膠質(zhì)瘤U87細胞來源的外泌體對星形膠質(zhì)細胞活化作用的蛋白組學(xué)研究摘要膠質(zhì)瘤是一種最常見的預(yù)后不良的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，具有極強的侵襲性和致命性。膠質(zhì)瘤微環(huán)境中的外泌體在腫瘤細胞和間質(zhì)細胞間信息交換作用的研究一直是熱點問題。膠質(zhì)瘤分泌的外泌體作為一種全新的細胞間信息傳遞系統(tǒng)，攜帶和傳遞重要的信息分子，參與了膠質(zhì)瘤與其微環(huán)境的相互作用，可活化星形膠質(zhì)細胞，從而使其促進腫瘤細胞的生長發(fā)育。盡管如此，目前研究尚不完善。本課題擬通過收集膠質(zhì)瘤分泌的外泌體，用以干預(yù)星形膠質(zhì)細胞，從而探究星形膠質(zhì)細胞的活化方向、蛋白表達水平變化及相關(guān)機制，驗證腫瘤來源的外泌體對腫瘤微環(huán)境中的間質(zhì)細胞是否起誘導(dǎo)活化作用，以期為尋找治療膠質(zhì)瘤的新方法提供一定的科學(xué)依據(jù)。關(guān)鍵詞：膠質(zhì)瘤星形膠質(zhì)細胞外泌體腫瘤微環(huán)境ProteomicsstudyofactivationofastrocytesbyU87glioma-derivedexosomesAbstractGliomaisoneofthemostcommonprimarycentralnervoussystemmalignanttumorswithpoorprognosis,whichisextremelyaggressiveandfatal.Theresearchontheroleofexosomesinthemicroenvironmentofgliomasintheexchangeofinformationbetweentumorcellsandmesenchymalcellshasalwaysbeenahotissue.Theexosomessecretedbygliomas,asabrandnewintercellularinformationtransmissionsystem,carryandtransmitimportantinformationmolecules,participateintheinteractionbetweengliomasandtheirmicroenvironment,andcanactivateastrocytestomakethempromotethegrowthanddevelopmentoftumorcells.Nevertheless,thecurrentresearchisnotperfect.Thisprojectintendstousetheexosomessecretedbygliomastointerveneinastrocytes,soastoexploretheactivationdirectionofastrocytes,changesinproteinexpressionlevelsandrelatedmechanisms,andverifythepairingoftumor-derivedexosomes,andverifywhethertumor-derivedexosomescaninduceactivationofmesenchymalcellsinthetumormicroenvironment.Basedonthese,wehopetoprovideacertainscientificbasisforfindingnewmethodstotreatglioma.Keywords：GliomaAstrocytesExosomesTumormicroenvironment1.介紹膠質(zhì)瘤(glioma)是一種最常見的預(yù)后不良的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，由于其高轉(zhuǎn)移率和耐藥性，成為最具侵襲性和致命性的癌癥之一，尤其是膠質(zhì)母細胞瘤，惡性程度最高[1,7]。盡管積極進行手術(shù)切除并且聯(lián)合化療和放療，但這些治療方案大部分是低效的，經(jīng)常復(fù)發(fā)，最終導(dǎo)致機體死亡[7,8,13]。對于改善治療方法，了解膠質(zhì)瘤在生物學(xué)上的創(chuàng)新性進展是有必要的。外泌體(exosome)是細胞內(nèi)的內(nèi)溶酶體微粒(endolysosomalvesicle)內(nèi)陷形成多囊泡體(multi-vesicularbody)，在刺激作用下，多囊泡體與細胞膜融合，向胞外分泌的大小均一、直徑在40-100nm的囊泡[6]。外泌體廣泛存在并分布于各種體液中，攜帶和傳遞重要的信號分子，形成了一種全新的細胞間信息傳遞系統(tǒng)，影響細胞的生理狀態(tài)并與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11]。在膠質(zhì)瘤病理學(xué)中外泌體的潛在參與越來越受到重視。膠質(zhì)細胞是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量眾多的一大類細胞群體，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)細胞總數(shù)的9000，星形膠質(zhì)細胞(astrocyte)是其中主要的組成成分[4]。星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元之間存在復(fù)雜的相互作用，以維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。它的作用包括支持和隔離、調(diào)節(jié)離子濃度和傳遞第二信使、供給和滅活神經(jīng)遞質(zhì)、營養(yǎng)修復(fù)作用等等[5]。但是在病理條件下，星形膠質(zhì)細胞從靜息狀態(tài)快速向活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變，其活化具有瀑布效應(yīng)，活化的星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元起保護或毒性作用，從而發(fā)揮“雙刃”效應(yīng)[3]。膠質(zhì)瘤分泌的外泌體對膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要作用，參與了膠質(zhì)瘤的免疫逃避、侵襲轉(zhuǎn)移、增殖、細胞周期的進展以及免疫反應(yīng)[2,9]，對耐藥性也有一定的影響[10]。它還可以改變腫瘤微環(huán)境[9]，并且能夠招募受體細胞來支持腫瘤細胞的生長發(fā)育，其中就包括鄰近的星形膠質(zhì)細胞。膠質(zhì)瘤分泌的外泌體對星形膠質(zhì)細胞活化后，星形膠質(zhì)細胞表現(xiàn)出很強的遷移能力，并且釋放了大量可促進腫瘤細胞生長發(fā)育的細胞因子，也表現(xiàn)出了細胞內(nèi)信號傳遞和轉(zhuǎn)化能力的改變[13]，以及相關(guān)的蛋白質(zhì)組和基因表達發(fā)生了變化，甚至改變了星形膠質(zhì)細胞的表型[11,12,14]。但是關(guān)于膠質(zhì)瘤分泌的外泌體對星形膠質(zhì)細胞活化作用的蛋白組學(xué)研究目前甚少，尚未弄清楚機制，所以由此進一步探索這方面的內(nèi)容可能是建立新的干預(yù)手段的關(guān)鍵。2.材料與方法2.1U87細胞培養(yǎng)用總體系為3ml的含10％的胎牛血清（FBS）的ModifiedEagleMedium（MEM）中培養(yǎng)，1天左右更換一次培養(yǎng)基，待細胞長到80％-90％（大概3至4天）進行傳代（100l的胰酶消化，800-900r/min、4min離心，總體積為1ml的MEM培養(yǎng)基重懸，取300-500l細胞原液傳代）。2.2外泌體的提取U87細胞培養(yǎng)狀態(tài)良好后，將其種植在總體系為小培養(yǎng)瓶的3倍的大培養(yǎng)瓶中；待其細胞密度達80%左右后，去除完全培養(yǎng)基，然后使用3-4mlhank’s溶液清洗2次，加入無血清MEM培養(yǎng)基進行饑餓培養(yǎng)，觀察細胞狀態(tài)，連續(xù)培養(yǎng)24小時。然后收集細胞培養(yǎng)上清液適量，并進行離心6000r/min、15min，初次去除殘余細胞及碎片，根據(jù)所選試劑盒的說明書提取外泌體。2.3免疫印跡技術(shù)通過免疫印跡技術(shù)的原理，利用SDS細胞裂解液提取外泌體總蛋白；制備濃縮膠及分離膠，然后進行總蛋白的上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉；再進行加一抗、洗一抗、加二抗、洗二抗；最后進行顯色、曝光、顯影、定影并保存分析圖像。2.4BCA法測定蛋白濃度預(yù)先進行蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（終濃度為0.5mg/ml）和BCA工作液（試劑A:試劑B體積比=50∶1）的制備。然后將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、4、8、12、16、20l加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補足到20l；加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液同樣補足到20l；最后各孔加200lBCA工作液，37℃放置20-30分鐘，即可用酶標(biāo)儀測定蛋白濃度。2.5原代星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)將3ml0.1g/lL-多聚賴氨酸溶液注入用于接種細胞的T75培養(yǎng)瓶中過夜，用無菌PBS洗3次，每次10min，常溫置于無菌超凈臺內(nèi)，1h內(nèi)接種細胞。用于差速粘附及傳代的培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿無需此處理。眼科彎鑷、直鑷及彎剪需提前浸泡酒精，高壓烘干。在無菌條件下，將乳鼠浸泡于酒精15s，用手術(shù)器械取出大腦皮質(zhì)，盡量剝離血管和腦膜。然后將組織剪碎，加入500l0.25%胰蛋白酶，37℃消化15min，加入等量含20%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基終止消化。用1000l槍頭反復(fù)輕柔吹打，使用70m細胞濾網(wǎng)過濾，將其以800r/min離心5min。吸除上清，用含10%胎牛血清、1%雙抗的完全培養(yǎng)基重懸沉淀。將細胞懸液接種至未用多聚賴氨酸處理過的T75培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)15min，吸出剩余未貼壁的星形膠質(zhì)細胞懸液，輕柔吹打混勻后，將細胞以5×106/mL接種至多聚賴氨酸包被預(yù)處理過的T75培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2培養(yǎng)。每隔3d換液，待細胞融合到90%左右時，進行下一步操作。細胞長滿瓶底后，更換完全培養(yǎng)基，37℃恒溫搖床200r/min振蕩18h。將培養(yǎng)瓶中上清液迅速倒掉，用PBS洗3次，將每瓶細胞加入1ml0.25%胰蛋白酶37℃消化，倒置顯微鏡下觀察，待細胞突觸回縮、大部分細胞脫落時，加入完全培養(yǎng)基終止消化。反復(fù)吹打瓶壁，收集細胞，用于傳代。以5×106/ml接種于未用多聚賴氨酸包被的100mm培養(yǎng)皿中。約3-5d后，細胞融合達到90%后，將每瓶細胞加入1ml0.25%胰蛋白酶37℃消化，約30s后，倒置顯微鏡下觀察，待細胞突觸回縮、大部分細胞脫落時，加入完全培養(yǎng)基終止消化，以1∶2的比例傳代，每3d全量換液一次。3.結(jié)果3.1膠質(zhì)瘤U87細胞系的建立我們用含濃度為10%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基(MEM)培養(yǎng)膠質(zhì)瘤U87細胞，1天左右更換一次培養(yǎng)基，3至4天按1：3傳代培養(yǎng)，通過倒置相差顯微鏡密切觀察細胞生長情況，培養(yǎng)直至細胞狀態(tài)良好，可以觀察到胞核明顯，有似神經(jīng)細胞的突起樣特征，數(shù)目及貼壁情況正常,無細菌、支原體等污染，即成功建立膠質(zhì)瘤U87細胞系（圖1）。圖1.膠質(zhì)瘤U87細胞及培養(yǎng)（A.低密度U87細胞；B.高密度U87細胞；C.培養(yǎng)U87細胞）3.2膠質(zhì)瘤U87細胞的外泌體的提取與鑒定膠質(zhì)瘤U87細胞狀態(tài)穩(wěn)定后，用無血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)U87細胞，12、24及48小時后收集U87細胞的條件培養(yǎng)基；通過試劑盒法提取U87細胞的外泌體,即試管底部所見淡白色沉淀（圖2）。然后利用BCA法測定了提取的外泌體的濃度，再通過SDS凝膠電泳對外泌體內(nèi)蛋白按照分子量分離；之后利用透射電鏡及免疫印跡技術(shù)對外泌體進行鑒定及表征（圖3）。透射電鏡下觀察可看到直徑分布于100-200nm的雙層膜結(jié)構(gòu)囊泡。免疫印跡表征U87細胞的外泌體表面標(biāo)志CD63及ALIX。這些結(jié)果表明，我們從膠質(zhì)瘤U87細胞的條件培養(yǎng)基中成功提取出U87細胞的外泌體，提示我們所采用的實驗方法是合理有效的。圖2.膠質(zhì)瘤U87細胞的外泌體的提取（A.收集U87的條件培養(yǎng)基；B.試劑盒法提取U87的外泌體）圖3.U87細胞的外泌體的表征及鑒定（A.外泌體蛋白濃度測定；B.外泌體SDS凝膠電泳；C.外泌體透射電鏡觀察；D.免疫印跡表征外泌體的表面標(biāo)志；E.免疫印跡操作）3.3星形膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)取新生24h的大鼠的大腦皮質(zhì)，充分剝離血管和腦膜，再剪碎、消化和反復(fù)離心，進行種植，此時觀察混有其他種類的細胞較多。培養(yǎng)一段時間后，逐漸神經(jīng)元等其余種類的細胞比例明顯減少，最后觀察到細胞分為兩層，星形膠質(zhì)細胞在下層鋪滿底壁，小膠質(zhì)細胞和其他神經(jīng)細胞在排列于上層。進行提取純化后，幾乎觀察不到其他類型的神經(jīng)細胞，星形膠質(zhì)細胞更易觀察，形態(tài)更為典型，胞體比較大，胞核呈圓形，周圍發(fā)出許多較長的突起呈星狀分布；整體上看，細胞交織緊密排列，胞核比較明顯，突起隱約可見。（圖4）圖4.不同時段的原代星形膠質(zhì)細胞4.討論目前治療腫瘤的常用方法副作用明顯，對于探究新的治療腫瘤的方法，深入到分子層面的腫瘤與其微環(huán)境的相互作用具有很大的潛力[7,8,13]。而腫瘤分泌的外泌體很可能在此過程中發(fā)揮著重要作用，通過攜帶各種信息分子，與微環(huán)境進行相互傳遞與交流，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2,9]。已有研究表明，在膠質(zhì)瘤的進程中，膠質(zhì)瘤分泌的外泌體影響了腫瘤微環(huán)境，通過活化星形膠質(zhì)細胞來支持腫瘤細胞的生長發(fā)育。受膠質(zhì)瘤的影響，活化的星形膠質(zhì)細胞的生物型行為、蛋白組學(xué)及基因均發(fā)生了相應(yīng)的改變[11,12,13,14]。在這種情況下，我們培養(yǎng)U87細胞，提取并表征U87細胞的外泌體，并且成功摸索出了原代星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)并純化得到原代星形膠質(zhì)細胞。希望能先驗證出類似的結(jié)果，再進行相關(guān)機制的蛋白組學(xué)研究。但在我們想要繼續(xù)推進實驗時，存在的這些以下問題，導(dǎo)致我們無法進一步開展，需要在后續(xù)的研究中進行改進：=1\*GB2⑴我們的實驗只是選取了一種類型的膠質(zhì)瘤細胞系，實驗結(jié)果較單一，可設(shè)置更多的對照組，不僅局限于人的膠質(zhì)瘤細胞系，也可采納動物的膠質(zhì)瘤細胞系，如：可以利用C6，GL261，U251和U373等細胞系。=2\*GB2⑵在原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞時，我們對星形膠質(zhì)細胞僅通過其典型的形態(tài)學(xué)特征進行鑒定，存在一定的偶然性，若再進行后續(xù)外泌體干預(yù)時勢必也存在著不確定性，需對其特征標(biāo)志物如GAFP加以鑒定更為有效。=3\*GB2⑶雖然我們成功提取膠質(zhì)瘤U87細胞的外泌體，但在實際操作中需要用很大體積的U87條件培養(yǎng)基才能得到很少的外泌體，并且條件培養(yǎng)基收集周期很長，這成為影響實驗推進進度的關(guān)鍵因素。=4\*GB2⑷我們提取到的外泌體濃度較低，體積較少。這不足以達到干預(yù)星形膠質(zhì)細胞的總量要求，因此未能進行最后的蛋白表達譜的建立及差異分析，表明外泌體的提取方法還需要優(yōu)化及改進，以期降低所需條件培養(yǎng)基的體積及提高外泌體濃度。總之，我們成功培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細胞，收集U87細胞的條件培養(yǎng)基，提取外泌體，最后表征外泌體表面標(biāo)志CD63及ALIX。但因時間受限及外泌體濃度較低，我們還未能將提取到的U87細胞的外泌體干預(yù)原代星形膠質(zhì)細胞。后面我們會在對星形膠質(zhì)細胞進行鑒定的同時，將繼續(xù)學(xué)習(xí)文獻，優(yōu)化提取方法，以期建立外泌體干預(yù)前后的星形膠質(zhì)細胞的蛋白表達譜，尋找差異蛋白，探究相關(guān)分子機制。5.參考文獻：[1]董世倩,潘文琦,李謙.外泌體在膠質(zhì)瘤中的研究進展與應(yīng)用[J].藥物生物技術(shù),2018,25(06):551-555.[2]楊海霞,李曉鳴.外泌體與膠質(zhì)瘤關(guān)系的研究進展[J].臨床與病理雜志,2017,37(11):2473-2478.[3]張敬軍.星形膠質(zhì)細胞的研究[J].中國藥理學(xué)通報,2006(07):788-791.[4]劉慧,王小軍,胡榮,楊忠,蔡文琴.星形膠質(zhì)細胞[J].生理科學(xué)進展,2004(01):86-91.[5]莫永炎,姜勇,陳瑗.腦星形膠質(zhì)細胞生物學(xué)功能研究進展[J].生理科學(xué)進展,2002(01):71-73.[6]盧婉,楊人強,王伶.外泌體的研究進展[J].生命的化學(xué),2013,33(04):438-442.[7].DavisME.Glioblastoma:OverviewofDiseaseandTreatment.ClinJOncolNurs.2016Oct1;20(5Suppl):S2-8.[8].BroniszA,WangY,NowickiMO,PeruzziP,AnsariK,OgawaD,BalajL,DeRienzoG,MineoM,NakanoI,OstrowskiMC,HochbergF,WeisslederR,LawlerSE,ChioccaEA,GodlewskiJ.ExtracellularvesiclesmodulatetheglioblastomamicroenvironmentviaatumorsuppressionsignalingnetworkdirectedbymiR-1.CancerRes.2014Feb1;74(3):738-750.[9].SimonT,JacksonE,GiamasG.Breakingthroughtheglioblastomamicro-environmentviaextracellularvesicles.Oncogene.2020Jun;39(23):4477-4490.[10].SimonT,PiniotiS,SchellenbergerP,RajeeveV,WendlerF,CutillasPR,KingA,StebbingJ,GiamasG.Sheddingofbevacizumabintumourcells-derivedextracellularvesiclesasanewtherapeuticescapemechanisminglioblastoma.MolCancer.2018Aug31;17