ICS65.020.30

CCSB41

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T4019—2025

馬腸道乳酸菌的篩選及鑒定技術(shù)規(guī)程

Codeofpracticeforscreeningandidentificationoflacticacid

bacteriainequinegut

2025-04-30發(fā)布2025-05-30實(shí)施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T4019—2025

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC19）歸口。

本文件起草單位：內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院、內(nèi)蒙古草原御驢科技牧業(yè)有限公司、內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)、杭

錦旗農(nóng)牧技術(shù)推廣中心、內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)、內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心、內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)畜產(chǎn)品

質(zhì)量安全中心、烏拉特中旗畜牧和水產(chǎn)服務(wù)中心。

本文件主要起草人：蘇少鋒、吳海青、趙一萍、耿傲盼、李建、張心壯、薄素玲、黃瑤、喬健敏、

高天、白晉宇、張勇偉、陳越、孫培陪、史艷英、羅杰、余彪、聶麗珍、王宇勝、烏仁塔娜、賈軍、海

旭冉、劉永、武玉平、郝治華、徐超、郝海忠、周姵諾、王春浩、馬曉彤、趙娜。

I

DB15/T4019—2025

馬腸道乳酸菌的篩選及鑒定技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了馬腸道乳酸菌的篩選及鑒定的材料和技術(shù)要求。

本文件適用于馬腸道乳酸菌的篩選及鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB4789.2食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定

GB4789.28-2024食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求

GB4789.35-2023食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)

GB7300.502-2023飼料添加劑第5部分：微生物植物乳桿菌

GB/T38483微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物抗細(xì)菌活性測(cè)定抑菌圈法

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4材料與設(shè)備

材料

4.1.1試驗(yàn)菌株

從馬腸道的內(nèi)容物與黏膜中分離的乳酸菌。

4.1.2指示菌株

傷寒沙門氏菌（SalmonellatyphimuriumCMCC（B）50071）、大腸埃希氏菌（Escherichiacoli

ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（StaphylococcusaureusCMCC（B）26003）。

儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)中用到的儀器設(shè)備按照附錄A中A.1執(zhí)行。

試劑與耗材

4.3.1試劑

實(shí)驗(yàn)中用到的試劑按照附錄A中A.2執(zhí)行。

1

DB15/T4019—2025

試劑質(zhì)量和培養(yǎng)基制備質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)按照GB4789.28執(zhí)行。

4.3.2耗材

實(shí)驗(yàn)中用到的耗材按照附錄A中A.3執(zhí)行。

溶液配制

按照附錄A中A.4執(zhí)行。

5乳酸菌的篩選

乳酸菌的分離、純化

5.1.1取樣部位

馬盲腸、結(jié)腸或直腸。

5.1.2分離方法

5.1.2.1樣品制備按照GB4789.35-2023中6.1.4部分執(zhí)行。

5.1.2.2稀釋按照GB4789.35-2023中6.2.1和6.2.2部分執(zhí)行。

5.1.2.3分別吸取200μL10-5g/mL～10-7g/mL稀釋液，涂布在MRS瓊脂培養(yǎng)基（含有溴甲酚紫）上，

37℃厭氧培養(yǎng)24h～36h，挑取產(chǎn)酸變黃的單菌落進(jìn)行純化。

5.1.3純化

按照GB4789.35-2023中8.1.1部分執(zhí)行。

復(fù)篩

5.2.1石蕊牛奶顯色

使用96孔板，吸取麥?zhǔn)蠞岫葹?.5的菌懸液20μL于200μL石蕊牛奶培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24

h，挑選使培養(yǎng)基呈粉色凝乳狀態(tài)的菌株。

5.2.2工作菌液的制備

吸取麥?zhǔn)蠞岫葹?.5的菌懸液，以1:10（v:v）加入MRS肉湯培養(yǎng)基中，制備成工作菌液。

5.2.3產(chǎn)酸性能

吸取工作菌液，37℃厭氧培養(yǎng)，測(cè)定0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h和36h的pH

值，選擇pH≤4.5的菌株。

5.2.4生長曲線

吸取工作菌液，37℃厭氧培養(yǎng)，在0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h和38h使用酶標(biāo)

儀測(cè)定OD600值，繪制生長曲線。

5.2.5耐酸性及耐膽鹽

2

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5.2.5.1耐酸性：調(diào)節(jié)工作菌液pH=2.0、pH=3.0、pH=4.0，37℃厭氧培養(yǎng)，在0h、2h、4h、6h、

8h、12h、16h、24h、32h、48h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD600值。

5.2.5.2耐膽鹽：調(diào)節(jié)工作菌液膽鹽濃度為0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L，37℃厭氧培養(yǎng)，在0h、

2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h、32h、48h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD600值。

5.2.6模擬人工消化液測(cè)試

吸取麥?zhǔn)蠞岫葹?.5的菌懸液，以1:10（v:v）分別加入到無菌人工胃液和腸液中，37℃、150rpm

厭氧培養(yǎng)2h。平板計(jì)數(shù)，按照GB4789.2執(zhí)行。

5.2.7耐熱試驗(yàn)

吸取麥?zhǔn)蠞岫葹?.5的菌懸液，分別置于37℃、42℃、50℃、55℃、60℃、65℃水浴鍋中加

熱10min。平板計(jì)數(shù)，按照GB4789.2執(zhí)行。

綜合以上數(shù)據(jù)，挑選綜合性能最好的菌株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

安全性評(píng)價(jià)

5.3.1溶血性

將麥?zhǔn)蠞岫葹?.5的菌懸液均勻地點(diǎn)種或劃線接種到哥倫比亞血平板表面，37℃厭氧培養(yǎng)24h，觀

察是否有溶血現(xiàn)象。溶血試驗(yàn)結(jié)果為陰性的，可通過；否則，應(yīng)放棄使用。

5.3.2抗生素敏感性

將麥?zhǔn)蠞岫葹?.5的菌懸液均勻涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，采用紙片擴(kuò)散法，將抗生素藥片（按照附

錄A中A.2執(zhí)行）放置于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)24h，觀察并測(cè)量抗菌圈直徑大小。

6乳酸菌的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定

使用革蘭氏染色方法，按照GB4789.35-2023中附錄A中A.7部分執(zhí)行，在顯微鏡下觀察菌株形態(tài)并

進(jìn)行描述分析。鏡下菌體形態(tài)多樣，呈球狀或桿狀，無芽孢，革蘭氏染色陽性。

生化鑒定

使用乳酸菌成套生化鑒定管，結(jié)合《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第九版）判定乳酸菌種屬。鑒定管成分

按照附錄A中A.2執(zhí)行。

分子生物學(xué)鑒定

按照GB7300.502-2023中附錄A中A.3部分執(zhí)行。

抑菌性能

按照GB/T38483執(zhí)行。

指示菌株標(biāo)準(zhǔn)株：傷寒沙門氏菌（SalmonellatyphimuriumCMCC（B）50071）、大腸埃希氏菌

（EscherichiacoliATCC25922）、金黃色葡萄球菌（StaphylococcusaureusCMCC（B）26003）。

抗氧化性

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6.5.1細(xì)胞外發(fā)酵上清液（EFS）：菌株生長到對(duì)數(shù)生長期（OD600約為1.0），4000rpm、4℃離心

10min，收集上清液。

6.5.2完整細(xì)胞（IC）：菌體用1×PBS溶液（pH=7.4）洗滌，重懸于等體積的1×PBS溶液中。

6.5.3細(xì)胞內(nèi)提取物（ICE）：菌體用1×PBS溶液洗滌，送入低溫超聲波破壞（400W，工作時(shí)間5s，

間隔5s，80次）、8000rpm離心20min，收集上清液。

6.5.4以上得到的溶液用于DPPH自由基清除能力測(cè)試。

7乳酸菌的保藏

可選擇使用凍干保藏，超低溫（不高于-70℃）冷凍保藏或其他有效的保藏方法。

4

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A

A

附錄A

（規(guī)范性）

所需儀器、試劑和耗材及培養(yǎng)基配置方法

A.1所需儀器如下：

a)超凈工作臺(tái)；

b)天平：感量為0.001g；

c)振蕩器；

d)移液器：量程0μL～100μL、0μL～200μL、0μL～1000μL；

e)厭氧培養(yǎng)裝置；

f)恒溫裝置：37℃±2℃；

g)恒溫水浴鍋：37℃～65℃；

h)酶標(biāo)儀；

i)細(xì)菌麥?zhǔn)蠞岫葍x；

j)pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙；

k)正置顯微鏡：最大放大倍數(shù)1000倍；

l)高速離心機(jī):溫度≤4℃，轉(zhuǎn)速≥8000rpm；

m)PCR儀；

n)電泳系統(tǒng):包括電泳儀、電泳槽、制備凝膠模具套裝、凝膠成像系統(tǒng)；

o)超聲波細(xì)胞破碎儀。

A.2所用試劑及規(guī)格見表A.1。

表A.1菌株篩選和鑒定所需試劑及規(guī)格

試劑規(guī)格及要求

DPPH自由基清除試劑盒按說明書使用

頭孢呋辛、頭孢他定、新霉素、萬古霉素、四環(huán)素、頭孢曲松、青霉素、苯唑

西林、丁胺卡那、羧芐西林、氨芐西林、多糖霉素、哌拉西林、紅霉素、麥迪

成套抗生素紙片霉素、頭孢氨芐、諾沙星氟、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、頭孢唑林、頭孢氨芐、

頭孢哌酮、卡那霉素、諾氟沙星、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、慶大霉素、克林霉素、

呋喃唑酮、氨氯霉素共30種抗生素藥片

七葉苷、纖維二塘、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖、

乳酸菌成套生化鑒定管

乳糖、1%馬尿酸鈉

A.3所用耗材及規(guī)格見表A.2。

表A.2菌株篩選和鑒定所需耗材及規(guī)格

試劑規(guī)格及要求

微孔板48孔或96孔

濾膜0.22μm

牛津杯不銹鋼

10μL

移液器吸頭200μL

1000μL

200μL

離心管2mL

50mL

無菌培養(yǎng)皿90mm

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DB15/T4019—2025

A.4所用試劑配置方法見表A.3。除另有規(guī)定外，試劑均為分析純或生化試劑，試驗(yàn)用水為滅菌的雙

蒸水或蒸餾水。

表A.3培養(yǎng)基配制方法

培養(yǎng)基名稱成分制備

按照GB7300.502-2023中附錄A中按照GB7300.502-2023中附錄A中

MRS肉湯培養(yǎng)基

A.1.1部分執(zhí)行A.1.1部分執(zhí)行

按照GB4789.28-2024中附錄E中E.2按照GB4789.28-2024中附錄E中E.2

MRS瓊脂培養(yǎng)基

部分執(zhí)行部分執(zhí)行

酪蛋白胰酶消化物10.0g、心胰酶消

化物3.0g、玉米淀粉1.0g、瓊脂14.0

酪蛋白胰酶消化物，心胰酶消化物，

g、肉胃酶消化物5.0g、酵母浸出粉

血瓊脂平板玉米淀粉，瓊脂，肉胃酶消化物，酵

5.0g、氯化鈉5.0g、加蒸餾水至930

母浸出粉，氯化鈉，羊血或馬血

mL，121℃高壓滅菌15min，冷卻后

加入脫纖羊血或馬血70mL混勻倒板

磷酸二氫鉀0.27g,磷酸氫二鈉1.42

g,氯化鈉8g,氯化鉀0.2g,加入約800

磷酸二氫鉀，磷酸氫二鈉，氯化鈉，mL去離子水充分?jǐn)嚢枞芙猓渭訚恹}

1×PBS緩沖液

氯化鉀酸將pH調(diào)節(jié)至7.4，最后定容到1L，

121℃高壓滅菌15min，稀釋10倍備

用

100mLMRS瓊脂培養(yǎng)基加上0.31mL溴

溴甲酚紫顯色MRS培養(yǎng)基溴甲酚紫，MRS瓊脂培養(yǎng)基甲酚紫溶液，高壓滅菌鍋滅菌121℃、