大腸桿菌中ATA117轉(zhuǎn)氨酶的高效重組表達(dá)及西他列汀生物合成研究一、引言1.1研究背景與意義在制藥領(lǐng)域，生物催化技術(shù)正發(fā)揮著日益重要的作用。傳統(tǒng)化學(xué)合成方法在藥物生產(chǎn)中面臨諸多挑戰(zhàn)，如反應(yīng)條件苛刻、副反應(yīng)多、環(huán)境污染嚴(yán)重以及對(duì)昂貴催化劑的依賴等。而生物催化技術(shù)利用酶或微生物作為催化劑，具有高效、高選擇性、反應(yīng)條件溫和以及環(huán)境友好等顯著優(yōu)勢，能夠有效克服傳統(tǒng)化學(xué)合成的不足，為藥物合成提供了一條綠色、可持續(xù)的發(fā)展途徑，在藥物研發(fā)和生產(chǎn)中展現(xiàn)出巨大的潛力，逐漸成為制藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。西他列汀（Sitagliptin），全稱(3r)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氫-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮，是由Merck和Codexis公司研制和開發(fā)的一種二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制藥。在糖尿病的治療中，西他列汀通過抑制DPP-4的活性，阻止腸促胰素如胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）和葡萄糖依賴性促胰島素釋放多肽（GIP）的降解，延長其半衰期。這些腸促胰素在血糖升高時(shí)，能夠刺激胰島素的分泌，從而降低血糖。同時(shí)，西他列汀還可以減少胰高血糖素的分泌，進(jìn)一步有助于降低血糖水平。而且，西格列汀的降糖機(jī)制具有血糖依賴性，在血糖升高時(shí)，它能夠發(fā)揮最大的降糖效果；而在血糖正常時(shí)，則不會(huì)引起低血糖的風(fēng)險(xiǎn)，安全性高。隨著全球糖尿病患者數(shù)量的不斷攀升，對(duì)西他列汀這類安全有效的降糖藥物的需求也在持續(xù)增長。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）統(tǒng)計(jì)，全球糖尿病患者人數(shù)已達(dá)數(shù)億，且呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，這使得西他列汀的市場前景十分廣闊。目前，西他列汀的制備方法主要包括化學(xué)合成法和生物合成法?；瘜W(xué)合成法通常需要在高溫、高壓等苛刻條件下進(jìn)行，且依賴貴重金屬催化劑進(jìn)行催化加氫，反應(yīng)步驟冗長。這不僅導(dǎo)致合成成本升高，還會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物和廢棄物，對(duì)環(huán)境造成較大壓力。相比之下，生物合成法，尤其是利用轉(zhuǎn)氨酶催化制備西他列汀的方法，具有明顯的優(yōu)勢。轉(zhuǎn)氨酶作為一類重要的生物催化劑，能夠在溫和的條件下，高效、立體選擇性地催化氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)手性化合物的合成與拆分。在西他列汀的合成中，轉(zhuǎn)氨酶能夠特異性地催化底物生成具有特定手性構(gòu)型的產(chǎn)物，避免了化學(xué)合成中復(fù)雜的手性拆分步驟，提高了反應(yīng)效率和產(chǎn)物純度。轉(zhuǎn)氨酶ATA117作為一種重要的轉(zhuǎn)氨酶，已被廣泛應(yīng)用于多種藥物的合成，展現(xiàn)出良好的催化性能和底物特異性。在西他列汀的制備中，轉(zhuǎn)氨酶ATA117能夠催化特定的底物生成西他列汀，為西他列汀的生物合成提供了關(guān)鍵的技術(shù)支持。然而，天然的轉(zhuǎn)氨酶ATA117在表達(dá)量和催化活性等方面可能存在一定的局限性，難以滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需求。因此，開展轉(zhuǎn)氨酶ATA117在大腸桿菌中的高效重組表達(dá)及催化制備西他列汀的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。通過基因工程技術(shù)，構(gòu)建轉(zhuǎn)氨酶ATA117在大腸桿菌中的高效重組表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)化表達(dá)條件，提高其表達(dá)量和催化活性，能夠?yàn)槲魉型〉纳锎呋苽涮峁┏渥愕拿冈?。同時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)氨酶ATA117催化制備西他列汀的反應(yīng)條件進(jìn)行深入研究和優(yōu)化，有助于提高西他列汀的產(chǎn)率和純度，降低生產(chǎn)成本，推動(dòng)西他列汀生物合成技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用。此外，該研究還能為其他生物活性分子的合成提供借鑒和參考，豐富生物催化技術(shù)在制藥領(lǐng)域的應(yīng)用，促進(jìn)生物制藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，生物催化技術(shù)在制藥領(lǐng)域的應(yīng)用研究起步較早，發(fā)展較為成熟。默克（Merck）和科迪克斯（Codexis）公司在西他列汀的生物合成方面取得了顯著成果，他們利用轉(zhuǎn)氨酶ATA117，通過多輪分子改造，成功獲得了高活性的突變體，實(shí)現(xiàn)了西他列汀的工業(yè)化生物轉(zhuǎn)化。該技術(shù)顯著提高了西他列汀的合成效率，降低了生產(chǎn)成本，減少了環(huán)境污染，為西他列汀的大規(guī)模生產(chǎn)提供了可行的方案，也為其他藥物的生物合成提供了重要的參考范例。在轉(zhuǎn)氨酶ATA117的表達(dá)研究方面，國外科研團(tuán)隊(duì)通過對(duì)表達(dá)載體、宿主菌以及發(fā)酵條件等多方面的優(yōu)化，成功提高了轉(zhuǎn)氨酶ATA117的表達(dá)量和活性。例如，有研究采用優(yōu)化的表達(dá)載體，調(diào)整啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等元件，使轉(zhuǎn)氨酶ATA117在大腸桿菌中的表達(dá)量得到了顯著提升；還有研究通過篩選合適的宿主菌，利用基因工程手段敲除宿主菌中可能影響轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)的基因，為轉(zhuǎn)氨酶ATA117的高效表達(dá)創(chuàng)造了良好的環(huán)境。國內(nèi)在生物催化技術(shù)和西他列汀合成方面的研究近年來也取得了長足的進(jìn)步。眾多科研機(jī)構(gòu)和企業(yè)紛紛投入到相關(guān)研究中，在轉(zhuǎn)氨酶ATA117的基因克隆、表達(dá)優(yōu)化以及西他列汀的生物合成工藝改進(jìn)等方面取得了一系列成果。一些高校和科研院所通過對(duì)轉(zhuǎn)氨酶ATA117基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使其更適合在大腸桿菌中表達(dá)，有效提高了酶的表達(dá)水平；同時(shí)，在西他列汀的合成工藝研究中，國內(nèi)研究人員通過對(duì)反應(yīng)條件的細(xì)致優(yōu)化，如溫度、pH值、底物濃度、反應(yīng)時(shí)間等，提高了西他列汀的產(chǎn)率和純度。此外，國內(nèi)企業(yè)也積極參與到西他列汀生物合成技術(shù)的研發(fā)中，通過產(chǎn)學(xué)研合作，加速了相關(guān)技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。然而，目前無論是國內(nèi)還是國外的研究，仍存在一些不足之處。在轉(zhuǎn)氨酶ATA117的表達(dá)方面，雖然已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但表達(dá)量和活性仍有待進(jìn)一步提高，以滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需求。部分優(yōu)化方法可能會(huì)增加生產(chǎn)成本或操作復(fù)雜性，不利于工業(yè)化應(yīng)用。在西他列汀的合成過程中，底物的耐受性和反應(yīng)的選擇性仍需進(jìn)一步優(yōu)化。一些研究中，底物濃度的提高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)效率下降或副反應(yīng)增加；反應(yīng)的選擇性也有待提高，以減少副產(chǎn)物的生成，提高產(chǎn)物的純度。此外，對(duì)于轉(zhuǎn)氨酶ATA117催化制備西他列汀的反應(yīng)機(jī)制研究還不夠深入，這限制了對(duì)反應(yīng)過程的進(jìn)一步優(yōu)化和調(diào)控。未來的研究可以朝著開發(fā)更加高效的表達(dá)系統(tǒng)，深入探究轉(zhuǎn)氨酶ATA117的催化機(jī)制，以及優(yōu)化西他列汀的合成工藝等方向展開，以實(shí)現(xiàn)西他列汀的綠色、高效、低成本生產(chǎn)。1.3研究內(nèi)容與目標(biāo)本研究圍繞轉(zhuǎn)氨酶ATA117在大腸桿菌中的高效重組表達(dá)及催化制備西他列汀展開，具體研究內(nèi)容和目標(biāo)如下：構(gòu)建轉(zhuǎn)氨酶ATA117在大腸桿菌中的高效重組表達(dá)系統(tǒng)并優(yōu)化：通過PCR擴(kuò)增技術(shù)，獲取轉(zhuǎn)氨酶ATA117的基因序列，并將其連接到合適的表達(dá)載體上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌宿主菌中，構(gòu)建重組大腸桿菌菌株。對(duì)重組菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行全面優(yōu)化，包括培養(yǎng)基成分（如碳源、氮源的種類和比例）、培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)劑濃度（如IPTG的濃度）、誘導(dǎo)時(shí)間等因素，以提高轉(zhuǎn)氨酶ATA117的表達(dá)量。目標(biāo)是獲得高表達(dá)量的轉(zhuǎn)氨酶ATA117重組大腸桿菌菌株，使轉(zhuǎn)氨酶ATA117的表達(dá)量相較于原始菌株有顯著提升，滿足后續(xù)催化反應(yīng)對(duì)酶量的需求。制備轉(zhuǎn)氨酶ATA117并進(jìn)行高效純化和活性檢測：利用優(yōu)化后的重組大腸桿菌菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，通過離心、過濾等技術(shù)進(jìn)行微生物細(xì)胞的分離，然后采用合適的方法（如超聲破碎、酶解法等）提取轉(zhuǎn)氨酶ATA117。運(yùn)用多種分離純化技術(shù)，如硫酸銨鹽析初步沉淀蛋白質(zhì)，再通過凝膠過濾層析進(jìn)一步分離不同分子量的蛋白質(zhì)，離子交換層析根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的差異進(jìn)行分離等，提高轉(zhuǎn)氨酶ATA117的純度。對(duì)純化后的轉(zhuǎn)氨酶ATA117進(jìn)行活性檢測，確定其最優(yōu)反應(yīng)條件，包括最適反應(yīng)溫度、pH值、底物濃度、反應(yīng)時(shí)間等。目標(biāo)是獲得高純度、高活性的轉(zhuǎn)氨酶ATA117，其純度需達(dá)到能夠滿足后續(xù)精確的酶學(xué)性質(zhì)研究和催化制備西他列汀反應(yīng)的要求，為后續(xù)研究提供高質(zhì)量的酶制劑。通過轉(zhuǎn)氨酶ATA117催化反應(yīng)制備西他列汀并優(yōu)化反應(yīng)條件：將獲得的高純度、高活性的轉(zhuǎn)氨酶ATA117與底物在一定反應(yīng)條件下進(jìn)行反應(yīng)，精確測定生成的西他列汀的產(chǎn)率。對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，包括底物濃度、反應(yīng)溫度、pH值、反應(yīng)時(shí)間、輔酶（如磷酸吡哆醛）的濃度、氨基供體（如異丙胺）的種類和濃度等因素，以提高西他列汀的產(chǎn)率和純度。同時(shí)，研究底物的耐受性和反應(yīng)的選擇性，通過改變底物結(jié)構(gòu)、添加助劑等方式，探索提高底物耐受性和反應(yīng)選擇性的方法，減少副反應(yīng)的發(fā)生，提高產(chǎn)物的純度。目標(biāo)是獲得最適宜的反應(yīng)條件，實(shí)現(xiàn)西他列汀的高效制備，使西他列汀的產(chǎn)率和純度達(dá)到或超過現(xiàn)有研究水平，降低生產(chǎn)成本，為工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。對(duì)所得西他列汀進(jìn)行純化和結(jié)構(gòu)鑒定，并對(duì)催化制備方法進(jìn)行評(píng)價(jià)：采用合適的純化方法，如結(jié)晶、萃取、柱層析等技術(shù)，對(duì)反應(yīng)生成的西他列汀進(jìn)行純化，去除雜質(zhì)和未反應(yīng)的底物，得到高純度的西他列汀產(chǎn)品。通過核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）等現(xiàn)代分析技術(shù)對(duì)純化后的西他列汀進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定所得產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與西他列汀的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)一致。對(duì)轉(zhuǎn)氨酶ATA117催化制備西他列汀的方法進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，從反應(yīng)效率、產(chǎn)率、純度、成本、環(huán)境友好性等多個(gè)方面進(jìn)行考量，分析該方法的優(yōu)勢和不足之處，并與傳統(tǒng)化學(xué)合成法和其他生物合成法進(jìn)行對(duì)比。目標(biāo)是確定轉(zhuǎn)氨酶ATA117在制備西他列汀中的應(yīng)用前景，為開發(fā)更安全、環(huán)保、高效的西他列汀生產(chǎn)工藝提供理論依據(jù)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)為制備其他生物活性物質(zhì)提供借鑒和參考。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)概述大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，其原理基于DNA重組技術(shù)。通過一系列實(shí)驗(yàn)操作，將外源基因（如編碼轉(zhuǎn)氨酶ATA117的基因）克隆到特定的表達(dá)載體上，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒。然后，利用轉(zhuǎn)化技術(shù)，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌宿主細(xì)胞內(nèi)。大腸桿菌在合適的培養(yǎng)條件下生長繁殖，細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制會(huì)識(shí)別重組質(zhì)粒上的外源基因，并以其為模板合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)外源蛋白的表達(dá)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)主要有兩種類型：一種是基于質(zhì)粒的表達(dá)系統(tǒng)，質(zhì)粒是一種小型的環(huán)狀雙鏈DNA分子，能夠在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制。通過將外源基因插入到質(zhì)粒的特定位置，并利用質(zhì)粒上的啟動(dòng)子、終止子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等元件來調(diào)控外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，實(shí)現(xiàn)外源蛋白的表達(dá)。這種表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡便、易于構(gòu)建和調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)，是最常用的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)類型。另一種是基于噬菌體的表達(dá)系統(tǒng)，噬菌體是一類病毒，能夠感染大腸桿菌并在其體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和繁殖。將外源基因整合到噬菌體基因組中，利用噬菌體感染大腸桿菌的過程，將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞，并借助噬菌體的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制實(shí)現(xiàn)外源蛋白的表達(dá)。這種表達(dá)系統(tǒng)在某些特殊情況下，如需要表達(dá)對(duì)大腸桿菌宿主細(xì)胞有毒性的蛋白時(shí)，具有一定的優(yōu)勢。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)外源蛋白中具有諸多顯著優(yōu)勢。首先，大腸桿菌具有清晰的遺傳背景，經(jīng)過長期的研究，科學(xué)家們對(duì)其基因組成、代謝途徑以及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制等方面都有了深入的了解。這使得在利用大腸桿菌表達(dá)外源蛋白時(shí)，可以更加精準(zhǔn)地進(jìn)行基因操作和表達(dá)調(diào)控，提高表達(dá)效率和成功率。其次，大腸桿菌的生長速度極快，在適宜的培養(yǎng)條件下，其代時(shí)可短至20分鐘左右。這意味著在短時(shí)間內(nèi)能夠獲得大量的菌體，進(jìn)而大量生產(chǎn)外源蛋白，大大縮短了生產(chǎn)周期，提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本。再者，大腸桿菌的培養(yǎng)條件相對(duì)簡單，對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的需求不苛刻，普通的培養(yǎng)基即可滿足其生長需求。而且，培養(yǎng)過程易于控制，只需調(diào)節(jié)溫度、pH值、通氣量等條件，就能實(shí)現(xiàn)大腸桿菌的高密度培養(yǎng)，為大規(guī)模生產(chǎn)外源蛋白提供了便利。此外，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的操作技術(shù)成熟，無論是基因克隆、載體構(gòu)建，還是轉(zhuǎn)化、篩選等實(shí)驗(yàn)步驟，都有標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)方法和流程，易于掌握和操作，這使得該系統(tǒng)在科研和工業(yè)生產(chǎn)中都具有廣泛的應(yīng)用前景。在實(shí)際應(yīng)用中，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在生物醫(yī)藥、工業(yè)酶生產(chǎn)等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，許多重要的蛋白質(zhì)藥物，如胰島素、干擾素、白細(xì)胞介素等，都是通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行生產(chǎn)的。在工業(yè)酶生產(chǎn)方面，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)也被廣泛用于生產(chǎn)各種工業(yè)用酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，這些酶在食品加工、紡織、造紙、洗滌劑等行業(yè)中都有重要的應(yīng)用。在轉(zhuǎn)氨酶ATA117的表達(dá)研究中，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)為其提供了一個(gè)高效、便捷的表達(dá)平臺(tái)，通過對(duì)該系統(tǒng)的優(yōu)化和調(diào)控，可以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶ATA117的高表達(dá)，為后續(xù)催化制備西他列汀提供充足的酶源。2.2轉(zhuǎn)氨酶ATA117的特性與功能轉(zhuǎn)氨酶ATA117最初是從[具體微生物名稱]中發(fā)現(xiàn)和分離得到的，這種微生物通常存在于[具體生態(tài)環(huán)境，如土壤、海洋特定區(qū)域等]中，適應(yīng)了該環(huán)境的特殊條件，從而進(jìn)化出具有獨(dú)特功能的轉(zhuǎn)氨酶ATA117。其氨基酸序列由[X]個(gè)氨基酸殘基組成，通過對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它含有多個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。其中，[具體保守結(jié)構(gòu)域名稱1]在維持酶的空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面起著關(guān)鍵作用，它通過與其他結(jié)構(gòu)域之間形成特定的相互作用，如氫鍵、疏水相互作用等，確保酶分子在不同環(huán)境條件下仍能保持正確的折疊狀態(tài)，從而維持其催化活性。[具體保守結(jié)構(gòu)域名稱2]則與底物的特異性結(jié)合密切相關(guān)，該結(jié)構(gòu)域的氨基酸組成和空間構(gòu)象決定了轉(zhuǎn)氨酶ATA117能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合特定的底物分子，為后續(xù)的催化反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。在三維結(jié)構(gòu)上，轉(zhuǎn)氨酶ATA117呈現(xiàn)出[具體的三維結(jié)構(gòu)特征，如α-螺旋、β-折疊的分布和組合方式]的結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)使得酶分子表面形成了一個(gè)獨(dú)特的活性中心，活性中心周圍環(huán)繞著特定的氨基酸殘基，這些殘基通過與底物分子形成特定的相互作用，如靜電相互作用、范德華力等，實(shí)現(xiàn)對(duì)底物的特異性識(shí)別和結(jié)合。活性中心內(nèi)的關(guān)鍵氨基酸殘基，如[具體關(guān)鍵氨基酸殘基名稱]，在催化過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，它們直接參與底物的化學(xué)反應(yīng)，促進(jìn)氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的進(jìn)行。轉(zhuǎn)氨酶ATA117的催化機(jī)制基于乒乓反應(yīng)機(jī)制。在催化過程中，首先，底物1（酮酸或醛）與酶分子活性中心的輔酶磷酸吡哆醛（PLP）結(jié)合，形成一個(gè)Schiff堿中間體。在這個(gè)過程中，底物1的羰基與PLP的醛基發(fā)生親核加成反應(yīng)，形成一個(gè)共價(jià)鍵，從而將底物1固定在活性中心。隨后，這個(gè)Schiff堿中間體發(fā)生重排反應(yīng)，底物1的α-碳原子上的氫原子發(fā)生轉(zhuǎn)移，同時(shí)伴隨著PLP的吡啶環(huán)發(fā)生電子重排，形成一個(gè)具有不同電子分布的中間體。接著，這個(gè)中間體與底物2（氨基酸）發(fā)生反應(yīng)，底物2的氨基進(jìn)攻中間體，發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，形成產(chǎn)物1（氨基酸或其衍生物）和一個(gè)新的Schiff堿中間體，該中間體是由PLP和底物2的碳骨架形成的。最后，這個(gè)新的Schiff堿中間體發(fā)生水解反應(yīng)，釋放出產(chǎn)物2（酮酸或醛的衍生物），同時(shí)輔酶PLP恢復(fù)到初始狀態(tài)，完成一個(gè)催化循環(huán)。在這個(gè)過程中，輔酶PLP起著至關(guān)重要的作用，它不僅作為氨基的載體，參與底物的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，還通過其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和電子性質(zhì)，促進(jìn)底物分子的活化和反應(yīng)的進(jìn)行，降低反應(yīng)的活化能，提高反應(yīng)速率。在合成手性胺類化合物中，轉(zhuǎn)氨酶ATA117具有諸多優(yōu)勢。與傳統(tǒng)化學(xué)合成方法相比，它能夠在溫和的條件下進(jìn)行反應(yīng)，一般反應(yīng)溫度在[具體溫度范圍，如25-37℃]，反應(yīng)pH值在[具體pH值范圍，如7.0-8.0]，避免了化學(xué)合成中高溫、高壓等苛刻條件的使用，降低了能源消耗和設(shè)備要求。而且，轉(zhuǎn)氨酶ATA117具有極高的立體選擇性，能夠特異性地催化生成具有特定手性構(gòu)型的手性胺類化合物，避免了化學(xué)合成中復(fù)雜的手性拆分步驟，提高了產(chǎn)物的純度和光學(xué)活性。例如，在西他列汀的合成中，轉(zhuǎn)氨酶ATA117能夠以高立體選擇性催化底物生成具有特定手性構(gòu)型的西他列汀，其光學(xué)純度可達(dá)到[具體光學(xué)純度數(shù)值，如99%ee以上]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)化學(xué)合成方法所能達(dá)到的水平。此外，轉(zhuǎn)氨酶ATA117催化反應(yīng)的副反應(yīng)少，能夠有效減少副產(chǎn)物的生成，提高原子利用率，符合綠色化學(xué)的理念。2.3西他列汀的合成原理與方法西他列汀，化學(xué)名為(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氫-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)復(fù)雜的雜環(huán)體系和多個(gè)氟原子取代基，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了西他列汀與二肽基肽酶-4（DPP-4）特異性結(jié)合的能力，從而有效抑制DPP-4的活性，發(fā)揮治療糖尿病的藥理作用。在糖尿病的治療中，西他列汀能夠特異性地抑制DPP-4的活性，阻止腸促胰素如胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）和葡萄糖依賴性促胰島素釋放多肽（GIP）的降解。這些腸促胰素在血糖升高時(shí)，能夠刺激胰島素的分泌，從而降低血糖水平。同時(shí)，西他列汀還可以減少胰高血糖素的分泌，進(jìn)一步有助于降低血糖。而且，西他列汀的降糖機(jī)制具有血糖依賴性，在血糖升高時(shí)，它能夠發(fā)揮最大的降糖效果；而在血糖正常時(shí)，則不會(huì)引起低血糖的風(fēng)險(xiǎn)，安全性高。傳統(tǒng)化學(xué)合成法制備西他列汀，通常以2,4,5-三氟苯乙酸、米氏酸及3-三氟甲基-5,6,7,8-四氫[1,2,4]三唑并[4,3-a]哌嗪鹽酸鹽為起始原料。首先，2,4,5-三氟苯乙酸與米氏酸在特定條件下發(fā)生縮合反應(yīng)，形成一個(gè)中間產(chǎn)物。然后，該中間產(chǎn)物與3-三氟甲基-5,6,7,8-四氫[1,2,4]三唑并[4,3-a]哌嗪鹽酸鹽進(jìn)行反應(yīng)，得到β-酮酰胺。接著，β-酮酰胺與乙酸銨反應(yīng)生成脫氫西他列汀，這一步反應(yīng)需要在特定的溫度和反應(yīng)時(shí)間下進(jìn)行，以確保反應(yīng)的順利進(jìn)行和產(chǎn)物的純度。最后，脫氫西他列汀在手性銠(Ⅰ)催化劑[RhCl(COD)]?/(R,S)-t-BuJOSIPHOS的催化下進(jìn)行不對(duì)稱氫化反應(yīng)，得到西他列汀。在這個(gè)過程中，手性銠(Ⅰ)催化劑起著至關(guān)重要的作用，它能夠選擇性地催化脫氫西他列汀的加氫反應(yīng)，使其生成具有特定手性構(gòu)型的西他列汀。然而，傳統(tǒng)化學(xué)合成法存在諸多弊端。反應(yīng)條件極為苛刻，需要在高溫、高壓以及特定的催化劑存在下進(jìn)行，這不僅增加了能源消耗和設(shè)備要求，還對(duì)反應(yīng)設(shè)備的材質(zhì)和性能提出了很高的要求，增加了生產(chǎn)成本。反應(yīng)步驟冗長，涉及多個(gè)復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，每一步反應(yīng)都可能伴隨著副反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致副產(chǎn)物增多。這些副產(chǎn)物不僅會(huì)降低目標(biāo)產(chǎn)物的純度，還需要進(jìn)行復(fù)雜的分離和純化步驟，進(jìn)一步增加了生產(chǎn)成本和生產(chǎn)過程的復(fù)雜性。而且，傳統(tǒng)化學(xué)合成法中使用的催化劑多為貴重金屬催化劑，如手性銠(Ⅰ)催化劑，這些催化劑價(jià)格昂貴，且在反應(yīng)后難以回收和重復(fù)利用，進(jìn)一步提高了生產(chǎn)成本。同時(shí)，大量的副產(chǎn)物和廢棄物的產(chǎn)生也對(duì)環(huán)境造成了較大的壓力，不符合綠色化學(xué)的理念。酶催化合成法，尤其是利用轉(zhuǎn)氨酶ATA117催化制備西他列汀，具有獨(dú)特的原理和顯著的優(yōu)勢。轉(zhuǎn)氨酶ATA117能夠特異性地識(shí)別底物β-酮酰胺，通過其活性中心與底物分子形成特定的相互作用，如氫鍵、疏水相互作用等，將底物分子固定在活性中心。在輔酶磷酸吡哆醛（PLP）的參與下，轉(zhuǎn)氨酶ATA117催化β-酮酰胺發(fā)生氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。首先，底物β-酮酰胺與輔酶PLP形成一個(gè)Schiff堿中間體，然后通過一系列的電子重排和化學(xué)反應(yīng)，將氨基從氨基供體（如異丙胺）轉(zhuǎn)移到底物β-酮酰胺上，生成具有特定手性構(gòu)型的西他列汀。在這個(gè)過程中，輔酶PLP起著至關(guān)重要的作用，它作為氨基的載體，參與底物的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，同時(shí)通過其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和電子性質(zhì)，促進(jìn)底物分子的活化和反應(yīng)的進(jìn)行，降低反應(yīng)的活化能，提高反應(yīng)速率。與傳統(tǒng)化學(xué)合成法相比，酶催化合成法具有明顯的優(yōu)勢。反應(yīng)條件溫和，一般在常溫、常壓下即可進(jìn)行，不需要高溫、高壓等苛刻條件，大大降低了能源消耗和設(shè)備要求，減少了對(duì)環(huán)境的影響。酶的催化具有高度的特異性，能夠選擇性地催化底物生成具有特定手性構(gòu)型的產(chǎn)物，避免了化學(xué)合成中復(fù)雜的手性拆分步驟，提高了反應(yīng)效率和產(chǎn)物純度。而且，酶催化反應(yīng)的副反應(yīng)少，能夠有效減少副產(chǎn)物的生成，提高原子利用率，符合綠色化學(xué)的理念。此外，酶是生物催化劑，通?？梢酝ㄟ^生物發(fā)酵的方式大量生產(chǎn)，成本相對(duì)較低，且在反應(yīng)后可以通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行回收和重復(fù)利用，進(jìn)一步降低了生產(chǎn)成本。三、轉(zhuǎn)氨酶ATA117在大腸桿菌中的高效重組表達(dá)3.1表達(dá)載體的構(gòu)建本研究選用大腸桿菌BL21(DE3)作為宿主菌株。大腸桿菌BL21(DE3)是一種常用于重組蛋白表達(dá)的菌株，其lon和ompT基因發(fā)生突變，這使得在表達(dá)外源蛋白時(shí)，能夠有效減少重組蛋白的降解，提高重組蛋白的產(chǎn)量。同時(shí)，該菌株基因組中整合了λ噬菌體DE3的基因組，包含由lacUV5啟動(dòng)子控制的T7RNA聚合酶基因，適用于高效表達(dá)克隆于含有T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體的基因。當(dāng)向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）時(shí)，IPTG可以與lac阻遏蛋白結(jié)合，解除其對(duì)T7RNA聚合酶基因表達(dá)的抑制，從而啟動(dòng)T7RNA聚合酶的表達(dá)，T7RNA聚合酶能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到表達(dá)載體上的T7啟動(dòng)子區(qū)域，啟動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，實(shí)現(xiàn)外源蛋白的高效表達(dá)。而且，大腸桿菌BL21(DE3)具有生長速度快、培養(yǎng)條件簡單、遺傳背景清晰等優(yōu)點(diǎn)，這些特性為轉(zhuǎn)氨酶ATA117的高效表達(dá)提供了良好的宿主環(huán)境，有助于在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量的表達(dá)產(chǎn)物，降低生產(chǎn)成本，提高實(shí)驗(yàn)效率。表達(dá)載體選用pET-28a(+)，它是一種廣泛應(yīng)用于原核表達(dá)的質(zhì)粒載體。該載體具有多個(gè)重要元件，其中T7啟動(dòng)子是一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，能夠被T7RNA聚合酶特異性識(shí)別并結(jié)合，從而高效啟動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄，保證了轉(zhuǎn)氨酶ATA117基因的高表達(dá)水平。多克隆位點(diǎn)（MCS）包含多個(gè)獨(dú)特的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，如NcoI、XhoI等，這些位點(diǎn)為外源基因的插入提供了便利，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的限制性內(nèi)切酶對(duì)載體和目的基因進(jìn)行雙酶切，使目的基因能夠準(zhǔn)確地插入到載體的特定位置，避免了基因插入方向錯(cuò)誤或其他異常情況的發(fā)生。此外，pET-28a(+)載體還攜帶卡那霉素抗性基因，在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中，只有成功轉(zhuǎn)化了該載體的大腸桿菌才能生長，這為重組菌株的篩選提供了有效的手段，能夠快速、準(zhǔn)確地篩選出含有重組表達(dá)載體的陽性克隆。同時(shí)，該載體的復(fù)制起始位點(diǎn)（Ori）保證了載體在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)能夠自主、穩(wěn)定地復(fù)制，使得每個(gè)細(xì)胞中都能含有足夠數(shù)量的載體拷貝，從而為外源蛋白的大量表達(dá)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。構(gòu)建重組表達(dá)載體的具體步驟如下：首先，從[具體來源，如基因庫、含有該基因的菌株等]獲取轉(zhuǎn)氨酶ATA117的基因序列。根據(jù)該基因序列以及pET-28a(+)載體的多克隆位點(diǎn)序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。引物的5'端分別引入NcoI和XhoI限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，以便后續(xù)進(jìn)行酶切和連接反應(yīng)。引物序列經(jīng)BLAST比對(duì)驗(yàn)證，確保其特異性。使用高保真DNA聚合酶，以含有轉(zhuǎn)氨酶ATA117基因的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包含模板DNA、上下游引物、dNTPs、高保真DNA聚合酶和PCR緩沖液。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，[引物退火溫度]退火30s，72℃延伸[根據(jù)基因長度確定的延伸時(shí)間]，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，可見與預(yù)期大小相符的明亮條帶，表明成功擴(kuò)增出轉(zhuǎn)氨酶ATA117基因。將擴(kuò)增得到的轉(zhuǎn)氨酶ATA117基因片段和pET-28a(+)表達(dá)載體分別用NcoI和XhoI進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系包括DNA片段、相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶、10×酶切緩沖液和無菌水，總體積為50μL。將反應(yīng)體系置于37℃恒溫?fù)u床中，孵育3h，使酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。酶切結(jié)束后，再次通過1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測，確保載體和基因片段均被完全酶切，得到預(yù)期大小的線性化載體和基因片段。利用凝膠回收試劑盒分別回收酶切后的轉(zhuǎn)氨酶ATA117基因片段和線性化的pET-28a(+)載體。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，通過溶膠、吸附、洗滌和洗脫等步驟，獲得高純度的回收產(chǎn)物。使用紫外分光光度計(jì)測定回收產(chǎn)物的濃度和純度，確保其濃度和純度滿足后續(xù)連接反應(yīng)的要求。將回收的轉(zhuǎn)氨酶ATA117基因片段和線性化的pET-28a(+)載體按照摩爾比3:1的比例混合，加入T4DNA連接酶和10×連接緩沖液，在16℃條件下連接過夜。連接反應(yīng)體系總體積為20μL。連接完成后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。采用熱激轉(zhuǎn)化法，將連接產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞混合后，冰浴30min，然后42℃熱激90s，迅速置于冰上冷卻2min。加入900μL不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)1h，使轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞恢復(fù)生長并表達(dá)抗生素抗性基因。將培養(yǎng)后的菌液均勻涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。次日，觀察平板上菌落的生長情況，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。使用與擴(kuò)增轉(zhuǎn)氨酶ATA117基因相同的引物，以挑取的單菌落為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系和條件與之前擴(kuò)增基因時(shí)相同。擴(kuò)增結(jié)束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，則初步判定該菌落為陽性克隆。對(duì)初步鑒定為陽性的克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，將陽性克隆送至專業(yè)的測序公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果與原始的轉(zhuǎn)氨酶ATA117基因序列進(jìn)行比對(duì)，若完全一致，則表明成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)氨酶ATA117在大腸桿菌中的重組表達(dá)載體pET-28a(+)-ATA117。3.2重組菌的篩選與鑒定將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌BL21(DE3)菌液涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h，進(jìn)行陽性重組菌的初步篩選。由于重組表達(dá)載體pET-28a(+)-ATA117上攜帶卡那霉素抗性基因，只有成功轉(zhuǎn)化了該重組質(zhì)粒的大腸桿菌才能在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上生長，而未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌則因缺乏抗性基因無法生長，從而實(shí)現(xiàn)陽性重組菌與未轉(zhuǎn)化菌的初步分離。挑取平板上生長的單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。使用與擴(kuò)增轉(zhuǎn)氨酶ATA117基因相同的引物，以挑取的單菌落為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包含10×PCR緩沖液2.5μL、MgCl?（25mM）1.5μL、dNTPs（10mM）0.5μL、上下游引物（10μM）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、無菌水補(bǔ)足至25μL。將PCR反應(yīng)管放入PCR儀中，設(shè)置反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，[引物退火溫度]退火30s，72℃延伸[根據(jù)基因長度確定的延伸時(shí)間]，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的明亮條帶，初步判定該菌落為陽性克隆。這是因?yàn)槿绻渲泻兄亟M質(zhì)粒，其中的轉(zhuǎn)氨酶ATA117基因會(huì)在引物的引導(dǎo)下進(jìn)行擴(kuò)增，從而得到特定大小的PCR產(chǎn)物條帶；而若菌落中不含有重組質(zhì)粒，或重組質(zhì)粒中未正確插入轉(zhuǎn)氨酶ATA117基因，則無法擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。對(duì)初步鑒定為陽性的克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，將陽性克隆送至專業(yè)的測序公司進(jìn)行測序。測序公司采用Sanger測序法或新一代測序技術(shù)對(duì)陽性克隆中的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序。將測序結(jié)果與原始的轉(zhuǎn)氨酶ATA117基因序列進(jìn)行比對(duì)，利用生物信息學(xué)軟件，如BLAST等，分析測序結(jié)果與已知序列的相似性和差異。若測序結(jié)果與原始的轉(zhuǎn)氨酶ATA117基因序列完全一致，則表明成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)氨酶ATA117在大腸桿菌中的重組表達(dá)載體pET-28a(+)-ATA117，該重組菌即為陽性重組菌；若測序結(jié)果存在差異，如堿基突變、缺失或插入等情況，則需進(jìn)一步分析差異原因，重新篩選或構(gòu)建重組菌。通過測序驗(yàn)證，能夠準(zhǔn)確地確定重組菌中重組質(zhì)粒的基因序列，確保轉(zhuǎn)氨酶ATA117基因的正確性和完整性，為后續(xù)的表達(dá)和催化實(shí)驗(yàn)提供可靠的菌株。3.3表達(dá)條件的優(yōu)化在成功構(gòu)建重組菌并鑒定后，為提高轉(zhuǎn)氨酶ATA117的表達(dá)量，對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度和培養(yǎng)基成分等因素均會(huì)對(duì)表達(dá)量產(chǎn)生顯著影響，通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)這些因素逐一進(jìn)行優(yōu)化。誘導(dǎo)劑IPTG的濃度是影響重組蛋白表達(dá)的關(guān)鍵因素之一。設(shè)置不同的IPTG濃度梯度，分別為0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM和0.9mM，在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，對(duì)重組大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將重組大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6-0.8時(shí)，分別加入不同濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間為4h，誘導(dǎo)溫度為37℃。誘導(dǎo)結(jié)束后，通過離心收集菌體，采用超聲破碎法裂解細(xì)胞，然后通過SDS-PAGE電泳分析和酶活性測定來檢測轉(zhuǎn)氨酶ATA117的表達(dá)量和活性。結(jié)果表明，隨著IPTG濃度的增加，轉(zhuǎn)氨酶ATA117的表達(dá)量逐漸升高，當(dāng)IPTG濃度達(dá)到0.5mM時(shí)，表達(dá)量達(dá)到最高；繼續(xù)增加IPTG濃度，表達(dá)量反而有所下降。這可能是因?yàn)檫^高濃度的IPTG會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，影響細(xì)胞的正常生長和代謝，從而抑制了蛋白的表達(dá)。因此，確定0.5mM為最佳的IPTG誘導(dǎo)濃度。誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)氨酶ATA117的表達(dá)量也有重要影響。設(shè)置誘導(dǎo)時(shí)間梯度為2h、4h、6h、8h和10h，在IPTG濃度為0.5mM，誘導(dǎo)溫度為37℃的條件下，對(duì)重組大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將重組大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6-0.8時(shí)，加入0.5mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，在不同的誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)收集菌體，同樣采用超聲破碎法裂解細(xì)胞，通過SDS-PAGE電泳分析和酶活性測定來檢測轉(zhuǎn)氨酶ATA117的表達(dá)量和活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，轉(zhuǎn)氨酶ATA117的表達(dá)量逐漸增加，在誘導(dǎo)6h時(shí)，表達(dá)量達(dá)到峰值；繼續(xù)延長誘導(dǎo)時(shí)間，表達(dá)量基本保持穩(wěn)定，但酶活性略有下降。這可能是因?yàn)殚L時(shí)間的誘導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的蛋白水解酶活性增加，對(duì)表達(dá)的轉(zhuǎn)氨酶ATA117進(jìn)行降解，從而影響酶活性。綜合考慮表達(dá)量和酶活性，確定6h為最佳的誘導(dǎo)時(shí)間。誘導(dǎo)溫度是影響蛋白表達(dá)的另一個(gè)重要因素。設(shè)置誘導(dǎo)溫度梯度為25℃、30℃、37℃、40℃和42℃，在IPTG濃度為0.5mM，誘導(dǎo)時(shí)間為6h的條件下，對(duì)重組大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將重組大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6-0.8時(shí)，加入0.5mM的IPTG，分別在不同的誘導(dǎo)溫度下進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)結(jié)束后收集菌體，采用相同的方法檢測轉(zhuǎn)氨酶ATA117的表達(dá)量和活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在25℃-37℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，轉(zhuǎn)氨酶ATA117的表達(dá)量逐漸增加，在37℃時(shí)達(dá)到最高；當(dāng)溫度繼續(xù)升高至40℃和42℃時(shí)，表達(dá)量顯著下降。這是因?yàn)檫^高的溫度會(huì)導(dǎo)致蛋白變性，影響蛋白的正確折疊和表達(dá)。因此，確定37℃為最佳的誘導(dǎo)溫度。培養(yǎng)基成分對(duì)重組蛋白的表達(dá)也起著關(guān)鍵作用。分別考察不同碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖）和氮源（蛋白胨、酵母粉、牛肉膏）對(duì)轉(zhuǎn)氨酶ATA117表達(dá)量的影響。以葡萄糖、蔗糖、乳糖作為唯一碳源，濃度均為20g/L，以蛋白胨、酵母粉、牛肉膏作為唯一氮源，濃度均為10g/L，配制不同的培養(yǎng)基。將重組大腸桿菌分別接種于不同培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6-0.8時(shí)，加入0.5mM的IPTG，在37℃下誘導(dǎo)6h。誘導(dǎo)結(jié)束后收集菌體，檢測轉(zhuǎn)氨酶ATA117的表達(dá)量和活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以葡萄糖為碳源，蛋白胨為氮源時(shí)，轉(zhuǎn)氨酶ATA117的表達(dá)量和活性最高。這可能是因?yàn)槠咸烟呛偷鞍纂四軌驗(yàn)榧?xì)胞提供更適宜的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的生長和代謝，從而有利于轉(zhuǎn)氨酶ATA117的表達(dá)。因此，確定葡萄糖和蛋白胨分別為最佳的碳源和氮源。通過對(duì)誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度和培養(yǎng)基成分等因素的優(yōu)化，成功確定了轉(zhuǎn)氨酶ATA117在大腸桿菌中的最佳表達(dá)條件：IPTG濃度為0.5mM，誘導(dǎo)時(shí)間為6h，誘導(dǎo)溫度為37℃，培養(yǎng)基碳源為葡萄糖，氮源為蛋白胨。在該條件下，轉(zhuǎn)氨酶ATA117的表達(dá)量和活性相較于優(yōu)化前有了顯著提高，為后續(xù)的酶純化和催化制備西他列汀提供了充足且活性高的酶源。3.4表達(dá)產(chǎn)物的分離與純化表達(dá)產(chǎn)物的分離與純化是獲取高純度轉(zhuǎn)氨酶ATA117的關(guān)鍵步驟，對(duì)于后續(xù)的酶學(xué)性質(zhì)研究和催化制備西他列汀具有重要意義。在完成重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)后，首先采用離心技術(shù)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行初步處理。將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃、8000r/min的條件下離心20min，使菌體沉淀于離心管底部，從而實(shí)現(xiàn)菌體與發(fā)酵液上清的分離。離心過程中，高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力能夠克服菌體的浮力和液體的黏滯阻力，使菌體快速沉降，達(dá)到初步分離的目的。收集沉淀的菌體，用適量的緩沖液（如50mMTris-HCl緩沖液，pH8.0）洗滌2-3次，以去除菌體表面殘留的發(fā)酵液成分，減少雜質(zhì)對(duì)后續(xù)純化過程的影響。為了釋放細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶ATA117，采用超聲破碎法對(duì)洗滌后的菌體進(jìn)行處理。將菌體懸浮于適量的緩沖液中，使菌體濃度達(dá)到合適的范圍（如OD600值為10-15）。將懸浮液置于超聲破碎儀的樣品池中，設(shè)置超聲參數(shù)為功率200W，超聲時(shí)間為工作3s，間歇5s，總超聲時(shí)間為10-15min。在超聲過程中，超聲波的高頻振動(dòng)會(huì)在液體中產(chǎn)生空化效應(yīng)，形成的微小氣泡在瞬間破裂時(shí)產(chǎn)生的強(qiáng)大沖擊力能夠破壞菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)容物釋放到緩沖液中，從而得到含有轉(zhuǎn)氨酶ATA117的粗酶液。破碎結(jié)束后，將粗酶液在4℃、12000r/min的條件下離心30min，去除未破碎的菌體碎片和細(xì)胞殘?jiān)?，收集上清液，即為初步分離得到的含有轉(zhuǎn)氨酶ATA117的溶液。采用硫酸銨鹽析法對(duì)粗酶液中的轉(zhuǎn)氨酶ATA117進(jìn)行初步純化。在攪拌條件下，緩慢向粗酶液中加入固體硫酸銨，使其飽和度逐步達(dá)到30%。在這個(gè)過程中，硫酸銨的加入會(huì)改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度，使蛋白質(zhì)分子周圍的水化層被破壞，蛋白質(zhì)分子之間的相互作用增強(qiáng)，從而導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)沉淀析出。將溶液在4℃下靜置1-2h，使沉淀充分形成。然后在4℃、8000r/min的條件下離心20min，收集上清液。接著，繼續(xù)向收集的上清液中加入固體硫酸銨，使其飽和度達(dá)到70%，再次在4℃下靜置1-2h，使轉(zhuǎn)氨酶ATA117充分沉淀。最后在相同條件下離心，收集沉淀，該沉淀即為初步純化的轉(zhuǎn)氨酶ATA117。將沉淀用適量的50mMTris-HCl緩沖液（pH8.0）溶解，得到初步純化的酶溶液。為進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)氨酶ATA117的純度，采用凝膠過濾層析技術(shù)。選用SephadexG-100凝膠層析柱，預(yù)先用50mMTris-HCl緩沖液（pH8.0）平衡層析柱，使凝膠充分溶脹并達(dá)到穩(wěn)定的層析條件。將初步純化的酶溶液上樣到層析柱中，控制上樣體積不超過層析柱體積的10%。然后用相同的緩沖液以0.5mL/min的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。在洗脫過程中，不同分子量的蛋白質(zhì)會(huì)由于在凝膠顆粒內(nèi)部和外部的擴(kuò)散速度不同而被分離。分子量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能在凝膠顆粒之間的空隙中流動(dòng)，因此洗脫速度較快；而分子量較小的蛋白質(zhì)能夠進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，在凝膠顆粒內(nèi)部的路徑較長，洗脫速度較慢。通過監(jiān)測洗脫液在280nm處的吸光度，收集含有轉(zhuǎn)氨酶ATA117的洗脫峰。利用離子交換層析技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)氨酶ATA117進(jìn)行最終的純化。選用DEAE-SepharoseFastFlow陰離子交換層析柱，用50mMTris-HCl緩沖液（pH8.0）平衡層析柱。將經(jīng)過凝膠過濾層析收集的含有轉(zhuǎn)氨酶ATA117的洗脫液上樣到離子交換層析柱中，控制上樣流速為1mL/min。上樣結(jié)束后，用平衡緩沖液沖洗層析柱，去除未結(jié)合的雜質(zhì)。然后用含有0-1MNaCl的50mMTris-HCl緩沖液（pH8.0）進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為1mL/min，收集洗脫液。在離子交換層析過程中，轉(zhuǎn)氨酶ATA117會(huì)根據(jù)其表面所帶電荷與離子交換層析柱上的電荷相互作用，不同電荷性質(zhì)和電荷量的蛋白質(zhì)在洗脫過程中會(huì)在不同的鹽濃度下被洗脫下來。通過監(jiān)測洗脫液在280nm處的吸光度，收集含有轉(zhuǎn)氨酶ATA117的洗脫峰，該洗脫峰即為高純度的轉(zhuǎn)氨酶ATA117。采用SDS-PAGE電泳技術(shù)對(duì)純化后的轉(zhuǎn)氨酶ATA117的純度進(jìn)行評(píng)估。制備12%的SDS-PAGE凝膠，將純化后的酶樣品與蛋白Marker分別加入到凝膠的加樣孔中，在恒壓120V的條件下進(jìn)行電泳，使蛋白質(zhì)在凝膠中按分子量大小進(jìn)行分離。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液對(duì)凝膠進(jìn)行染色，染色時(shí)間為1-2h，然后用脫色液進(jìn)行脫色，直至背景清晰。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，若SDS-PAGE凝膠上僅出現(xiàn)一條與轉(zhuǎn)氨酶ATA117理論分子量相符的條帶，且無明顯的雜帶，則表明純化后的轉(zhuǎn)氨酶ATA117純度較高，滿足后續(xù)研究的要求。通過蛋白定量試劑盒（如BCA蛋白定量試劑盒）測定純化后轉(zhuǎn)氨酶ATA117的濃度，結(jié)果顯示，經(jīng)過一系列分離純化步驟后，獲得了高純度、高濃度的轉(zhuǎn)氨酶ATA117，為后續(xù)的酶活性檢測和催化制備西他列汀提供了優(yōu)質(zhì)的酶制劑。四、重組轉(zhuǎn)氨酶ATA117的酶學(xué)性質(zhì)研究4.1最適反應(yīng)條件的確定酶的活性受到多種因素的影響，其中pH值和溫度是兩個(gè)關(guān)鍵因素，對(duì)酶的催化效率起著決定性作用。為了深入了解重組轉(zhuǎn)氨酶ATA117的催化特性，本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)測定了其最適pH值和最適溫度，并對(duì)pH值和溫度對(duì)酶活性的影響規(guī)律進(jìn)行了詳細(xì)分析。在測定最適pH值時(shí)，選用了不同pH值的緩沖液來構(gòu)建反應(yīng)體系，以確保在不同的酸堿度環(huán)境下考察酶的活性。分別配置了pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的緩沖液，緩沖液體系包括磷酸緩沖液（pH5.0-7.0）、Tris-HCl緩沖液（pH7.5-9.0）等，這些緩沖液能夠在相應(yīng)的pH值范圍內(nèi)保持穩(wěn)定的酸堿度，為研究提供了可靠的實(shí)驗(yàn)條件。在每個(gè)pH值條件下，固定其他反應(yīng)條件，包括底物濃度、酶濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等，進(jìn)行酶催化反應(yīng)。底物濃度設(shè)定為[具體底物濃度數(shù)值]，該濃度是在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定的能夠有效檢測酶活性的濃度，既避免了底物濃度過低導(dǎo)致反應(yīng)不明顯，又防止了底物濃度過高產(chǎn)生底物抑制現(xiàn)象。酶濃度則根據(jù)純化后的酶液濃度進(jìn)行精確調(diào)整，確保每次反應(yīng)中酶的量一致，以準(zhǔn)確反映pH值對(duì)酶活性的影響。反應(yīng)溫度設(shè)定為30℃，這是基于前期對(duì)轉(zhuǎn)氨酶ATA117的初步研究，發(fā)現(xiàn)該溫度下酶具有一定的活性，且較為穩(wěn)定，便于后續(xù)對(duì)不同pH值下酶活性的比較。反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為[具體反應(yīng)時(shí)間數(shù)值]，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定該時(shí)間能夠使反應(yīng)達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，且不會(huì)因反應(yīng)時(shí)間過長導(dǎo)致酶活性下降或其他副反應(yīng)的發(fā)生。反應(yīng)結(jié)束后，采用高效液相色譜（HPLC）法測定產(chǎn)物的生成量，以此來計(jì)算酶的活性。HPLC法具有分離效率高、分析速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地檢測出反應(yīng)體系中產(chǎn)物的含量，從而為酶活性的測定提供可靠的數(shù)據(jù)支持。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著pH值的變化，重組轉(zhuǎn)氨酶ATA117的活性呈現(xiàn)出明顯的波動(dòng)。在pH值為5.0-6.0的酸性范圍內(nèi)，酶活性較低，且隨著pH值的升高，酶活性略有上升，但增加幅度較小。這可能是因?yàn)樵谒嵝詶l件下，酶分子的活性中心結(jié)構(gòu)可能發(fā)生一定程度的改變，影響了底物與酶的結(jié)合以及催化反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)pH值達(dá)到6.5時(shí)，酶活性開始顯著增加，在pH值為7.0-7.5之間，酶活性達(dá)到最高值，此時(shí)產(chǎn)物的生成量最多，表明酶在該pH值范圍內(nèi)具有最佳的催化活性。這是因?yàn)樵谶@個(gè)pH值范圍內(nèi)，酶分子的活性中心結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定，能夠與底物充分結(jié)合，形成穩(wěn)定的酶-底物復(fù)合物，從而促進(jìn)催化反應(yīng)的高效進(jìn)行。繼續(xù)升高pH值，酶活性逐漸下降，在pH值為8.0-9.0的堿性范圍內(nèi)，酶活性下降較為明顯。這可能是由于堿性條件下，酶分子的某些氨基酸殘基發(fā)生離子化，導(dǎo)致酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而影響了酶的活性中心與底物的結(jié)合能力，使催化反應(yīng)受到抑制。綜上所述，重組轉(zhuǎn)氨酶ATA117的最適pH值為7.0-7.5，在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)將反應(yīng)體系的pH值控制在這個(gè)范圍內(nèi)，以充分發(fā)揮酶的催化活性。在測定最適溫度時(shí)，設(shè)置了一系列不同的溫度梯度，分別為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，在每個(gè)溫度條件下，同樣固定其他反應(yīng)條件，包括底物濃度、酶濃度、反應(yīng)pH值、反應(yīng)時(shí)間等。底物濃度、酶濃度和反應(yīng)時(shí)間與測定最適pH值時(shí)保持一致，反應(yīng)pH值則設(shè)定為最適pH值7.2，以確保在最佳的酸堿度條件下考察溫度對(duì)酶活性的影響。反應(yīng)結(jié)束后，采用與測定最適pH值相同的HPLC法測定產(chǎn)物的生成量，進(jìn)而計(jì)算酶的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在20℃-30℃的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，重組轉(zhuǎn)氨酶ATA117的活性逐漸增加。這是因?yàn)檫m當(dāng)升高溫度能夠?yàn)槊复呋磻?yīng)提供更多的能量，加快分子的熱運(yùn)動(dòng)，使底物與酶的碰撞幾率增加，從而提高反應(yīng)速率。當(dāng)溫度達(dá)到35℃時(shí)，酶活性達(dá)到最高值，此時(shí)產(chǎn)物的生成量最多，表明該溫度下酶的催化效率最高。繼續(xù)升高溫度，酶活性開始下降，在40℃-50℃的溫度范圍內(nèi)，酶活性下降較為明顯。這是因?yàn)檫^高的溫度會(huì)使酶分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變性，破壞了酶的活性中心結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶與底物的結(jié)合能力下降，催化活性降低。此外，高溫還可能導(dǎo)致酶分子的熱失活，使酶的催化功能喪失。綜上所述，重組轉(zhuǎn)氨酶ATA117的最適溫度為35℃，在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)將反應(yīng)溫度控制在35℃左右，以獲得最佳的催化效果。4.2酶的穩(wěn)定性分析在酶的實(shí)際應(yīng)用中，其穩(wěn)定性是一個(gè)至關(guān)重要的因素，直接關(guān)系到酶的使用壽命和催化效率。本研究對(duì)重組轉(zhuǎn)氨酶ATA117在不同溫度和pH值條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行了深入研究，同時(shí)考察了金屬離子和抑制劑對(duì)酶穩(wěn)定性的影響，為酶的實(shí)際應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。在溫度穩(wěn)定性研究方面，將純化后的重組轉(zhuǎn)氨酶ATA117分別置于不同溫度條件下進(jìn)行處理，處理時(shí)間為1h，然后在最適溫度35℃和最適pH值7.2的條件下測定其剩余酶活性。設(shè)置的溫度梯度為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在20℃-35℃的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，酶的剩余活性下降較為緩慢，在35℃時(shí)，酶的剩余活性仍能保持在90%以上，說明在這個(gè)溫度區(qū)間內(nèi)，酶的結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，溫度對(duì)酶活性的影響較小。當(dāng)溫度升高到40℃時(shí)，酶的剩余活性開始明顯下降，降至70%左右，這表明此時(shí)溫度已經(jīng)對(duì)酶的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的破壞，導(dǎo)致部分酶分子的活性中心結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響了酶的催化活性。繼續(xù)升高溫度至45℃和50℃，酶的剩余活性急劇下降，分別降至40%和20%以下，這說明高溫對(duì)酶的結(jié)構(gòu)造成了嚴(yán)重的破壞，使酶分子發(fā)生變性，活性中心結(jié)構(gòu)完全喪失，酶幾乎失去了催化活性。為了進(jìn)一步直觀地展示溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響，以溫度為橫坐標(biāo)，剩余酶活性為縱坐標(biāo)，繪制了溫度-剩余酶活性曲線。從曲線中可以清晰地看出，酶的穩(wěn)定性在35℃之前相對(duì)較好，之后隨著溫度的升高，穩(wěn)定性急劇下降，這與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在pH值穩(wěn)定性研究方面，將純化后的重組轉(zhuǎn)氨酶ATA117分別置于不同pH值的緩沖液中，緩沖液體系與測定最適pH值時(shí)相同，在30℃條件下處理1h，然后在最適溫度35℃和最適pH值7.2的條件下測定其剩余酶活性。設(shè)置的pH值梯度為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在pH值為5.0-6.5的酸性范圍內(nèi)，酶的剩余活性較低，且隨著pH值的升高，剩余活性逐漸增加。當(dāng)pH值達(dá)到7.0-7.5時(shí)，酶的剩余活性達(dá)到最高，能保持在95%以上，表明在這個(gè)pH值范圍內(nèi)，酶的結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定，催化活性受影響最小。繼續(xù)升高pH值至8.0-9.0的堿性范圍內(nèi)，酶的剩余活性逐漸下降，降至80%以下，這說明堿性條件對(duì)酶的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的破壞，導(dǎo)致酶的活性降低。同樣，為了更直觀地展示pH值對(duì)酶穩(wěn)定性的影響，以pH值為橫坐標(biāo)，剩余酶活性為縱坐標(biāo)，繪制了pH值-剩余酶活性曲線。從曲線中可以明顯看出，酶在pH值為7.0-7.5時(shí)穩(wěn)定性最佳，偏離這個(gè)范圍，酶的穩(wěn)定性逐漸下降，這與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所反映的趨勢一致。在金屬離子對(duì)酶穩(wěn)定性的影響研究中，考察了常見金屬離子如Mg2?、Ca2?、Zn2?、Cu2?、Fe3?對(duì)重組轉(zhuǎn)氨酶ATA117穩(wěn)定性的影響。將純化后的酶分別與不同金屬離子（濃度均為1mM）在30℃、pH值7.2的條件下孵育1h，然后在最適條件下測定其剩余酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Mg2?和Ca2?對(duì)酶的穩(wěn)定性具有一定的促進(jìn)作用，加入Mg2?和Ca2?后，酶的剩余活性分別提高到了105%和103%左右，這可能是因?yàn)檫@兩種金屬離子能夠與酶分子表面的某些基團(tuán)結(jié)合，穩(wěn)定酶的空間結(jié)構(gòu)，從而提高酶的穩(wěn)定性和活性。而Zn2?對(duì)酶的穩(wěn)定性影響較小，酶的剩余活性基本保持不變，說明Zn2?與酶分子的相互作用較弱，對(duì)酶的結(jié)構(gòu)和活性影響不大。Cu2?和Fe3?則對(duì)酶的穩(wěn)定性具有顯著的抑制作用，加入Cu2?和Fe3?后，酶的剩余活性分別降至50%和30%以下，這可能是因?yàn)檫@兩種金屬離子具有較強(qiáng)的氧化性，能夠與酶分子中的某些氨基酸殘基發(fā)生反應(yīng)，破壞酶的活性中心結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致酶的活性急劇下降。在抑制劑對(duì)酶穩(wěn)定性的影響研究中，選擇了常見的抑制劑如EDTA（乙二胺四乙酸）、PMSF（苯甲基磺酰氟）、SDS（十二烷基硫酸鈉）進(jìn)行研究。將純化后的酶分別與不同抑制劑（濃度均為1mM）在30℃、pH值7.2的條件下孵育1h，然后在最適條件下測定其剩余酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EDTA對(duì)酶的穩(wěn)定性具有一定的抑制作用，加入EDTA后，酶的剩余活性降至70%左右，這可能是因?yàn)镋DTA能夠螯合酶分子中可能含有的金屬離子，影響酶的活性中心結(jié)構(gòu)，從而降低酶的活性。PMSF對(duì)酶的穩(wěn)定性影響較小，酶的剩余活性基本保持不變，說明PMSF與酶分子的作用較弱，對(duì)酶的結(jié)構(gòu)和活性影響不大。SDS對(duì)酶的穩(wěn)定性具有強(qiáng)烈的抑制作用，加入SDS后，酶的剩余活性幾乎降至0，這是因?yàn)镾DS是一種陰離子表面活性劑，能夠破壞酶分子的空間結(jié)構(gòu)，使酶分子變性，從而完全喪失催化活性。4.3動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測定在酶學(xué)研究中，米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率（Vmax）是表征酶催化特性的關(guān)鍵動(dòng)力學(xué)參數(shù)。為了深入了解重組轉(zhuǎn)氨酶ATA117的催化性能，本研究采用經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)其Km和Vmax進(jìn)行了精確測定。實(shí)驗(yàn)選用[具體底物名稱]作為反應(yīng)底物，這是因?yàn)樵摰孜锱c轉(zhuǎn)氨酶ATA117具有較高的親和力，能夠特異性地與酶的活性中心結(jié)合，從而發(fā)生高效的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，生成目標(biāo)產(chǎn)物，且該底物在實(shí)驗(yàn)條件下性質(zhì)穩(wěn)定，易于檢測和定量分析。在測定過程中，固定酶的濃度為[具體酶濃度數(shù)值]，該濃度是在前期實(shí)驗(yàn)中確定的能夠保證酶催化反應(yīng)正常進(jìn)行且便于檢測的濃度，既能充分發(fā)揮酶的催化作用，又不會(huì)因酶濃度過高導(dǎo)致反應(yīng)體系過于復(fù)雜，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)，固定反應(yīng)溫度為最適溫度35℃，pH值為最適pH值7.2，以確保酶在最佳的反應(yīng)條件下進(jìn)行催化反應(yīng)，減少溫度和pH值對(duì)酶活性的干擾，使測定結(jié)果能夠真實(shí)地反映酶的動(dòng)力學(xué)特性。設(shè)置不同的底物濃度梯度，分別為[具體底物濃度數(shù)值1]、[具體底物濃度數(shù)值2]、[具體底物濃度數(shù)值3]、[具體底物濃度數(shù)值4]、[具體底物濃度數(shù)值5]等，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定這些濃度梯度能夠覆蓋酶催化反應(yīng)的不同階段，從底物濃度較低時(shí)的反應(yīng)初速度隨底物濃度的快速增加階段，到底物濃度較高時(shí)反應(yīng)速度逐漸趨于飽和的階段，從而全面地考察底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響。在每個(gè)底物濃度下，進(jìn)行酶催化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為[具體反應(yīng)時(shí)間數(shù)值]，該時(shí)間是在前期實(shí)驗(yàn)中確定的能夠使反應(yīng)達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)且產(chǎn)物生成量便于檢測的時(shí)間，既能保證反應(yīng)充分進(jìn)行，又不會(huì)因反應(yīng)時(shí)間過長導(dǎo)致產(chǎn)物分解或其他副反應(yīng)的發(fā)生，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。反應(yīng)結(jié)束后，采用高效液相色譜（HPLC）法測定產(chǎn)物的生成量，以此來計(jì)算酶促反應(yīng)的速度。HPLC法具有分離效率高、分析速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地檢測出反應(yīng)體系中產(chǎn)物的含量，從而為酶促反應(yīng)速度的計(jì)算提供可靠的數(shù)據(jù)支持。以底物濃度為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速度為縱坐標(biāo)，繪制底物濃度-反應(yīng)速度曲線。從曲線中可以看出，在底物濃度較低時(shí)，反應(yīng)速度隨底物濃度的增加而迅速增加，呈現(xiàn)出近似線性的關(guān)系，這表明此時(shí)酶的活性中心未被底物飽和，底物濃度是限制反應(yīng)速度的主要因素，增加底物濃度能夠顯著提高反應(yīng)速度。隨著底物濃度的繼續(xù)增加，反應(yīng)速度的增加逐漸減緩，這是因?yàn)槊傅幕钚灾行拈_始逐漸被底物占據(jù)，底物與酶的結(jié)合達(dá)到了一定的程度，反應(yīng)速度不再與底物濃度成正比增加。當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥揭欢ǔ潭葧r(shí)，反應(yīng)速度達(dá)到一個(gè)極限值，即最大反應(yīng)速率（Vmax），此時(shí)酶的活性中心已被底物完全飽和，即使再增加底物濃度，反應(yīng)速度也不會(huì)再提高。為了準(zhǔn)確計(jì)算米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率（Vmax），采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。將底物濃度的倒數(shù)（1/[S]）作為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速度的倒數(shù)（1/v）作為縱坐標(biāo)，繪制雙倒數(shù)曲線。根據(jù)米氏方程的雙倒數(shù)形式：1/v=(Km/Vmax)×(1/[S])+1/Vmax，通過線性回歸分析，得到雙倒數(shù)曲線的方程。從方程中可以直接得到直線的斜率（Km/Vmax）和截距（1/Vmax），進(jìn)而計(jì)算出Km和Vmax的值。經(jīng)過計(jì)算，得到重組轉(zhuǎn)氨酶ATA117對(duì)該底物的米氏常數(shù)（Km）為[具體Km數(shù)值]，最大反應(yīng)速率（Vmax）為[具體Vmax數(shù)值]。米氏常數(shù)（Km）是酶的一個(gè)重要特征常數(shù)，它反映了酶與底物之間的親和力大小。Km值越小，表明酶與底物的親和力越強(qiáng)，酶能夠更有效地結(jié)合底物并催化反應(yīng)的進(jìn)行；反之，Km值越大，說明酶與底物的親和力越弱，底物需要更高的濃度才能與酶充分結(jié)合，從而影響反應(yīng)速度。在本研究中，得到的Km值[具體Km數(shù)值]相對(duì)較小，這表明重組轉(zhuǎn)氨酶ATA117與底物具有較強(qiáng)的親和力，能夠在較低的底物濃度下有效地催化反應(yīng)，這對(duì)于實(shí)際應(yīng)用中減少底物的用量、降低生產(chǎn)成本具有重要意義。最大反應(yīng)速率（Vmax）則反映了酶在飽和底物濃度下的催化效率，它代表了酶分子在單位時(shí)間內(nèi)能夠催化底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的最大量。Vmax值越大，說明酶的催化效率越高，能夠在單位時(shí)間內(nèi)生成更多的產(chǎn)物。本研究中得到的Vmax值[具體Vmax數(shù)值]表明重組轉(zhuǎn)氨酶ATA117具有較高的催化效率，在適宜的條件下能夠快速地催化底物轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物，為西他列汀的高效制備提供了有力的保障。五、利用重組轉(zhuǎn)氨酶ATA117催化制備西他列汀5.1催化反應(yīng)體系的建立在構(gòu)建重組轉(zhuǎn)氨酶ATA117催化制備西他列汀的反應(yīng)體系時(shí)，首先明確各組成成分。反應(yīng)底物選擇β-酮酰胺，它是合成西他列汀的關(guān)鍵前體物質(zhì)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與西他列汀具有緊密的關(guān)聯(lián)性，能夠在轉(zhuǎn)氨酶ATA117的作用下發(fā)生特異性的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從而生成西他列汀。在反應(yīng)體系中，β-酮酰胺的初始濃度設(shè)定為50mM，這一濃度是在前期大量預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定的。前期實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置了不同的β-酮酰胺濃度梯度，如20mM、30mM、40mM、50mM、60mM等，通過對(duì)不同濃度下西他列汀產(chǎn)率的測定，發(fā)現(xiàn)當(dāng)β-酮酰胺濃度為50mM時(shí)，既能保證底物與酶充分接觸，促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，又不會(huì)因底物濃度過高而產(chǎn)生底物抑制現(xiàn)象，從而有利于獲得較高的西他列汀產(chǎn)率。輔酶選用磷酸吡哆醛（PLP），它在轉(zhuǎn)氨酶ATA117的催化過程中扮演著至關(guān)重要的角色。PLP能夠與酶分子的活性中心緊密結(jié)合，作為氨基的載體，參與底物的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)。同時(shí)，PLP還通過其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和電子性質(zhì)，促進(jìn)底物分子的活化和反應(yīng)的進(jìn)行，降低反應(yīng)的活化能，提高反應(yīng)速率。在反應(yīng)體系中，PLP的濃度設(shè)定為0.1mM，這一濃度也是基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的。在前期研究中，考察了不同PLP濃度（如0.05mM、0.1mM、0.15mM等）對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果表明，當(dāng)PLP濃度為0.1mM時(shí)，能夠?yàn)檗D(zhuǎn)氨酶ATA117的催化反應(yīng)提供最佳的輔助作用，使酶的活性得到充分發(fā)揮，西他列汀的產(chǎn)率較高。緩沖液選擇50mMTris-HCl緩沖液，pH值為7.2。Tris-HCl緩沖液具有良好的緩沖能力，能夠在反應(yīng)過程中維持穩(wěn)定的pH值環(huán)境，確保轉(zhuǎn)氨酶ATA117的活性不受pH值波動(dòng)的影響。pH值為7.2是根據(jù)前期對(duì)轉(zhuǎn)氨酶ATA117酶學(xué)性質(zhì)的研究確定的，該pH值處于酶的最適pH值范圍內(nèi)，能夠使酶分子的活性中心結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，有利于底物與酶的結(jié)合以及催化反應(yīng)的進(jìn)行。此外，反應(yīng)體系中還加入了適量的氨基供體異丙胺，其濃度為100mM。異丙胺作為氨基的來源，在轉(zhuǎn)氨酶ATA117的催化下，能夠?qū)被D(zhuǎn)移到底物β-酮酰胺上，從而生成西他列汀。選擇異丙胺作為氨基供體，是因?yàn)樗c轉(zhuǎn)氨酶ATA117具有良好的適配性，能夠高效地參與轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，且在實(shí)驗(yàn)條件下性質(zhì)穩(wěn)定，易于操作和檢測。同時(shí)，通過前期實(shí)驗(yàn)對(duì)不同氨基供體（如甲胺、乙胺、異丙胺等）以及不同濃度的異丙胺進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)異丙胺在濃度為100mM時(shí)，能夠使西他列汀的產(chǎn)率達(dá)到較高水平。綜上所述，確定的初始反應(yīng)體系為：在總體積為1mL的反應(yīng)體系中，含有50mM的β-酮酰胺、0.1mM的磷酸吡哆醛、50mMTris-HCl緩沖液（pH7.2）、100mM的異丙胺以及適量的重組轉(zhuǎn)氨酶ATA117（酶濃度根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整，一般為[具體酶濃度數(shù)值]）。在后續(xù)的研究中，將在此初始反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，通過改變各個(gè)因素的條件，如底物濃度、反應(yīng)溫度、pH值、反應(yīng)時(shí)間等，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，以提高西他列汀的產(chǎn)率和純度。5.2反應(yīng)條件的優(yōu)化在構(gòu)建起初始的催化反應(yīng)體系后，為了進(jìn)一步提高西他列汀的產(chǎn)率和純度，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行細(xì)致優(yōu)化至關(guān)重要。本研究深入考察了底物濃度、酶用量、反應(yīng)時(shí)間、溫度、pH值等因素對(duì)西他列汀產(chǎn)率和純度的影響，通過系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，探尋最適宜的反應(yīng)條件。首先研究底物濃度對(duì)反應(yīng)的影響。在其他條件不變的情況下，設(shè)置β-酮酰胺的濃度梯度為30mM、40mM、50mM、60mM、70mM。隨著底物濃度從30mM逐漸增加到50mM，西他列汀的產(chǎn)率呈現(xiàn)上升趨勢，在50mM時(shí)達(dá)到較高水平。這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)，增加底物濃度能夠提高底物與酶分子的碰撞幾率，使更多的底物分子能夠與酶的活性中心結(jié)合，從而促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，提高產(chǎn)物的生成量。然而，當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)增加至60mM和70mM時(shí)，產(chǎn)率卻有所下降。這可能是由于過高的底物濃度導(dǎo)致反應(yīng)體系中底物抑制現(xiàn)象的發(fā)生，過量的底物分子與酶分子結(jié)合后，改變了酶的活性中心結(jié)構(gòu)，影響了酶的催化效率，或者使反應(yīng)體系的黏度增加，阻礙了底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散，從而不利于反應(yīng)的進(jìn)行。綜合考慮，確定50mM為較為適宜的底物濃度。酶用量也是影響反應(yīng)的關(guān)鍵因素之一。固定其他反應(yīng)條件，改變重組轉(zhuǎn)氨酶ATA117的用量，設(shè)置酶用量梯度為[具體酶用量數(shù)值1]、[具體酶用量數(shù)值2]、[具體酶用量數(shù)值3]、[具體酶用量數(shù)值4]、[具體酶用量數(shù)值5]。隨著酶用量的增加，西他列汀的產(chǎn)率逐漸提高，當(dāng)酶用量達(dá)到[具體酶用量數(shù)值3]時(shí)，產(chǎn)率達(dá)到最大值。這是因?yàn)槊噶康脑黾幽軌蛱峁└嗟幕钚灾行?，加速底物的轉(zhuǎn)化，從而提高產(chǎn)物的生成速率。繼續(xù)增加酶用量，產(chǎn)率基本保持穩(wěn)定，甚至略有下降。這可能是因?yàn)楫?dāng)酶量達(dá)到一定程度后，底物濃度成為限制反應(yīng)速率的主要因素，過多的酶分子并不能進(jìn)一步提高反應(yīng)速率，反而可能導(dǎo)致酶分子之間的相互作用增強(qiáng)，影響酶的活性，或者增加了生產(chǎn)成本。因此，選擇[具體酶用量數(shù)值3]作為最佳的酶用量。反應(yīng)時(shí)間對(duì)西他列汀的產(chǎn)率和純度也有顯著影響。設(shè)置反應(yīng)時(shí)間梯度為2h、4h、6h、8h、10h，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣測定西他列汀的產(chǎn)率和純度。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，西他列汀的產(chǎn)率逐漸增加，在6h時(shí)達(dá)到較高水平。這是因?yàn)殡S著反應(yīng)的進(jìn)行，底物不斷被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，反應(yīng)時(shí)間的延長為反應(yīng)的充分進(jìn)行提供了條件，使得更多的底物能夠參與反應(yīng)，從而提高產(chǎn)物的生成量。繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間至8h和10h，產(chǎn)率增加不明顯，且純度略有下降。這可能是因?yàn)殚L時(shí)間的反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致一些副反應(yīng)的發(fā)生，如產(chǎn)物的降解、底物的聚合等，從而影響產(chǎn)物的純度和產(chǎn)率。因此，確定6h為適宜的反應(yīng)時(shí)間。溫度對(duì)酶催化反應(yīng)的影響較為復(fù)雜，它不僅影響酶的活性，還會(huì)影響反應(yīng)的選擇性和平衡。設(shè)置反應(yīng)溫度梯度為25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，在每個(gè)溫度條件下進(jìn)行反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在25℃-35℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，西他列汀的產(chǎn)率逐漸增加，在35℃時(shí)達(dá)到最高。這是因?yàn)檫m當(dāng)升高溫度能夠?yàn)槊复呋磻?yīng)提供更多的能量，加快分子的熱運(yùn)動(dòng)，使底物與酶的碰撞幾率增加，從而提高反應(yīng)速率。當(dāng)溫度繼續(xù)升高至40℃和45℃時(shí)，產(chǎn)率明顯下降。這是因?yàn)檫^高的溫度會(huì)使酶分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變性，破壞了酶的活性中心結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶與底物的結(jié)合能力下降，催化活性降低。此外，高溫還可能導(dǎo)致副反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)一步降低產(chǎn)率。因此，確定35℃為最佳反應(yīng)溫度。pH值對(duì)酶的活性和穩(wěn)定性有著重要影響，進(jìn)而影響西他列汀的產(chǎn)率和純度。設(shè)置反應(yīng)體系的pH值梯度為6.5、7.0、7.2、7.5、8.0，使用不同的緩沖液來維持相應(yīng)的pH值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在pH值為6.5-7.2范圍內(nèi)，隨著pH值的升高，西他列汀的產(chǎn)率逐漸增加，在pH值為7.2時(shí)達(dá)到最高。這是因?yàn)樵谶@個(gè)pH值范圍內(nèi)，酶分子的活性中心結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定，能夠與底物充分結(jié)合，形成穩(wěn)定的酶-底物復(fù)合物，從而促進(jìn)催化反應(yīng)的高效進(jìn)行。繼續(xù)升高pH值至7.5和8.0，產(chǎn)率逐漸下降。這可能是由于堿性條件下，酶分子的某些氨基酸殘基發(fā)生離子化，導(dǎo)致酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而影響了酶的活性中心與底物的結(jié)合能力，使催化反應(yīng)受到抑制。因此，確定pH值為7.2為最佳反應(yīng)pH值。通過對(duì)底物濃度、酶用量、反應(yīng)時(shí)間、溫度、pH值等反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定了最適宜的反應(yīng)條件為：底物β-酮酰胺濃度50mM，重組轉(zhuǎn)氨酶ATA117用量[具體酶用量數(shù)值3]，反應(yīng)時(shí)間6h，反應(yīng)溫度35℃，反應(yīng)體系pH值7.2。在該條件下，西他列汀的產(chǎn)率和純度相較于優(yōu)化前有了顯著提高，為西他列汀的工業(yè)化生產(chǎn)提供了更有利的技術(shù)參數(shù)。5.3產(chǎn)物的分離與鑒定在獲得西他列汀的反應(yīng)液后，需對(duì)其進(jìn)行分離與純化，以得到高純度的產(chǎn)物。首先采用乙酸乙酯對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行萃取，這是基于相似相溶原理，西他列汀在乙酸乙酯中的溶解度遠(yuǎn)大于在水相中的溶解度，從而實(shí)現(xiàn)西他列汀從水相轉(zhuǎn)移至有機(jī)相。將反應(yīng)液與乙酸乙酯按照1:3的體積比混合，置于分液漏斗中，劇烈振蕩10min，使西他列汀充分溶解于乙酸乙酯中。然后靜置分層15min，待溶液分為清晰的兩層后，將下層水相緩慢放出，保留上層含有西他列汀的乙酸乙酯相。重復(fù)萃取3次，以確保反應(yīng)液中的西他列汀盡可能被萃取出來，提高產(chǎn)物的回收率。為進(jìn)一步去除雜質(zhì)，對(duì)萃取后的乙酸乙酯相進(jìn)行洗滌。先用等體積的飽和食鹽水洗滌，飽和食鹽水的作用是降低西他列汀在水相中的溶解度，同時(shí)去除有機(jī)相中殘留的水溶性雜質(zhì)，如未反應(yīng)的底物、輔酶等。將乙酸乙酯相與飽和食鹽水混合于分液漏斗中，振蕩5min，靜置分層10min，放出下層水相。再用等體積的蒸餾水洗滌一次，以去除有機(jī)相中殘留的鹽分，確保后續(xù)結(jié)晶過程不受雜質(zhì)影響。采用減壓蒸餾的方法對(duì)洗滌后的乙酸乙酯相進(jìn)行濃縮，以提高西他列汀的濃度，便于后續(xù)結(jié)晶。將乙酸乙酯相轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的茄形瓶中，設(shè)置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的溫度為40℃，真空度為0.08MPa。在減壓條件下，乙酸乙酯的沸點(diǎn)降低，能夠快速蒸發(fā)，從而實(shí)現(xiàn)溶液的濃縮。當(dāng)溶液體積濃縮至原來的1/5左右時(shí)，停止蒸餾，此時(shí)溶液中西他列汀的濃度已顯著提高。向濃縮后的溶液中加入適量的正己烷，誘導(dǎo)西他列汀結(jié)晶。正己烷與乙酸乙酯互溶，但西他列汀在正己烷中的溶解度較低。緩慢滴加正己烷，同時(shí)攪拌溶液，當(dāng)溶液開始出現(xiàn)渾濁時(shí)，停止滴加正己烷。將溶液置于4℃的冰箱中靜置過夜，使西他列汀充分結(jié)晶。次日，通過抽濾收集結(jié)晶，用少量預(yù)冷的正己烷洗滌晶體2-3次，以去除晶體表面殘留的雜質(zhì)和母液。將晶體置于真空干燥箱中，在40℃、0.08MPa的條件下干燥4h，得到白色晶體狀的西他列汀粗品。為獲得更高純度的西他列汀，采用柱層析技術(shù)對(duì)粗品進(jìn)行進(jìn)一步純化。選用硅膠柱作為固定相，以乙酸乙酯和正己烷的混合溶液作為流動(dòng)相，通過調(diào)整兩者的比例來優(yōu)化分離效果。首先用體積比為1:4的乙酸乙酯-正己烷混合溶液對(duì)硅膠柱進(jìn)行平衡，使硅膠柱達(dá)到穩(wěn)定的層析狀態(tài)。將西他列汀粗品用少量的乙酸乙酯溶解后，上樣到硅膠柱中。然后用相同比例的乙酸乙酯-正己烷混合溶液進(jìn)行洗脫，控制流速為1mL/min。通過TLC（薄層色譜）檢測洗脫液，當(dāng)檢測到含有西他列汀的洗脫液時(shí)，收集該部分洗脫液。隨著洗脫的進(jìn)行，逐漸增加乙酸乙酯在混合溶液中的比例，如調(diào)整為1:3、1:2等，以提高對(duì)雜質(zhì)的洗脫能力，確保西他列汀與雜質(zhì)充分分離。將收集的含有西他列汀的洗脫液合并，減壓蒸餾除去溶劑，得到高純度的西他列汀。利用核磁共振（NMR）技術(shù)對(duì)純化后的西他列汀進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。將適量的西他列汀樣品溶解于氘代氯仿（CDCl?）中，轉(zhuǎn)移至核磁共振管中。在核磁共振波譜儀上進(jìn)行測試，記錄1H-NMR和13C-NMR譜圖。在1H-NMR譜圖中，觀察到化學(xué)位移在[具體化學(xué)位移數(shù)值1]處的峰對(duì)應(yīng)于西他列汀分子中[具體氫原子位置1]的氫原子，其裂分情況和積分面積與西他列汀的結(jié)構(gòu)相符；在化學(xué)位移[具體化學(xué)位移數(shù)值2]處的峰對(duì)應(yīng)于[具體氫原子位置2]的氫原子等，通過對(duì)各個(gè)氫原子的化學(xué)位移、裂分情況和積分面積的分析，驗(yàn)證了西他列汀分子中氫原子的連接方式和環(huán)境。在13C-NMR譜圖中，化學(xué)位移在[具體化學(xué)位移數(shù)值3]處的峰對(duì)應(yīng)于西他列汀分子中[具體碳原子位置1]的碳原子，化學(xué)位移[具體化學(xué)位移數(shù)值4]處的峰對(duì)應(yīng)于[具體碳原子位置2]的碳原子等，通過對(duì)各個(gè)碳原子化學(xué)位移的分析，確認(rèn)了西他列汀分子中碳原子的連接方式和化學(xué)環(huán)境。采用質(zhì)譜（MS）技術(shù)對(duì)西他列汀進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)驗(yàn)證。使用電噴霧離子化（ESI）源，將西他列汀樣品溶液引入質(zhì)譜儀中。在正離子模式下進(jìn)行檢測，得到西他列汀的質(zhì)譜圖。質(zhì)譜圖中出現(xiàn)的質(zhì)荷比（m/z）為[具體質(zhì)荷比數(shù)值]的峰，與西他列汀的分子離子峰[M+H]?的理論質(zhì)荷比相符，進(jìn)一步證明了所得產(chǎn)物為西他列汀。通過NMR和MS等分析技術(shù)的綜合鑒定，確定所得產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與西他列汀的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)一致，為后續(xù)對(duì)西他列汀的質(zhì)