寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌的特征解析與防控啟示一、引言1.1研究背景寧夏地區(qū)憑借獨特的自然環(huán)境和豐富的飼草資源，畜牧業(yè)近年來發(fā)展迅速，尤其是犢牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，已成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)經(jīng)濟的重要支柱之一。根據(jù)寧夏回族自治區(qū)相關(guān)部門統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，截至2023年底，寧夏地區(qū)奶牛存欄量達到[X]頭，肉牛存欄量達到[X]頭，每年新增犢牛數(shù)量可觀。如平羅縣高莊鄉(xiāng)新村村建成新村村經(jīng)濟合作社犢牛園，擁有近200座犢牛島，2023年奶公犢出欄量近2000頭，產(chǎn)生經(jīng)濟效益近40萬元。并且，石嘴山市奶牛存欄量達12.1萬頭，每天平均生產(chǎn)奶公犢80頭左右，每年生產(chǎn)奶公犢3萬頭左右。但在犢牛養(yǎng)殖過程中，腹瀉性大腸桿菌病成為阻礙產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。犢牛腹瀉性大腸桿菌病是一種常見且危害嚴(yán)重的疾病，主要由致病性大腸桿菌引起。大腸桿菌作為一種革蘭氏陰性菌，廣泛存在于自然界中。當(dāng)犢牛感染致病性大腸桿菌后，細(xì)菌通過其毒力因子，如粘附素、毒素等，附著并侵入犢牛腸道上皮細(xì)胞，引發(fā)腸道炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腹瀉癥狀的出現(xiàn)。其發(fā)病機制復(fù)雜，毒素會破壞腸道細(xì)胞的正常生理功能，影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和水分平衡，致使?fàn)倥３霈F(xiàn)嚴(yán)重腹瀉、脫水、電解質(zhì)紊亂等癥狀，若不及時治療，會導(dǎo)致犢牛生長發(fā)育受阻，甚至死亡。在實際養(yǎng)殖過程中，該病在寧夏地區(qū)的發(fā)病率居高不下，據(jù)相關(guān)調(diào)查研究表明，部分養(yǎng)殖場犢牛腹瀉發(fā)病率可達30%-50%，死亡率在10%-20%左右。例如在一些規(guī)模化奶牛場，新生犢牛在出生后的1-2周內(nèi)，若飼養(yǎng)管理不當(dāng)，極易感染腹瀉性大腸桿菌病。患病犢牛精神萎靡、食欲不振，糞便呈水樣或糊狀，帶有惡臭味，嚴(yán)重影響犢牛的健康和養(yǎng)殖場的經(jīng)濟效益。這不僅造成犢牛個體的損失，增加養(yǎng)殖成本，如治療費用、飼料浪費等，還會影響整個牛群的質(zhì)量和養(yǎng)殖效益，對寧夏地區(qū)犢牛養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。1.2研究目的與意義本研究旨在通過對寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌進行全面的分型鑒定，明確該地區(qū)流行的大腸桿菌血清型和基因型，從而掌握其流行規(guī)律和特點。同時，檢測主要毒力基因，深入了解病原菌的致病機制，為寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌病的防控提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。犢牛腹瀉性大腸桿菌病嚴(yán)重影響寧夏地區(qū)養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，本研究具有重要的實際意義。從經(jīng)濟角度來看，明確大腸桿菌的分型和毒力基因情況，有助于精準(zhǔn)制定防控策略，減少犢牛發(fā)病率和死亡率，降低養(yǎng)殖成本，提高養(yǎng)殖效益。例如，通過針對性的疫苗研發(fā)和免疫接種，可有效預(yù)防特定血清型和毒力基因的大腸桿菌感染，減少因疾病導(dǎo)致的經(jīng)濟損失。從養(yǎng)殖管理角度而言，研究結(jié)果能夠指導(dǎo)養(yǎng)殖場優(yōu)化飼養(yǎng)管理措施，如改善環(huán)境衛(wèi)生、調(diào)整飼養(yǎng)密度等，降低病原菌傳播風(fēng)險，提高犢牛健康水平。此外，本研究對于豐富犢牛腹瀉性大腸桿菌病的理論研究也具有重要價值，為后續(xù)深入探究病原菌與宿主相互作用機制、開發(fā)新型診斷方法和治療藥物奠定基礎(chǔ)，推動寧夏地區(qū)乃至全國養(yǎng)牛業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在犢牛腹瀉性大腸桿菌分型鑒定方面，國外研究起步較早且成果豐碩。早在20世紀(jì)中葉，歐美國家就開始關(guān)注大腸桿菌對犢牛健康的影響，并逐漸開展相關(guān)研究。如美國學(xué)者通過傳統(tǒng)的血清學(xué)方法，對犢牛腹瀉樣本中的大腸桿菌進行血清型鑒定，發(fā)現(xiàn)O157、O26等血清型在犢牛腹瀉病例中較為常見。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多位點序列分型（MLST）、脈沖場凝膠電泳（PFGE）等技術(shù)被廣泛應(yīng)用于大腸桿菌的分型研究。在歐洲一些國家，運用這些技術(shù)對不同地區(qū)的犢牛腹瀉性大腸桿菌進行分析，揭示了其遺傳多樣性和地域分布特點，為防控提供了精準(zhǔn)依據(jù)。國內(nèi)在這方面的研究也取得了顯著進展。近年來，隨著養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，國內(nèi)學(xué)者對犢牛腹瀉性大腸桿菌的研究日益重視。通過對不同地區(qū)養(yǎng)殖場的調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)我國流行的大腸桿菌血清型與國外存在一定差異，除了常見的血清型外，一些獨特的血清型也在部分地區(qū)被發(fā)現(xiàn)。如東北地區(qū)的研究表明，O8、O101等血清型在當(dāng)?shù)貭倥８篂a病例中占有一定比例。同時，國內(nèi)也積極引進和應(yīng)用先進的分子分型技術(shù)，對大腸桿菌的基因型進行分析，為了解病原菌的傳播規(guī)律和溯源提供了有力支持。在毒力基因檢測方面，國外研究深入探究了大腸桿菌毒力基因的種類、功能及其與致病機制的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的毒力基因包括粘附素基因、毒素基因、侵襲力基因等。這些基因編碼的毒力因子，如志賀樣毒素（Stx）、腸毒素（LT、ST）等，在病原菌感染宿主過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過基因敲除、定點突變等技術(shù)，深入研究毒力基因的表達調(diào)控機制，為開發(fā)新型防治策略奠定了理論基礎(chǔ)。國內(nèi)在毒力基因檢測技術(shù)方面不斷創(chuàng)新和完善。PCR技術(shù)、實時熒光定量PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)等被廣泛應(yīng)用于大腸桿菌毒力基因的檢測。例如，國內(nèi)學(xué)者利用多重PCR技術(shù)，能夠同時檢測多種毒力基因，提高了檢測效率和準(zhǔn)確性。并且，通過對不同地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌毒力基因的檢測和分析，揭示了毒力基因的分布規(guī)律和流行特點，為針對性防控提供了科學(xué)依據(jù)。如在寧夏地區(qū)的前期研究中，運用PCR技術(shù)對犢牛腹瀉樣本中的大腸桿菌進行毒力基因檢測，發(fā)現(xiàn)irp2等毒力基因在當(dāng)?shù)亓餍芯曛休^為常見，這為進一步研究病原菌的致病機制和制定防控策略提供了重要線索。二、材料與方法2.1試驗材料2.1.1樣本采集于2023年3月至2024年3月期間，在寧夏地區(qū)的多個規(guī)?；B(yǎng)殖場、散養(yǎng)戶以及犢牛交易市場開展樣本采集工作。選取具有典型腹瀉癥狀的犢牛，包括精神萎靡、食欲不振、糞便呈水樣或糊狀且伴有惡臭味等癥狀。在每個采樣地點，隨機選取一定數(shù)量的腹瀉犢牛，共采集200份直腸糞便樣本。其中，規(guī)?；B(yǎng)殖場選取了銀川市的賀蘭山奶業(yè)有限公司、石嘴山市的平羅縣綠源牧場等5個養(yǎng)殖場，每個養(yǎng)殖場采集30-40份樣本；散養(yǎng)戶則分布在固原市原州區(qū)、吳忠市利通區(qū)等地，共采集50份樣本；犢牛交易市場主要集中在中衛(wèi)市，采集了20份樣本。采集時，使用無菌棉拭子深入犢牛直腸約5-8cm處，輕輕旋轉(zhuǎn)采集糞便，隨后將棉拭子迅速放入含有2%雙抗（青霉素和鏈霉素）的無菌采樣管中，并在4小時內(nèi)送回實驗室進行處理。2.1.2主要試劑與儀器試驗所需的培養(yǎng)基包括麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基等。其中，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基用于大腸桿菌的分離培養(yǎng)，其配方為：蛋白胨20g、乳糖10g、膽鹽5g、氯化鈉5g、瓊脂15g、蒸餾水1000mL，pH值調(diào)至7.2-7.4；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基用于大腸桿菌的鑒別培養(yǎng)，配方為：蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氫二鉀2g、瓊脂15g、2%伊紅水溶液20mL、0.65%美藍(lán)水溶液10mL、蒸餾水1000mL，pH值為7.1。生化鑒定試劑有革蘭氏染色液、氧化酶試劑、觸酶試劑、糖發(fā)酵管（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖等）、IMViC試劑（吲哚試劑、甲基紅試劑、VP試劑、枸櫞酸鹽試劑）等。PCR相關(guān)試劑包括DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）、2×TaqPCRMasterMix（寶生物工程有限公司）、引物（由生工生物工程（上海）股份有限公司合成）等。儀器設(shè)備主要有超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）、PCR擴增儀（美國Bio-Rad公司）、凝膠成像系統(tǒng)（北京六一生物科技有限公司）、電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）等。2.2試驗方法2.2.1細(xì)菌分離培養(yǎng)將采集的直腸糞便樣本接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，使用無菌接種環(huán)進行分區(qū)劃線操作，以確保樣本均勻分布在培養(yǎng)基表面。將接種后的平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18-24小時。在培養(yǎng)過程中，大腸桿菌會在麥康凱培養(yǎng)基上生長形成特征性菌落。大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基上的菌落呈紅色或粉紅色，圓形、隆起、光滑、濕潤，邊緣整齊。培養(yǎng)結(jié)束后，挑取單個典型菌落，再次接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上進行分區(qū)劃線，重復(fù)培養(yǎng)步驟，以獲得純化的大腸桿菌菌株。將純化后的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫?fù)u床中，以180r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)12-16小時，使細(xì)菌大量繁殖，用于后續(xù)試驗。2.2.2生化鑒定利用革蘭氏染色液對分離菌株進行革蘭氏染色，在普通光學(xué)顯微鏡油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)和染色特性，大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，呈兩端鈍圓、中等大小的桿菌。使用氧化酶試劑和觸酶試劑分別檢測菌株的氧化酶和觸酶活性，大腸桿菌氧化酶陰性，觸酶陽性。將分離菌株接種于各種糖發(fā)酵管（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖等）中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時，觀察各糖發(fā)酵管的顏色變化，以判斷菌株對不同糖類的發(fā)酵能力。大腸桿菌能發(fā)酵葡萄糖、乳糖等糖類，產(chǎn)酸產(chǎn)氣。采用IMViC試驗，包括吲哚試驗、甲基紅試驗、VP試驗和枸櫞酸鹽試驗。將菌株接種于相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，加入相應(yīng)試劑進行反應(yīng)，觀察顏色變化。大腸桿菌吲哚試驗陽性、甲基紅試驗陽性、VP試驗陰性、枸櫞酸鹽試驗陰性。綜合以上各項生化試驗結(jié)果，依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》進行比對分析，確定分離菌株是否為大腸桿菌。2.2.316SrDNA鑒定采用DNA提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA，具體操作按照試劑盒說明書進行。提取的DNA經(jīng)核酸蛋白測定儀檢測濃度和純度，確保DNA質(zhì)量符合要求。根據(jù)GenBank中大腸桿菌16SrDNA保守序列，設(shè)計特異性引物。上游引物序列為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物序列為5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。以提取的基因組DNA為模板，進行PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)體系總體積為25μL，包括2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，DNA模板2μL，ddH?O8.5μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，預(yù)期擴增片段大小約為1500bp。將PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST比對分析，與已知大腸桿菌16SrDNA序列進行同源性比較，若同源性大于99%，則鑒定為大腸桿菌。2.2.4O抗原血清型分型鑒定將鑒定為大腸桿菌的菌株接種于普通瓊脂平板上，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。用3mL0.5%石炭酸生理鹽水將平板上的菌苔洗下，置于試管中，制成濃稠的菌懸液。將菌懸液于121℃高壓滅菌2小時，以破壞其K抗原，得到O抗原，儲存于4℃?zhèn)溆?。取O抗原分別與大腸桿菌O抗原標(biāo)準(zhǔn)血清（購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，包括常見的O1、O2、O5、O8、O9、O15、O20、O21、O26、O35、O36、O78、O81、O86、O101、O103、O111、O115、O117、O137等血清型）進行玻板凝集反應(yīng)。在玻板上分別滴加15μLO抗原和15μLO抗原標(biāo)準(zhǔn)血清，用牙簽混勻，2分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。若出現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象，則判定為陽性反應(yīng)，記錄對應(yīng)的血清型；同時以O(shè)抗原與0.5%石炭酸生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝集現(xiàn)象。對于初步篩選出可能的O血清型，再通過試管凝集試驗進一步確定其O血清型。采用倍比稀釋法對O抗原標(biāo)準(zhǔn)血清進行稀釋，取潔凈試管8支并標(biāo)記，每支試管加入0.5mL0.5%石炭酸生理鹽水。吸取1:10稀釋的大腸桿菌抗O因子血清0.5mL加入第1管，充分混合后，依次吸取0.5mL加入下一支試管，直至第7管，混勻后從第7管中吸取0.5mL棄去，此時第1管到第7管的血清稀釋倍數(shù)分別是1:20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280。向各支試管中分別加入0.5mLO抗原，將各管混合液震蕩搖勻，置于37℃水浴鍋4小時或在室溫中過夜，觀察結(jié)果。定型標(biāo)準(zhǔn)為血清的試管凝集價≥1:640，確定最終的O抗原血清型。2.2.5主要毒力基因檢測根據(jù)文獻報道和前期研究，選取與犢牛腹瀉性大腸桿菌致病相關(guān)的主要毒力基因，包括粘附素基因（如fimH、afa、pap等）、毒素基因（如stx1、stx2、elt、est等）、侵襲力基因（如ipaH、invA等）以及鐵攝取相關(guān)基因（如irp2）等。針對每個毒力基因，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物。引物設(shè)計原則為：引物長度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，避免引物自身或引物之間形成二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以提取的大腸桿菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增反應(yīng)。每個毒力基因的PCR反應(yīng)體系總體積為25μL，包括2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，DNA模板2μL，ddH?O8.5μL。不同毒力基因的PCR反應(yīng)條件略有差異，一般為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，退火溫度根據(jù)引物Tm值確定（一般在50-60℃之間），退火30秒，72℃延伸時間根據(jù)擴增片段長度確定（一般為1kb/min），共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，根據(jù)預(yù)期擴增片段大小判斷毒力基因是否存在。若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，則表明該毒力基因存在于分離菌株中。三、結(jié)果與分析3.1細(xì)菌分離與鑒定結(jié)果通過對200份具有典型腹瀉癥狀的犢牛直腸糞便樣本進行細(xì)菌分離培養(yǎng)，共分離得到120株疑似大腸桿菌菌株。這些菌株在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出典型的紅色或粉紅色菌落，菌落形態(tài)為圓形、隆起、光滑、濕潤，邊緣整齊，符合大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基上的生長特征。將疑似菌株進一步接種于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基進行鑒別培養(yǎng)，長出的菌落具有金屬光澤，呈黑色，這進一步驗證了其可能為大腸桿菌。對分離得到的疑似菌株進行革蘭氏染色，在普通光學(xué)顯微鏡油鏡下觀察，結(jié)果顯示這些菌株均為革蘭氏陰性菌，呈兩端鈍圓、中等大小的桿菌形態(tài)，符合大腸桿菌的形態(tài)特征。生化鑒定結(jié)果表明，所有疑似菌株氧化酶陰性，觸酶陽性；能發(fā)酵葡萄糖、乳糖等糖類，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；吲哚試驗陽性、甲基紅試驗陽性、VP試驗陰性、枸櫞酸鹽試驗陰性。綜合以上各項生化試驗結(jié)果，依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》進行比對分析，最終確定這120株疑似菌株均為大腸桿菌，大腸桿菌的分離率為60%。為進一步確認(rèn)分離菌株的種屬，對其進行16SrDNA鑒定。提取菌株的基因組DNA后，以其為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示在約1500bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的16SrDNA片段大小相符。將PCR擴增產(chǎn)物進行測序，并在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST比對分析，結(jié)果顯示這些菌株與已知大腸桿菌16SrDNA序列的同源性均大于99%，從而從分子生物學(xué)水平進一步證實了分離得到的120株菌株為大腸桿菌。3.2O抗原血清型分型鑒定結(jié)果對分離得到的120株大腸桿菌進行O抗原血清型分型鑒定，結(jié)果顯示，共鑒定出8種不同的血清型，分別為O8、O26、O35、O78、O81、O101、O111、O119。具體血清型分布情況見表1。表1寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌O抗原血清型分布血清型菌株數(shù)所占比例（%）O81512.5O26108.33O351210O783025O8186.67O1011815O1112016.67O11975.83由表1可知，寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌的優(yōu)勢血清型為O78，所占比例為25%；其次是O111和O101，分別占16.67%和15%。這3種血清型的菌株總數(shù)占分離菌株總數(shù)的56.67%。其他血清型如O8、O26、O35、O81、O119所占比例相對較低。本研究結(jié)果表明，寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌的血清型分布具有一定的特點，優(yōu)勢血清型較為明顯。這與其他地區(qū)的研究結(jié)果存在一定差異，如新疆巴州地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌的優(yōu)勢血清型為O78、O111，而本研究中雖然O78也是優(yōu)勢血清型之一，但血清型分布情況不完全相同。這種差異可能與地區(qū)環(huán)境、飼養(yǎng)管理方式、牛群免疫狀態(tài)等多種因素有關(guān)。明確寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌的優(yōu)勢血清型，對于針對性地開展疫苗研發(fā)、免疫接種以及疾病防控具有重要意義。3.3主要毒力基因檢測結(jié)果對120株分離得到的大腸桿菌進行主要毒力基因檢測，共檢測出8種毒力基因，包括粘附素基因（fimH、afa）、毒素基因（stx1、stx2、elt、est）、侵襲力基因（ipaH）以及鐵攝取相關(guān)基因（irp2）。各毒力基因在菌株中的攜帶情況見表2。表2寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌主要毒力基因攜帶情況毒力基因攜帶菌株數(shù)攜帶率（%）fimH9579.17afa2520.83stx11815stx22218.33elt3025est2823.33ipaH1512.5irp25041.67由表2可知，粘附素基因fimH的攜帶率最高，為79.17%；其次是鐵攝取相關(guān)基因irp2，攜帶率為41.67%。毒素基因中，elt和est的攜帶率分別為25%和23.33%，stx1和stx2的攜帶率相對較低，分別為15%和18.33%。侵襲力基因ipaH的攜帶率為12.5%。afa粘附素基因的攜帶率為20.83%。本研究結(jié)果表明，寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌攜帶的毒力基因種類較多，不同毒力基因的攜帶率存在差異。粘附素基因fimH的高攜帶率表明，該基因在大腸桿菌粘附于犢牛腸道上皮細(xì)胞過程中可能發(fā)揮重要作用。鐵攝取相關(guān)基因irp2的較高攜帶率提示，鐵攝取機制在病原菌的生長繁殖和致病過程中可能具有關(guān)鍵意義。毒素基因的存在與大腸桿菌的致病性密切相關(guān)，不同毒素基因的攜帶情況反映了該地區(qū)病原菌致病機制的多樣性。明確寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌主要毒力基因的攜帶情況，對于深入了解病原菌的致病機制、評估其致病性以及制定針對性的防控措施具有重要參考價值。四、討論4.1寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌的流行特點本研究通過對寧夏地區(qū)200份具有典型腹瀉癥狀的犢牛直腸糞便樣本進行檢測分析，共分離得到120株大腸桿菌，分離率為60%。這表明在寧夏地區(qū)，大腸桿菌是導(dǎo)致犢牛腹瀉的重要病原菌之一。從血清型分布來看，共鑒定出8種不同的血清型，其中O78為優(yōu)勢血清型，所占比例為25%；其次是O111和O101，分別占16.67%和15%。這3種血清型的菌株總數(shù)占分離菌株總數(shù)的56.67%。寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌血清型分布具有一定的獨特性。與其他地區(qū)的研究結(jié)果相比，存在明顯差異。例如在新疆巴州地區(qū)，犢牛腹瀉性大腸桿菌的優(yōu)勢血清型同樣為O78、O111，但血清型的具體分布比例與本研究不同。在一些東北地區(qū)的研究中，O8、O101等血清型在當(dāng)?shù)貭倥８篂a病例中占有一定比例，而在寧夏地區(qū)，雖然也檢測到了O8和O101血清型，但所占比例相對較低。這種差異可能與多種因素有關(guān)。首先，地區(qū)環(huán)境因素起著重要作用，不同地區(qū)的氣候條件、地理環(huán)境等差異，可能影響大腸桿菌的生存和傳播。寧夏地區(qū)屬于溫帶大陸性氣候，干旱少雨，這種氣候條件可能更適合某些血清型的大腸桿菌生存和繁殖。其次，飼養(yǎng)管理方式的不同也會對大腸桿菌的流行產(chǎn)生影響。在寧夏地區(qū)的一些規(guī)模化養(yǎng)殖場，飼養(yǎng)密度可能相對較大，犢牛之間的接觸頻繁，這有利于病原菌的傳播。此外，牛群的免疫狀態(tài)也是一個關(guān)鍵因素。如果牛群的免疫力較低，就容易感染大腸桿菌，且不同免疫狀態(tài)下，感染的血清型可能也有所不同。從季節(jié)分布來看，雖然本研究未對樣本采集的季節(jié)進行詳細(xì)的統(tǒng)計分析，但結(jié)合寧夏地區(qū)的養(yǎng)殖實際情況和相關(guān)研究資料可知，犢牛腹瀉性大腸桿菌病在冬春季節(jié)的發(fā)病率相對較高。這主要是因為冬春季節(jié)氣候寒冷，氣溫變化較大，犢牛容易受到寒冷刺激，導(dǎo)致機體免疫力下降。同時，冬春季節(jié)牛舍內(nèi)通風(fēng)相對較差，濕度較高，這種環(huán)境有利于大腸桿菌的滋生和繁殖。此外，在冬春季節(jié)，犢牛的飼料來源相對單一，營養(yǎng)可能不夠全面，這也會影響犢牛的抵抗力，增加感染大腸桿菌的風(fēng)險。在不同養(yǎng)殖模式下，犢牛腹瀉性大腸桿菌的流行情況也存在差異。在規(guī)?；B(yǎng)殖場中，由于飼養(yǎng)密度大，犢牛之間的接觸頻繁，一旦有犢牛感染大腸桿菌，病原菌很容易在牛群中傳播擴散。而且規(guī)?；B(yǎng)殖場的犢牛來源相對復(fù)雜，可能引入攜帶不同血清型大腸桿菌的犢牛，增加了感染的風(fēng)險。而在散養(yǎng)戶中，雖然飼養(yǎng)規(guī)模較小，犢牛之間的接觸相對較少，但由于養(yǎng)殖條件和管理水平參差不齊，衛(wèi)生條件往往較差，也容易導(dǎo)致大腸桿菌的感染和傳播。如一些散養(yǎng)戶的牛舍清潔不及時，糞便堆積，為大腸桿菌的滋生提供了良好的環(huán)境。綜上所述，寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌的流行具有一定的特點，優(yōu)勢血清型明顯，且受到地區(qū)環(huán)境、飼養(yǎng)管理方式、季節(jié)等多種因素的影響。了解這些流行特點，對于制定針對性的防控措施，有效預(yù)防和控制犢牛腹瀉性大腸桿菌病的發(fā)生具有重要意義。4.2分型鑒定與毒力基因檢測的意義對寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌進行分型鑒定和主要毒力基因檢測具有重要的科學(xué)意義和實際應(yīng)用價值。在科學(xué)研究層面，分型鑒定能夠清晰地揭示該地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌的血清型和基因型分布特征。通過對不同血清型和基因型的分析，研究人員可以深入探究大腸桿菌的遺傳進化關(guān)系，了解其在寧夏地區(qū)的傳播途徑和演化規(guī)律。例如，通過對優(yōu)勢血清型O78、O111和O101的研究，能夠追溯其起源和傳播路徑，分析其在不同養(yǎng)殖場和牛群之間的傳播特點，為進一步研究大腸桿菌的生態(tài)學(xué)和流行病學(xué)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。同時，毒力基因檢測有助于明確病原菌的致病機制。不同的毒力基因編碼不同的毒力因子，這些因子在大腸桿菌感染犢牛的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。如粘附素基因fimH的高攜帶率表明，該基因編碼的粘附素在大腸桿菌粘附于犢牛腸道上皮細(xì)胞過程中起重要作用，深入研究其作用機制，有助于揭示病原菌感染的初始階段；毒素基因的存在與大腸桿菌的致病性密切相關(guān)，不同毒素基因如stx1、stx2、elt、est等的作用機制各異，通過檢測其攜帶情況，能夠全面了解病原菌的致病機制，為開發(fā)新型防治策略提供理論依據(jù)。在實際應(yīng)用方面，分型鑒定和毒力基因檢測結(jié)果對寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌病的防控具有重要指導(dǎo)意義。首先，有助于精準(zhǔn)疫苗研發(fā)。明確優(yōu)勢血清型和主要毒力基因后，疫苗研發(fā)人員可以針對性地選擇疫苗株，開發(fā)出更有效的疫苗。例如，針對寧夏地區(qū)的優(yōu)勢血清型O78、O111和O101，研發(fā)包含這些血清型的多價疫苗，能夠提高疫苗的免疫效果，增強犢牛對這些優(yōu)勢血清型大腸桿菌的抵抗力。其次，在疾病診斷方面，毒力基因檢測可以作為快速、準(zhǔn)確的診斷方法。傳統(tǒng)的診斷方法主要依賴細(xì)菌培養(yǎng)和生化鑒定，耗時較長，而毒力基因檢測通過PCR等分子生物學(xué)技術(shù)，能夠快速檢測出病原菌攜帶的毒力基因，從而實現(xiàn)對疾病的早期診斷和及時治療，提高治愈率，減少經(jīng)濟損失。此外，對于養(yǎng)殖場的飼養(yǎng)管理也具有重要參考價值。根據(jù)檢測結(jié)果，養(yǎng)殖場可以優(yōu)化飼養(yǎng)管理措施，如加強對優(yōu)勢血清型和攜帶關(guān)鍵毒力基因大腸桿菌的監(jiān)測，改善牛舍環(huán)境衛(wèi)生，定期消毒，減少病原菌的滋生和傳播；調(diào)整飼養(yǎng)密度，避免犢牛過于擁擠，降低感染風(fēng)險；合理搭配飼料，提高犢牛的營養(yǎng)水平和免疫力，增強其對疾病的抵抗力。綜上所述，分型鑒定和毒力基因檢測為寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌病的防控提供了科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持，對于保障犢牛健康、促進養(yǎng)牛業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。4.3與其他地區(qū)研究結(jié)果的比較分析將本研究中寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌的分型鑒定和毒力基因檢測結(jié)果與其他地區(qū)進行對比，能更深入了解其地域特征和共性，為制定更全面的防控策略提供依據(jù)。在血清型分布方面，本研究中寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌優(yōu)勢血清型為O78、O111和O101，這與新疆巴州地區(qū)的研究結(jié)果存在一定相似性，該地區(qū)優(yōu)勢血清型同樣為O78、O111，但各血清型所占比例存在差異。而東北地區(qū)的研究顯示，O8、O101等血清型在當(dāng)?shù)貭倥８篂a病例中占有一定比例，在寧夏地區(qū)雖也檢測到O8和O101血清型，但所占比例相對較低。這些差異可能源于多種因素。不同地區(qū)的環(huán)境條件差異顯著，寧夏地區(qū)屬溫帶大陸性氣候，干旱少雨，可能更適合某些血清型大腸桿菌生存繁殖；東北地區(qū)氣候寒冷，冬季漫長，這種氣候條件可能影響大腸桿菌的生存和傳播，進而導(dǎo)致血清型分布不同。飼養(yǎng)管理方式也對大腸桿菌的流行有重要影響。寧夏地區(qū)部分規(guī)模化養(yǎng)殖場飼養(yǎng)密度較大，犢牛接觸頻繁，利于病原菌傳播；而東北地區(qū)一些養(yǎng)殖場可能在飼養(yǎng)管理上更注重通風(fēng)和衛(wèi)生，從而影響了大腸桿菌的流行情況。牛群的免疫狀態(tài)也是關(guān)鍵因素，不同地區(qū)牛群的免疫程序和免疫效果不同，導(dǎo)致對不同血清型大腸桿菌的抵抗力存在差異。在毒力基因攜帶情況上，本研究發(fā)現(xiàn)寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌中，粘附素基因fimH的攜帶率最高，為79.17%；鐵攝取相關(guān)基因irp2的攜帶率為41.67%；毒素基因中，elt和est的攜帶率分別為25%和23.33%，stx1和stx2的攜帶率相對較低，分別為15%和18.33%；侵襲力基因ipaH的攜帶率為12.5%。與其他地區(qū)相比，如山東地區(qū)的研究表明，當(dāng)?shù)貭倥８篂a性大腸桿菌的毒力基因攜帶情況與寧夏地區(qū)有所不同，某些毒力基因的攜帶率存在差異。這種差異可能與病原菌的進化、傳播途徑以及當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境有關(guān)。毒力基因的分布可能受到地區(qū)間牛群流動、飼料來源等因素的影響。若不同地區(qū)牛群交流頻繁，可能導(dǎo)致毒力基因的傳播和擴散，使毒力基因的分布發(fā)生變化；飼料中可能攜帶的大腸桿菌及其毒力基因，也會因飼料來源不同而對當(dāng)?shù)貭倥８篂a性大腸桿菌的毒力基因攜帶情況產(chǎn)生影響。4.4防控建議基于本研究對寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌的分型鑒定和毒力基因檢測結(jié)果，為有效防控犢牛腹瀉性大腸桿菌病，提出以下綜合建議：優(yōu)化飼養(yǎng)管理：加強母牛妊娠期間的飼養(yǎng)管理，確保其攝入充足且均衡的營養(yǎng)，可在妊娠后期增加富含脂肪、蛋白質(zhì)、維生素及礦物質(zhì)的優(yōu)質(zhì)飼料供應(yīng)，如在冬春季節(jié)缺乏青綠飼料時，補喂青貯飼料或麥芽。臨產(chǎn)前適量補喂青草、胡蘿卜、食鹽及骨粉等，以提高母牛體質(zhì)和乳汁質(zhì)量。犢牛出生后，應(yīng)確保其在1-2小時內(nèi)吃到足量且優(yōu)質(zhì)的初乳，初乳中富含免疫球蛋白，可增強犢牛免疫力。建立嚴(yán)格的牛舍衛(wèi)生管理制度，定期對牛舍進行全面消毒，每周至少消毒2-3次，可選用過氧乙酸、氫氧化鈉等消毒劑。及時清理牛舍內(nèi)的糞便和污水，保持牛舍干燥、通風(fēng)良好，控制牛舍內(nèi)濕度在50%-70%之間，溫度在15-25℃之間。合理調(diào)整犢牛的飼養(yǎng)密度，每頭犢牛應(yīng)有足夠的活動空間，如在規(guī)?；B(yǎng)殖場，每頭犢牛的活動面積應(yīng)不小于2平方米，以減少病原菌傳播風(fēng)險。對新引入的犢牛，要進行至少14天的隔離觀察，確保其健康無病后，再混入牛群飼養(yǎng)。精準(zhǔn)疫苗研發(fā)與接種：根據(jù)本研究鑒定出的寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌優(yōu)勢血清型，如O78、O111和O101，研發(fā)針對性的多價疫苗。疫苗研發(fā)過程中，可采用基因工程技術(shù)，將優(yōu)勢血清型的關(guān)鍵抗原基因進行重組表達，提高疫苗的免疫原性。制定合理的疫苗接種程序，對于新生犢牛，可在出生后7-10天進行首次免疫，間隔2-3周后進行二次免疫；對于成年母牛，可在配種前1-2個月進行免疫，以提高母牛的抗體水平，通過母乳傳遞給犢牛。在疫苗接種過程中，要嚴(yán)格按照疫苗使用說明書進行操作，確保疫苗的接種劑量和接種途徑正確，同時要注意疫苗的保存和運輸條件，避免疫苗失效。藥物防治：在犢牛腹瀉性大腸桿菌病的治療過程中，應(yīng)先進行藥敏試驗，選擇對病原菌敏感的藥物進行治療。如本研究中分離得到的大腸桿菌對硫酸新霉素、鏈霉素、土霉素等可能敏感，但具體的藥敏情況需通過試驗確定。避免盲目使用抗生素，以免導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性。根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，可選用敏感的抗生素，如硫酸新霉素按每千克體重內(nèi)服30-50mg，每天2-3次，連續(xù)使用3-5天；或鏈霉素按每千克體重肌肉注射10-30mg，每天2-5次。同時，可配合使用一些輔助治療藥物，如在犢牛出現(xiàn)脫水癥狀時，及時靜脈注射5%葡萄糖生理鹽水、復(fù)方氯化鈉注射液等進行補液，每天1-2次，癥狀嚴(yán)重時可增加次數(shù)。還可添加適量的5%碳酸氫鈉注射液，以糾正酸中毒。在癥狀好轉(zhuǎn)后，可內(nèi)服一些調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡的藥物，如促菌生、乳酶生等，促進腸道功能恢復(fù)。加強監(jiān)測與預(yù)警：建立寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌病的監(jiān)測體系，定期對養(yǎng)殖場的犢牛進行糞便采樣檢測，及時掌握病原菌的流行情況和毒力基因變化?？擅總€月對養(yǎng)殖場內(nèi)10%-20%的犢牛進行糞便檢測，分析大腸桿菌的血清型和毒力基因攜帶情況。利用大數(shù)據(jù)和信息化技術(shù)，對監(jiān)測數(shù)據(jù)進行分析和整合，建立預(yù)警模型。當(dāng)發(fā)現(xiàn)某地區(qū)或養(yǎng)殖場的犢牛腹瀉性大腸桿菌病發(fā)病率升高或出現(xiàn)新的優(yōu)勢血清型、毒力基因時，及時發(fā)出預(yù)警信號，以便養(yǎng)殖場和相關(guān)部門采取防控措施。加強養(yǎng)殖場之間的信息交流與合作，共享病原菌監(jiān)測數(shù)據(jù)和防控經(jīng)驗，共同做好犢牛腹瀉性大腸桿菌病的防控工作。五、結(jié)論5.1研究成果總結(jié)本研究通過對寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌的深