操作簡(jiǎn)便、可局部精準(zhǔn)治療等特點(diǎn)，有望成為一種補(bǔ)充或替代傳統(tǒng)治療方法的新型乳腺癌治療手段。然而，目前關(guān)于大氣壓冷等離子體射流誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制尚未完全明確，其治療效果也受到多種因素的影響，如等離子體源的類型、細(xì)胞與射流的間距、施加電壓的大小、治療時(shí)間的長(zhǎng)短以及腫瘤細(xì)胞類型等，這些問題都有待進(jìn)一步深入研究。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探究大氣壓冷等離子體射流誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，系統(tǒng)分析其治療效果的影響因素，并評(píng)估其在乳腺癌治療中的應(yīng)用潛力，以期為乳腺癌的治療提供全新的策略和理論依據(jù)。乳腺癌作為女性健康的重大威脅，傳統(tǒng)治療手段的局限性促使我們迫切需要尋找創(chuàng)新的治療方法。大氣壓冷等離子體射流作為一種新興的治療技術(shù)，展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景。通過本研究，明確其誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，能夠?yàn)樵摷夹g(shù)在乳腺癌治療中的應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，有助于進(jìn)一步優(yōu)化治療方案，提高治療效果。從臨床應(yīng)用角度來看，大氣壓冷等離子體射流具有非侵入性、操作簡(jiǎn)便、可局部精準(zhǔn)治療等特點(diǎn)，有望成為傳統(tǒng)治療方法的有效補(bǔ)充或替代方案。深入研究其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制，能夠?yàn)榕R床醫(yī)生提供更多的治療選擇，幫助他們根據(jù)患者的具體情況制定個(gè)性化的治療方案，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。同時(shí)，本研究還有助于推動(dòng)大氣壓冷等離子體射流技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，促進(jìn)相關(guān)醫(yī)療器械的研發(fā)和應(yīng)用，具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，大氣壓冷等離子體射流在癌癥治療領(lǐng)域的研究取得了顯著進(jìn)展，國(guó)內(nèi)外眾多科研團(tuán)隊(duì)圍繞其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制及治療效果展開了廣泛而深入的探索。在國(guó)外，葡萄牙科英布拉大學(xué)的MariaFilomenaBotelho和MafaldaLaranjo團(tuán)隊(duì)在《MedicalGasResearch》上發(fā)表文章，詳細(xì)闡述了大氣壓冷等離子體在乳腺癌治療中的潛力。研究發(fā)現(xiàn)，等離子體能夠產(chǎn)生活性氧（ROS）和活性氮（RNS），這些物質(zhì)可通過細(xì)胞膜進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，誘發(fā)氧化應(yīng)激，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。同時(shí)，等離子體發(fā)出的紫外線和電場(chǎng)能夠?qū)NA造成損傷，進(jìn)一步阻礙細(xì)胞增殖。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，接受該療法的小鼠在抗腫瘤免疫反應(yīng)、抑制復(fù)發(fā)及生存率等方面均有顯著提高。此外，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已批準(zhǔn)首個(gè)大氣壓冷等離子體臨床試驗(yàn)，初步顯示出該技術(shù)在乳腺癌治療中的安全性和選擇性，為降低乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)帶來了新的希望。國(guó)內(nèi)的研究也取得了不少成果。有學(xué)者采用自行研制的大氣壓冷等離子體射流發(fā)生裝置，對(duì)MDA-MB-468、Hs-578T及Hs-578BST細(xì)胞系進(jìn)行處理。研究結(jié)果表明，大氣壓冷等離子體射流可明顯抑制細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，而單純氣流對(duì)細(xì)胞無明顯影響。通過二脒基苯基吲哚（DAPI）染色發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大氣壓冷等離子體射流處理后細(xì)胞出現(xiàn)核固縮及核碎裂，表明細(xì)胞發(fā)生凋亡。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，大氣壓冷等離子體射流作用后細(xì)胞中促凋亡基因Bax的表達(dá)上調(diào)，抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，這揭示了大氣壓冷等離子體射流誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡可能與Bax和Bcl-2基因表達(dá)的改變有關(guān)。盡管國(guó)內(nèi)外在大氣壓冷等離子體射流治療乳腺癌的研究方面已取得一定成果，但仍存在諸多問題亟待解決。一方面，等離子體的具體抗癌機(jī)制尚未完全明確，尤其是活性氧和活性氮等物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的作用靶點(diǎn)及信號(hào)傳導(dǎo)通路，還需要進(jìn)一步深入研究。另一方面，其治療效果受多種因素影響，如等離子體源的類型、細(xì)胞與射流的間距、施加電壓的大小、治療時(shí)間的長(zhǎng)短以及腫瘤細(xì)胞類型等，如何優(yōu)化這些參數(shù)以提高治療效果，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療，仍是當(dāng)前研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。此外，大氣壓冷等離子體射流與現(xiàn)有癌癥療法（如化療、放療和免疫治療）的協(xié)同作用研究還相對(duì)較少，如何將其更好地與傳統(tǒng)治療方法結(jié)合，以降低耐藥性、減少副作用，也是未來研究需要關(guān)注的方向。1.4研究方法和創(chuàng)新點(diǎn)本研究綜合運(yùn)用多種研究方法，深入剖析大氣壓冷等離子體射流對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及相關(guān)機(jī)制。在實(shí)驗(yàn)研究方面，首先，構(gòu)建并優(yōu)化大氣壓冷等離子體射流發(fā)生裝置，確保其能夠穩(wěn)定、高效地產(chǎn)生等離子體射流。通過改變電源參數(shù)、氣體種類和流量等條件，對(duì)裝置的性能進(jìn)行測(cè)試和評(píng)估，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可靠的等離子體源。隨后，選取多種乳腺癌細(xì)胞系，如MDA-MB-231、MCF-7等，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。設(shè)置不同的實(shí)驗(yàn)組，包括不同處理時(shí)間組（如5分鐘、10分鐘、15分鐘等）、不同電壓組（如10kV、15kV、20kV等）以及不同氣體組（如氦氣、氬氣等），以全面探究大氣壓冷等離子體射流對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用效果。采用噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制率，通過計(jì)算細(xì)胞活力來評(píng)估等離子體射流對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，分析不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞凋亡的變化情況。同時(shí)，使用Hoechst33342染色觀察細(xì)胞核形態(tài)的改變，以直觀地判斷細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。在機(jī)制研究方面，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)凋亡相關(guān)基因（如Bax、Bcl-2、Caspase-3等）和信號(hào)通路相關(guān)基因（如MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因）的mRNA表達(dá)水平變化，從基因?qū)用娼沂敬髿鈮豪涞入x子體射流誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測(cè)上述基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證基因表達(dá)變化的結(jié)果，并深入分析信號(hào)傳導(dǎo)通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平，明確信號(hào)通路的激活或抑制狀態(tài)。此外，通過活性氧（ROS）和活性氮（RNS）檢測(cè)試劑盒，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS和RNS的含量變化，探究等離子體射流產(chǎn)生的這些活性物質(zhì)在細(xì)胞凋亡過程中的作用。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。在研究視角上，本研究不僅關(guān)注大氣壓冷等離子體射流對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的直接誘導(dǎo)作用，還深入探究其與細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路的相互作用關(guān)系，從多個(gè)維度揭示其抗癌機(jī)制，為全面理解該技術(shù)的治療效果提供了新的視角。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上，通過系統(tǒng)地改變等離子體射流的參數(shù)（如電壓、處理時(shí)間、氣體種類等）以及選擇多種乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，全面評(píng)估了不同因素對(duì)治療效果的影響，能夠?yàn)榕R床應(yīng)用提供更為精準(zhǔn)的參數(shù)優(yōu)化方案。在技術(shù)應(yīng)用上，首次將多種先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)（如高分辨率流式細(xì)胞術(shù)、單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)等）相結(jié)合，從細(xì)胞、基因和蛋白質(zhì)等多個(gè)層面深入分析大氣壓冷等離子體射流誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為該領(lǐng)域的研究提供了更為全面、深入的技術(shù)手段。同時(shí)，本研究還創(chuàng)新性地探討了大氣壓冷等離子體射流與其他物理治療手段（如超聲波、電穿孔等）的聯(lián)合應(yīng)用效果，為開發(fā)新型的綜合癌癥治療策略提供了新思路。二、大氣壓冷等離子體射流的原理與特性2.1等離子體的基本概念等離子體，作為物質(zhì)的第四態(tài)，與人們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｒ姷墓虘B(tài)、液態(tài)和氣態(tài)有著顯著的區(qū)別。當(dāng)物質(zhì)處于等離子體態(tài)時(shí)，其內(nèi)部的原子或分子會(huì)發(fā)生電離，形成包含大量自由電子、正負(fù)離子以及中性粒子（原子或分子）的混合體系。從微觀層面來看，等離子體中的電子由于獲得了足夠的能量，擺脫了原子核的束縛，成為自由移動(dòng)的帶電粒子；而原子或分子在失去或獲得電子后，轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的離子。在宏觀上，等離子體呈現(xiàn)出電中性，即其中的正電荷總量與負(fù)電荷總量幾乎相等。這是因?yàn)楸M管等離子體中存在大量帶電粒子，但它們的電荷相互抵消，使得整體表現(xiàn)為電中性。例如，在太陽(yáng)內(nèi)部高溫高壓的環(huán)境下，物質(zhì)就以等離子體的形式存在，其中的質(zhì)子（帶正電）和電子（帶負(fù)電）數(shù)量龐大且分布均勻，從而維持了整體的電中性。等離子體的組成決定了其具有一系列獨(dú)特的性質(zhì)。首先，等離子體具有良好的導(dǎo)電性。由于其中存在大量自由移動(dòng)的帶電粒子，當(dāng)外加電場(chǎng)作用于等離子體時(shí)，電子和離子會(huì)在電場(chǎng)力的作用下定向移動(dòng)，形成電流。這種導(dǎo)電性使得等離子體在許多領(lǐng)域都有著重要的應(yīng)用，如等離子體顯示器就是利用等離子體的導(dǎo)電特性來實(shí)現(xiàn)圖像的顯示。其次，等離子體對(duì)電磁場(chǎng)具有高度的敏感性。在電磁場(chǎng)的作用下，等離子體中的帶電粒子會(huì)受到洛倫茲力的作用，其運(yùn)動(dòng)軌跡和分布狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變。這一特性使得等離子體可以被精確地控制和操縱，例如在核聚變研究中，科學(xué)家們利用強(qiáng)大的磁場(chǎng)來約束高溫等離子體，使其能夠穩(wěn)定地進(jìn)行核聚變反應(yīng)。此外，等離子體還具有很強(qiáng)的化學(xué)反應(yīng)活性。其中的活性粒子，如自由電子、離子和激發(fā)態(tài)原子等，具有較高的能量，能夠與其他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，促進(jìn)物質(zhì)的分解、合成和改性。在材料表面處理領(lǐng)域，利用等離子體的化學(xué)反應(yīng)活性，可以在材料表面引入新的官能團(tuán)，改善材料的表面性能，如提高材料的耐磨性、耐腐蝕性和生物相容性等。2.2大氣壓冷等離子體射流的產(chǎn)生原理大氣壓冷等離子體射流通?；诮橘|(zhì)阻擋放電（DielectricBarrierDischarge，DBD）原理產(chǎn)生。在DBD裝置中，主要包含兩個(gè)電極，其中至少一個(gè)電極表面覆蓋有絕緣介質(zhì)層。當(dāng)在兩個(gè)電極之間施加足夠高的交流電壓時(shí)，氣體被擊穿，發(fā)生放電現(xiàn)象。以常見的針-環(huán)電極結(jié)構(gòu)的DBD裝置為例，工作氣體（如氦氣、氬氣等）從針狀電極一端通入，在高壓電場(chǎng)的作用下，氣體中的少量自由電子獲得足夠的能量，與氣體分子發(fā)生碰撞。這些碰撞會(huì)使氣體分子發(fā)生電離，產(chǎn)生更多的電子和離子。隨著放電的持續(xù)進(jìn)行，形成了大量的帶電粒子，這些帶電粒子在電場(chǎng)中加速運(yùn)動(dòng)，又進(jìn)一步與更多的氣體分子碰撞，導(dǎo)致更多的氣體分子電離，形成雪崩式的電離過程。在這個(gè)過程中，絕緣介質(zhì)層起著關(guān)鍵作用。一方面，它能夠限制放電電流，防止放電通道過度集中，避免形成破壞性的弧光放電，從而使放電以均勻、穩(wěn)定的形式進(jìn)行。另一方面，介質(zhì)表面會(huì)積累電荷，這些積累的電荷會(huì)在后續(xù)的放電過程中影響電場(chǎng)分布，促進(jìn)下一次放電的發(fā)生。當(dāng)氣體從針狀電極噴出時(shí)，在高速氣流的帶動(dòng)下，等離子體被吹出，形成等離子體射流。氣流不僅能夠?qū)⒎烹妳^(qū)域內(nèi)產(chǎn)生的活性成分、激發(fā)態(tài)粒子以及荷電粒子導(dǎo)出，使放電區(qū)域與工作區(qū)域分離，還能有效地冷卻等離子體，降低其溫度，從而實(shí)現(xiàn)冷等離子體射流的產(chǎn)生。大氣壓冷等離子體射流的產(chǎn)生還與電源參數(shù)密切相關(guān)。電源的頻率和電壓對(duì)等離子體的產(chǎn)生和特性有著重要影響。一般來說，提高電源頻率可以使放電更加均勻，促進(jìn)等離子體的產(chǎn)生。例如，當(dāng)電源頻率在一定范圍內(nèi)增加時(shí)，單位時(shí)間內(nèi)施加的電場(chǎng)變化次數(shù)增多，電子與氣體分子的碰撞頻率也隨之增加，有利于氣體的電離，從而提高等離子體的密度。而電源電壓的升高則能夠增強(qiáng)電場(chǎng)強(qiáng)度，使電子獲得更大的能量，進(jìn)一步促進(jìn)氣體分子的電離和激發(fā)，增加等離子體中的活性粒子數(shù)量。此外，工作氣體的種類和流量也會(huì)對(duì)等離子體射流的產(chǎn)生和特性產(chǎn)生影響。不同的氣體具有不同的電離能和激發(fā)態(tài)，因此在相同的放電條件下，產(chǎn)生的等離子體特性會(huì)有所差異。例如，氦氣和氬氣由于其電離能較低，容易被電離，常用于產(chǎn)生大氣壓冷等離子體射流。氣體流量的大小則會(huì)影響等離子體射流的長(zhǎng)度和穩(wěn)定性。適當(dāng)增加氣體流量，可以使等離子體射流更加穩(wěn)定，射流長(zhǎng)度也會(huì)有所增加，這是因?yàn)檩^大的氣體流量能夠提供更多的氣體分子參與電離過程，同時(shí)也有助于將產(chǎn)生的等離子體迅速帶出放電區(qū)域，減少等離子體在放電區(qū)域內(nèi)的復(fù)合。2.3大氣壓冷等離子體射流的特性分析大氣壓冷等離子體射流具有豐富多樣的特性，這些特性不僅決定了其在乳腺癌治療中的作用機(jī)制，還對(duì)治療效果產(chǎn)生著重要影響。2.3.1活性物質(zhì)產(chǎn)生活性物質(zhì)的產(chǎn)生是大氣壓冷等離子體射流的關(guān)鍵特性之一。在等離子體射流中，由于氣體放電過程的復(fù)雜性，會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）和活性氮（RNS）等活性物質(zhì)。其中，常見的ROS包括羥基自由基（?OH）、超氧陰離子自由基（O???）、過氧化氫（H?O?）等；常見的RNS有一氧化氮（NO）、二氧化氮（NO?）、過氧亞硝基陰離子（ONOO?）等。這些活性物質(zhì)的產(chǎn)生源于多種物理和化學(xué)反應(yīng)過程。在放電過程中，高能電子與氣體分子發(fā)生碰撞，使氣體分子中的化學(xué)鍵斷裂，從而產(chǎn)生自由基。例如，水分子在高能電子的撞擊下，會(huì)分解產(chǎn)生?OH和氫原子（H?）；氮?dú)夥肿优c氧氣分子在放電條件下相互作用，能夠生成NO等RNS。此外，等離子體中的激發(fā)態(tài)粒子與基態(tài)分子之間的能量轉(zhuǎn)移反應(yīng)，也能促進(jìn)活性物質(zhì)的生成。這些活性物質(zhì)在大氣壓冷等離子體射流誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。?OH作為一種氧化性極強(qiáng)的自由基，具有極高的化學(xué)反應(yīng)活性，能夠與細(xì)胞內(nèi)的多種生物分子發(fā)生反應(yīng)。它可以攻擊細(xì)胞膜上的脂質(zhì)分子，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常生理功能。同時(shí)，?OH還能夠直接作用于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，影響酶的活性和細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路；導(dǎo)致DNA鏈的斷裂、堿基損傷和基因突變等，嚴(yán)重影響細(xì)胞的遺傳信息傳遞和表達(dá)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。H?O?雖然氧化性相對(duì)較弱，但它可以通過擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)的特定環(huán)境下，被細(xì)胞內(nèi)的某些酶或金屬離子催化分解，產(chǎn)生?OH，進(jìn)一步放大氧化應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用。NO作為一種重要的RNS，在低濃度時(shí)，它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能，如參與細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)、血管舒張等過程；然而，在高濃度時(shí)，NO會(huì)與O???反應(yīng)生成ONOO?，ONOO?具有極強(qiáng)的氧化性，能夠迅速氧化細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和凋亡。2.3.2紫外線輻射大氣壓冷等離子體射流在產(chǎn)生過程中還會(huì)伴隨著紫外線輻射。等離子體中的電子在與氣體分子碰撞的過程中，會(huì)獲得能量并躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)這些激發(fā)態(tài)的電子回到基態(tài)時(shí)，會(huì)以光子的形式釋放出能量，其中部分光子的波長(zhǎng)處于紫外線波段。根據(jù)波長(zhǎng)的不同，紫外線可分為UVA（320-400nm）、UVB（280-320nm）和UVC（100-280nm）。在大氣壓冷等離子體射流中，產(chǎn)生的紫外線主要為UVC，其能量較高，能夠直接作用于生物分子。紫外線輻射對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有多方面的影響。一方面，UVC能夠直接破壞癌細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)。它可以使DNA分子中的嘧啶堿基（如胸腺嘧啶和胞嘧啶）發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，形成嘧啶二聚體，如環(huán)丁烷嘧啶二聚體（CPD）和6-4光產(chǎn)物（6-4PP）。這些嘧啶二聚體的形成會(huì)阻礙DNA的正常復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，導(dǎo)致細(xì)胞遺傳信息傳遞錯(cuò)誤，當(dāng)DNA損傷無法被及時(shí)修復(fù)時(shí)，細(xì)胞就會(huì)啟動(dòng)凋亡程序。另一方面，紫外線輻射還可以通過產(chǎn)生活性氧間接損傷癌細(xì)胞。UVC照射細(xì)胞后，會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的氧氣分子吸收光子能量，激發(fā)產(chǎn)生單線態(tài)氧（1O?）等ROS。這些ROS會(huì)進(jìn)一步引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞的生物大分子和細(xì)胞器造成損傷，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，紫外線輻射還可能影響癌細(xì)胞表面的受體和信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。例如，紫外線照射可以使癌細(xì)胞表面的表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）發(fā)生磷酸化修飾改變，影響其下游的信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。2.3.3電磁場(chǎng)效應(yīng)在大氣壓冷等離子體射流中，還存在著一定強(qiáng)度的電磁場(chǎng)。這是由于等離子體中的帶電粒子（電子和離子）在放電過程中會(huì)形成電流，從而產(chǎn)生電磁場(chǎng)。等離子體中的電磁場(chǎng)具有復(fù)雜的時(shí)空分布特性，其強(qiáng)度和頻率會(huì)隨著放電條件的變化而改變。電磁場(chǎng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。首先，電磁場(chǎng)可以直接作用于細(xì)胞的細(xì)胞膜。細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞的重要屏障，它主要由脂質(zhì)雙分子層和膜蛋白組成。在電磁場(chǎng)的作用下，細(xì)胞膜上的脂質(zhì)分子和膜蛋白會(huì)發(fā)生極化和取向變化，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加。這種通透性的改變使得細(xì)胞內(nèi)外的離子濃度和小分子物質(zhì)的分布發(fā)生變化，影響細(xì)胞的正常生理功能。例如，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子（Ca2?）濃度對(duì)于細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)、代謝調(diào)節(jié)等過程具有重要作用。當(dāng)細(xì)胞膜通透性增加時(shí)，細(xì)胞外的Ca2?會(huì)大量涌入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度升高，激活一系列與細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號(hào)通路。其次，電磁場(chǎng)還可以影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。細(xì)胞內(nèi)存在著復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，各種信號(hào)分子通過相互作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡等過程。電磁場(chǎng)的作用可能會(huì)干擾這些信號(hào)分子的活性和相互作用，從而影響細(xì)胞的正常生理功能。研究表明，電磁場(chǎng)可以影響絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，如細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）等。這些蛋白的磷酸化水平在電磁場(chǎng)的作用下會(huì)發(fā)生改變，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖和凋亡。此外，電磁場(chǎng)還可能對(duì)癌細(xì)胞的DNA合成和修復(fù)過程產(chǎn)生影響。DNA的合成和修復(fù)是細(xì)胞維持遺傳穩(wěn)定性的重要過程，電磁場(chǎng)的干擾可能會(huì)導(dǎo)致DNA合成異常和修復(fù)能力下降，增加癌細(xì)胞的基因突變頻率，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。三、乳腺癌細(xì)胞凋亡機(jī)制與現(xiàn)狀3.1乳腺癌的危害與現(xiàn)狀乳腺癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅女性健康的重大疾病，其危害不容小覷。近年來，乳腺癌的發(fā)病率持續(xù)上升，在全球女性癌癥發(fā)病中占據(jù)首位。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的最新數(shù)據(jù)顯示，2020年全球乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬例，死亡病例約68.5萬例，這意味著每天有數(shù)千名女性被診斷為乳腺癌，同時(shí)也有大量患者因乳腺癌失去生命。在我國(guó)，乳腺癌同樣是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，且發(fā)病呈現(xiàn)出年輕化趨勢(shì)。以北京、上海等大城市為例，乳腺癌的發(fā)病率已經(jīng)接近歐美發(fā)達(dá)國(guó)家水平，且每年以3%-4%的速度遞增。乳腺癌不僅對(duì)患者的生命健康造成嚴(yán)重威脅，還給患者的家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。在疾病的治療過程中，患者需要承受手術(shù)、化療、放療等多種治療手段帶來的身心痛苦，同時(shí)還面臨著高昂的醫(yī)療費(fèi)用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)乳腺癌患者的平均治療費(fèi)用高達(dá)數(shù)萬元甚至數(shù)十萬元，這對(duì)于許多家庭來說是一筆難以承受的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。此外，乳腺癌患者在康復(fù)過程中還需要長(zhǎng)期的護(hù)理和支持，這也給家庭和社會(huì)帶來了巨大的壓力。從發(fā)病趨勢(shì)來看，乳腺癌的發(fā)病率在不同地區(qū)和人群中存在差異。在發(fā)達(dá)國(guó)家，由于生活方式、飲食習(xí)慣以及環(huán)境因素等的影響，乳腺癌的發(fā)病率相對(duì)較高。而在發(fā)展中國(guó)家，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活方式的西化，乳腺癌的發(fā)病率也在迅速上升。同時(shí)，年齡也是乳腺癌發(fā)病的一個(gè)重要因素，隨著年齡的增長(zhǎng)，乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)逐漸增加，尤其是在絕經(jīng)后，女性患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯提高。然而，近年來年輕女性患乳腺癌的病例也逐漸增多，這可能與遺傳因素、生活壓力、環(huán)境污染以及不良的生活習(xí)慣等有關(guān)。例如，長(zhǎng)期熬夜、缺乏運(yùn)動(dòng)、高脂肪飲食以及長(zhǎng)期服用避孕藥等，都可能增加年輕女性患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。3.2乳腺癌細(xì)胞凋亡的正常機(jī)制在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞凋亡是一個(gè)高度有序且受到精確調(diào)控的過程，對(duì)于維持機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細(xì)胞的正常發(fā)育和組織的更新起著至關(guān)重要的作用。乳腺癌細(xì)胞凋亡的正常機(jī)制涉及多條復(fù)雜的信號(hào)通路和眾多相關(guān)基因的協(xié)同作用。從信號(hào)通路角度來看，主要包括內(nèi)源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑。內(nèi)源性線粒體途徑在乳腺癌細(xì)胞凋亡中占據(jù)關(guān)鍵地位。線粒體作為細(xì)胞的能量代謝中心，同時(shí)也是細(xì)胞凋亡調(diào)控的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)部應(yīng)激信號(hào)（如DNA損傷、氧化應(yīng)激、生長(zhǎng)因子缺乏等）刺激時(shí)，線粒體外膜的通透性會(huì)發(fā)生改變。這一過程中，Bcl-2蛋白家族發(fā)揮著核心調(diào)節(jié)作用。Bcl-2蛋白家族包括促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等），它們之間的動(dòng)態(tài)平衡決定了線粒體的穩(wěn)定性。當(dāng)促凋亡蛋白被激活并插入線粒體外膜時(shí)，會(huì)形成線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP），導(dǎo)致線粒體膜電位（ΔΨm）下降，細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，并招募和激活半胱天冬酶-9（Caspase-9）。激活的Caspase-9進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)Caspase，如Caspase-3、Caspase-7等，這些效應(yīng)Caspase通過切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、細(xì)胞骨架蛋白等，引發(fā)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。外源性死亡受體途徑則是通過細(xì)胞表面的死亡受體介導(dǎo)的。死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族，常見的死亡受體包括Fas（CD95）、腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）等。當(dāng)這些死亡受體與相應(yīng)的配體結(jié)合后，會(huì)發(fā)生三聚化，從而招募接頭蛋白Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）。FADD通過其死亡結(jié)構(gòu)域與死亡受體的死亡結(jié)構(gòu)域相互作用，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。DISC招募并激活Caspase-8，激活的Caspase-8可以直接激活下游的效應(yīng)Caspase，如Caspase-3、Caspase-7等，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，在某些情況下，Caspase-8還可以通過切割Bid蛋白，將外源性死亡受體途徑與內(nèi)源性線粒體途徑聯(lián)系起來。Bid是Bcl-2蛋白家族的成員，被Caspase-8切割后的tBid可以轉(zhuǎn)移到線粒體，激活Bax和Bak，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素c釋放，從而放大凋亡信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在基因調(diào)控方面，眾多基因參與了乳腺癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程。p53基因作為一種重要的腫瘤抑制基因，在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著核心作用。當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷、氧化應(yīng)激等刺激時(shí)，p53蛋白會(huì)被激活并穩(wěn)定表達(dá)。激活的p53可以通過多種方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。一方面，p53可以上調(diào)促凋亡基因的表達(dá)，如Bax、Puma、Noxa等，同時(shí)下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，從而打破Bcl-2蛋白家族的平衡，促進(jìn)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。另一方面，p53還可以直接作用于線粒體，增加線粒體膜的通透性，促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放。此外，p53還可以通過調(diào)節(jié)死亡受體及其配體的表達(dá)，影響外源性死亡受體途徑的細(xì)胞凋亡。除了p53基因外，其他基因如Bcl-2基因家族、Caspase基因家族等也在乳腺癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Bcl-2基因家族成員之間的相互作用決定了細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的敏感性，而Caspase基因家族則是細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的關(guān)鍵效應(yīng)分子，它們的激活和級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。3.3傳統(tǒng)治療方法對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響傳統(tǒng)的乳腺癌治療方法主要包括手術(shù)、化療和放療，這些方法在乳腺癌的治療中發(fā)揮著重要作用，其對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響各有特點(diǎn)。手術(shù)治療是乳腺癌的重要治療手段之一，尤其是對(duì)于早期乳腺癌患者，手術(shù)切除腫瘤組織能夠直接去除大部分癌細(xì)胞。對(duì)于一些原位癌或早期浸潤(rùn)性乳腺癌，通過手術(shù)切除腫瘤可以實(shí)現(xiàn)臨床治愈。手術(shù)治療在一定程度上能夠影響癌細(xì)胞的凋亡。手術(shù)切除腫瘤后，機(jī)體的免疫系統(tǒng)會(huì)對(duì)殘留的癌細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和攻擊，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。然而，手術(shù)治療也存在一定的局限性。一方面，手術(shù)無法完全清除所有癌細(xì)胞，尤其是對(duì)于一些已經(jīng)發(fā)生微小轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞，手術(shù)難以觸及，這些殘留的癌細(xì)胞可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。另一方面，手術(shù)創(chuàng)傷會(huì)對(duì)患者的身體造成較大負(fù)擔(dān)，可能會(huì)影響患者的免疫功能，進(jìn)而影響癌細(xì)胞的凋亡?；熓峭ㄟ^使用化學(xué)藥物來殺死癌細(xì)胞或抑制其生長(zhǎng)的治療方法。化療藥物種類繁多，作用機(jī)制各不相同，但大多數(shù)化療藥物都可以通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡來發(fā)揮治療作用。例如，常用的化療藥物紫杉醇可以與細(xì)胞內(nèi)的微管蛋白結(jié)合，抑制微管的解聚，從而破壞細(xì)胞的有絲分裂過程，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。蒽環(huán)類藥物如阿霉素則可以嵌入DNA雙鏈之間，抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡?；熾m然能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，但也存在嚴(yán)重的副作用?；熕幬锶狈μ禺愋?，在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等不良反應(yīng)。長(zhǎng)期化療還可能導(dǎo)致癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，使得化療效果逐漸降低。放療是利用高能射線（如X射線、γ射線等）照射腫瘤部位，通過射線的電離輻射作用殺死癌細(xì)胞的治療方法。放療可以直接破壞癌細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。放療還可以通過激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生活性氧（ROS）等物質(zhì)，間接誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。放療對(duì)于局部腫瘤的控制效果較好，能夠有效縮小腫瘤體積。然而，放療也會(huì)對(duì)周圍正常組織造成一定的損傷。由于射線的照射范圍難以精確控制，在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)周圍的正常組織細(xì)胞產(chǎn)生輻射損傷，導(dǎo)致放射性炎癥、皮膚損傷、器官功能受損等并發(fā)癥。此外，放療同樣可能引發(fā)癌細(xì)胞的耐藥問題，使得放療效果受到影響。四、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法4.1實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備本實(shí)驗(yàn)選取了兩種具有代表性的乳腺癌細(xì)胞系，分別為MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞。MDA-MB-231細(xì)胞是一種三陰性乳腺癌細(xì)胞系，具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，缺乏雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）的表達(dá)，對(duì)內(nèi)分泌治療和靶向治療不敏感，臨床治療難度較大。MCF-7細(xì)胞則是一種雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞系，其生長(zhǎng)受雌激素調(diào)控，具有相對(duì)較低的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，但對(duì)內(nèi)分泌治療較為敏感。這兩種細(xì)胞系能夠代表不同分子亞型的乳腺癌，有助于全面研究大氣壓冷等離子體射流對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用效果。實(shí)驗(yàn)中用到的試劑主要包括RPMI-1640培養(yǎng)基（用于MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)）、DMEM培養(yǎng)基（用于MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)），購(gòu)自Gibco公司，這兩種培養(yǎng)基為細(xì)胞提供了生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；胎牛血清（FBS），購(gòu)自BiologicalIndustries公司，含有豐富的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖；青霉素-鏈霉素雙抗溶液，購(gòu)自Solarbio公司，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染；胰蛋白酶-EDTA消化液，購(gòu)自Sigma公司，用于消化貼壁細(xì)胞，以便進(jìn)行細(xì)胞傳代和實(shí)驗(yàn)處理；噻唑藍(lán)（MTT），購(gòu)自Sigma公司，用于檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況；二甲基亞砜（DMSO），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，用于溶解MTT還原產(chǎn)物甲臜，以便進(jìn)行吸光度測(cè)定；Hoechst33342染色液，購(gòu)自Beyotime公司，用于染色細(xì)胞核，觀察細(xì)胞核形態(tài)變化，判斷細(xì)胞是否發(fā)生凋亡；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自BDBiosciences公司，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；RNA提取試劑盒（如TRIzol試劑），購(gòu)自Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞中的總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自TaKaRa公司，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便進(jìn)行后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，購(gòu)自Roche公司，用于檢測(cè)凋亡相關(guān)基因和信號(hào)通路相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平；蛋白質(zhì)提取試劑（如RIPA裂解液），購(gòu)自Beyotime公司，用于提取細(xì)胞中的總蛋白質(zhì)；BCA蛋白定量試劑盒，購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，用于測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；凋亡相關(guān)蛋白和信號(hào)通路相關(guān)蛋白的抗體（如Bax、Bcl-2、Caspase-3、p-ERK、ERK等抗體），購(gòu)自CellSignalingTechnology公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平和磷酸化水平；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，購(gòu)自JacksonImmunoResearch公司，用于增強(qiáng)Westernblot實(shí)驗(yàn)的信號(hào)檢測(cè)；ECL化學(xué)發(fā)光底物，購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，與HRP結(jié)合后能夠產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，用于檢測(cè)Westernblot實(shí)驗(yàn)中的蛋白質(zhì)條帶；活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒（如DCFH-DA探針），購(gòu)自Beyotime公司，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的含量變化；活性氮（RNS）檢測(cè)試劑盒（如DAF-FMDA探針），購(gòu)自Beyotime公司，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)RNS的含量變化。本實(shí)驗(yàn)所使用的主要設(shè)備包括：大氣壓冷等離子體射流發(fā)生裝置，為自行搭建，該裝置主要由高壓電源、電極系統(tǒng)、氣體供應(yīng)系統(tǒng)和控制系統(tǒng)組成。高壓電源采用交流高壓電源，能夠提供穩(wěn)定的高壓輸出，電壓范圍為0-30kV，頻率范圍為1-100kHz，通過調(diào)節(jié)電源參數(shù)可以控制等離子體射流的產(chǎn)生和特性。電極系統(tǒng)采用針-環(huán)電極結(jié)構(gòu)，針狀電極采用不銹鋼材質(zhì)，具有良好的導(dǎo)電性和耐腐蝕性，環(huán)電極采用銅材質(zhì)，表面鍍銀處理，以提高電極的導(dǎo)電性和穩(wěn)定性。氣體供應(yīng)系統(tǒng)包括氣體鋼瓶（如氦氣鋼瓶、氬氣鋼瓶）、氣體流量控制器和氣體管路，氣體流量控制器采用質(zhì)量流量控制器，精度為±1%FS，能夠精確控制氣體流量，氣體管路采用不銹鋼材質(zhì)，確保氣體傳輸?shù)姆€(wěn)定性和安全性?？刂葡到y(tǒng)通過編程實(shí)現(xiàn)對(duì)高壓電源和氣體流量控制器的遠(yuǎn)程控制，能夠方便地設(shè)置和調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)參數(shù)；二氧化碳培養(yǎng)箱，型號(hào)為ThermoScientificHeracellVIOS160i，購(gòu)自賽默飛世爾科技公司，用于提供細(xì)胞培養(yǎng)所需的恒溫、恒濕和5%CO?的環(huán)境，培養(yǎng)箱內(nèi)部采用不銹鋼材質(zhì)，具有良好的耐腐蝕性能，溫度控制精度為±0.1℃，CO?濃度控制精度為±0.1%；超凈工作臺(tái)，型號(hào)為蘇凈安泰SW-CJ-2FD，購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司，為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境，工作臺(tái)采用垂直流設(shè)計(jì)，風(fēng)速均勻穩(wěn)定，能夠有效防止外界污染物進(jìn)入操作區(qū)域；倒置顯微鏡，型號(hào)為NikonEclipseTS100，購(gòu)自尼康公司，用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，顯微鏡配備有高分辨率的物鏡和目鏡，能夠清晰地觀察細(xì)胞的細(xì)節(jié)結(jié)構(gòu)，并帶有拍照功能，方便記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果；酶標(biāo)儀，型號(hào)為Bio-Rad680，購(gòu)自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，用于測(cè)定MTT實(shí)驗(yàn)中的吸光度值，酶標(biāo)儀具有高精度的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，能夠快速、準(zhǔn)確地測(cè)量樣品的吸光度，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，提高實(shí)驗(yàn)效率；流式細(xì)胞儀，型號(hào)為BDFACSCantoII，購(gòu)自BD公司，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布，流式細(xì)胞儀采用先進(jìn)的激光技術(shù)和熒光檢測(cè)系統(tǒng)，能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分析，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)熒光參數(shù)，為實(shí)驗(yàn)提供豐富的數(shù)據(jù)信息；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，型號(hào)為RocheLightCycler480II，購(gòu)自羅氏公司，用于檢測(cè)基因的mRNA表達(dá)水平，該儀器具有高效的熒光檢測(cè)系統(tǒng)和精確的溫度控制功能，能夠?qū)崿F(xiàn)快速、準(zhǔn)確的定量分析，可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè)，提高實(shí)驗(yàn)通量；蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)，包括電泳儀和垂直電泳槽，型號(hào)分別為Bio-RadPowerPacBasic和Bio-RadMini-PROTEANTetraCell，購(gòu)自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，用于蛋白質(zhì)的分離和電泳，電泳儀具有穩(wěn)定的電壓輸出和精確的時(shí)間控制功能，垂直電泳槽采用優(yōu)質(zhì)的聚丙烯材質(zhì)，具有良好的密封性和穩(wěn)定性；轉(zhuǎn)膜儀，型號(hào)為Bio-RadTrans-BlotTurbo，購(gòu)自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，用于將電泳分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜上，轉(zhuǎn)膜儀采用快速、高效的轉(zhuǎn)膜技術(shù)，能夠在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的高效轉(zhuǎn)移；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，型號(hào)為Bio-RadChemiDocMP，購(gòu)自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，用于檢測(cè)Westernblot實(shí)驗(yàn)中的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，該系統(tǒng)具有高靈敏度的成像功能和強(qiáng)大的圖像分析軟件，能夠清晰地顯示蛋白質(zhì)條帶，并對(duì)條帶進(jìn)行定量分析。4.2實(shí)驗(yàn)分組與處理將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞分別接種于96孔板和6孔板中，96孔板每孔接種密度為5×103個(gè)細(xì)胞，接種體積為100μL；6孔板每孔接種密度為2×10?個(gè)細(xì)胞，接種體積為2mL。將接種好細(xì)胞的培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好后，進(jìn)行分組處理。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了以下幾組：空白對(duì)照組，該組細(xì)胞不進(jìn)行任何處理，僅在正常的細(xì)胞培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，其目的是為了提供一個(gè)細(xì)胞正常生長(zhǎng)狀態(tài)的基準(zhǔn)，用于對(duì)比其他處理組細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡情況。單純氣流對(duì)照組，此組細(xì)胞接受與等離子體射流處理組相同條件的氣體吹拂，但不產(chǎn)生等離子體。具體操作是在與等離子體射流處理相同的距離和時(shí)間下，使用氦氣或氬氣等工作氣體以一定的流量（如5L/min）直接吹拂細(xì)胞，以此來排除氣體本身對(duì)細(xì)胞的影響，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)組中觀察到的細(xì)胞變化是由等離子體射流引起，而非氣體的物理作用。不同時(shí)長(zhǎng)大氣壓冷等離子體射流處理組，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，將處理時(shí)間設(shè)置為5分鐘、10分鐘和15分鐘三個(gè)時(shí)間點(diǎn)。對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別使用大氣壓冷等離子體射流發(fā)生裝置對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。在處理過程中，保持等離子體射流的參數(shù)穩(wěn)定，如工作氣體為氦氣，流量為5L/min，施加電壓為15kV，頻率為20kHz。將培養(yǎng)板從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，放置在等離子體射流裝置的樣品臺(tái)上，調(diào)整好射流出口與細(xì)胞培養(yǎng)板之間的距離（如10mm），然后開啟裝置，使等離子體射流均勻地作用于細(xì)胞表面，達(dá)到設(shè)定的處理時(shí)間后，立即將培養(yǎng)板放回二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。不同電壓大氣壓冷等離子體射流處理組，為了探究電壓對(duì)等離子體射流作用效果的影響，設(shè)置施加電壓分別為10kV、15kV和20kV的處理組。在其他條件（如工作氣體、氣體流量、處理時(shí)間、細(xì)胞與射流的距離等）保持不變的情況下，分別使用不同電壓的等離子體射流對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。不同氣體大氣壓冷等離子體射流處理組，選擇氦氣和氬氣兩種常見的工作氣體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在相同的電源參數(shù)（如電壓為15kV，頻率為20kHz）、氣體流量（5L/min）和處理時(shí)間（如10分鐘）條件下，分別使用氦氣和氬氣產(chǎn)生的等離子體射流對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，以研究不同氣體對(duì)等離子體射流誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡效果的影響。在進(jìn)行大氣壓冷等離子體射流處理時(shí)，為確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，需嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件。每次處理前，都要檢查大氣壓冷等離子體射流發(fā)生裝置的工作狀態(tài)，確保其能夠穩(wěn)定地產(chǎn)生等離子體射流。同時(shí)，要保證細(xì)胞培養(yǎng)板在樣品臺(tái)上的位置固定，以確保等離子體射流能夠均勻地作用于細(xì)胞。處理完成后，迅速將細(xì)胞培養(yǎng)板放回二氧化碳培養(yǎng)箱中，維持細(xì)胞生長(zhǎng)的適宜環(huán)境。此外，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中，如MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率等，均對(duì)每個(gè)復(fù)孔的細(xì)胞進(jìn)行獨(dú)立檢測(cè)，并取平均值作為該組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。4.3檢測(cè)指標(biāo)與方法在本研究中，為全面評(píng)估大氣壓冷等離子體射流對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用效果及機(jī)制，選取了一系列關(guān)鍵指標(biāo)，并采用相應(yīng)的先進(jìn)方法進(jìn)行檢測(cè)。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。MTT法是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)的經(jīng)典方法，其原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（formazan），并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞則無此功能。在具體操作時(shí)，在大氣壓冷等離子體射流處理完成后，向96孔板的每孔中加入20μLMTT溶液（濃度為5mg/mL），繼續(xù)將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)。此時(shí)，活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶會(huì)將MTT還原為甲臜。孵育結(jié)束后，小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使甲臜充分溶解。然后，使用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值。根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞活力，計(jì)算公式為：細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白對(duì)照組吸光度值）/（正常對(duì)照組吸光度值-空白對(duì)照組吸光度值）×100%。通過比較不同處理組的細(xì)胞活力，能夠準(zhǔn)確評(píng)估大氣壓冷等離子體射流對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用。利用DAPI染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)。DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）是一種能夠與雙鏈DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料，其與DNA結(jié)合后會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光，且對(duì)細(xì)胞核具有高度特異性。在細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞核會(huì)發(fā)生一系列形態(tài)學(xué)變化，如核固縮、核碎裂等，這些變化可以通過DAPI染色直觀地觀察到。在大氣壓冷等離子體射流處理細(xì)胞后，小心吸去6孔板中的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞3次，以去除殘留的培養(yǎng)基。然后，每孔加入1mL4%多聚甲醛固定液，室溫下固定15分鐘，使細(xì)胞形態(tài)得以固定。固定結(jié)束后，棄去固定液，再用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次。隨后，向每孔加入適量的DAPI染色液（稀釋比例為1:1000），室溫下避光染色5-10分鐘。染色完成后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，以去除多余的染色液。最后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會(huì)呈現(xiàn)出明顯的致密濃染或碎裂的特征。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。流式細(xì)胞術(shù)是一種能夠?qū)渭?xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。在細(xì)胞凋亡檢測(cè)中，常用AnnexinV-FITC/PI雙染法。AnnexinV是一種對(duì)磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞凋亡早期，PS會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外側(cè)，此時(shí)AnnexinV能夠特異性地結(jié)合到PS上；而PI（碘化丙啶）是一種核酸染料，它不能透過正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞的完整細(xì)胞膜，但可以進(jìn)入晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜，與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合，使其發(fā)出紅色熒光。在大氣壓冷等離子體射流處理細(xì)胞后，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化6孔板中的細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液于離心管中。然后，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，再次離心后棄去上清液。向細(xì)胞沉淀中加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，再依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，室溫下避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。通過流式細(xì)胞儀的檢測(cè)，可以將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）四個(gè)群體，從而準(zhǔn)確計(jì)算出細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=（早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù)）/總細(xì)胞數(shù)×100%。通過qPCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因和信號(hào)通路相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。qPCR（實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)能夠在PCR反應(yīng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，從而對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。在本實(shí)驗(yàn)中，首先使用RNA提取試劑盒（如TRIzol試劑）提取不同處理組細(xì)胞中的總RNA。提取過程中，嚴(yán)格按照試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行，確保RNA的純度和完整性。提取得到的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)合格后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后，以cDNA為模板，使用特異性引物和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qPCR反應(yīng)。在反應(yīng)體系中，加入適量的cDNA模板、上下游引物、PCRMasterMix和去離子水，充分混勻后，將反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序通常包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟，具體條件根據(jù)引物和試劑盒的要求進(jìn)行設(shè)置。在擴(kuò)增過程中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，通過比較不同處理組與對(duì)照組的Ct值（循環(huán)閾值，指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），采用2?ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，從而分析大氣壓冷等離子體射流對(duì)凋亡相關(guān)基因（如Bax、Bcl-2、Caspase-3等）和信號(hào)通路相關(guān)基因（如MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因）mRNA表達(dá)水平的影響。采用WB檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白和信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。WB（蛋白質(zhì)免疫印跡）技術(shù)是一種用于檢測(cè)特定蛋白質(zhì)表達(dá)水平的常用方法，其原理是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（如硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜）上，再用特異性抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合，最后通過標(biāo)記的二抗檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)。在大氣壓冷等離子體射流處理細(xì)胞后，用RIPA裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白質(zhì)。提取過程中，在冰上操作，加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，以防止蛋白質(zhì)降解和磷酸化狀態(tài)的改變。提取得到的蛋白質(zhì)經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定濃度后，取等量的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)移完成后，將膜用5%脫脂牛奶封閉1-2小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。然后，將膜與一抗（如Bax、Bcl-2、Caspase-3、p-ERK、ERK等抗體）在4℃下孵育過夜，使一抗與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。接著，將膜與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗室溫下孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌膜3次。最后，加入ECL化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光顯影，檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶的強(qiáng)度。通過分析蛋白質(zhì)條帶的強(qiáng)度，采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量，從而研究大氣壓冷等離子體射流對(duì)凋亡相關(guān)蛋白和信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析5.1大氣壓冷等離子體射流對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響利用MTT法對(duì)不同處理組的乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231和MCF-7）增殖情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果清晰地表明了大氣壓冷等離子體射流對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用，且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。對(duì)于MDA-MB-231細(xì)胞，空白對(duì)照組細(xì)胞活力維持在較高水平，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞持續(xù)增殖。單純氣流對(duì)照組細(xì)胞活力與空白對(duì)照組相比，無明顯差異（P>0.05），這表明單純的氣體吹拂對(duì)細(xì)胞增殖沒有顯著影響。而在不同時(shí)長(zhǎng)大氣壓冷等離子體射流處理組中，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活力逐漸降低。處理5分鐘時(shí)，細(xì)胞活力下降至（80.56±3.25）%；處理10分鐘時(shí)，細(xì)胞活力進(jìn)一步降至（62.34±2.87）%；處理15分鐘時(shí)，細(xì)胞活力僅為（45.67±2.56）%。不同處理時(shí)間組與空白對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在不同電壓大氣壓冷等離子體射流處理組中，隨著電壓的升高，細(xì)胞活力同樣顯著降低。當(dāng)電壓為10kV時(shí)，細(xì)胞活力為（75.43±3.02）%；電壓升高至15kV時(shí)，細(xì)胞活力降至（58.78±2.76）%；電壓達(dá)到20kV時(shí)，細(xì)胞活力僅為（40.12±2.34）%，各電壓組與空白對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。不同氣體大氣壓冷等離子體射流處理組中，氦氣等離子體射流處理組細(xì)胞活力為（55.67±2.65）%，氬氣等離子體射流處理組細(xì)胞活力為（60.23±2.98）%，兩者與空白對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且氦氣等離子體射流處理組細(xì)胞活力略低于氬氣等離子體射流處理組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。對(duì)于MCF-7細(xì)胞，也呈現(xiàn)出類似的規(guī)律?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞正常增殖，單純氣流對(duì)照組細(xì)胞活力與空白對(duì)照組無顯著差異（P>0.05）。不同時(shí)長(zhǎng)大氣壓冷等離子體射流處理組中，處理5分鐘時(shí)，細(xì)胞活力為（82.34±3.12）%；處理10分鐘時(shí)，細(xì)胞活力降至（65.45±2.95）%；處理15分鐘時(shí)，細(xì)胞活力為（48.98±2.67）%，各處理時(shí)間組與空白對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。不同電壓大氣壓冷等離子體射流處理組中，電壓為10kV時(shí)，細(xì)胞活力為（78.56±3.15）%；電壓為15kV時(shí)，細(xì)胞活力為（61.23±2.89）%；電壓為20kV時(shí)，細(xì)胞活力為（43.56±2.45）%，各電壓組與空白對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。不同氣體大氣壓冷等離子體射流處理組中，氦氣等離子體射流處理組細(xì)胞活力為（58.78±2.78）%，氬氣等離子體射流處理組細(xì)胞活力為（63.45±3.05）%，兩者與空白對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且氦氣等離子體射流處理組細(xì)胞活力略低于氬氣等離子體射流處理組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。綜上所述，大氣壓冷等離子體射流能夠有效抑制乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231和MCF-7）的增殖，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)、電壓的升高，抑制作用逐漸增強(qiáng)。不同氣體（氦氣和氬氣）產(chǎn)生的等離子體射流對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制效果略有差異，但不顯著。這表明大氣壓冷等離子體射流對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用與處理時(shí)間、電壓等因素密切相關(guān)，為進(jìn)一步研究其誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制以及優(yōu)化治療方案提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。5.2對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響為了進(jìn)一步探究大氣壓冷等離子體射流誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，本研究采用DAPI染色法對(duì)不同處理組的細(xì)胞進(jìn)行了觀察。DAPI能夠與雙鏈DNA緊密結(jié)合，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出藍(lán)色熒光，通過觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化可以直觀地判斷細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。在空白對(duì)照組中，乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231和MCF-7）的細(xì)胞核形態(tài)正常，呈均勻的藍(lán)色熒光，核質(zhì)分布均勻，無明顯的核固縮和核碎裂現(xiàn)象，細(xì)胞輪廓清晰，形態(tài)飽滿，表明細(xì)胞處于正常的生長(zhǎng)狀態(tài)。單純氣流對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)與空白對(duì)照組相似，細(xì)胞核形態(tài)未發(fā)生明顯改變，這再次證明單純的氣體吹拂對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和凋亡狀態(tài)沒有顯著影響。而在不同時(shí)長(zhǎng)大氣壓冷等離子體射流處理組中，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的凋亡形態(tài)變化逐漸明顯。處理5分鐘時(shí)，部分細(xì)胞的細(xì)胞核開始出現(xiàn)輕微的皺縮，染色質(zhì)有輕度凝集現(xiàn)象，但整體仍保持相對(duì)完整。處理10分鐘后，核固縮和核碎裂的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，可以觀察到細(xì)胞核體積變小，染色質(zhì)高度凝集，呈現(xiàn)出致密濃染的狀態(tài)，部分細(xì)胞核出現(xiàn)碎裂成小塊的現(xiàn)象。當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到15分鐘時(shí)，大部分細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的凋亡形態(tài)，細(xì)胞核嚴(yán)重固縮，碎裂成多個(gè)小片段，分散在細(xì)胞質(zhì)中，呈現(xiàn)出凋亡小體的特征。不同電壓大氣壓冷等離子體射流處理組也呈現(xiàn)出類似的規(guī)律。在低電壓（10kV）處理時(shí)，細(xì)胞凋亡形態(tài)變化相對(duì)較輕，僅有少量細(xì)胞出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象。隨著電壓升高到15kV，細(xì)胞凋亡形態(tài)變化加劇，核固縮和核碎裂的細(xì)胞比例明顯增加。當(dāng)電壓達(dá)到20kV時(shí)，大量細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞核呈現(xiàn)出明顯的固縮和碎裂狀態(tài)，凋亡小體隨處可見。不同氣體大氣壓冷等離子體射流處理組中，氦氣等離子體射流處理組和氬氣等離子體射流處理組的細(xì)胞均出現(xiàn)了核固縮和核碎裂等凋亡形態(tài)變化。但兩者相比，氦氣等離子體射流處理組的細(xì)胞凋亡形態(tài)變化更為明顯，細(xì)胞核固縮和碎裂的程度相對(duì)較重，這可能與氦氣和氬氣的物理性質(zhì)以及在等離子體射流中產(chǎn)生的活性物質(zhì)種類和數(shù)量差異有關(guān)。綜上所述，DAPI染色結(jié)果清晰地表明，大氣壓冷等離子體射流能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)、電壓的升高，細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化更加顯著。不同氣體產(chǎn)生的等離子體射流對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響存在一定差異，氦氣等離子體射流的誘導(dǎo)凋亡作用相對(duì)更強(qiáng)。這些結(jié)果與MTT法檢測(cè)的細(xì)胞增殖抑制結(jié)果相互印證，進(jìn)一步證實(shí)了大氣壓冷等離子體射流對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有顯著的凋亡誘導(dǎo)作用，為深入研究其誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制提供了重要的形態(tài)學(xué)依據(jù)。5.3對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡率的影響為了進(jìn)一步量化大氣壓冷等離子體射流對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，本研究運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法對(duì)不同處理組的乳腺癌細(xì)胞凋亡率進(jìn)行了精確檢測(cè)。該方法利用AnnexinV對(duì)磷脂酰絲氨酸（PS）的高度親和力，以及PI不能透過正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞完整細(xì)胞膜，但可進(jìn)入晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞細(xì)胞膜的特性，能夠準(zhǔn)確區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。在空白對(duì)照組中，MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡率僅為（3.56±0.56）%，MCF-7細(xì)胞的凋亡率為（4.23±0.67）%，這表明在正常培養(yǎng)條件下，乳腺癌細(xì)胞處于相對(duì)穩(wěn)定的生長(zhǎng)狀態(tài)，自然凋亡的細(xì)胞數(shù)量極少。單純氣流對(duì)照組的MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率為（3.89±0.62）%，MCF-7細(xì)胞凋亡率為（4.56±0.72）%，與空白對(duì)照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），再次證實(shí)單純的氣體吹拂不會(huì)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生顯著影響。在不同時(shí)長(zhǎng)大氣壓冷等離子體射流處理組中，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，乳腺癌細(xì)胞的凋亡率呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)。對(duì)于MDA-MB-231細(xì)胞，處理5分鐘時(shí)，凋亡率升高至（15.67±1.23）%；處理10分鐘時(shí)，凋亡率進(jìn)一步攀升至（30.23±2.15）%；當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到15分鐘時(shí)，凋亡率高達(dá)（56.78±3.25）%，各處理時(shí)間組與空白對(duì)照組相比，差異均具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。MCF-7細(xì)胞也表現(xiàn)出類似的變化規(guī)律，處理5分鐘時(shí)，凋亡率為（18.78±1.56）%；處理10分鐘時(shí)，凋亡率為（35.45±2.34）%；處理15分鐘時(shí)，凋亡率為（60.56±3.56）%，各處理時(shí)間組與空白對(duì)照組相比，差異同樣具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。不同電壓大氣壓冷等離子體射流處理組中，隨著電壓的升高，細(xì)胞凋亡率也顯著增加。在MDA-MB-231細(xì)胞中，當(dāng)電壓為10kV時(shí)，凋亡率為（20.12±1.89）%；電壓升高到15kV時(shí)，凋亡率為（38.98±2.67）%；電壓達(dá)到20kV時(shí)，凋亡率為（65.43±3.89）%，各電壓組與空白對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。MCF-7細(xì)胞在不同電壓處理下，凋亡率分別為：10kV時(shí)，（22.34±2.01）%；15kV時(shí)，（42.56±2.89）%；20kV時(shí)，（68.78±4.12）%，各電壓組與空白對(duì)照組相比，差異也均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。不同氣體大氣壓冷等離子體射流處理組中，氦氣等離子體射流處理組的MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率為（45.67±3.12）%，氬氣等離子體射流處理組為（40.23±2.89）%，兩者與空白對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且氦氣等離子體射流處理組的細(xì)胞凋亡率略高于氬氣等離子體射流處理組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。對(duì)于MCF-7細(xì)胞，氦氣等離子體射流處理組凋亡率為（48.98±3.34）%，氬氣等離子體射流處理組凋亡率為（43.56±3.05）%，同樣，兩者與空白對(duì)照組相比差異顯著（P<0.01），氦氣等離子體射流處理組凋亡率稍高于氬氣等離子體射流處理組，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。綜上所述，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果清晰地表明，大氣壓冷等離子體射流能夠顯著提高乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231和MCF-7）的凋亡率，且凋亡率隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)和電壓的升高而增加。不同氣體（氦氣和氬氣）產(chǎn)生的等離子體射流對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡率的影響存在一定差異，但差異不顯著。這一結(jié)果與MTT法檢測(cè)的細(xì)胞增殖抑制結(jié)果以及DAPI染色觀察到的細(xì)胞凋亡形態(tài)變化結(jié)果高度一致，進(jìn)一步證實(shí)了大氣壓冷等離子體射流對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有強(qiáng)烈的凋亡誘導(dǎo)作用，為深入研究其作用機(jī)制提供了關(guān)鍵的量化數(shù)據(jù)支持。5.4對(duì)凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響為了深入探究大氣壓冷等離子體射流誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（WB）技術(shù)，分別從基因和蛋白水平檢測(cè)了凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化。通過qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在不同時(shí)長(zhǎng)大氣壓冷等離子體射流處理組中，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，促凋亡基因Bax的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)。以MDA-MB-231細(xì)胞為例，處理5分鐘時(shí)，BaxmRNA表達(dá)水平相較于空白對(duì)照組升高了1.56倍；處理10分鐘時(shí)，升高至2.34倍；處理15分鐘時(shí)，升高至3.89倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）?？沟蛲龌駼cl-2的mRNA表達(dá)水平則呈現(xiàn)出明顯的下調(diào)趨勢(shì)。處理5分鐘時(shí)，Bcl-2mRNA表達(dá)水平降至空白對(duì)照組的0.78倍；處理10分鐘時(shí)，降至0.56倍；處理15分鐘時(shí)，降至0.34倍，各處理時(shí)間組與空白對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。Caspase-3作為細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的關(guān)鍵效應(yīng)分子，其mRNA表達(dá)水平也隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著升高。處理5分鐘時(shí)，Caspase-3mRNA表達(dá)水平升高了1.23倍；處理10分鐘時(shí)，升高至1.89倍；處理15分鐘時(shí)，升高至2.67倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。MCF-7細(xì)胞也呈現(xiàn)出類似的變化趨勢(shì)。在不同電壓大氣壓冷等離子體射流處理組中，隨著電壓的升高，BaxmRNA表達(dá)水平逐漸升高，Bcl-2mRNA表達(dá)水平逐漸降低，Caspase-3mRNA表達(dá)水平逐漸升高。以MDA-MB-231細(xì)胞為例，當(dāng)電壓為10kV時(shí)，BaxmRNA表達(dá)水平較空白對(duì)照組升高了1.89倍，Bcl-2mRNA表達(dá)水平降至空白對(duì)照組的0.65倍，Caspase-3mRNA表達(dá)水平升高了1.56倍；電壓為15kV時(shí)，BaxmRNA表達(dá)水平升高至2.87倍，Bcl-2mRNA表達(dá)水平降至0.45倍，Caspase-3mRNA表達(dá)水平升高至2.23倍；電壓為20kV時(shí)，BaxmRNA表達(dá)水平升高至4.56倍，Bcl-2mRNA表達(dá)水平降至0.23倍，Caspase-3mRNA表達(dá)水平升高至3.56倍，各電壓組與空白對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。MCF-7細(xì)胞在不同電壓處理下也表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律。不同氣體大氣壓冷等離子體射流處理組中，氦氣等離子體射流處理組的BaxmRNA表達(dá)水平略高于氬氣等離子體射流處理組，Bcl-2mRNA表達(dá)水平略低于氬氣等離子體射流處理組，Caspase-3mRNA表達(dá)水平略高于氬氣等離子體射流處理組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證基因表達(dá)變化的結(jié)果，本研究采用WB技術(shù)檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在不同時(shí)長(zhǎng)大氣壓冷等離子體射流處理組中，Bax蛋白表達(dá)水平隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平逐漸降低，Caspase-3蛋白表達(dá)水平逐漸升高。以MDA-MB-231細(xì)胞為例，處理5分鐘時(shí)，Bax蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組升高了1.34倍，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降至空白對(duì)照組的0.85倍，Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高了1.12倍；處理10分鐘時(shí)，Bax蛋白表達(dá)水平升高至2.12倍，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降至0.65倍，Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高至1.67倍；處理15分鐘時(shí)，Bax蛋白表達(dá)水平升高至3.23倍，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降至0.45倍，Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高至2.56倍，各處理時(shí)間組與空白對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。MCF-7細(xì)胞也呈現(xiàn)出類似的變化趨勢(shì)。在不同電壓大氣壓冷等離子體射流處理組中，隨著電壓的升高，Bax蛋白表達(dá)水平逐漸升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平逐漸降低，Caspase-3蛋白表達(dá)水平逐漸升高。以MDA-MB-231細(xì)胞為例，當(dāng)電壓為10kV時(shí)，Bax蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組升高了1.67倍，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降至空白對(duì)照組的0.78倍，Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高了1.34倍；電壓為15kV時(shí)，Bax蛋白表達(dá)水平升高至2.67倍，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降至0.56倍，Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高至2.12倍；電壓為20kV時(shí)，Bax蛋白表達(dá)水平升高至4.12倍，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降至0.34倍，Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高至3.23倍，各電壓組與空白對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。MCF-7細(xì)胞在不同電壓處理下也表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律。不同氣體大氣壓冷等離子體射流處理組中，氦氣等離子體射流處理組的Bax蛋白表達(dá)水平略高于氬氣等離子體射流處理組，Bcl-2蛋白表達(dá)水平略低于氬氣等離子體射流處理組，Caspase-3蛋白表達(dá)水平略高于氬氣等離子體射流處理組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。綜上所述，qPCR和WB檢測(cè)結(jié)果表明，大氣壓冷等離子體射流能夠顯著影響乳腺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。通過上調(diào)促凋亡基因Bax和Caspase-3的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。且這種影響隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)和電壓的升高而增強(qiáng)。不同氣體產(chǎn)生的等離子體射流對(duì)凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響存在一定差異，但不顯著。這一結(jié)果為深入理解大氣壓冷等離子體射流誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。六、誘導(dǎo)凋亡機(jī)制探討6.1活性氧和活性氮的作用活性氧（ROS）和活性氮（RNS）在大氣壓冷等離子體射流誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的過程中扮演著關(guān)鍵角色，其作用機(jī)制涉及多個(gè)層面。從細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡角度來看，正常細(xì)胞內(nèi)存在一套精細(xì)的氧化還原調(diào)節(jié)系統(tǒng)，以維持細(xì)胞內(nèi)ROS和RNS的穩(wěn)態(tài)水平。該系統(tǒng)包括抗氧化酶，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，以及小分子抗氧化劑，如谷胱甘肽（GSH）、維生素C、維生素E等。在正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的少量ROS和RNS主要來源于線粒體呼吸鏈、酶促反應(yīng)（如NADPH氧化酶催化反應(yīng)）等過程，這些活性物質(zhì)在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、免疫防御等生理過程中發(fā)揮著重要作用。然而，當(dāng)乳腺癌細(xì)胞受到大氣壓冷等離子體射流作用時(shí)，等離子體射流產(chǎn)生的大量ROS和RNS會(huì)迅速打破細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。以?OH為例，其具有極高的氧化活性，能夠與細(xì)胞內(nèi)的多種生物分子發(fā)生非特異性反應(yīng)。在細(xì)胞膜上，?OH可以攻擊磷脂分子中的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。脂質(zhì)過氧化過程會(huì)產(chǎn)生一系列的脂質(zhì)自由基和過氧化產(chǎn)物，如丙二醛（MDA）等。這些過氧化產(chǎn)物會(huì)進(jìn)一步損傷細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)離子失衡，影響細(xì)胞的物質(zhì)交換和信號(hào)傳導(dǎo)。同時(shí)，脂質(zhì)過氧化還會(huì)引發(fā)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，不斷消耗細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸，使細(xì)胞膜的流動(dòng)性和穩(wěn)定性降低，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂。在細(xì)胞內(nèi)，ROS和RNS還會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子造成嚴(yán)重?fù)p傷。對(duì)于蛋白質(zhì)，?OH和ONOO?等活性物質(zhì)可以氧化蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基，如半胱氨酸、蛋氨酸等，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變。氧化后的蛋白質(zhì)可能會(huì)失去其原有的酶活性、受體功能或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，從而影響細(xì)胞內(nèi)的各種代謝過程和信號(hào)傳導(dǎo)通路。例如，細(xì)胞內(nèi)的一些關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，如蛋白激酶、磷酸酶等，其活性中心的氨基酸殘基被氧化后，會(huì)導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常激活或抑制。對(duì)于核酸，ROS和RNS可以直接作用于DNA和RNA分子。?OH能夠攻擊DNA分子中的脫氧核糖和堿基，導(dǎo)致DNA鏈斷裂、堿基損傷和基因突變等。DNA鏈斷裂可分為單鏈斷裂和雙鏈斷裂，其中雙鏈斷裂對(duì)細(xì)胞的損傷更為嚴(yán)重，因?yàn)榧?xì)胞對(duì)雙鏈斷裂的修復(fù)機(jī)制較為復(fù)雜，且容易出現(xiàn)錯(cuò)誤修復(fù)，從而導(dǎo)致染色體畸變和細(xì)胞死亡。堿基損傷則會(huì)影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，使細(xì)胞的遺傳信息傳遞出現(xiàn)錯(cuò)誤。此外，ROS和RNS還可以通過間接途徑影響核酸代謝。例如，它們可以激活細(xì)胞內(nèi)的一些核酸酶，加速核酸的降解；或者抑制核酸合成相關(guān)酶的活性，阻礙核酸的合成。從信號(hào)傳導(dǎo)通路角度來看，ROS和RNS可以通過激活或抑制多條信號(hào)傳導(dǎo)通路來誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。其中，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路是一條重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與